外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

Biochemistry

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Summary

ここで、シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーの単離およびエキソプロテオームの単離に関するプロトコルが記載されている。両方の手順は、さらなる分析または用途に使用できる高純度のポリマーまたはタンパク質を得るための重要なステップを具体化します。それらはまた特定のユーザーの必要性に従って容易に合わせることができる。

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Flores, C., Tamagnini, P. Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins. J. Vis. Exp. (147), e59590, doi:10.3791/59590 (2019).

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Abstract

シアノバクテリアは、ヘテロ多糖やタンパク質などの細胞外環境に幅広い生体分子を積極的に分泌することができます。これらの生体分子の同定と特徴付けは、それらの分泌経路に関する知識を改善し、それらを操作するのに役立ちます。さらに、これらの生体分子のいくつかは、バイオテクノロジーの応用の面でも興味深い。ここで説明するシアノバクテリア放出炭水化物ポリマーおよびタンパク質の容易かつ迅速な単離のための2つのプロトコルがある。放出された炭水化物ポリマーの単離方法は、有機溶媒を用いた水溶液中の多糖類の従来の沈殿技術に基づいている。この方法は、ポリマーの特性を保持し、同時に細胞破片および培養培地からの汚染物質の存在を回避する。プロセスの終わりに、凍結乾燥ポリマーは、使用または特徴付けされる準備ができているか、または最終意図された使用に応じて、更なる精製のラウンドを受けることができる。シアノバクテリアエキソプロテオームの単離に関して、この技術は遠心分離および濾過による主要な汚染物質の除去後の無細胞培地の濃度に基づいている。この戦略は、膜トランスポーターまたは外膜小胞を介して細胞外のmilieuに達するタンパク質の信頼性の高い単離を可能にします。これらのタンパク質は、その後、標準的な質量分析技術を使用して同定することができる。ここで提示されるプロトコルは、幅広いシアノバクテリアだけでなく、他の細菌株にも適用することができる。さらに、これらの手順は、製品の最終使用、必要な純度、および細菌株に応じて容易に調整することができます。

Introduction

シアノバクテリアは、有望なバイオテクノロジー/バイオメディカルアプリケーションを持つ天然物の多産源として広く認識されています。そのため、シアノバクテリアの分泌機構を理解し、抽出・回収方法の最適化を行うには、効率的な微生物細胞工場としてシアノバクテリアを実装することが不可欠です。

多くのシアノバクテリア株は、細胞外高分子物質(EPS)を産生することができ、主にヘテロ多糖類によって形成され、細胞表面に関連したままであるか、または培地1に放出される。これらの放出された炭水化物ポリマーは、他の細菌のものと比較して特徴があり、幅広い用途(例えば、抗ウイルス剤2、免疫刺激3、抗酸化4、抗酸化剤)に適しています。金属キレート5、乳化6、および薬物送達剤7、8)。これらのポリマーの単離のための方法論は、主に収率の向上に寄与するだけでなく、得られたポリマーの純度および特定の物理的特性の増加に寄与する9.ポリマーの単離のためのこれらの方法の大半は、ポリマーの強いアニオン性質9、10のために容易に達成される培養培地からの降水戦略に依存する。さらに、沈殿工程で使用される溶媒の除去は、蒸発および/または凍結乾燥によって迅速に達成することができる。予見された用途に応じて、トリクロロ酢酸(TCA)処理、濾過、またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を含む最終製品を調整するために、ポリマー沈殿後または前に異なるステップを結合することができます。列浄化10.

シアノバクテリアはまた、膜トランスポーター(古典的)11または小胞(非古典的)12に媒介される経路を介してタンパク質の広い範囲を分泌することができる。したがって、シアノバクテリアエキソプロテオームの分析は、シアノバクテリアタンパク質分泌機構を理解/操作し、これらのタンパク質の特異的な細胞外機能を理解するために不可欠なツールを構成する。分泌タンパク質の豊富さは比較的低いので、エキソプロテオームの信頼性の高い単離および分析は、細胞外milieuの濃度を必要とする。加えて、他の物理的または化学的ステップ(例えば、遠心分離、濾過、またはタンパク質沈殿)は、得られるエキソプロテオームの品質を最適化し、タンパク質含有量13を濃縮し、汚染物質の存在を回避し得る(例えば、顔料、炭水化物など)14歳,15またはサンプル中の細胞内タンパク質の優位性。しかし、これらのステップの一部は、検出可能なタンパク質のセットを制限し、偏った分析につながる可能性があります。

本研究では、シアノバクテリア培養培地から放出された炭水化物ポリマーとエキソプロテオームを単離するための効率的なプロトコルについて説明する。これらのプロトコルは、ここで説明する基本的な手順を維持しながら、研究の特定の目的とユーザーのニーズに簡単に適応できます。

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Protocol

1. シアノバクテリア放出炭水化物ポリマー分離

  1. ポリマーの単離と汚染物質の除去
    1. 標準的な条件下でシアノバクテリア株を栽培する[例えば、12h光の下で30°C(50 μE m-2s -1)/12 h暗いレジメン、150 rpmで軌道揺さぶりで]。標準プロトコル(例えば、730nm(OD730nm)の光学密度、クロロフィルa、乾燥重量等を用いて増殖を測定し、フェノール硫酸法16に従って放出された多糖類の産生測定する。
    2. 培養物を透析膜(分子量遮断の12~14kDa)に移し、連続撹拌で24時間の脱イオン水の最低10体に対して透析する。
      注:透析および培地組成物に培養する培養量によっては、透析水を変更する必要がある場合がある。
    3. 4°Cで15分間15,000 x gで培養を遠心分離します。上清を新しいバイアルに移し、ペレット(細胞)を捨てる。
    4. 4°Cで15分間20,000 x gで再度遠心分離機を使用し、細胞壁の破片やリポ多糖類(LPS)などの汚染物質を除去します。
    5. 上清をガラスビーカーに移し、ペレットを捨てます。
  2. ポリマーの沈殿
    1. 上清に96%エタノールの2巻を加えます。
    2. 懸濁液を4°C、少なくとも一晩でインキュベートする。
    3. ポリマー回収
      1. 沈殿したポリマーの小さいまたは目に見えない量のために:4°Cで25分間13,000 x gで懸濁液を遠心分離する。上清を捨て、1 mLまたは2mLのオートクレーブド脱イオン水でペレットを再懸濁する。水性懸濁液をバイアルに移します。
        注意:上清は簡単に再懸濁してしまう可能性がありますので、優しく廃棄する必要があります。
      2. 可視/大量の沈殿ポリマーの場合:シ菌金属鉗子を使用して沈殿したポリマーをバイアルに集める。ポリマーを絞り、余分なエタノールを捨てます。
    4. 任意:必要なポリマー精製の程度に応じて、脱イオン水中のポリマーを再懸濁した後、96%エタノールで沈殿工程を繰り返す。
  3. ポリマーの凍結乾燥
    1. 沈殿したポリマーとバイアルを-80 °C、少なくとも一晩保管してください。
    2. 少なくとも48時間のポリマーを凍結乾燥(凍結乾燥)する(凍結乾燥前に懸濁液を解凍させないようにする)。
    3. 乾燥ポリマーを室温(RT)で保存し、さらに使用します。
      注:ポリマーをデシケータに保存すると、時間の経過とともに水を吸収できるため、保存することをお勧めします。

2. シアノバクテリアエキソプロテオーム分離

  1. 中濃度
    1. 標準的な条件下でシアノバクテリアを培養する[例えば、12h光の下で30°C(50 μE m-2s -1)/12 h暗いレジメン、150 rpmで軌道揺さぶりで]。標準的な手順(例えば、OD730nm、クロロフィルa、乾燥重量など)を使用してチアノバクテリウム増殖を監視する。
    2. RTで10分間、4,000 x gで培養物を遠心分離します。
    3. 上清をフラスコに移し、細胞ペレットを捨てます。
    4. 0.2 μmの細孔サイズフィルターを通してデカントされた媒体をろ過する。
      注:培地が4°Cに保たれている場合、プロトコルはここで短時間一時停止することができます。
    5. 約500倍(濾過媒体の初期体積を考慮)、公称分子量カットオフ3kDaの遠心コンセントレータを用いて濃縮する。遠心分離は15°Cで4,000 x g(最大1時間/遠心分離ラウンド)で作動する必要があります。
      注意:コンセントレータブランドの大半では、フィルタデバイスを使用前に超純水で遠心分離してすすいでください。フィルターが濡れたら乾かさないようにしてください。デバイスが使用されていない場合は、十分な流体をリザーバに残します。
      注:遠心分離温度を4°Cに下げることは、タンパク質活性を研究することを目的としている場合に役立ちますが、サンプル濃度に必要な時間が増加します。培地が4°Cに保たれている場合、プロトコルは遠心分離ステップ間を短時間休止することができます。
    6. 濃縮サンプルでフィルターデバイスサンプルリザーバの壁をすすいで、内容物をマイクロ遠心管に移します。
    7. オートクレーブ培養培地を用いたフィルターデバイスサンプルリザーバの追加洗浄工程を実行し、最大のエキソプロテオーム回収を確保する。
      注: 回復の割合を定量化するには、特定の製造元の指示に従ってください。
    8. エキソプロテオームサンプルは、さらに使用するまで-20 °Cで保存します。
      注:プロテアーゼ阻害剤の添加は、長期保存のために推奨されます。
  2. エキソプロテオームの分析
    1. メーカーの指示に従って96ウェルプレートでBCAタンパク質アッセイによるタンパク質含有量を定量します。
    2. ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動ナトリウム(SDS-PAGE)によってタンパク質を分離し、標準的な染色プロトコル(例えば、クーマシーブルー、銀染色)を使用します。
    3. 目的のバンド/ゲル領域を切り取り、超純水の適切な量を含む異なるマイクロ遠心管でそれらを収集します。
    4. 質量分析によるタンパク質の同定と分析を進めます。

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Representative Results

シアノバクテリア培養物から放出された炭水化物ポリマーを抽出するために記載された方法の概略表現が図1に示されている。中等度のEPS生産者シアノバクテリウムシネコシスティススティスsp.PCC 6803および効率的なEPS生産者シアノテスsp. CCY 0110からの沈殿ポリマーは、図2に示されている。図3では、汚染度の異なる凍結乾燥ポリマーを示し、最終製品の純度に対する遠心分離ステップの重要性を強調する。図4は、シアノバクテリアエキソプロテオームの単離方法を図示する。明確な無細胞培地濃縮サンプル(すなわち、異なる成長相の培養物および低いカロテノイド産生を有するシアノバクテリア株から得られる)を図5に示す。2つの形態的に異なるシアノバクテリア株からのエキソプロテオームサンプル、単細胞シアノバクテリアシネコシスティスsp.PCC 6803および糸状シアノバクテリアアナバエナsp.PCC 7120、SDS-PAGEで区切られた図 6.

Figure 1
図 1: の分離のためのワークフローシアノバクテリアは炭水化物ポリマーを放出した。シアノバクテリア培養から始まり、汚染物質の除去を開始し、ポリマー単離および凍結乾燥で終わる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 沈殿後のシアノバクテリアポリマー。(A)中等度のEPS生産者シネコシスティスsp.PCC 6803からのポリマーは、降水および遠心分離(矢印)後の遠心フラスコの壁に付随する。(B)効率的なEPS生産者シアノテスsp.CCY 0110からのポリマー塊は、降水後にガラスビーカーに浮遊する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 凍結乾燥シアノバクテリアポリマー。(A) シネコシスティスsp. PCC 6803から単離されたポリマーの3つの独立したバッチ:目に見える汚染(AI)なし、およびカロテノイド(AII)または細胞破片(AIII)による汚染の色素沈着を示す色素沈着を伴う.(B)シアノテスsp.CCY 0110由来の凍結乾燥ポリマー。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: ワークフローシアノバクテリアエキソプロテオーム分離。シアノバクテリア培養から中程度の分離および濃度まで、エキソプロテオーム分析で終わる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 濃縮無細胞培地サンプルを含むマイクロ遠心管。(A)シネコシスティスsp.PCC 6803野生型から濃縮された培地試料を、異なるOD 730nm(0.5、1、および2)で採取した。(B)シネコシスティスから濃縮培地試料は、カロテノイド産生15を損なった変異体である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6:シアノバクテリア無細胞濃縮培地に蓄積されたタンパク質を示すクマシーブルー染色SDS-PAGEゲル。(A)単細胞シアノバクテリアシネコシスティススティスsp.PCC 6803野生型および+sigF変異体からのエキソプロテオーム。(B)シネコシスティスからエキソプロテオームは、高レベルの多糖類で汚染されたsigFである。(C)糸状チアノバクテリウム・アナバエナsp.PCC 7120からのエキソプロテオーム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

細菌分泌機構をよりよく理解し、放出された製品を研究するためには、細胞外細菌環境に存在する生体分子の効率的な単離と分析を実証することが極めて重要です(放出など)炭水化物ポリマーおよびタンパク質)。

シアノバクテリア細胞外炭水化物ポリマーは、主にその組成1を構成する異なる単糖類の数および割合に起因する非常に複雑である。これらの高分子物質の単離に用いられる従来の方法は、これらの糖分が豊富な物質が水溶液に可溶性であり、有機溶媒(アセトンやエタノールなど)の添加によって沈殿できるという単純な概念に依存している9 、17、18.これは、ポリマーの水和シェルからの水分子の抽出に起因し、プロセスの効率は、ポリマーの分子量(より高い分子量の分画でより効率的)、化学構造、および濃度9,18.降水ステップに加えて、ここで説明する方法は、透析および遠心分離の重要なステップを含む。透析は、塩やその他の化合物を効率的に除去し、凍結乾燥後に粉末状の構造として現れる可能性があり、遠心分離ステップは主要な汚染物質や細胞破片を除去します。

これらのステップ中の故障は、絶縁バッチに応じて、高い汚染レベルと異なる特性を有するポリマーにつながる可能性があります。一部の汚染は、ポリマー色素沈着(通常は白色または薄茶色)を変化するので、ポリマー凍結乾燥後にマクロ的に容易に検出することができる。例えば、緑色またはオレンジ色の凍結乾燥ポリマーは、一般に細胞破片/クロロフィルまたはカロテノイドで高く汚染されている。これは、遠心分離ステップの不十分な時間またはg力に関連しています。しかしながら、一部のシアノバクテリア株は、ポリマーに自然に関連したままの色素および分泌タンパク質を放出することができ、これは最終製品19を分析する際に考慮する必要がある。ポリマーをさらに精製するための追加のステップ(例えば、TCA治療)10.それにもかかわらず、これらの精製工程は、タンパク質やその他の成分を除去するとポリマー特性(例えば、粘度、疎水性など)を変化させる可能性があるため、最終製品に悪影響を及ぼす可能性があります。1,20.沈殿/凍結乾燥のステップを繰り返しても、主にその物理化学的特性を容易に修飾する凍結解凍サイクルに起因するポリマーに悪影響を及ぼす可能性があります21。ポリマー収率を向上させるために、加熱処理は、沈殿前に培養物全体に適用することができる。この余分なステップは、細胞表面に関連するポリマーを放出するが、脱重合18、20にもつながる可能性がある。要約すると、プロトコルの選択は、単離されたポリマー9、20の量と品質の両方に影響を与ることに注意することが重要です。

細胞外のmilieuで同定されたシアノバクテリアタンパク質に関しては、分子量および等電点の広い範囲を表示し、可溶性または膜関連のいずれかでありうる。この物理化学的特性の多様性は、エキソプロテオーム単離に最も適した方法の選択に関する問題を表す。ここで提示される方法は、細胞外のmilieuにおける生体分子の濃度に大きく依存する。この方法は、培地に分泌されるタンパク質だけでなく、外膜小胞(OMV)に存在し、細胞リシスに由来するタンパク質も単離します。したがって、遠心分離ステップは、細胞の破壊を避けるために穏やかに実行する必要がありますが、同時にOMVを収集する必要があります。効率的なOMV生産者であるシアノバクテリア株では、エキソプロテオーム製剤は、通常、これらの脂質構造に関連するカロテノイドの存在に起因するオレンジ色である14,15。しかし、この特徴は、シアノバクテリア株および増殖相に応じて大きく異なる。OMVによるタンパク質の寄与を評価するためには、超遠心分離ステップを手順22に追加する必要があります。さらに、細胞リシスによる細胞外空間に到達するタンパク質は、異なる成長段階でサンプルを収集し、反復回数を増やすことによって検出され得る。

前述のように、多くのシアノバクテリア株は細胞外炭水化物ポリマー(EPS)を産生するので、エキソプロテオーム製剤はまた、その組成にEPSを有し得る。濾過ステップは、より複雑で大きなEPSを保持する必要がありますが、より単純なEPS分画は最終的に通過する可能性があります。その結果、大量の炭水化物による汚染は、エキソプロテオーム分析を妨げる可能性があります。例えば、この汚染は、ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質分離の遅延を引き起こす可能性があり、また、より少ないタンパク質をマスクする。細胞外培地に存在する汚染された生体分子を除去することを目的としたエキソプロテオーム単離に対する代替プロトコルが提案されているが、それらは非常に選択的であることが示されており、偏ったエキソプロテオームプロファイル13につながる可能性がある。一方、一定量のタンパク質がフィルターに詰まっている場合、より複雑なEPS画分に捕らえられる可能性があります。この場合、異なる成長相/実験条件からのエキソプロテオーム製剤の分析およびEPS画分におけるタンパク質の分析は、閉じ込められたタンパク質の同定に役立つ可能性がある。

全体として、ここで説明するプロトコルは、シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーおよびエキソプロテオームの効率的な単離のための重要なステップを具体化する。最も重要なことは、それらは容易に特定のユーザーの必要性に従って調整することができ、他の細菌株を含むことができる。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

この作品は、コンペ2020-競争力と国際化のためのオペラプログラム(POCI)、ポルトガル2020、FCTを通じてポルトガルのファンドによって資金提供されたフンド・ヨーロッパ・デ・デセンボルヴィメント地域(FEDER)ファンドによって資金提供されました - フンダサン・パラ・シエンシアeテクノロジア/ミニステリオ・ダ・シエンシア、テクノロジア・エ・エンシノ・スーペリアは、プロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-028779および助成金SFRH/BD/99715/2014(CF)の枠組みの中でスーペリア。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dialysis membranes Medicell Membranes Ltd  DTV.12000.07 Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll 
Ethanol 96% AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. 4.000.02.02.00 Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μm Fisher Scientific, Lda 15206869 Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K Merck Millipore Ltd. UFC900324 Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Fisher Scientific, Lda 10741395 Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate  Sigma Aldrich Química SL B2025-1EA Coomassie blue 

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References

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