التعبير وتنقيه الأكسجين خاليه من النيوداز الزبال بروتوكاتيتشواتي 3 ، 4-ديوكسيجيناسي

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

بروتوكاتيتشواتي 3, 4-ديوكسيجيناسي (PCD) يمكن انزيمي أزاله الأكسجين ثنائي الذرة الحرة من نظام مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA). يصف هذا البروتوكول التعبير ، وتنقيه ، وتحليل النشاط لهذا الانزيم الكسح الأوكسجين.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويستخدم المجهر جزيء واحد (SM) في دراسة التفاعلات الجزيئية الديناميكية من فلوكوفيري المسمية الجزيئات الحيوية في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، فان الفلوروبيورس عرضه لفقدان الاشاره عن طريق الرشح بواسطة الأكسجين المذاب (O2). لمنع الارتشاح الضوئي وأطاله عمر الفلوفيبيوم ، يتم استخدام أنظمه المسح بالأكسجين (OSS) لتقليل O2. وقد تكون البرمجيات المتاحة تجاريا ملوثه بالأحماض النووية التي تلحق ضررا أو تحللا ، وتفسر النتائج التجريبية تفسيرا محيرا. هنا نقوم بالتفصيل بروتوكول للتعبير وتنقيه الزائفة النشطة للغاية putida بروتوكاتيتشواتي-3 ، ديوكسيجيناسي (PCD) مع عدم وجود تلوث النواز قابل للكشف. يمكن PCD أزاله بكفاءة O2 الأنواع التفاعلية عن طريق تحويل الركيزة حمض بروتوكاتيتشويك (PCA) إلى 3-كربوكسي كومنولث الدول المستقلة ، وحمض كومنولث الدول المستقلة-muconic. ويمكن استخدام هذا الأسلوب في اي نظام مائي حيث O2 يلعب دورا ضارا في الحصول علي البيانات. هذا الأسلوب هو فعال في إنتاج النشطة للغاية ، النواز الحرة PCD بالمقارنة مع PCD المتاحة تجاريا.

Introduction

جزيء واحد (SM) الفيزياء الحيوية هو حقل ينمو بسرعة تغيير الطريقة التي ننظر فيها إلى الظواهر البيولوجية. هذا المجال لديه القدرة الفريدة لربط القوانين الاساسيه للفيزياء والكيمياء إلى علم الاحياء. المجهر الفلوري هو الطريقة البيوفيزيائية واحده التي يمكن ان تحقق حساسية SM. يستخدم الفلوري للكشف عن الجزيئات الحيوية عن طريق ربطها بالفلور العضوية الصغيرة أو النقاط الكمية1. هذه الجزيئات يمكن ان تنبعث منها الفوتونات عندما متحمس باشعه الليزر قبل التسرب الضوئي لا رجعه فيه2. يحدث الرشح الضوئي عندما تخضع الملصقات الفلورية للضرر الكيميائي الذي يدمر قدرتها علي الاثاره عند الموجه الموجية المطلوبة2،3. وجود أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في العازلة المائية هي السبب الرئيسي لتسرب الصور2،4. بالاضافه إلى ذلك ، روس يمكن ان تتلف الجزيئات الحيوية ويؤدي إلى ملاحظات خاطئه في التجارب SM5،6. لمنع الضرر التاكسدي ، ويمكن استخدام أنظمه المسح الأوكسجين (OSS)3،7،8. نظام اكسيداز الجلوكوز/catalase (GODCAT) هو فعال في أزاله الأكسجين8، ولكنه ينتج الأكاسيد الفوقية الضارة المحتملة كوسيطه. قد تكون هذه الاضرار إلى الجزيئات الحيوية للاهتمام في دراسات SM.

بدلا من ذلك ، بروتوكاتيتشواتي 3, 4 ديوكسيجيناسي (PCD) سوف يزيل بكفاءة O2 من محلول مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA)7,9. PCD هو الانزيم الفلزي الذي يستخدم الحديد اللاهيمي لتنسيق PCA وتحفيز حلقه الكاتهول رد فعل الافتتاح باستخدام المذاب O210. ويظهر هذا التفاعل خطوه واحده ليكون أفضل OSS عموما لتحسين الاستقرار فلوكوفيري في تجارب SM7. لسوء الحظ ، تحتوي العديد من الانزيمات OSS المتاحة تجاريا ، بما في ذلك PCD ، تلوث النوكليميس11. ويمكن ان تؤدي هذه الملوثات إلى تلف الركائز المستندة إلى الأحماض النووية المستخدمة في تجارب SM. سيوضح هذا العمل بروتوكول تنقيه يستند إلى الفصل اللوني لاستخدام PCD المؤتلف في أنظمه SM. يمكن تطبيق PCD علي نطاق واسع علي اي تجربه حيث تتلف الركائز اللازمة للحصول علي البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحث علي التعبير PCD في e. كولاي

  1. الجمع بين 1 μl pVP91A pcahg PCD التعبير البلازميد (20 نانوغرام/μl ، الشكل 1ا) و 20 μl من e. القولونية BL21 (20 μl الخلايا المتاحة تجاريا ، > 2 × 106 كفو/ميكروغرام البلازميد) في أنبوب. نفض الغبار الأنبوب لخلط. وضع الأنبوب علي الجليد 5 دقيقه.
  2. مكان التحول في 42 درجه مئوية لمده 30 ثانيه. ثم الجليد 2 دقيقه.
  3. أضافه 80 μL SOC وسائل الاعلام (مرق الأمثل مع القمع هدم: 2.5 mM KCl ، 10 مم كلوريد الصوديوم ، 2 ٪ التريتون ، 0.5 ٪ استخراج الخميرة ، 10 ملم MgSO4، 10 مم mgcl2، 20 ملم الجلوكوز). يهز في 225 الثورات في الدقيقة (دوره في الدقيقة) 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
  4. لوحه رد فعل التحول علي رطل الأمبير أجار (1L المرق لوريا أجار: 10 غرام كلوريد الصوديوم ، 10 غرام باكالي-التريتون ، 5 غرام استخراج الخميرة ، 15 ز أجار ، 50 ميكروغرام/مل ampicillin ؛ 25 مل لكل 10 سم قطرها طبق بتري).
  5. احتضان لوحه ، وغطاء التي تواجهها ، في 37 درجه مئوية ل 16-18 h.
  6. تطعيم 50 mL LB الأمبير (1L LB: 10 غرام bacto-تريتوني ، 10 غرام كلوريد الصوديوم ، 5 غرام استخراج الخميرة ، 50 ميكروغرام/مل ampicillin) في قارورة 250 mL Erlenmeyer مع مستعمره واحده. احتضان في 37 درجه مئوية ل 16-18 h تهتز في 225 دوره في الدقيقة.
  7. نقل الثقافة 20 مل إلى قارورة 4 لتر مع 1 L LB الأمبير. يهز في 225 لفه في الدقيقة في 37 درجه مئوية.
  8. كل h قياس الثقافة OD600 (الكثافة البصرية في 600 nm). كما الثقافة OD600 يقترب 0.5 ، زيادة وتيره القياسات إلى كل 15 دقيقه. الكثافة المطلوبة من الثقافة هو 0.5 OD600.
  9. نقل قارورة 4L إلى سله من الثلج. دوامه القارورة في حمام الجليد للحد من درجه حرارة الثقافة.
    ملاحظه: يجب ان يبقي الوقت علي الجليد إلى الحد الأدنى بحيث تبقي الخلايا نشطه أيضي. من الناحية المثالية ستكون الخلايا علي الجليد اقل من 10 دقيقه.
  10. ويمكن ملاحظه الحث الناجح لل PCD عن طريق تحليل الصوديوم دوديسيل كبريتات بولياكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE). حصاد 1 مل من الثقافة غير المستحثة في أنبوب. تدور عينه 1 دقيقه في 14,000 x ز في الطارد المجهري في درجه الحرارة المحيطة. كنت الخارقة.
    1. Solubilize الخلايا التي تغلف في 150 μL تلفزيوني (الفوسفات مخزنه المالحة).
    2. أضافه حجم متساو من صبغ 2X التحميل (1.2 ٪ SDS ، 30 ٪ الجلسرين ، 150 mM تريس-HCl ، pH 6.8 ، 0.0018 ٪ بروموفينول الأزرق ، 15 ٪ β-mercaptoethanol). دوامه العينة لخلط جيدا.
    3. تغلي العينة لمده 3 دقائق ونقلها إلى الجليد. يمكن تخزين العينة في الفريزر-20 درجه مئوية للتحليل في المستقبل.
      ملاحظه: الخدمات التلفزيونية متاحه تجاريا مع أو بدون CaCl2 و mgcl2. سيكون العديد من المختبرات التلفزيونية دون CaCl2 و mgcl2 لأساليب ثقافة الخلية. لقد وجدنا اي فرق مع تلفزيوني مع أو بدون CaCl2 و mgcl2.
  11. نقل قارورة 4 لتر إلى حاضنه في 17 درجه مئوية مع 180 لفه في الدقيقة تهتز. الاستمرار في مراقبه OD600 كل 20 دقيقه.
  12. في 0.7 OD600 أضافه ايزوبروبيل-بيتا-د-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (iptg) إلى 0.5 mM التركيز النهائي (0.25 M الحل الأسهم) و 10 ملغ/لتر حديد الأمونيوم (II) كبريتات هيدرات (Fe (NH4)2(حتى4)2, 10 مغ/مل الأسهم الحل). يتم المستحثة الجينات PCD Pcah و pcag من المروج T5 باضافه iptg (الشكل 1ا). كبريتات الحديد ملزمه بواسطة PCD والمطلوبة للنشاط الحفاز عن طريق تنسيق الأكسجين خلال افتتاح الكاتهول.
  13. يهز الثقافة في 180 دوره في الدقيقة في 17 درجه مئوية لمده 18 ساعة.
  14. وضع قارورة الثقافة في الجليد كما في 1.2. حصاد 1 مل من الخلايا المستحثة ل SDS-PAGE كما في 1.3.
  15. صب الثقافة البكتيرية علي الزجاجات المناسبة لطرد. وقد طرد 1 L الثقافة في زجاجات أسفل مخروطيه 4 250 mL. بيليه الثقافة في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه في 3000 x ز. Decant السوبر النمل. تخلص من النفايات السائلة البكتيرية بشكل مناسب.
  16. Pipet لأعاده تعليق الكريات في 25 مل الباردة التلفزيونية (CaCl2 و mgcl2 اختياريه) لكل ثقافة 1 L.
  17. نقل أعاده التعليق إلى 50 mL أنابيب مخروطيه (1 50 mL أنبوب لكل 1 L الثقافة). بيليه الخلايا في 3000 x ز لمده 20 دقيقه في 4 ° c. التخلص من ماده طافي والتصرف بشكل مناسب.
  18. أعاده التعليق الخلايا في 10 مل من تحلل العازلة (300 mM كلوريد الصوديوم ، 50 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ، 20 مم ايميدازول ، 10 ٪ الجلسرين ، 800 ng/mL بيبستاتين ، 1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين ، و 87.1 ميكروغرام/مل من فلوريد فينيلميثيل السلفونيل (PMSF)) عن طريق التنضيد. تجميد أعاده التعليق مع النيتروجين السائل في قارورة ديوار. تخزين أنابيب عينه في 80 درجه مئوية الفريزر. قمنا بتنقية PCD من الكريات المخزنة في-80 درجه مئوية لمده سنه واحده مع عدم فقدان واضح للنشاط.
  19. قارن بين الخلايا غير المستحثة والمستحثة من قبل صفحه SDS.
    ملاحظه: لم يكن لدينا اي صعوبة مع التعريفي من PCD متغاير. ومع ذلك ، نوصي باختبار الحث قبل المتابعة مع التنقية في حاله انتهاء صلاحيه اي كاشف بشكل غير متوقع.
    1. تجميع لوحات ل SDS-الصفحة (الابعاد: 7.3 سم × 8.3 سم × 0.75 مم سميكه). جل التراص هو 1.5 مل 6 ٪ بولياكرياميد (6 ٪ اكريلاميد ، 125 mM تريس-HCl ، pH 6.8 ، 0.1 ٪ SDS ، 0.1 ٪ persulfate الأمونيوم ، 0.001 ٪ TEMED). هلام حل هو 3.5 مل 12 ٪ بولياكرياميد (12 ٪ اكريلاميد ، 375 mM تريس-HCl ، pH 8.8 ، 0.1 ٪ SDS ، 0.1 ٪ persulfate الأمونيوم ، 0.001 ٪ TEMED). ادراج مشط جيد 10 إلى طبقه التراص.
    2. تحميل 10 μL من العينات البكتيرية غير المستحثة والمستحثة. تحميل 4 μL من علامات الوزن الجزيئي الملون للبروتينات (الشكل 1ب).
    3. الكتروفوريس الهلام في 16.5 V/سم تقريبا 1 ح. وينبغي ان الأزرق بروموفينول الوصول إلى الجزء السفلي من هلام.
    4. وضع هلام في كوماسي Blue وصمه عار (10 ٪ حمض الخليك ، 40 ٪ الميثانول ، 0.1 ٪ صبغ الأزرق كوماسي) في حوض من البلاستيك. وصمه عار ينبغي ان تزج تماما هلام. وصمه عار في درجه الحرارة المحيطة لمده 20 دقيقه. دوران لطيف اثناء تلطيخ هو اختياري.
    5. استبدل المحلول بحمض الخليك بنسبه 10% ، 40% الميثانول. احتضان في درجه الحرارة المحيطة مع تناوب لطيف اختياري حتى العصابات البروتين مرئية بسهوله.
    6. استبدلي المياه المنزوعة الأيونات بالماء. ومن بين البروتينات البكتيرية ، ينبغي ان تكون وحدات PCD التي يسببها التهاب مرئية في الخلايا المستحثة. هيكاهيسدين الموسومة الوحدة الفرعية PCD pcaH لديه الوزن الجزيئي 28.3 ده والوحدة الفرعية pcaG هو 22.4 كده. إذا لم تكن الوحدات الفرعية PCD واضحة ، يجب اجراء استقراء جديد مشتق من مستعمره الرواية.

2. تنقيه اللوني النيكل تقارب PCD

  1. ذوبان علي الجليد 1 50 mL أنبوب من الخلايا المستحثة. قد يستغرق 2-3 h لأذابه الجليد تماما العينة.
  2. الحفاظ علي أنبوب علي الجليد ، والعينة في السعه 30 ٪ لمده 1 دقيقه ، وركوب الدراجات 1 s وإيقاف تشغيله. استخدام الطرف الصغير مدبب (قطر 0.125 بوصه) sonicator. الحد الأقصى للطاقة هو 400 W والتردد هو 20 كيلوهرتز ولكل 1 لتر الثقافة بيليه.
  3. سونيكيشن التالية ، أضافه الليزوزيم إلى 0.2 ملغ/مل التركيز النهائي (10 ملغ/مل حل الأسهم) والحفاظ علي الجليد لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية.
  4. صب الليمات البكتيرية في زجاجه البولي قبل المبردة (الابعاد: 25 مم × 89 مم). يجب ان تكون الزجاجة متوافقة مع دوار زاوية ثابته. ويمكن استبدال الأنابيب و/أو الدوارات الأخرى ، ولكن ينبغي الحفاظ علي قوه الجاذبية النهائية.
  5. الطرد المركزي لمده 60 دقيقه في 120,000 x ز في 4 ° c. الحطام الخلوي سيشكل بيليه قد يظهر العملاق الأصفر.
    1. ويمكن ادراج البيليه في التحليل اللاحق لصفحات SDS لتحديد قابليه الذوبان في PCD (الشكل 1ب). Solubilize بيليه بواسطة vortexing في 10 مل تلفزيوني. نقل 150 μL إلى أنبوب 1.5 mL. اعداد العينة لصفحه SDS كما في 1.3.
  6. صب ماده طافي إلى الباردة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. لاحظ وحده التخزين. قد ينتج عن تلوث الحمض النووي الجرثومي البكتيري عينه لزجه. الحمض النووي الجرثومي يمكن ان يمنع تدفق العمود وينبغي ان تتكرر الخطوة نبذ حلول 2.2 إلى بيليه الحمض النووي البكتيري. قد لا يكون بيليه من هذه الدورة الثانية مرئية بسهوله أو قد تكون شفافة.
  7. جعل 500 mL Ni العازلة (300 mM كلوريد الصوديوم ، 50 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ، و 10 ٪ الجلسرين ، 800 ng/mL بيبستاتين ، 1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين ، و 87.1 ميكروغرام/مل PMSF) و 500 mL Ni العازلة B (300 mM كلوريد الصوديوم ، 50 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ، 10 ٪ الجلسرين ، 800 ng/mL بيبستاتين ، 1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين ، و 87.1 ميكروغرام/مل PMSF ، 250 mM ايميدازول ، pH 8.0). تمرير كل من المخازن المؤقتة Ni من خلال مرشحات المسام 0.2 μm.
  8. العينة ، والمخازن المؤقتة ، ونظام FPLC (اللوني السائل البروتين السريع) في غرفه المبردة في 4 درجه مئوية. مضخة غسل A مع العازلة Ni A ومضخة B مع Ni العازلة b. غسل النظام مع 20 مم ايميدازول (8 ٪ ني العازلة B ، 92 ٪ ني العازلة A) حتى الاشعه فوق البنفسجية والموصليه استقرار. نحن تدفق المخازن المؤقتة بشكل روتيني في 5 مل/دقيقه مع حد الضغط 1.0 MPa. وينبغي تحديد معدل التدفق والحد من الضغط حسب مواصفات الاداه FPLC المستخدمة.
  9. اعداد عمود مع 1.5 mL النيكل المشحون الراتنج (الابعاد: 110 مم طويلة x 5 مم). القدرة الراتنج ملزمه هو 50 ملغ/مل ويمكن ان تتسامح مع 1 ميغاباسكال الضغط. وقد يسكب عمود ويخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية قبل التنقية.
    ملاحظه: قد يكون حجم العمود زيادة تناسبيا لاستيعاب أكثر من 1 50 mL أنبوب من الخلايا المستحثة إذا كان هناك حاجه إلى مزيد من البروتين. نحن نفضل عمود جديد لكل اعداد للتاكد من ان اي بروتينات المتبقية تلوث البروتين المطلوب لدينا. ومع ذلك ، يمكن أعاده تدوير الراتنجات النيكل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  10. إرفاق العمود من الراتنج النيكل المشحونة إلى FPLC. تشغيل 20 مل من 92 ٪ ني العازلة A و 8 ٪ ني العازلة B (20 مم ايميدازول) في 0.5 mL/min مع حد الضغط 0.5 MPa من خلال العمود لتتوازن. في الوقت الحقيقي يجب علي FPLC قياس280 (280 nm الامتصاص فوق البنفسجية) ، فضلا عن الموصليه. إذا لم تستقر هذه القيم بعد تمرير وحده التخزين سعة 20 مل خلال العمود ، فقم بانسياب المخازن المؤقتة حتى تستقر.
  11. تحميل العينة إلى العمود (~ 10 مل) في 0.15 mL/min. تعيين حد الضغط إلى 0.5 MPa. جمع التدفق من خلال.
  12. غسل العمود مع 20 مل Ni العازلة في 20 مم ايميدازول (92 ٪ ني العازلة A و 8 ٪ ني العازلة B). الاحتفاظ بالغسيل في أنبوب 50 mL للتحليل. غسل العمود مع 15 مل من 50 ٪ ني العازلة و 50 ٪ ني العازلة B (125 mM ايميدازول). جمع الشطف في 19 الكسور من حجم 0.8 مل. غسل العمود مع 15 مل 100 ٪ ني العازلة b. جمع الكسور 75 اضافيه من 0.2 mL. وسوف بعض المتغايرة PCD الوت في 50 ٪ ني العازلة b الغسيل ، ولكن الغالبية من المغاير سوف الوت في 100 ٪ ني العازلة b الغسيل.
  13. تحليل الكسور التي تم جمعها علي 12 ٪ الهلام الصفحة SDS لتاكيد وجود PCD. أضافه كميات متساوية من صبغ 2X التحميل إلى التدفق من خلال ، وغسل ، والذروة A280 الكسور. يغلي لمده 3 دقائق. نقل إلى الجليد. صب 2 12 ٪ SDS-صفحه الهلام (كما في الخطوة 1.7). كرر طريقه هلام كما هو موضح في 1.7.

3. مقايسة النشاط النواسي

  1. استنادا إلى تحليل SDS-PAGE ، حدد كسور تقارب النيكل التي تحتوي علي PCD النقي تقريبا. الجمع بين 5 μl اللوني الجزء و 500 ng 3 كيلوبايت سوبر ملفوف البلازميد pxba + في رد فعل العازلة (50 mm تريس-HCl ، pH 7.5 ، 100 mm كلوريد الصوديوم ، 5 مم mgcl2، 0.1 mm dtt) مع الحجم النهائي من 50 μl.
    1. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
    2. تضمين عنصر تحكم سلبي (لا يوجد بروتين مضاف) وعنصر تحكم إيجابي (PCD متوفر تجاريا). وقف رد الفعل مع 10 μL توقف الحل (150 mM أدتا ، الأس الهيدروجيني 8.0 ، 0.6 ٪ SDS ، 18 ٪ الجلسرين ، 0.15 ٪ اورانج G).
    3. يمكن الاحتفاظ بالعينات في الفريزر-20 درجه مئوية ليتم تحليلها لاحقا. ويمكن استخدام اي البلازميد سوبرملفوف في فحص النيوداز طالما يمكن حل منتجات رد فعل الدائرة الفائقة والاسترخاء من قبل الكهربائي هلام الاغاروز.
  2. صب 120 mL 1 ٪ هلام اجنشا في 1X تاي ايثيديوم العازلة (40 mM تريس-خلات ، 1 مم أدتا ، 0.5 ميكروغرام/مل ايثيديوم بروميد) في هلام المدلي بها (الابعاد: 15 × 10 سم). استخدام مشط جيد 15 (ابعاد جيدا: 5mm x 1.5 مم). عندما تم تعيين هلام ، تزج في 1x العازلة تاي بروميد الايثيديوم.
  3. حللت 30 [ميكرول] من الرد فعل ب [اغبرز] هلام. الكتروفوريس في 10 V/cm في درجه الحرارة المحيطة لمده 1 ساعة تقريبا. يجب ان تكون الجبهة صبغه اورانج ز في نهاية هلام.
  4. استخدام الماسح الضوئي مضان للصورة علي الفور اشاره بروميد بروميد الايثيديوم من هلام. إذا تم استخدام البلازميد 3 كيلو بايت ، سيكون إبطا الفرقة الدوائر في ~ 3.5 كيلوبايت تقريبا ، والحمض النووي الخطي سيتم تشغيلها في 3 كيلوبايت ، سيكون البلازميد الملفوف أسرع التنقل في ~ 2 كيلوبايت.
    1. حساب إجمالي حجم بكسل من كل حاره مع برنامج تحليل الصور.
    2. تحديد حجم البكسل للأنواع المختلفة من الحمض النووي ، مثل الدوائر الملفوفة والخطية والسرقة. استخدم هذه القيم لتحديد النسبة المئوية لكل نوع من أنواع الحمض النووي. علي سبيل المثال ، زيادة وجود دوائر السرق المرتبطة بكسر مقارنه بالتحكم السلبي يشير إلى وجود النيوداز. يتم تقسيم حجم بكسل من الدوائر سرق في حاره بقيمه بكسل من الحمض النووي الكلي. تحديد نسبه مئوية عن طريق ضرب هذا الرقم ب100.
  5. الجمع بين الكسور من ذروه التملص الثانية التي تحتوي علي تقريبا الصرفة PCD المتغايرة استنادا إلى تحليل SDS-الصفحة ويكون الحد الأدنى للنشاط النيوداز غير قابل للكشف. لدينا حجم مجمع نموذجي هو ~ 2 مل.
  6. تحميل العينة إلى وحده تصفيه الطرد المركزي مع 10 كده قطع الوزن الجزيئي. أجهزه الطرد المركزي في الطرد المركزي دلو يتارجح في 4000 x ز ل 40 دقيقه في 4 درجه مئوية. بدلا من ذلك يمكن استخدام الدوار زاوية ثابته 35 درجه في 7500 x ز لمده 20 دقيقه في 4 ° c.
    1. كرر طرد حتى وحده التخزين النهائي هو 100-200 μL.
    2. عكس وحده فلتر واستعاده retentate بواسطة طرد في 1000 x g لمده 2 دقيقه في 4 ° c.

4. حجم الاستبعاد تنقيه اللوني من PCD

  1. جعل 250 حجم mL استبعاد الفصل اللوني (SEC) تشغيل العازلة (100 mM كلوريد الصوديوم ، 50 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ، 10 ٪ الجلسرين ، 0.1 mM أدتا ، 800 ng/mL بيبستاتين ، 1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين ، و 87.1 ميكروغرام/مل PMSF). تمرير المخزن المؤقت من خلال فلتر مسام 0.2 μm وتخزين في 4 درجه مئوية.
    ملاحظه: تنفيذ جميع الخطوات في غرفه المبردة في 4 ° c. تنقيه SEC اختياريه ، ولكن يجب تخزين البروتين في المخزن المؤقت قيد التشغيل SEC. إذا تم حذف تنقيه SEC ، يتم تجميعها في 3.6.2. يجب ان يكون الطنين مقابل 1 لتر من المخزن المؤقت SEC في 10 كده MWCO (الوزن الجزيئي قطع) أنابيب غسيل الكلي في 4 °C بين عشيه وضحيها.
  2. تتوازن عمود "الفصل اللوني لاستبعاد الحجم" (ثنائي الفوسفات: 10 مم × 300 مم ؛ 24 مل من حجم السرير ؛ 25-500 حجم العينة μL ؛ الحد الأقصى للضغط 1.5 ميغاباسكال ؛ 2 × 106 دا حد الاستبعاد ؛ 1 إلى 300 الفصل) مع المخزن المؤقت لتشغيل sec في 0.5 mL/min.
    ملاحظه: إذا كان من الممكن استخدام أعمده الحجم البديل SEC.
  3. تحميل الكسور المركزة إلى حلقه حقن وحده التخزين 200 μL. تحميل العينة في 0.5 mL/min إلى العمود. زيادة دقه SEC مع حجم تحميل أصغر. Elute مع 23 مل SEC تشغيل العازلة وجمع 94 الكسور من 250 μL. وينبغي لل SEC لوني حل واحد a280 الذروة التي هي متغايرة PCD odimer. نجد ان PCD elutes 8.9 mL. سيتم تغيير توقيت التملص مع الاعمده البديلة SEC.

5-اختبارات أكسده الانيسول الخماسي الكلور ونشاط النيواز

  1. يتم تنفيذ ردود الفعل لفحص كل من أكسده الانيسول الخماسي الكلور والنشاط النيوداز في لوحه مسطحه القاع 96. تجميع ردود الفعل في لوحه جيده 96 علي الجليد في غرفه بارده 4 °C لمنع الحفز المبكر. الجمع في حجم النهائي من 50 μl: 130 mm كلوريد الصوديوم ، 50 mm تريس-HCl ، pH 7.5 ، 5 مم mgcl2، 0.1 mm dtt ، 5 مم PCA ، 10 نانوغرام/مل البلازميد pxba + ، و 10 μl من الكسور الفردية PCD SEC.
    ملاحظه: يجب أضافه الكسور PCD SEC الاخيره ومباشره قبل التحليل كما سيبدا البروتين الحفز في وقت الاضافه.
  2. أكسده PCD من الانيسول الخماسي الكلور يؤدي إلى انخفاض امتصاص الانيسول الخماسي الكلور في 290 نانومتر (A290). نقل لوحه البئر 96 إلى حامل لوحه من قارئ لوحه تعيين إلى درجه حرارة داخلية من 37 درجه مئوية. سحب حامل لوحه في الصك وقياس A290 في فترات 20 s لمده 1 ساعة. وقد الصك يهز لوحه 5 ليالي قبل كل قراءه.
  3. بعد 1 ح ، وإنهاء ردود الفعل عن طريق أضافه 10 μL وقف الحل (150 mM أدتا ، الأس الهيدروجيني 8.0 ، 0.6 ٪ SDS ، 18 ٪ الجلسرين ، 0.15 ٪ اورانج G).
  4. اعداد وتحميل وتشغيل هلام اجبرز كما هو الوضع في الخطوة 3.2.
  5. صوره وتحليل هلام اجبرز كما في الخطوة 3.3.
  6. حدد الكسور مع معظم نشاط أكسده الانيسول الخماسي الكلور وعدم وجود تلوث النيوداز الملاحظ للتخزين علي المدى الطويل في-80 درجه مئوية. قياس A280.
  7. حساب تركيز PCD الإجمالي باستخدام A280 ومعامل الانقراض (ε280) من 734,700 M-1سم-1.
  8. المفاجئة تجميد الكسور الفردية في النيتروجين السائل. يحفظ في 80 درجه مئوية الفريزر. بدلا من ذلك ، يمكنك الجمع بين الكسور النشطة والخالية من النواز والمجمدة والتجميد بنفس الطريقة. العائد النموذجي لدينا هو 1-2 ملغ PCD لكل ثقافة L. الاستخدام النموذجي في تجربه SM هو 3 ميكروغرام PCD. لقد استخدمنا PCD المخزنة في-80 درجه مئوية لمده تصل إلى 1 سنه مع عدم وجود انخفاض في النشاط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المتاحة تجاريا الأوكسجين الزبال PCD غالبا ما تكون ملوثه بنواه الحمض النووي. تلوث النشاط النيوداز يمكن ان يؤدي إلى نتائج زائفه في الدراسات الفلورية ، وخاصه الدراسات التي تحلل الحمض النووي أو الحمض النووي التفاعل البروتينات. وقد وجدنا ان PCD المؤتلف ، وهو مغاير من hexahistidine الموسومة pcaH و pcaG ، يمكن التعبير عنها في كولاي (الشكل 1). يتم تنقيته المتغايرة أولا بواسطة اللوني تقارب النيكل (الشكل 2). يتم التملص من PCD في خطوتين من تركيزات ايميدازول. يتم تحليل كسور اللوني من قبل SDS-PAGE. الكسور من PCD نقيه تقريبا تتركز وأكثر تنقيه من قبل SEC (الشكل 3). يتم تحليل كسور SEC بشكل فردي لكل من نشاط أكسده الانيسول الخماسي الكلور ونشاط النيوداز (الشكل 4). الكسور التي عرضت نشاط الاكسده العالية وليس النشاط النيوداز واضحة هي التهاوي لتركيز البروتين وابقي في 80 درجه مئوية الفريزر للاستخدام التجريبي.

Figure 1
الشكل 1: التعريفي من PCD في e. كولاي. (ا) PVP91A-pcaHG هو مبين مع pcag (α) و hexahistidine-الموسومة pcah (β) الوحدات الفرعية PCD. (ب) التمثيل التمثيلي لصفحات البيانات التعريفية للاستقراء PCD. يتم الاشاره إلى الأوزان الجزيئية علي اليسار. التنقلات من 28.3 كده hexahistidine-الموسومة pcaH و 22.4 ده pcaG علي اليمين. غير مستحث e. كولاي (Un) ، المستحثة e. كولاي (في) ، بيليه التالية e. القولونية تحلل و نبذ حلول (ع) ، و ماده طافي التالية ليتم تحميلها إلى عمود (S) النيكل ، وكسر التمثيل بعد اللوني النيكل (Ni) ، وجزء تمثيلي بعد SEC (SE). وقد عدل هذا الرقم من منشور سابق هو12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تنقيه الفصل اللوني لنيكل التقارب من PCD. (ا) الكروماتوجرام من الفصل اللوني لتقارب النيكل من PCD. يتم عرض280 A باللون الأزرق ويتم عرض تركيز النسبة المئوية لل Ni المخزن المؤقت ب باللون الأحمر. تم تحميل العينة في تركيز منخفض 20 مم ايميدازول. الجريان (Flw Thr) يظهر البروتينات البكتيرية القابلة للذوبان التي لم ترتبط الراتنج النيكل. تم غسل العمود مع 20 مل من 20 مم ايميدازول العازلة. تم اجراء غسيل 15 مل الثاني مع 125 mM ايميدازول. تم تنفيذ التملص من PCD مع 250 mM ايميدازول. بعض PCD التملص في وجود 125 mM ايميدازول ، ولكن الغالبية العظمي من البروتين في التملص في 250 مم ايميدازول. (ب) التحليل التمثيلي لصفحات المخزون من كسور النيكل المتقاربة. وأظهرت الحمولة ، وتدفق (Flw Thr) ، وغسل الاولي التحريض الناجح من PCD ، والبروتينات البكتيرية القابلة للذوبان التي لم تربط راتنج النيكل ، والبروتينات الحد الأدنى التي لوحظت اثناء الغسيل الأول ، علي التوالي. يتم عرض العديد من الكسور خلال الغسيل الثاني وخطوات الشطف. وشملت الكسور من الغسيل الثاني بروتين PCD ولكن أيضا عرض الملوثات الوزن الجزيئي اعلي للكشف. ويبدو ان الكسور الناجمة عن خطوه التملص خاليه من الملوثات. وتظهر الأوزان الجزيئية علي اليسار. يتم عرض التنقلات من pcaH و pcaG علي اليمين. (ج) هلام الفحص النواسي. تم اختبار حموله عمود تقارب النيكل ، والتدفق ، والغسيل ، والكسور المتعددة لنشاط النيوداز. A السيطرة السلبية (السيطرة) هو البلازميد دون البروتين المضافة. السيطرة الايجابيه (PCDa) هي pcd متاحه تجاريا معروفه بأنها ملوثه بنواه الحمض النووي. ويشار إلى أنواع الحمض النووي علي اليمين كشظايا صغيره (SF) ، سوبرملفوف (SC) ، الخطي (LN) ، دائره سرق (NC) ، و سرق ديمر (ND). (د) كميه الأنواع المختلفة من الحمض النووي التي لوحظت في فحص النيوداز الهلام الذي نشا. تم قياس إجمالي حجم البكسل لكل حاره. تم تحديد حجم البكسل لكل نوع من أنواع الحمض النووي والتعبير عنه كنسبه مئوية من إجمالي حجم البكسل في الممر. وكانت السيطرة السلبية 81.7 ٪ supercoiled مع 14.4 ٪ دوائر سرق. أظهرت السيطرة الايجابيه زيادة كبيره في الدوائر سرق% 46.0. الحمولة والانسيابية الواردة نوكليسيس البكتيرية التي حولت البلازميد وتلويث البكتيريا DNA إلى شظايا صغيره. الغسيل الأول في ايميدازول 20 مم يبدو أيضا انه يحتوي علي نشاط النيوداز كبير ، مما ادي إلى الدوائر الخطية والسرقة. الكسور 4-7 من الغسيل الثاني في 125 مم ايميدازول أيضا عرض النشاط النيوداز كبيره (وخاصه, الكسور 4 و 5 التي ولدت لاحظ plasmid بلازميد). الكسور 29-38 من الخطوة التملص ظهرت أكثر مماثله للسيطرة السلبية. في هذا المثال ، تم اختيار الكسور 29-38 ليتم دمجها وتركيزها وتنقيتها بواسطة SEC. وقد عدل هذا الرقم من منشور سابق هو12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تنقيه الثانية من PCD. (ا) الكروماتوجرام من الثانية من كسور PCD بعد اللوني تقارب النيكل. يتم عرضال280 A باللون الأزرق ويتم الاشاره إلى كسور الشطف. PCD التملص من SEC كذروة واحده واضحة. (ب) التحليل التمثيلي لصفحه البيانات المخزونة لكسور الثانية 33-48. والحمولة هي PCD المركزة بعد تنقيه تقارب النيكل. الكسور 33-48 تمتد الذروة SEC الظاهر. ولم تلاحظ اي ملوثات يمكن كشفها. (ج) هلام الفحص النواسي. تم اختبار تحميل SEC وكسور متعددة للنشاط النيوداز. A السيطرة السلبية (السيطرة) هو البلازميد دون البروتين المضافة. السيطرة الايجابيه (PCDa) هي pcd متاحه تجاريا معروفه بأنها ملوثه بنواه الحمض النووي. ويشار إلى أنواع الحمض النووي علي اليسار كما الملفوف (SC) ، دائره سرق (NC) ، و سرق ديمر (ND). (د) كميه الأنواع المختلفة من الحمض النووي التي لوحظت في فحص النيوداز الهلام الذي نشا. تم قياس إجمالي حجم البكسل لكل حاره. تم تحديد حجم البكسل لكل نوع من أنواع الحمض النووي والتعبير عنه كنسبه مئوية من إجمالي حجم البكسل في الممر. كان التحكم سلبيه 82.1% [سوبرملفوف] مع فقط 13.7% [سرق] دوائر. أظهرت السيطرة الايجابيه زيادة كبيره في الدوائر سرق% 64.8. التحميل SEC عرض اي نشاط النيوداز واضح بسبب الاختيار الحكيم من الكسور من تنقيه تقارب النيكل. المثل ، ظهرت كسور 33-48 مماثله للسيطرة السلبية. علي سبيل المثال ، كان كسر 36 82.5 ٪ supercoiled و 13.2 ٪ دائره سرق. في هذا المثال ، تم اختيار الكسور 36 و 37 ليتم تحديدها كميا ، وتجميدها ، والاحتفاظ بها في الفريزر-80 درجه مئوية للاستخدام التجريبي في المستقبل. وقد عدل هذا الرقم من منشور سابق هو12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أكسده الانيسول الخماسي الكلور ونشاط النيوداز لكسور PCD SEC. وقد قيست أكسده الانيسول الخماسي الكلورب290. كما أكسده PCD جزيء PCA ، انخفض A290 . تم قياس أكسده الانيسول الخماسي الكلور كل 20 ثانيه لمده 1 ساعة. وأظهرت السيطرة السلبية مع عدم وجود جزء PCD المضافة (الخط الأزرق) اي تغيير في290، مما يدل علي جزيء PCA كان مستقرا. بيانات من ثلاثه الكسور الممثل SEC (36 في الأحمر ، 33 باللون البرتقالي ، 39 باللون الأصفر) تظهر ان PCD المنقي خفض A290، مما يدل علي أكسده PCA. وقد عدل هذا الرقم من منشور سابق هو12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وعاده ما يتم تضمين أنظمه المسح الأوكسجين في جزيء واحد المجهر المجهري للحد من التصوير الضوئي3,7,8. وغالبا ما تستخدم هذه التقنيات المجهرية لمراقبه الأحماض النووية أو تفاعلات البروتين مع الأحماض النووية1،13،14. قد يؤدي تلوث الملوثات المستنفدة للأوزون مع النوكليسيس إلى نتائج زائفه.

وقد ثبت ان الأصول المتاحة تجاريا ، بما في ذلك GODCAT و PCD ، تشمل التلوث النواسي الهام11. فمن الممكن لشراء PCD وتوظيف SEC لأزاله الملوثات النيوداز11. ومع ذلك ، زاد سعر PCD المتاحة تجاريا من بائع واحد 5 اضعاف بعد نشر هذه الطريقة. هذا الأسلوب يولد نشطه للغاية ، النيوداز الحرة PCD متغاير ويمكن تصور ان يؤديها في غضون أسبوع 1. في تجربتنا, كميه PCD المتولدة عن ثقافة 1 L (1-2 ملغ) كافيه لمده سنه واحده من التجارب (3 ميكروغرام/تجربه) في مختبر الانتاجيه مع 2 نظم التصوير الفلوري.

الكفاءة التعريفية هي المفتاح لنجاح هذه الطريقة. إذا كانت الصورة غير المتجانسة لل PCD غير مستحثه بكفاءة وواضحة بواسطة SDS-PAGE ، فان التنقية ستكون غير ناجحه. ويمكن تجريب استراتيجيتين بديلتين. أولا ، محاولة الاستقراء من مستعمره مختلفه علي e. القولونية تحول لوحه. ثانيا ، كان لدينا النجاح السابق مع BL21 ، ولكن بديل e. كولاي سلاله للتعبير ، مثل BL21 pLysS ، قد يحاكم. يعتمد نجاح فحص الاكسده PCA علي الحد الأدنى من التعرض للركيزة إلى PCD قبل البدء في الفحص. ويوصي بشده لتجميع ردود الفعل لوحه 96 جيدا علي الجليد في غرفه بارده وأضافه عينه البروتين علي الفور قبل تحميل لوحه للقارئ.

قد يكون الفصل اللوني التقارب النيكل كافيه لتحديد كسور PCD نقيه مع عدم تلويث النشاط النيوداز. في هذه الحالة ، فمن الممكن للقضاء علي تنقيه SEC. ومع ذلك ، يجب الجمع بين كسور اللوني النيكل والطنين بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية في SEC تشغيل المخزن المؤقت. الجلسرين الموجود في المخزن المؤقت تشغيل SEC مهم للتخزين في-80 درجه مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة GM121284 و AI126742 إلى KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics