Een in vivo oestrogeen deficiëntie muis model voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Klinisch, oestrogeen deficiëntie bij menopauzale vrouwen kunnen verergeren de incidentie van lipide verstoring en atherosclerose. We vestigden een in vivo oestrogeen deficiëntie model door bilaterale ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen. Het muismodel is van toepassing voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Postmenopauzale vrouwen lopen een groter risico op het ontwikkelen van cardiovasculaire aandoeningen dan premenopauzale vrouwen. Vrouwelijke muizen ovariectomized (OVX) bij spening display verhoogde atherosclerotische laesies in de aorta in vergelijking met vrouwelijke muizen met intact ovariële functie. Echter, laboratorium modellen waarbij oestrogeen-deficiënte muizen met atherosclerose-gevoelige status ontbreken. Dit tekort is van cruciaal belang omdat klinische oestrogeen deficiëntie bij menopauzale vrouwen de incidentie van reeds bestaande of voortdurende lipide verstoring en atherosclerose kan verergeren. In deze studie, we vestigen een in vivo oestrogeen-deficiënte muismodel door bilaterale ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apolipoproteïne E (ApoE)-/- muizen. Vervolgens vergelijken we de effecten van 17β-estradiol en pseudoprotodioscin (PPD) (een fyto-oestrogeen), oraal toegediend via hazelnoot verspreiding. We vinden dat hoewel PPD enige invloed uitoefent op het verminderen van het eindgewicht en plasma TG in OVX apoE-/- muizen, het anti-atherosclerotische en cardiale beschermende capaciteiten heeft die vergelijkbaar zijn met zijn tegenhanger van 17β-estradiol. PPD is een fyto-oestrogenen die is gemeld dat anti-tumor eigenschappen uit te oefenen. De voorgestelde methode is dus van toepassing op het screenen van fyto-oestrogenen via perorale toediening ter vervanging van traditionele hormonale substitutietherapie bij postmenopauzale vrouwen, waarvan is gemeld dat zij potentieel schadelijke tumorigenetische Capaciteit. Perorale toediening via hazelnootpasta is niet-invasief, waardoor het algemeen toepasbaar is op veel patiënten. Dit artikel bevat stapsgewijze demonstraties van bilaterale ovariëctomie via de dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen en peroral 17β-estradiol of fyto-oestrogeen hormoon vervanging via hazelnoot verspreiding. Plasma lipide en cardiovasculaire functie analyses met behulp van echocardiografie volgen.

Introduction

Epidemiologische en klinische studies hebben aangetoond dat postmenopauzale vrouwen een aanzienlijk groter risico op hart-en vaatziekten hebben dan premenopauzale vrouwen1,2. Hormonale substitutietherapie (HRT) kan het relatieve risico van hart-en vaatziekten te verminderen 0,37-0.793. Onder andere complicaties, atherosclerose veroorzaakt door hart-en vaatziekten is de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd4. Echter, laboratorium modellen waarbij oestrogeen deficiënte muizen presenteren atherosclerose gevoelige status ontbreken. Dit protocol biedt een in vivo oestrogeen deficiëntie muismodel voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze.

Eerdere studies tonen aan dat de toepassing van ovx in atherosclerotische knaagdieren gevoed met een hoog-cholesterol dieet postmenopauzale vrouwen die lijden aan atherosclerose5,6,7,8kan nabootsen. Een reproduceerbare en handige diermodel lijkt op de atherosclerotische toestand bij menopauzale vrouwen is de basis van exogene oestrogeen onderzoek. Hier werd een dubbele Dorsale-laterale incisie van bilaterale ovariëctomie toegepast bij atherosclerose-gevoelige apolipoproteïne E Knockout (ApoE-/-) muizen9,10. Vergeleken met middelste buik-of dorsale incisie, is dubbele Dorsale-laterale incisie een eenvoudigere, minder tijdrovende methode die ernstige hechting en ontsteking van de buikholte kan voorkomen. Perorale toediening via hazelnoot verspreiding (Zie tabel van de materialen) is niet-invasief en handig, waardoor het algemeen toepasbaar als een lange termijn administratie modus11. Slow-release pellet implantatie is ook populair6. Implantaten verergeren echter de incidentie van infectie, vooral bij muizen die onderworpen zijn aan OVX. Andere niet-invasieve toedieningswijzen, zoals mond sonde en waterbeheer, hebben ook veel nadelen. Orale maagsonde stress meestal muizen en kan veroorzaken oesofageale letsel. Het hormoon toedienen via drinkwater is zeer gunstig; echter, de toevoeging van DMSO als een emulgator is onvermijdelijk als exogene oestrogenen zijn onoplosbaar in water. Hier kozen we voor peroral 17β-estradiol of fyto-oestrogenen hormoon vervanging via hazelnoot verspreiding voor langdurige toediening.

Onlangs is het gunstige effect van HRT op het cardiovasculaire systeem van postmenopauzale vrouwen betwist in het vrouwen gezondheidinitiatief (WHI) Trials12. Aan de ene kant, exogene oestrogeen alleen oefent een gunstig effect op het cardiovasculaire systeem; aan de andere kant, het kan combineren met metohydroxyprogesteron acetaat te verhogen het risico van cardiovasculaire gebeurtenissen. Serieuzer, HRT kan leiden tot borst-en baarmoeder tumorprogressie, en dit effect heeft aanzienlijk beperkt het gebruik13,14. Meer belangstelling is gericht op de cardiovasculaire-beschermende effecten van exogene oestrogenen ontbreekt mitotische activiteit in tumorcellen15,16,17. Meerdere studies bij mens en dier suggereren dat fyto-oestrogenen met structuren die vergelijkbaar zijn met die van oestrogeen een gunstige rol in cardiovasculaire bescherming kunnen spelen15,18.

Dus, de doelstellingen van het huidige werk zijn (i) om een in vivo oestrogeen deficiëntie muismodel te bouwen door bilaterale ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen en (II) om de cardiovasculaire beschermende effecten van peroraal te vergelijken toegediend 17β-estradiol en pseudoprotodioscin (PPD), via hazelnoot verspreiding. 17β-estradiol is een soort exogene oestrogeen dat behoort tot vrouwelijke seksuele hormonen6,11,19. PPD, een steroïde saponine en fyto-oestrogenen van Dioscorea planten, is eerder gemeld om uit te oefenen anti-tumor eigenschappen20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Dierenzorg-en experimentele protocollen werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Chinese Academie voor medische wetenschappen en Peking Union Medical College (machtigings nummer: SYXK (Peking) 2013-0023). De oorsprong van ApoE-/- muizen is C57BL/6j9,10.

1. bilaterale Ovariëctomie via een dubbele Dorsale-laterale incisie in apoE-/- muizen

  1. Bij het spenen (leeftijd 28 dagen), verdoven vrouwelijke ApoE-/- C57BL/6j muizen met Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally).
    Opmerking: 32 ApoE-/- muizen werden willekeurig verdeeld in 4 groepen: Sham, ovx, ovx/E2, en ovx/PPD groep (n = 8 per groep).
  2. Plaats het dier in de liggende positie op een verwarmingskussen. Breng oogsmeer middel voor oogbescherming tijdens de anesthesie.
  3. Behoud de lichaamstemperatuur binnen 36 ± 0,5 °C. Dien 5 mg/kg lichaamsgewicht van de analgetische carprofen subcutaan toe aan het laterale aspect van de nek van de muis.
  4. Scheer een 3 x 5 cm2 muis gebied kopborststuk van de iliacale Crest. Voorafgaand aan het bedekken van het dier met een 3 x 5 cm2 diafragma chirurgische plaat, reinig het geschoren gebied grondig met jodium en vervolgens 70% ethanol. Gebruik tijdens het experiment steriele instrumenten en handschoenen.
  5. Gebruik een schaar en een tang om een incisie van 1 cm lateraal aan de middenlijn en 1 cm laterale aan de ribben te maken.
  6. Ontleden het onderhuidse weefsel met behulp van een tang.
  7. Gebruik ontleed bril (Zie tabel met materialen) om het witte vetweefsel in de buikholte te identificeren.
  8. Gebruik micro schaar en microforceps om een insnijding van 0,5-1 cm door de fascia te maken tot de buikholte is bereikt.
    Opmerking: Voor de Sham-bediende groep, sluit de wonden direct. Hechting van de spierlaag en de huid afzonderlijk met behulp van een monofilament hechtmiddel.
  9. Wanneer het witte vetweefsel in de buikholte kan worden gezien, pak het vetweefsel met behulp van microforceps en trek het voorzichtig uit. Een roze moerbei vormige eierstok gewikkeld door vetweefsel in de buikholte kan worden gezien.
  10. Ligate het 0,5-1 cm proximale vat en de baarmoeder hoorn met behulp van een monofilament hechtmiddel. Verwijder de eierstok met behulp van een micro schaar en plaats het resterende weefsel terug in de buikholte.
    Opmerking: De belangrijkste nadelige symptomen voor de OVX-operatie is ureterale ligatie die leidt tot hoge sterfte in OVX-bediende muizen. Dit kan worden vermeden door het identificeren van de weefsels met behulp van een ontleed Goggle.
  11. Sluit de wonden. Hechting van de spierlaag en de huid afzonderlijk met behulp van een monofilament hechtmiddel.
  12. Gebruik een schaar en een tang om een andere incisie van 1 cm laterale naar de middenlijn en 1 cm laterale aan de ribben aan de andere kant te maken. Herhaal de bovenstaande procedure (1,5 tot 1,11).
  13. Laat het dier ontwaken uit de anesthesie. Houd de muis apart op de eerste dag na de operatie.
  14. Reinig of vervang de kooi regelmatig tijdens de herstelfase.
  15. Ongeveer 24 h na de operatie, toedienen van een ander 5 mg/kg lichaamsgewicht van de analgetische carprofen subcutaan.

2. perorale toediening van 17β-estradiol of PPD via hazelnoot verspreiding

  1. Los 17β-estradiol of PPD in sesamolie grondig op en meng vervolgens de sesamolie met hazelnootpasta (Zie tabel met materialen). Een dagelijkse portie voor elke 30 g muis bevat 3 μg 17β-estradiol of 15 μg PPD, 4 μL sesamolie en 60 mg hazelnootpasta. Bereid een placebo voor elke 30 g muis bevat 4 μL sesamolie en 60 mg hazelnootpasta.
    Opmerking: Het dagelijkse toedienings gedeelte van 17β-estradiol of PPD was gebaseerd op eerdere onderzoeken6,11 en voorbereidende experimenten.
  2. Een week na OVX, voeden de muizen met een hoog-cholesterol dieet (1,25% cholesterol, 0% cholate) voor 12 weken. Een typische experimentele behandelings regeling, zoals gebruikt in deze studie, wordt geïllustreerd in Figuur 1.
  3. 5 dagen voor de perorale toediening van hazelnoot verspreid in week 4, Train de muizen om de placebo te eten met ongeveer 30 mg hazelnoot spreiding voor 2-5 muizen gedurende 5 dagen. Train de muizen in groepen in hun huis kooien tijdens de eerste 3 dagen. Plaats de muizen in afzonderlijke kooien op de vierde en vijfde dagen van de training en serveer de dagelijkse portie om de experimentele situatie te lijken.
  4. In de laatste 9 weken, plaats de muizen in aparte kooien en serveer vervolgens dagelijks een portie hazelnoot spreiding voor elke voeder gelegenheid.
    Opmerking: Serveer een dagelijkse portie met 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) of PPD (0,5 mg · kg-1) via hazelnoot verspreiding in respectievelijk ovx/E2 en ovx/PPD-groep; Serveer een dagelijkse portie met hormoon vrije hazelnoot verspreiding in SHAM en OVX groep.

3. bepaling van de Intima-media dikte en cardiale disfunctie met behulp van een Microultrasoon systeem

  1. Ultrasonografische biomicroscopie
    1. Een dag voor de beëindiging, onderzoeken Intima-media dikte en cardiale disfunctie met behulp van een microecho grafie systeem (Zie tabel van de materialen) zoals eerder beschreven21.
    2. Vóór het onderzoek, geef elke muis een 200 mg/kg intraperitoneale injectie van Avertin (tribromoethanol) als anesthesie (n = 8 muizen per groep).
    3. Scheer het nekhaar van elke muis voorzichtig. Breng warme ultrasone transmissie gel royaal aan om een optimale beeldkwaliteit te garanderen.
    4. Verkrijg Baseline ultrasonografische beelden van de aorta wortel en oplopende aorta met de 30 MHz scan Head op een 12,7 mm focus en een resolutie van 40 μm.
    5. Gebruik elektrocardiografie met een lead II configuratie voor monitoring.
    6. Leg de juiste parasternale lange-assige beelden vast van de stijgende aorta, aortische boog en brachiocephalische arterietak in één vliegtuig in systool (Figuur 3).
  2. Metingen van Intima-media en maximale plaque dikte
    1. Pas de afstand tussen de transducer en de arteriële plaats gemakkelijk aan om duidelijke beelden te verkrijgen.
    2. Bewaar een 10 s Cine loop digitaal voor offline onderzoek op een beeldanalyse systeem.
    3. Kies voor verdere metingen handmatig een optimaal Freeze-frame ultrasonografisch beeld. Controleer de beelden in de kleine kromming van de oplopende aorta. Als plaque in de oplopende aorta kan worden gezien, meet de maximale plaque dikte. Als plaque in de opgaande aorta niet kan worden gezien, meet de maximale IMT.
    4. Meet de IMT (afstand tussen de vasculaire luminal-intimale interface en de mediale-adventitiële Interface). Meet de maximale plaque dikte (de dikste afstand tussen de rand van het vasculaire lumen en de adventitiële laag).
    5. Gemiddelde gegevens van drie laesie sites (Figuur 3).
  3. Bepaling van cardiale disfunctie met behulp van echocardiografie
    Opmerking:
    onderzoek de cardiale functie via echocardiografie met behulp van een microultrasone systeem, zoals eerder beschreven22.
    1. Direct een ultrasone straal naar het hart, in de buurt van de papillaire spieren.
    2. Bereik twee-dimensionale elektrocardiogram gebaseerde kilohertz visualisatie.
    3. Voer in vivo transthoracische echocardiografie van de linker ventrikel met behulp van een 30 MHz scan hoofd.
    4. Meet parameters gekoppeld aan cardiale functie digitaal van M-modus tracings.
    5. Gemiddelde van de gegevens van drie tot vijf cardiale cycli (tabel 1).
  4. Intra-en interobserver variabiliteit
    1. Voor validatie van intraobserver variabiliteit, analyseren van de gegevens door één operator op twee verschillende gelegenheden.
    2. Voor evaluatie van interobserver variabiliteit, analyseren van de gegevens door een andere operator.

4. wekelijkse meting van het lichaamsgewicht en bepaling van het plasma totaal cholesterol (TC) en triglyceride (TG)

  1. Wekelijkse lichaamsgewicht meting
    1. Meet lichaamsgewichten eenmaal per week van week-1 tot week 12.
      NB: n = 8 muizen per groep.
  2. Plasma preparaat
    1. Voordat u bloedmonsters verzamelt via intracardiale punctie, bereidt u spuiten en buizen voor. Gebruik EDTA als antistollingsmiddel. Voeg 10 μL van 0,5 M EDTA toe aan elke 2 mL spuit en voeg 8 μL 0,5 M EDTA toe aan elke tube van 1,5 mL.
    2. In week 12, na een nacht vasten, anesthetiseren de muizen met Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneaal).
      Opmerking: n = 3 muizen per groep.
    3. Bereid het ventrale borst oppervlak voor met 70% ethanol.
    4. Gebruik een schaar en een tang om de thoracische holte te openen en snijd de ribben tot het kloppend hart wordt blootgesteld.
    5. Steek de 25 G naald in de rechter ventrikel. Aspireren langzaam totdat het bloed begint te stromen in de spuit.
      Opmerking: We gebruiken wegwerpspuiten in steriele toestand met 25 G naalden (Zie tabel met materialen).
    6. Blijven aspireren met constante, gelijkmatige druk. Als er geen bloed wordt gezien, plaats de naald dan opnieuw en herhaal aspiratie.
    7. Houd muizen diep verdoeiliseerd voordat het vereiste bloed volume wordt verzameld. Normaalgesproken kan maximaal 1 mL bloed worden verzameld. Euthaniseer de muizen door cervicale dislocatie onder deze diepe verdoving aandoening.
    8. Pipetteer bloedmonsters in buizen van 1,5 mL en keer het bloed om in het bloed om ervoor te zorgen dat EDTA wordt gemengd. Plaats dan onmiddellijk bloedmonsters op ijs.
    9. Centrifugeer monsters gedurende 20 minuten bij 400 x g bij 4 °c binnen 30 minuten na afname.
    10. Vang het supernatant zorgvuldig op. Aliquot en bewaar plasma monsters bij-80 °C.
  3. Construct standaard curves voor TC of TG content meting
    1. Voor de TC-standaard curve bereidt u verschillende concentraties van cholesterol normen voor: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L en 10,34 mmol/L. meet O.D. voor elke cholesterol norm. Stel gemiddelde O.D. voor elke cholesterol norm. Stel als de waarde van de verticale as (Y) de concentratie in als de waarde voor de horizontale as (X). Maak een standaard curve met behulp van een statistische software.
    2. Voor de TG standaard curve, bereiden verschillende concentraties van TG-normen: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L en 9,04 mmol/L. meet O.D. voor elke TG-norm. Stel gemiddelde O.D. voor elke TG-standaard in als de verticale (Y) Aswaarde; Stel de concentratie in als de waarde voor de horizontale as (X). Maak een standaard curve met behulp van een statistische software.
      Opmerking: Een vier-parameter logistieke curve fitting (4-PL) werd gebruikt voor de standaard curve constructie in de huidige studie. Controleer de standaard curve voordat u de plasma monsters meet en zorg ervoor dat r2 groter is dan 0,995.
  4. Meting van TC-inhoud
    1. Label de fles kleur reagens (25 mL) van de TC assay kit als "TC Working Solution".
    2. Vortex de gekoelde exemplaren kort. Verdunningen voorbereiden: 20 μL plasma in 80 μL gedistilleerd water. Kort Vortex verdunningen.
    3. Voeg 2,5 μL cholesterol normen (5,17 mmol/L) of 2,5 μL verdund plasma of 2,5 μL gedestilleerd water (blanco) toe aan de juiste putjes van een 96-well plaat. Triplication wordt aanbevolen.
    4. Voeg aan alle putjes 250 μL van het kleur reagens toe.
    5. Incuberen bij 37 °C gedurende 10 min.
    6. Draai de microplaat Reader aan en laat 10 minuten opwarmen.
    7. Verwijder de plaat (en) uit de incubator en lees de microplaat Reader op 510 Nm. Zorg ervoor dat er geen bellen of stof aanwezig zijn in de micro titer putten of aan de onderkant van de plaat, respectievelijk.
    8. Bereken de TC-concentratie als volgt:
      TC cont. = cholesterol normen cont. × (plasma monster O.D.-Blanco O. D)/(cholesterol normen O.D.-Blanco O. D)
  5. TG-inhoud meten
    1. Label de fles kleur reagens (25 mL) uit TG-assay kit als "TG-werkoplossing".
    2. Vortex de gekoelde exemplaren kort.
    3. Voeg 2,5 μL TG-normen (2,26 mmol/L) of 2,5 μL verdund plasma of 2,5 μL gedestilleerd water (blanco) toe aan de juiste putjes van een 96-wells plaat. Triplication wordt aanbevolen.
    4. Voeg aan alle putjes 250 μL van het kleur reagens toe.
    5. Incuberen bij 37 °C gedurende 10 min.
    6. Draai de microplaat Reader aan en laat 10 minuten opwarmen.
    7. Verwijder de plaat (en) uit de incubator en lees de microplaat Reader op 510 Nm.
      Opmerking: Zorg ervoor dat er geen bellen of stof aanwezig zijn in de micro titer putten of op de bodem van de plaat.
    8. Bereken de TG-concentratie als volgt:
      TG vervolg = TG-normen cont. × (plasma monster O.D.-Blanco O. D)/(TG-normen O.D.-Blanco O. D)

5. en Gezichtsanalyse van aorta atherosclerotische laesies

  1. Aorta isolatie en excisie
    1. In week 12, na een nacht vasten, anesthetiseren de muizen met Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneaal). Euthaniseer de muizen door cervicale dislocatie onder deze diepe verdoving aandoening.
      Opmerking: We gebruikten 3 muizen per groep.
    2. Bereid het ventrale borst oppervlak voor met 70% ethanol. Gebruik een schaar en een tang om de thoracische holte te openen en snijd de ribben tot het kloppend hart wordt blootgesteld.
    3. Vul een 50 mL spuit met fosfaatgebufferde zoutoplossing bij pH 7,4 (Zie tabel van de materialen). Steek een 25 G naald in de linker ventrikel en snijd het rechter Atrium om hoge druk van perfusie te voorkomen.
    4. Voer in situ perfusie uit met een debiet van 0,05-0.08 mL/min. Absorbeer perfusievloeistof met weefsels.
    5. Verwijder ribben en longen in de thoracische holte met een schaar en een tang. Open vervolgens de buikholte en verwijder de organen naar binnen voor een beter zicht op de aorta.
    6. Verwijder de aorta door het hart met de microforceps te houden en de aorta te scheiden van rugdorsaal met microscisssors tot de iliacale bifurcatie.
      Opmerking: Bij het ontleden in de buurt van de nieratriale takken, snijd diep met behulp van micro schaar om te voorkomen dat aorta schade.
    7. Bevestig het hart en aorta voor 48 h in 4% Paraformaldehyde. Bewaar de aortas in zoutoplossing bij kamertemperatuur of bij 2-8 °C gedurende een paar uur.
      Opmerking: Deze procedure vergemakkelijkt de reiniging.
  2. Voorbereiding van aorta
    1. Verwijder het hart. Verwijder voorzichtig de adventitiële weefsels uit de aorta's met behulp van microforceps en microscisssors onder een stereomicroscoop. Gebruik zoutoplossing om het weefsel vochtig te houden tijdens het reinigen.
      Opmerking: Wees voorzichtig om niet scheuren of Nick de aorta en enkele belangrijke takken, zoals de anoniem slagader, links gemeenschappelijke carotis slagader, en linker subclavia slagader.
    2. Laat 1 mm van de anoniem en links gemeenschappelijke carotis slagaders en afgesneden van de gehele linker subclavia slagader.
    3. Snijd Open de buitenste kromming door de anoniem slagader, dan naar de linker gemeenschappelijke halsslagader, en vervolgens naar de linker subclavia slagader.
    4. Snijd open langs de binnenste kromming van het oplopende gedeelte naar de onderkant van het buik gedeelte.
    5. Speld de aorta plat op een zwarte plastic plaat en breng een zoutoplossing aan om aorta's te laten drogen.
  3. Afbeelding van de intimale regio van aorta
    1. Maak foto's van en gezicht aortas met een stereomicroscoop. Neem een millimeter schaal liniaal op in de afbeeldingen om metingen te kalibreren.
    2. Neem de boog en thoracale gebieden in hetzelfde beeld en de abdominale regio in een ander. Afbeeldingen opslaan als JPEG of TIFF.
      Opmerking: De boog regio is van de kruising van het myocardium tot 3 mm distale van de linker subclavia slagader, de thoracale regio is 3 mm distale naar de linker subclavia slagader naar de laatste intercostale slagader, en de abdominale regio is de laatste intercostale slagader naar de iliacale Bifurcatie.
  4. Kwantificering van atherosclerotische laesie-en gezichts methode
    1. Kalibratie
      1. Open de afbeelding met beeldanalyse software (Zie tabel met materialen), ga naar ruimtelijke kalibratie en volg de instructies.
      2. Wijzig de referentie-eenheden in mm door de liniaal over de lijn te plaatsen.
    2. Meting
      1. Stel de juiste kalibratie in voor elke afbeelding.
      2. Meet 3 mm op de liniaal.
      3. Meting van de boog en de thoracale regio: schets het gebied van de boog van de kruising van het myocardium tot 3 mm distale van de linker subclavia slagader en het thoracale gebied van 3 mm distale naar de linker subclavia slagader naar de laatste intercostale slagader. Traceer laesies in de boog en de thoracische regio en kijk naar de aorta door de Microscoop.
      4. Abdominale regio meting: omtrek van de abdominale regio van het einde van de thoracale regio naar de iliacale bifurcation. Trace laesies in de abdominale regio en kijk naar de aorta door de Microscoop.
      5. Bereken het laesie gebied ten opzichte van het binnenste oppervlak van aorta.
      6. Controleer de kwantificering door een tweede waarnemer die blind is voor de studiegroepen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een typische experimentele behandelings regeling, zoals gebruikt in deze studie, wordt geïllustreerd in Figuur 1. Bij het spenen (leeftijd 28 dagen), vrouwelijke apoE-/- C57BL/6j muizen werden verdoeiliseerd withavertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally). Muizen waren bilateraal OVX of Sham bediend door middel van een 1 cm dorsale incisie. Een week na bilaterale OVX, de muizen werden gevoed een hoog-cholesterol dieet (1,25% cholesterol, 0% cholate) voor 12 weken. 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) of PPD (0,5 mg · kg-1) werd tijdens de laatste 9 weken behandeling gelijktijdig oraal toegediend via de hazelnootpasta. Alle muizen werden wekelijks gewogen. Zoals weergegeven in Figuur 2, de effecten van beide exogene oestrogenen (17β-ESTRADIOL en PPD) op de plasma lipiden en wekelijks lichaamsgewicht van ApoE-/- muizen na oestrogeen deficiëntie werden geëvalueerd. Na 12 weken van een hoog-cholesterol dieet vertoonden OVX-muizen een opmerkelijke toename van plasma-TC-en TG-concentraties. OVX-muizen, oraal toegediend met 17β-estradiol of PPD via een hazelnoot sprei, vertoonden significant lagere plasma-TC concentraties dan door schijn werkende muizen (Figuur 2a). Plasma TG-concentraties daalden in OVX-muizen, oraal toegediend met 17β-estradiol, maar niet met PPD (Figuur 2b). Zoals wordt weergegeven in figuur 2c, terwijl een neiging tot verhoogd lichaamsgewicht (BW) werd waargenomen bij ovx-muizen in vergelijking met de door Sham bediende muizen, werd BW in ovx-muizen oraal toegediend met 17β-ESTRADIOL of PPD via hazelnoot verspreiding na een hoog-cholesterol dieet toonde een tendens tegenover dat in OVX muizen. Het uiteindelijke lichaamsgewicht van muizen in verschillende groepen toonde echter geen significante veranderingen.

Cardiovasculaire functie werd geëvalueerd met behulp van echocardiografie. Zoals weergegeven in Figuur 3, werd de maximale plaque of IMT van de oplopende aorta gemeten in ovx-muizen, oraal toegediend met 17β-estradiol of PPD via hazelnoot verspreiding. De aortaboog van hoog-cholesterol-dieet-gevoed apoE-/- muizen werden waargenomen door B-mode echocardiografie. Representatieve longitudinale beelden van oplopende aorta werden gevangen door ultrasonografische biomicroscopie. De rode pijlen geven de plaques aan. OVX-muizen vertoonden een verhoogde maximale plaque of IMT van de oplopende aorta in vergelijking met schijn-bediende muizen. Na perorale toediening van 17β-estradiol of PPD via een hazelnootpasta, daalde de maximale plaque of IMT van de oplopende aorta opmerkelijk in vergelijking met die van OVX-muizen. (Figuur 3). We hebben ook cardiale disfunctie waargenomen in reactie op OVX in apoE-/- muizen na een 12 weken durende High-cholesterol-dieetvoeding (tabel 1). Cardiale functie werd onderzocht door middel van echocardiografie. In OVX muizen, perorale toediening van 17β-estradiol of PPD via hazelnoot verspreiding kan gedeeltelijk verzachten parameters tonen cardiale disfunctie.

Vervolgens gebruikten we en face analyse om aorta atherosclerotische laesies te bepalen. Zoals eerder gemeld, na 12 weken, een hoog-cholesterol dieet leidde tot atherosclerotische plaque vorming op het Luminale oppervlak van de aorta. Zoals weergegeven in Figuur 4, steeg het gemiddelde percentage aorta laesies ten opzichte van het gehele aorta gebied significant in ovx-muizen. Na perorale toediening met 17β-estradiol of PPD via hazelnoot verspreiding, daalde de aorta laesie opmerkelijk in vergelijking met die van de tegenhanger van de OVX-muizen. Dit resultaat is consistent met de bescherming van 17β-estradiol of PPD uit de ontwikkeling van atherosclerose, gepresenteerd in Figuur 3.

Concluderend is de voorgestelde procedure, die bilaterale ovariëctomie gebruikt via een dubbele ruglaterale incisie in apoE-/- muizen, van toepassing voor het screenen van niet-invasieve exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze. Het is ook vooral nuttig voor het vermijden van schadelijke tumorigenetische capaciteit.

Figure 1
Figuur 1. Behandelingsschema van de muis. Bij het spenen (leeftijd, 28 dagen), vrouwelijke apoE-/- C57BL/6j muizen werden verdoeseerd met Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneaal). Muizen waren bilateraal ovariectomized (OVX) of Sham bediend door middel van een 1 cm dorsale incisie. Een week na OVX, de muizen werden gevoed een hoog-cholesterol dieet (1,25% cholesterol, 0% cholate) voor 12 weken. 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) of PPD (0,5 mg · kg-1) werd tijdens de laatste 9 weken behandeling gelijktijdig oraal toegediend via de hazelnootpasta. Alle muizen werden elke week gewogen. In week 12 werd de cardiovasculaire functie analyse geëvalueerd met behulp van echocardiografie. Na 12 weken van een dieet met een hoog cholesterolgehalte werden alle muizen geëerd en werden bloedmonsters en weefsels geoogst voor verder onderzoek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Effecten van verschillende exogene oestrogenen op plasma lipiden en wekelijks lichaamsgewicht in apoE-/- muizen. Sham muizen onderging een mock operatie en kreeg een hoog-cholesterol dieet. OVX-muizen onderging bilaterale ovariëctomie en vervolgens willekeurig onderverdeeld in de volgende groepen: de OVX-groep, die werd behandeld met een dieet met een hoog cholesterolgehalte; de OVX/E2 (17β-estradiol) groep, die een hoog-cholesterol dieet kreeg gedurende 12 weken plus 0,1 mg/kg E2 door middel van perorale toediening via een hazelnoot verspreiding gedurende de laatste 9 weken van de behandeling; en de OVX/PPD-groep, die gedurende 12 weken een hoog-cholesterol dieet ontving plus 0,5 mg/kg PPD via perorale toediening via een hazelnoot verspreiding gedurende de laatste 9 weken van de behandeling. De totale cholesterol en triglyceridenspiegels van plasma werden gemeten via enzymatische methoden (A-B). Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelden ± SEM van n = 5 muizen per groep. Wekelijkse lichaamsgewichten werden gemeten van week-1 tot week 12 (C). Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelden ± SEM van n = 8 muizen per groep. One-way ANOVA gevolgd door de post hoc test van Dunnett werd uitgevoerd voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05 in vergelijking met de Sham-groep; # p < 0,05 vergeleken met de ovx-groep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. IMT of maximale plaque diktemetingen in apoE-/- muizen. B-mode beelden tonen de aortaboog van apoE-/- muizen worden gepresenteerd. De longitudinale beelden van oplopende aorta werden verkregen door ultrasonografische biomicroscopie. Maximale plaque of IMT van de oplopende aorta (mm) werd gemeten. De ultrasonografische beelden tonen plaque in de kleine kromming van de oplopende aorta; de rode pijlen geven de plaques aan. De gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM van n = 8 muizen per groep. One-way ANOVA gevolgd door de post hoc test van Dunnett werd uitgevoerd voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05 in vergelijking met de Sham-groep; # p < 0,05 vergeleken met de ovx-groep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. En gezichtsanalyse van aorta atherosclerotische laesies in apoE-/- muizen. Het gemiddelde percentage aorta laesie ten opzichte van het gehele aorta gebied werd in alle groepen gekwantificeerd. Representatieve micro grafieken van de intimale laesies (en gezicht) van de aorta worden getoond. De gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM van n = 3 muizen per groep. One-way ANOVA gevolgd door de post hoc test van Dunnett werd uitgevoerd voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05 in vergelijking met de Sham-groep; # P < 0,05 vergeleken met de OVX-groep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Sham OVX OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (mm) 3,72 ± 0,10 3,74 ± 0. 24 3,68 ± 0,16 3,88 ± 0,16
LVIDs (mm) 2,34 ± 0,11 2,16 ± 0,22 2,12 ± 0,13 2,55 ± 0,12#
IVSd (mm) 0,83 ± 0,09 0,84 ± 0,07 0,91 ± 0,05 0,74 ± 0,06#
IVSs (mm) 1,24 ± 0,02 1,35 ± 0,06 * 1,45 ± 0,04# 1,09 ± 0,04#
PWTd (mm) 0,7 ± 0,10 0,68 ± 0,04 0,72 ± 0,07 0,58 ± 0,07#
PWTs (mm) 1,10 ± 0,12 1,17 ± 0,08 1,24 ± 0,04 0,98 ± 0,08#
EDV (mm3) 58,89 ± 3,74 59,88 ± 9,02 57,39 ± 5,79 65,11 ± 6,13
ESV (mm3) 18,86 ± 2,17 15,75 ± 4,00 14,85 ± 2,37 23,45 ± 2,64#
EF (%) 67,84 ± 1,52 73,91 ± 3.63 * 74,23 ± 1,50 63,91 ± 3,61#
FS (%) 37,19 ± 1,53 42,22 ± 1,17 * 42,36 ± 1,21 34,28 ± 2,69#
LVIDd = LV inwendige diameter tijdens diastole; LVIDs = LV inwendige diameter tijdens systole; IVSd = interne ventriculaire septum tijdens diastole; IVSs = interne ventriculaire septum tijdens systole; PWTd = posterieure wanddikte tijdens diastole; PWTs = posterieure wanddikte tijdens systole; EF = ejectiefractie; FS = Fractioneel inkorten; EDV = eind diastolische volume; ESV = end-systolische volume.

Tabel 1: cardiale functie evaluatie met behulp van echocardiografie. Parameters die zijn gekoppeld aan cardiale functie digitaal van M-modus tracings werden in alle groepen gekwantificeerd. De gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM van n = 8 muizen per groep. One-way ANOVA gevolgd door de post hoc test van Dunnett werd uitgevoerd voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05 in vergelijking met de Sham-groep; # p < 0,05 vergeleken met de ovx-groep.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methodologie is een muismodel dat lijkt op lipide verstoring en atherosclerose gezien bij menopauzale vrouwen. Het is goed gedocumenteerd dat oestrogeen deficiëntie bij postmenopauzale vrouwen kan verergeren de incidentie van reeds bestaande of lopende hypercholesterolemie met progressief complexe en wijdverbreide atherosclerostic laesies1. Om na te bootsen de atherosclerose-gevoelige status in kliniek, ApoE-deficiënte muizen, een reproduceerbare en handige bron van dieren waarmee te bestuderen atherogenese23,24,25, werden toegepast. Zoals wordt aangetoond in de huidige studie, een vrouwelijke OVX apoE-/- muizen bij het spening weergegeven een toename van atherosclerotische laesies in de aorta in vergelijking met vrouwelijke ApoE-/- muizen met intact ovariële functie. In dit diermodel, we ook vergeleken het effect van verschillende exogene oestrogeen vervangende therapieën op atherosclerotische laesie grootte onder een gecontroleerde dieet conditie.

De dubbele Dorsale-laterale incisie van bilaterale ovariëctomie die in dit artikel wordt gepresenteerd, is technisch eenvoudiger, minder tijdrovend en veiliger in vergelijking met de middelste Dorsale-laterale incisie of middelste abdominale incisie van bilaterale ovariectomie in apoE-/- muizen. Bilaterale ovariëctomie via Midden-abdominale incisie presenteert een groot nadeel: het kan leiden tot ernstige hechting van de buikholte, die op zijn beurt kan invloed hebben op de absorptie van de drug. Recente rapporten tonen aan dat perorale toediening van lage dosis 17β-estradiol beschermt tegen cerebrale ischemie26. Zo selecteerden we perorale toediening via hazelnoot verspreiding in de huidige studie. Commerciële slow-release pellets zijn een veelgebruikte administratie modus voor het testen van farmacologische effecten in een muismodel, maar kan schadelijk cerebrale schade veroorzaken27. Implantaten zijn vatbaar voor infecties, vooral als muizen worden blootgesteld aan bilaterale OVX via een dubbele ruglaterale incisie. Hoewel zorgvuldige desinfectie van de huid voorafgaand aan incisie wordt uitgevoerd, infectie is moeilijk te vermijden. Water beheer en orale maagsonde zijn twee minder frequent gebruikte methoden die zijn getest. Het hormoon toedienen via drinkwater is zeer gunstig vanwege het feit dat het extreem noninvasief is omdat er bijna geen dieren behandeling nodig is. Echter, 17β-estradiol is niet oplosbaar in water zonder een emulgator. Zo gebruikten we DMSO bij een concentratie van minder dan 0,5% om de oplossing in drinkwater te vergemakkelijken. Echter, deze aanpak voor de lange termijn toediening van lage dosis DMSO is moeilijk te beheersen en giftig voor muizen of mensen. Muizen kunnen ook water drinken over de gehele 24 h van surveillance, wat het werkelijke drugsgebruik moeilijk maakt om te bepalen. Een ander nadeel van deze aanpak is dat de water inname van het individu moeilijk te beheersen is. Het grootste nadeel van orale maagsonde is dat het stressvol voor dieren en kan veroorzaken oesofageale letsel en invloed hebben op eetgedrag. In de hier beschreven methodologie, een 5 daagse training van het eten van hormoon-vrije hazelnoot verspreiding voorafgaand aan het experiment werd uitgevoerd. Ongeveer 95% van de muizen zal de hazelnoot verspreiding accepteren als ze worden getraind zoals beschreven in het protocol gedeelte. Eenmaal volledig gewend, zullen de meeste muizen het binnen enkele seconden consumeren. In overeenstemming met een eerdere studie6,11, daalden de plasma E2-waarden in ovx-muizen in vergelijking met de door Sham bediende tegenhanger in week 4 (gegevens niet weergegeven). In week 12 na de vaststelling, we waargenomen baarmoeder atrofie in OVX-bediende muizen. Echter, de circulerende oestrogeenniveaus werden niet gecontroleerd na OVX in de huidige studie.

Bij afwezigheid van het opsporen van atherosclerotische laesies in de stijgende aorta, kan de aorta IMT worden geëvalueerd door het meten van de afstand tussen de lumen-intimale interface en de mediale-adventitiële interface. Deze meting is gebaseerd op een eerder gevalideerd protocol bij mensen28. Gemiddelde gegevens van drie sites die ongeveer 100 μm van elkaar afwijken. De cardiale werklast stijgt na OVX in apoE-/- muizen kan als gevolg van compenserende hypertrofische groei van individuele cardiomyocyten die uiteindelijk kan leiden tot verhoging van de cardiale output (tabel 1). Overwegende dat na een perorale toediening van PPD gedurende 9 weken, de compenserende cardiale hypertrofie werd verzwakt met een EF% vergelijkbaar met de Sham-tegenhanger. Voor validatie van intra-of inter-Observer variabiliteit, analyseren coëfficiënten van variatie voor atherosclerotische diktemetingen en parameters geassocieerd met cardiale functie door één operator op twee verschillende gelegenheden of door een andere exploitant.

Zoals gepresenteerd in onze studie, OVX muizen peroraal toegediend met 17β-estradiol of PPD via hazelnoot verspreiding neiging om te voorkomen dat de toename van het lichaam gewicht en verminderen van oestrogeen deficiëntie-geassocieerde lipide verstoring, hoewel geen significante verschillen in het uiteindelijke lichaamsgewicht waren Waargenomen. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat lipide parameters variatie mogelijk te klein om uit te leggen van de antiatherosclerotische effecten van hormonen29. De gunstige effecten van oestrogeen zijn niet beperkt tot veranderingen in lipide eiwit eigenschappen. Sommige nonlipide effecten van oestrogeen30,31, zoals ontsteking, endotheliale dysfunctie, en hemodynamische stasis, cardiovasculaire bescherming bij menselijke ziekte kan vergemakkelijken. Gezien de resultaten waargenomen in de huidige studie, de bescherming van exogene oestrogeen van atherosclerose ontwikkeling is gedeeltelijk onafhankelijk van systemische lipide niveaus. In endotheliale cellen remde PPD de uitdrukkingen van het adhesieve molecuul en de ontstekingsmediatoren (gegevens niet weergegeven). Bovendien kan PPD de perivasculaire vetweefvorming onderdrukken die nauw gecorreleerd is met endotheliale anti-contractiliteit. De werking van PPD en 17β-estradiol was dus verschillend en het onderliggende mechanisme moet verder worden onderzocht. Ongetwijfeld kan overmatige consumptie van energierijke voeding, zoals hazelnoot verspreiding, gewichtstoename veroorzaken. De kleine hoeveelheden hazelnootpasta (200 mg · kg-1· dag-1), zoals vermeld in de huidige studie, kunnen echter slechts verantwoordelijk zijn voor minder dan 5% van de dagelijkse energie inname van de dieren. Ook, geen duidelijke gewichtstoename werd gedetecteerd door het gebruik van deze hoeveelheid hazelnoot verspreiding. Het gebruik van 17β-estradiol en PPD was voornamelijk voor de behandeling van hart-en vaatziekten. Omdat, tijdens de progressie van atherosclerose in OVX-opereerde aopE-/- muizen, van week 4 tot week 12, 17β-ESTRADIOL of PPD werd oraal toegediend.

Een niet-verwaarloosbaar punt van het klinisch gebruik van HRT is de nadelige bijwerkingen, waaronder ovariële en borstkanker,13,14. De fyto-oestrogenen getest in de huidige studie is een steroïde saponine samengestelde gevonden in Dioscorea planten. Er is gemeld dat PPD een remmende werking heeft op sommige cellijnen van kanker20. Bovendien vertoont PPD antiatherosclerotische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van 17β-estradiol. Het model dat we hier presenteren kan helpen scherm potentiële kandidaatverbindingen, met inbegrip van fyto-oestrogenen, die een minimaal effect op de proliferatie van de tumor oefent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81202526 tot J.X.), de National Natural Science Foundation of China (81302769 tot B.S.), de Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 tot B.S.), de Chinese postdoctorale Science Foundation (20110490325 tot J.X.), en de Ph.D. Programma's Stichting van het ministerie van onderwijs van China (20121106120031 tot B.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329, (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26, (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153, (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45, (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63, (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258, (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14, (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64, (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288, (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372, (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15, (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76, (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4, (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299, (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7, (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107, (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23, (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833, (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168, (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10, (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89, (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14, (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281, (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25, (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74, (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143, (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75, (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40, (5), 893-900 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics