Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

Cancer Research
 

Summary

Het doel van dit artikel is een protocol voor extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse, in het bijzonder, capillaire elektroforese-massaspectrometrie te beschrijven.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Maruyama, A., Kami, K., Sasaki, K., Sato, H., Sato, Y., Tsuchihara, K., Makinoshima, H. Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59551, doi:10.3791/59551 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metabolomic analyse is een veelbelovende omics aanpak om niet alleen de specifieke metabole regulatie in kankercellen te begrijpen in vergelijking met normale cellen, maar ook om biomarkers te identificeren voor vroegtijdig stadium kanker detectie en voorspelling van chemotherapie respons in Kankerpatiënten. Voorbereiding van uniforme monsters voor metabolomic analyse is een kritisch probleem dat nog moet worden aangepakt. Hier presenteren we een eenvoudig en betrouwbaar protocol voor de extractie van waterige metabolieten uit gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse met behulp van capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS). Waterige metabolieten van gekweekte cellen worden geanalyseerd door kweken en wassen van cellen, de behandeling van cellen met methanol, extractie van metabolieten, en het verwijderen van eiwitten en macromoleculen met spin kolommen voor CE-MS analyse. Representatieve resultaten met behulp van longkanker cel lijnen behandeld met diamide, een oxidatieve reagens, illustreren de duidelijk waarneembare metabole verschuiving van cellen onder oxidatieve stress. Dit artikel zou vooral waardevol zijn voor studenten en onderzoekers die betrokken zijn bij metabolomics onderzoek, die nieuw zijn voor het oogsten van metabolieten uit de cel lijnen voor analyse door CE-MS.

Introduction

Otto Warburg merkte op dat de kankercellen de ongebruikelijke capaciteit verwerven om glucose op te nemen en het te vergisten om lactaat in aanwezigheid van adequate zuurstof te produceren-een fenomeen dat als Warburg effect wordt genoemd of aërobe glycolyse1,2. Mitochondriale Ademhalings tekorten worden gespeculeerd als onderliggende basis voor aërobe glycolyse in kankercellen3. Inderdaad, de Warburg effect is de basis voor tumor Imaging door fluorodeoxyglucose (FDG)-positron emissie tomografie (PET), die op grote schaal wordt gebruikt in de klinische praktijk4,5. Een hoge mate van aërobe glycolyse wordt beschouwd als een belangrijk kenmerk van kanker en is onlangs aangenomen als een van de bekende "kenmerken van kanker," zoals beschreven door D. Hanahan en B. Weinberg6. Somatische mutaties in oncogenen en tumor suppressor genen — zoals HRAS/kras/nri's, EGFR, BRAF, Myc, TP53, isocitrate dehydrogenase () enfumaraat hydratase (FH )-zijn gekoppeld aan specifieke metabole veranderingen in kankercellen, vermoedelijk een gevolg van de Warburg effect7.

Metabolomic analyse is een veelbelovende aanpak niet alleen om metabole regulatie in kankercellen te begrijpen, maar ook om vroegtijdig stadium kanker biomarkers en chemotherapie respons voorspelling te identificeren. Na behandeling van gevoelige of resistente kankercellen met antikanker verbindingen, het bijhouden van hun metabole reacties vergemakkelijkt de identificatie van metabole biomarkers om de werkzaamheid van specifieke kankertherapieën te voorspellen bij kankerpatiënten8 ,9,10,11. In dit artikel, kanker cel lijnen afgeleid van een Long adenocarcinoom met een EGFR mutatie behandeld met diamide-die oxidatieve stress veroorzaakt-werden gebruikt als modellen voor metabolomic analyse. Het voordeel van deze analytische methode met behulp van capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS) is de uitgebreide meting van de geladen metabolieten met de massa bereik m/z 50-100012,13. Het doel van dit artikel is om novicen een gedetailleerd stapsgewijze visueel protocol voor de voorbereiding van waterige metabolieten van gekweekte kankercellen en de daaropvolgende metabolomic analyse, met name door CE-MS.

Protocol

1. Cell cultuur op dag 1

Opmerking: elk monster voor metaboliet extractie moet worden bereid uit een enkele 100 mm weefselkweek schaal die is matig maar niet volledig Confluent (met ongeveer 2 tot 5 miljoen cellen). Bereken het aantal gerechten die nodig zijn voor de assay en bereid ze dienovereenkomstig.

  1. Cultuur HCC827 en PC-9 cellen in 5% CO2 bij 37 °C in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetale boviene serum (FBS).
  2. Aspireren de cel cultuurmedia van de 100 mm cultuur gerechten.
  3. Was de cellen op elke schotel met behulp van 2 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), zonder calcium en magnesium. Zachtjes rots elke schotel, zodat de PBS-oplossing volledig dekt het oppervlak van de schotel.
  4. Aspireren de Wash buffer van de cultuur gerechten.
  5. Warme 0,25% trypsine-EDTA-oplossing voor 37 °C en voeg 2 mL trypsine-EDTA-oplossing toe met een serologische Pipet van 5 mL. Zachtjes rots elke schotel, zodat de trypsine volledig dekt het oppervlak van de schotel.
  6. Incubeer de cultuur gerechten bij 37 °C voor ongeveer 5 minuten.
  7. Voeg 4 mL van de voorverwarmde volledige groeimedium per schotel toe. De cellen in het midden opnieuw onderbreken door meerdere malen voorzichtig te pipetteren.
  8. Breng elke cel schorsing om een aparte 15 mL kegelvormige buis en centrifuge op 800 × g voor 5 min.
  9. Opnieuw op te schorten elke cel pellet in 2 mL van de voorverwarmde volledige groeimedium.
  10. Bepaal het totale aantal en de percenten levensvatbaarheid van de cellen gebruikend de geautomatiseerde teller van de cel en 0,4% trypaanblauw blauwe oplossing.
    1. Meng 10 l van de cel schorsing en 10 l van 0,4% trypaanblauw blauwe oplossing.
    2. Laad 10 l steekproef in de cel tellende kamer glijden door middel van capillaire werking.
    3. Plaats de kamer Schuif in de automatische teller. Het doorgegeven licht wordt automatisch verlicht en het instrument auto richt zich op de cel.
    4. Druk op de Capture knop om het beeld vast te leggen en de resultaten weer te geven.
    5. Voeg indien nodig verder groeimedium toe om de gewenste cel concentratie te verkrijgen.
  11. Zaad ongeveer 1 tot 2,5 miljoen cellen per 100 mm cel kweek schotel.
    Opmerking: metaboliet concentraties bepaald door de CE-MS analyse zal worden genormaliseerd op basis van het aantal levensvatbare cellen. Voor het doel van het tellen van cellen, is het noodzakelijk om ten minste een extra gezaaid cultuur gerecht voor elke groep voor te bereiden.
  12. Incubeer de kweek gerechten in 5% CO2 bij 37 °c voor 18 uur.

2. bereiding van reagentia

  1. Verdun een commerciële interne standaardoplossing met inbegrip van L-methionine sulfon en d-kamfer-10-sulfonic acid 1000-voudige in ultrapuur water.
    Let op: voor minder dan 80 monsters mengt u eenvoudigweg 50 l van de interne standaardoplossing 1 en 45 mL ultrapuur water in een maatkolf van 50 mL en brengt u de oplossing tot 50 mL met ultrapuur water.
  2. Bereid een 0,05 g/mL mannitol oplossing in ultrapuur water als was buffer.
    Let op: voor minder dan 30 monsters lost u eenvoudigweg 25 g mannitol op in 500 mL ultrapuur water. Ongeveer 15 mL van het wassen buffer is vereist per 100 mm kweekschaal, dus een voldoende volume van de Wash buffer te bereiden op basis van het aantal monsters.

3. pre-wassen centrifugaal filtereenheden

  1. Pipetteer 250 l van ultrapuur water in de filterbeker van elke centrifugale filtereenheid (Zie de tabel met materialen).
    Opmerking: er zijn twee filtereenheden per monster vereist.
  2. GLB de filtereenheden stevig en centrifuge bij 9.100 × g bij 4 °c voor 5 min.
  3. Controleer het volume van elk filtraat — als significant filtraat is opgebouwd tijdens de eerste korte rotatie, kan de filtereenheid defect zijn. In dat geval verwijdert u de filtereenheid en gebruikt u in plaats daarvan een nieuwe filtereenheid.
  4. Sluit de deksels van de filter units stevig af en centrifugeer opnieuw bij 9.100 × g bij 4 °c gedurende 30 min.
  5. Zorg ervoor dat geen ultrapuur water in om het even welke filter koppen blijft; Verwijder de gefilterde ultrapuur water in elke collectie buis met een pipet en gooi.
    Opmerking: Probeer niet om restwater te verwijderen in een filterbeker met een pipet als het kan het filter beschadigen.
  6. Vervang de filter cups in hun collectie buizen.
    Opmerking: gebruik de centrifugale filtereenheden binnen een uur, omdat de filters kunnen beschadigd raken bij het drogen.

4. Cell cultuur op dag 2

  1. Haal de 100 mm kweek gerechten uit de incubator.
    Nota: de geadviseerde cultuur duur van de cel is 18 h.
  2. Aspireren de cel cultuurmedium van elke 100 mm kweek schotel.
  3. Voeg 10 mL van de cel cultuurmedium dat de juiste concentraties van verbindingen of drugs omvat aan elk gerecht, waarbij zorg niet verstoren de cel laag.
    Opmerking: voor demonstratiedoeleinden hebben we in dit experiment 10 l van 250 mM diamide opgelost in PBS (eindconcentratie van 250 μM) toegevoegd.
  4. Incubeer de cultuur gerechten bij 37 °C voor 30 min in aanwezigheid van diamide of PBS als controle.
  5. Aspireren de cel cultuurmedium van elke 100 mm kweek schotel.
  6. Cellen wassen door zachtjes toe te voegen 2 mL van 5% mannitol oplossing aan de rand van elk gerecht, zorg ervoor dat niet te verstoren de cel laag, dan lichtjes kantelen van de schotel.
    Opmerking: PBS of zoutoplossing interfereert met CE-MS-based metabolomic analyse en nadelige invloed op de meetresultaten, en dus mag niet worden gebruikt als was buffer.
  7. Aspireren de Wash buffer van elke cultuur schotel, dan was de cellen weer door zachtjes toe te voegen 10 mL wassen buffer per schotel en iets kantelen van de schotel.
  8. Volledig aspireren de Wash buffer van de rand van elke kweek schotel.
    Nota: aspireren zo veel was buffer mogelijk, terwijl het letten op niet aspireren de cellen. Residuele mannitol kunnen interfereren met de CE-MS analyse; aspiratie van cellen zal het aantal cellen verminderen en zo een bron van fout in gegevens normalisatie worden.

5. extractie van metabolieten uit gekweekte cellen

  1. Voeg 800 l van 99,7% methanol per kweek schotel toe. Zachtjes rots elke cultuur schotel heen en weer om het gehele oppervlak te dekken. Laat de gerechten bij kamertemperatuur voor 30 s.
  2. Voeg langzaam 550 l van de verdunde interne standaardoplossing per schaal toe door het uiteinde van de pipet in de methanol te dompelen en meerdere keren voorzichtig op en neer te pipetteren.
  3. Zachtjes rots elke cultuur schotel heen en weer om het gehele oppervlak te dekken.
  4. Laat de gerechten bij kamertemperatuur voor 30 s.

6. filtratie van de cel extracten

  1. Breng de geëxtraheerde oplossing van elke kweek schotel over naar een aparte 1,5 mL micro centrifuge Tube.
  2. Centrifugeer de tubes bij 2.300 × g bij 4 °c gedurende 5 min.
  3. Breng 350 l van elke bovendrijvende over in twee centrifugale filtereenheden per monster.
    Opmerking: van elke kweekschaal wordt een totaal van 700 l van de geëxtraheerde oplossing in twee filter buizen (350 l/Tube) overgebracht.
  4. Centrifugeer de filter buizen bij 9.100 × g bij 4 °c voor ongeveer 2 h tot geen vloeistof in de filter koppen blijft.
  5. Verwijder de filter cups en sluit de deksels van de inzamelings buizen stevig af.

7. sample verdamping

  1. Bereid een centrifugale verdamper-typisch, dit bestaat uit een verdamper, een koude val, en een vacuümpomp.
  2. Plaats de inzamelings buizen in de centrifugale verdamper.
    Opmerking: laat de deksels van de buizen open.
  3. Verdampen de geëxtraheerde monster oplossingen onder vacuümomstandigheden bij kamertemperatuur.
    Nota: de typische configuraties voor het aantal omwentelingen en de druk zijn 1.500 t/min en 1.000 PA, respectievelijk, en het vergt gewoonlijk ongeveer 3 h om de steekproeven volledig te verdampen.
  4. Bevestig dat er geen vloeistof in een van de inzamelings buizen blijft en sluit de deksels van de buizen stevig af.
  5. Bewaar de collectie buizen in een ultra-lage temperatuur (− 80 °C) diepvriezer tot metabolomic analyse.

8. Metabolomic analyse door CE-MS

  1. Het filtraat in 50 l van ultrapuur water onmiddellijk vóór de analyse van CE-MS opnieuw op te schorten.
  2. Voer CE-MS analyse door methoden beschreven eerder12,13 met behulp van capillaire elektroforese systeem en time-of-Flight massaspectrometer systeem uitgerust met een isocratic pomp, een CE-MS adapter, en een CE-ESI-MS sproeier.
    Opmerking: beide systemen kunnen worden gecontroleerd door de software van het systeemleveranciers en zijn verbonden door een gesmolten silica capillaire (50 μm interne diameter × 80 cm totale lengte).
    1. Stel instrumenten en monster flacons, de voorbereiding van de capillaire met een capillaire cassette, vullen schede vloeistoffen en passende elektroforese buffers afhankelijk van anion of kationen analyse modus, en vervolgens van toepassing voltages.
      Opmerking: instrumentatie en analytische voorwaarden worden in detail beschreven elders12,13.
    2. Open de software en bereid een composities met data-acquisitie methoden en sample informatie.
    3. Start een test run en controleer de gegevens, zoals de signaalintensiteit en de piek vorm van de interne normen en de piek resolutie van andere standaardverbindingen.
    4. Verfijnen indien nodig de analytische condities.
    5. Injecteer de sample oplossingen op 50 mbar voor 3 s en een spanning van 30 kV.
      Opmerking: CE-MS werd uitgevoerd, hetzij in de positieve of negatieve Ion-modus. Stel de spectrometer in om het massa bereik m/z 50 – 1000 te scannen. De capillaire spanning werd vastgesteld op 4 kV; het debiet van stikstof gas (verwarmingstemperatuur 300 °C). Voor de positieve modus, de fragmentatie, skimmer en OCT RFV voltage werden vastgesteld op 75, 50 en 125 V, respectievelijk. Voor de negatieve Ion-modus, de fragmentatie, skimmer, en OCT RFV voltage werd ingesteld op 100, 50, en 200 V, respectievelijk.
  3. Analyseer spectrum gegevens.
    1. Haal pieken uit de massa spectrale gegevens met behulp van automatische integratie software om piek informatie, waaronder m/z, Peak Area, en de migratietijd (MT) te verkrijgen.
      Opmerking: de methode wordt in detail elders beschreven14.
    2. Sluit signaalpieken uit die overeenkomen met isotopomers, adduct ionen en andere product ionen van bekende metabolieten.
    3. Aantekeningen resterende pieken met informatie uit de HMT metaboliet database volgens m/z waarden en MTs.
    4. Normaliseren gebieden van de geannoteerde pieken aan interne standaard niveaus en aantallen cellen per monster.
    5. Evalueer de concentratie van elke metaboliet in de gekweekte cellen (pmol/106 cellen) met behulp van standaard bochten voorbereid voor elke metaboliet.
    6. Gebruik de gekwantificeerde metaboliet concentraties voor latere statistische analyses en biologische interpretaties14.

Representative Results

Aangezien de metaboliet concentraties in kankercellen (pmol/106 cellen) worden genormaliseerd tot het aantal levensvatbare cellen, moeten experimentele voorwaarden met zorg worden opgezet om de variatie in het aantal levensvatbare cellen tussen de omstandigheden te minimaliseren. Bijvoorbeeld, diamide behandeling was op een relatief hoge concentratie (250 μm), maar voor een korte tijd om alle cellen te laten groeien zo even mogelijk, waardoor egaliseren van het aantal levensvatbare cellen geanalyseerd. Onder deze experimentele omstandigheden, HCC827 en PC-9 cellen groeide even voor 3 h (Figuur 1). CE-MS analyse van diamide-behandelde cellen in vergelijking met PBS-behandeld (controle) cellen bleek 175 en 150 differentiële metabolieten in HCC827 en PC-9 cellen, respectievelijk. Onder deze, verschillende tussenproducten in de pentose fosfaat pad (PPP) en in de bovenste glycolyse waren significant hoger in de diamide-behandelde omstandigheden in beide cellen, terwijl een paar tricarbonzuur acid (TCA) cyclus tussenproducten lager waren in de behandelde voorwaarden (Figuur 2 en Figuur 3).

De PPP genereert vermindering van equivalenten in de vorm van verminderde Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH), die wordt gebruikt voor redox homeostase onderhoud en vetzuur biosynthese15. Na diamide behandeling, het niveau van gluconzuur zuur-een geoxideerde glucose-verhoogde 12-voudige in HCC827 cellen en 10-voudige in PC-9 cellen; Evenzo, na diamide behandeling, het niveau van glucose 6-fosfaat (G6P)-een phosphorylated glucose en de eerste hexokinase-gekatalyseren glycolyse product-ook toegenomen 6,3-en 3,5-voudige in HCC827 en PC-9 cellen, respectievelijk (Figuur 4). Bovendien, na diamide behandeling, de niveaus van 6-phosphogluconate (6PG)-de eerste intermediair in PPP-drastisch toegenomen 89-voudige in HCC827 cellen en 231-voudige in PC-9 cellen ten opzichte van de niveaus gezien in de PBS controles (Figuur 4). De niveaus van andere glycolytic tussenproducten, zoals fructose 6-fosfaat (F6P) en fructose 1,6-difosfaat (F1, 6P), zijn daarentegen niet veranderd in de diamide experimentele toestand (Figuur 4). Total Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP+) niveaus waren bijna gelijk tussen diamide behandeling en PBS controle voorwaarden (Figuur 4), wat suggereert dat glucose was voornamelijk catabolized via de PPP.

Figure 1
Figuur 1. Onveranderde cel nummers bij diamide behandeling. Celgroei reacties op 250 μm van diamide werden gemeten met behulp van trypaanblauw blauwe kleuring. De aantallen van de cel van (a) HCC827 en (B) PC-9 cellen die met PBS (blauw) worden behandeld of diamide (rood; 250 μm) voor 1 of 3 h worden getoond. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD (n = 6). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Representatieve MS pieken van metabolieten. Electropherograms geannoteerd als (a) gluconzuur zuur, (B) GLUCOSE 6-fosfaat (G6P), (C) 6-Phosphogluconate (6PG), en (D) Nicotinamide ADENINE dinucleotide fosfaat (NADP+) verkregen door CE-MS analyse. Elke lijn wijst op de cel lijn (vast lichaam, HCC827; gestippeld, PC-9) en behandeling (blauw, PBS; rood, diamide) gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Metaboloom profielen van intracellulaire metabolieten. Vouwen veranderingen van metabolieten in (a) HCC827 en (B) PC-9 cellen behandeld met diamide worden weergegeven als log2(diamide/PBS). In totaal, 175 en 150 metabolieten werden geannoteerde in HCC827 en PC-9 cellen, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. Up-regulering van PPP bij diamide behandeling. Intracellulaire concentraties (pmol/106 cellen) van de belangrijkste metabolieten die betrokken zijn bij glycolyse en de pentose fosfaat pathway (PPP) na behandeling met diamide worden getoond. Metabolieten werden geëxtraheerd uit HCC827 en PC-9 cellen behandeld met PBS (blauw) of diamide (rood, 250 μm) voor 30 min. representatieve metabolieten zoals gluconzuur zuur, glucose 6-fosfaat (G6P), fructose 6-fosfaat (F6P), 6 -phosphogluconate (6PG), en nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP+) worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie voor de voorbereiding van metabolieten van gekweekte kankercellen voor de CE-MS-based metabolomic analyse. Een van de meest kritieke punten in dit protocol is de juiste voorbereiding van kankercellen, omdat gemeten metaboliet concentraties zijn genormaliseerd tot het aantal levensvatbare cellen. Voor een nauwkeurige schatting van het aantal cellen is het noodzakelijk om ten minste één extra kweek schotel per experimentele groep voor te bereiden om het aantal levensvatbare cellen gelijktijdig te tellen met de extractie van metabolieten voor metabolomic analyse. Bovendien moet hetzelfde aantal cellen worden gezaaid in elk gerecht voor de herhalingen en in de schotel voor het tellen; in de toekomst zou dit worden geholpen door een snelle en stressor-vrij (bijv. trypsine-vrij) cel tellen protocol dat het mogelijk maakt dezelfde schotel te worden gebruikt voor zowel het tellen van levensvatbare cellen en het uitpakken van metabolieten. Zorg moet worden genomen tijdens de wasbeurten, zodat cellen niet los van het oppervlak van de gerechten. Ernstige chemo tests en andere experimenten die de hechting van cellen verminderen, kunnen niet geschikt zijn voor dit extractie protocol als gevolg van mogelijk verlies van cellen tijdens de wassen procedure.

Het is belangrijk om een 5% mannitol oplossing te gebruiken als de Wash buffer voor het uitpakken van metabolieten uit gekweekte cellen voor de CE-MS-based metabolomic analyse, omdat zout-gebaseerde buffers, zoals PBS, interfereren met metabolomic analyse en negatieve invloed op de meting.

Twee of drie gerechten kunnen worden gecombineerd als een enkel monster door individueel extractie van metabolieten van elk gerecht en vervolgens poolen monsters; echter, het combineren van meerdere gerechten vaak verhoogt residuele mannitol in de geëxtraheerde metaboliet oplossing. Dit kan ook interfereren met metabolomic analyse door CE-MS. Vandaar, is het raadzaam om geen gebruik maken van meerdere gerechten of putten als een enkel monster.

Deze metabolomic analysemethode met behulp van CE-MS is ontwikkeld voor een uitgebreide meting van geladen moleculen met molecuulgewichten tussen 50 en 1000 da; zo is dit protocol geoptimaliseerd voor extractie van waterige, lage molecuulgewicht verbindingen. Daarom is dit protocol niet geschikt voor het uitpakken van hydrofobe metabolieten zoals lipiden of macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren. Aangezien er een stijgende vraag naar uitgebreide lipide analyses of lipidomics van gekweekte cel steekproeven is, is de ontwikkeling van een gemakkelijk en efficiënt protocol voor gelijktijdige extractie van zowel hydrofiele als hydrofobe metabolieten nodig.

De eerste stap van de metaboliet extractie-opzuigen medium en wassen cellen met mannitol-moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om veranderingen in het metabolische Profiel van de cellen te minimaliseren. De behandeling van cellen met methanol na het wassen met mannitol wordt verondersteld om proteïnen te denatureren en daardoor enzymen te verhinderen verdere metabolische reacties te katalyseren. Echter, zelfs na methanol behandeling, niet-enzymatische chemische reacties-zoals redox reacties, sommige decarboxylatie processen, en thiol verbanden-kan plaatsvinden. Als zodanig moeten alle concentraties van metabolieten die bij deze reacties worden gemeten, met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. In tegenstelling tot het genoom of transcriptoom, bestaat de Metaboloom uit moleculen met een grote variëteit aan chemische eigenschappen; Daarom kan geen enkel protocol extract alle metabolieten zonder verlies of verstoring. Voor nauwkeurigere metingen van dergelijke zeer reactieve metabolieten moet een protocol worden geraadpleegd dat specifiek is ontworpen voor het uitpakken van bepaalde groepen metabolieten, waarvoor fractionering en derivatizations vereist zijn. Het protocol hier gepresenteerd, echter, beschrijft een eenvoudige en snelle extractie van waterige metabolieten uit gekweekte cel monsters voor metabolomic analyse door CE-MS. In deze paper konden we niet beschrijven hoe het opzetten van CE-MS in detail, omdat de focus van het huidige manuscript is anders, echter, het beschrijven van gedetailleerde stappen om het opzetten van CE-MS kan een aparte dedicated artikel vereisen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken alle leden van het Shonai Regional Industry Promotion Center voor hun hulp. Dit werk werd deels ondersteund door onderzoekfondsen van Yamagata Prefecture en Tsuruoka City, door het National Cancer Center onderzoek en ontwikkeling Fonds [Grant Number 28-A-9], en door de Japan Society voor de bevordering van de wetenschap (JSPS) KAKENHI [Grant Number 17K07189] aan HM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated cell counter Thermo Scientific AMQAX1000 Countess II automated cell counter
Automatic integration software Agilent Technologies MassHunter G3335-60041 version B.02.00
CE system Agilent Technologies Agilent 7100 CE system
CE/MS adapter kit Agilent Technologies G1603A
CE-ESI-MS Sprayer kit Agilent Technologies G1607A
Cell counting chamber slide Thermo Scientific C10282 Countess cell counting chamber slides
Centrifugal filter device, 5 kDa Human Metabolome Technologies ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml Thermo Scientific N339651
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml Thermo Scientific N339653
Costar stripette, 10 ml Corning 4488
Costar stripette, 5 ml Corning 4487
D(-)-Mannitol Wako 133-00845 500 g
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
Electrophoresis buffer Human Metabolome Technologies H3301-1001 for cation analysis
Electrophoresis buffer Human Metabolome Technologies H3302-1021 for anion analysis
Fetal bovine serum Biowest S1780
Filter tip, 1000 μl Watson 124P-1000S
Filter tip, 20 μl Watson 124P-20S
Filter tip, 200 μl Watson 1252-703CS
Fused silica capillary Polymicro Technologies TSP050375 50 μm i.d. × 80 cm total length
HCC827 American Type Culture Collection CRL-2868
Internal standard solution Human Metabolome Technologies H3304-1002
Isocratic pump Agilent Technologies Agilent 1100 Series Isocratic Pump
Methanol Wako 138-14521 1 L, LC/MS grade
Microtube, 1.5 ml Watson 131-415C
Operating Software Agilent Technologies ChemStation G2201AA version B.03.01 for CE
PC-9 RIKEN Bio Resource Center RCB4455
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R8758-500ML
Sterile tissue culture dish, 100 mm Corning 430167
Time-of-flight mass spectrometer Agilent Technologies Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Scientific T10282
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-100ML
Ultrapure water Merck Milli-Q water 18.2 MΩ·cm pure water
Volumetric flask, 50 ml Iwaki 5640FK50E TE-32

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).
  2. Soga, T. Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming. Cancer Science. 104, (3), 275-281 (2013).
  3. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and Cancer. Molecular Cell. 61, (5), 667-676 (2016).
  4. Fukuda, H., et al. Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection. European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7, (7), 294-297 (1982).
  5. Miles, K. A., Williams, R. E. Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism. Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).
  6. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  7. Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes. Science. 330, (6009), 1340-1344 (2010).
  8. Makinoshima, H., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 289, (30), 20813-20823 (2014).
  9. Makinoshima, H., et al. Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 290, (28), 17495-17504 (2015).
  10. Makinoshima, H., et al. Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma. Cancer Research. 78, (9), 2179-2190 (2018).
  11. Sato, Y., et al. Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1129 (2018).
  12. Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Molecular BioSystems. 4, (2), 135-147 (2008).
  13. Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Molecular BioSystems. 7, (4), 1217-1223 (2011).
  14. Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6, (1), 78-95 (2010).
  15. Patra, K. C., Hay, N. The pentose phosphate pathway and cancer. Trends in Biochemical Sciences. 39, (8), 347-354 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics