Udtryk og rensning af nuklease-fri oxygen Scavenger Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisk fjerne fri diatomisk ilt fra et vandigt system ved hjælp af dets substrat protocatechuinsyre Acid (PCA). Denne protokol beskriver udtrykket, rensning og aktivitetsanalyse af dette iltskylle enzym.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Enkelt molekyle (SM) mikroskopi anvendes i studiet af dynamiske molekylære interaktioner af fluoroforet mærket biomolekyler i realtid. Fluorophorer er dog udsat for tab af signal via foto blegning ved opløst ilt (O2). For at forhindre foto blegning og forlænge fluoroforet levetid, er ilt scavenging Systems (OSS) ansat til at reducere O2. Kommercielt tilgængelige OSS kan være forurenet af nukleaser, der beskadiger eller nedbryder nukleinsyrer, som giver en forvirrende fortolkning af eksperimentelle resultater. Her detaljeret en protokol til ekspression og oprensning af meget aktive Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) uden påviselige nuklease kontaminering. PCD kan effektivt fjerne reaktive O2 arter ved omdannelse af substrat protocatechuinsyre Acid (PCA) til 3-carboxy-CIS, CIS-muconic Acid. Denne metode kan anvendes i ethvert vandigt system, hvor O2 spiller en skadelig rolle i dataindsamlingen. Denne metode er effektiv til at producere meget aktive, nuclease gratis PCD i sammenligning med kommercielt tilgængelige PCD.

Introduction

Et enkelt molekyle (SM) Biofysik er et hastigt voksende felt, der ændrer den måde, vi ser på biologiske fænomener. Dette felt har den unikke evne til at forbinde grundlæggende love i fysik og kemi til biologi. Fluorescens mikroskopi er en Biofysisk metode, der kan opnå SM følsomhed. Fluorescens anvendes til påvisning af biomolekyler ved at forbinde dem til små organiske fluorophorer eller kvante prikker1. Disse molekyler kan udsende fotoner, når de er ophidsede af lasere før foto blegning irreversibelt2. Foto blegning opstår, når de fluorescerende etiketter undergår kemiske skader, der ødelægger deres evne til at ophidde ved den ønskede bølgelængde2,3. Tilstedeværelsen af reaktive oxygenarter (ros) i vandig buffer er en primær årsag til foto blegning2,4. Derudover kan ros skade biomolekyler og føre til fejlagtige observationer i SM eksperimenter5,6. For at forhindre oxidativ skader, ilt scavenging Systems (OSS) kan anvendes3,7,8. Glucoseoxidase/catalase (GODCAT) systemet er effektivt til at fjerne ilt8, men det producerer potentielt skadelige peroxider som mellemprodukter. Disse kan være skadelige for biomolekyler af interesse i SM-undersøgelser.

Alternativt vil protocatechuate 3, 4 dioxygenase (PCD) effektivt fjerne O2 fra en vandig opløsning ved hjælp af dets substrat protocatechuinsyre Acid (PCA)7,9. PCD er et metalloenzym, der bruger hæm jern til at koordinere PCA og katalyserer catechol ring åbnings reaktionen ved hjælp af opløst O210. Denne ene skridt reaktion er vist sig at være en samlet bedre OSS for at forbedre fluoroforet stabilitet i SM eksperimenter7. Desværre indeholder mange kommercielt tilgængelige OSS-enzymer, herunder PCD, kontaminerende nukleaser11. Disse forurenende stoffer kan føre til beskadigelse af nukleinsyre-baserede substrater, der anvendes i SM eksperimenter. Dette arbejde vil belyse en kromatografi baseret rensnings protokol for brug af rekombinant PCD i SM-systemer. PCD kan anvendes bredt på ethvert eksperiment, hvor ROS er skadelige substrater, der er nødvendige for dataindsamling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducerer PCD-ekspression i E. coli

  1. Kombiner 1 μL pVP91A-pcaHG PCD Expression plasmid (20 ng/μL, figur 1A) og 20 μl E. coli BL21 (20 μl kommercielt tilgængelige celler, > 2 x 106 CFU/μg plasmid) i et rør. Svip røret for at blande. Anbring røret på is 5 min.
  2. Placer transformation ved 42 °C i 30 s. Så is 2 min.
  3. Tilsæt 80 μL SOC-medier (Super optimal bouillon med katabolit undertrykkelse: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, 0,5% gærekstrakt, 10 mM MgSO4, 10 mm mgcl2, 20 mm glukose). Ryst ved 225 omdrejninger pr. minut (rpm) 37 °C i 1 time.
  4. Plade Transformations reaktionen på LB amp agar (1L Luria bouillon agar: 10 g NaCl, 10 g Bacto-trypton, 5 g gær ekstrakt, 15 g agar, 50 μg/mL ampicillin; 25 mL pr. 10 cm diameter petriskål).
  5. Pladen, låget vender nedad, ved 37 °C i 16-18 h.
  6. Inoculate 50 mL LB amp (1L LB: 10 g Bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g gær ekstrakt, 50 μg/mL ampicillin) i en 250 mL Erlenmeyer kolbe med en koloni. Inkuber ved 37 °C for 16-18 h omrystning ved 225 rpm.
  7. 20 mL kultur overføres til en 4 L kolbe med 1 L LB amp. Ryst ved 225 rpm ved 37 °C.
  8. Hver h måler kulturen OD600 (optisk densitet ved 600 nm). Som kulturen OD600 nærmer 0,5, øge hyppigheden af målinger til hver 15 min. Den ønskede tæthed af kulturen er 0,5 OD600.
  9. 4L-kolben overføres til en isbeholder. Drej kolben i isbadet for at reducere dyrknings temperaturen.
    Bemærk: Tiden på isen bør holdes på et minimum, så cellerne forbliver metabolisk aktive. Ideelt set vil cellerne være på is mindre end 10 min.
  10. Vellykket induktion af PCD kan observeres ved denaturering af natriumdodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side) analyse. Høst 1 mL af den ikke-inducerede kultur i et rør. Drej prøve 1 min ved 14.000 x g i en mikrofuge ved omgivelsestemperatur. Decant supernatanten.
    1. Solubilize de pelleterede celler i 150 μL PBS (fosfat bufferet saltvand).
    2. Tilsæt en tilsvarende mængde 2x loading Dye (1,2% SDS, 30% glycerol, 150 mm Tris-HCl, ph 6,8, 0,0018% bromphenolblåt blå, 15% β-mercaptoethanol). Vortex prøven til at blande grundigt.
    3. Kog prøven i 3 min. og Overfør til is. Prøven kan opbevares i en-20 °C fryser til fremtidig analyse.
      Bemærk: PBS er kommercielt tilgængeligt med eller uden CaCl2 og mgcl2. Mange laboratorier vil have PBS uden CaCl2 og mgcl2 for cellekultur metoder. Vi har ikke fundet nogen forskel med PBS med eller uden CaCl2 og mgcl2.
  11. 4 L kolben overføres til en inkubator ved 17 °C med 180 rpm omrystning. Fortsæt med at overvåge OD600 hver 20 min.
  12. Ved 0,7 OD600 tilsættes isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (iptg) til 0,5 mm endelig koncentration (0,25 M stamopløsning) og 10 mg/L ammonium jern (II) sulfat hexahydrat (FE (NH4)2(so4)2, 10 mg/ml stamopløsning). PCD gener Pcah og pcag induceres af T5-promotoren ved tilsætning af iptg (figur 1A). Jernsulfat er bundet af PCD og kræves for katalytisk aktivitet ved at koordinere ilt under åbning af catechol.
  13. Ryst kulturen ved 180 rpm ved 17 °C i 18 timer.
  14. Dyrknings kolben anbringes i is i 1,2. 1 mL af de inducerede celler høstes til SDS-side som i 1,3.
  15. Hæld bakterie kulturen til flasker, som er egnede til centrifugering. En 1 L kultur kan centrifugeres i 4 250 mL koniske bund flasker. Pellet kulturen ved 4 °C i 20 min ved 3000 x g. Decant supernatants. Bortskaf bakterielt flydende affald på passende vis.
  16. Pipet til at resuspendere pellets i 25 mL kold PBS (CaCl2 og mgcl2 er valgfri) pr 1 L kultur.
  17. Opblanding overføres til 50 ml koniske rør (1 50 ml rør pr. 1 L kultur). Pellet cellerne ved 3000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanten og bortskaffes på passende vis.
  18. Cellerne opslæmmes i 10 mL lysisbuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM imidazol, 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin og 87,1 μg/mL phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) ved pipettering. Opblanding fastfryses med flydende nitrogen i en afkrigskolbe. Prøverørene opbevares i en-80 °C fryser. Vi har renset PCD fra pellets opbevares ved-80 °C i et år uden tilsyneladende tab af aktivitet.
  19. Sammenlign de ikke-induceret og inducerede celler med SDS-PAGE.
    Bemærk: Vi har ikke haft problemer med induktion af PCD heterodimer. Vi anbefaler dog, at du tester induktionen, før du fortsætter med rensningen i tilfælde af, at et reagens er udløbet uventet.
    1. Montageplader til SDS-side (mål: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm tyk). Stabel gel er 1,5 mL 6% polyacrylamid (6% acrylamid, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfat, 0,001% TEMED). Løsningen gel er 3,5 mL 12% polyacrylamid (12% acrylamid, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfat, 0,001% TEMED). Indsæt en 10 brønd kam til stablings laget.
    2. Indlæs 10 μL ikke-inducerede og inducerede bakterie prøver. Læg 4 μL præfarvede molekylvægt markører for proteiner (figur 1B).
    3. Elektrophorese gelen ved 16,5 V/cm ca. 1 time. Bromphenolblåt blå skal nå bunden af gelen.
    4. Læg gelen i Coomassie Blue Stain (10% eddikesyre, 40% methanol, 0,1% Coomassie Blue Dye) i et plastik karbad. Pletten skal helt nedsænke gelen. Pletter ved omgivelsestemperatur i 20 min. forsigtig rotation under farvning er valgfri.
    5. Opløsningen udskiftes med destain (10% eddikesyre, 40% methanol). Inkuber ved omgivende temperatur med valgfri blid rotation, indtil protein båndene er let synlige.
    6. Udskift depletten med deioniseret vand. Blandt de bakterielle proteiner skal de inducerede PCD-under enheder være synlige i de inducerede celler. Hexahistidine Tagged PCD underenhed pcah har en molekylvægt på 28,3 kDa og pcag-under enheden er 22,4 kDa. Hvis PCD-underenhederne ikke er synlige, skal der udføres en ny induktion afledt af en roman koloni.

2. nikkel affinitets kromatografi rensning af PCD

  1. Tø på is 1 50 mL rør af inducerede celler. Det kan tage 2-3 h til helt at tø prøven.
  2. Holder røret på is, soniker prøven ved 30% amplitude i 1 min, cykling 1 s til og fra. Brug en tilspidset mikrospids (diameter 0,125 tommer) sonicator. Maksimal effekt er 400 W og frekvens er 20 kHz og pr 1 L kultur pellet.
  3. Efter sonikering tilsættes lysozym til 0,2 mg/mL endelig koncentration (10 mg/ml stamopløsning) og opbevares på is i 30 minutter ved 4 °C.
  4. Hæld bakterie lyatet i en forkølet polycarbonat flaske (mål: 25 mm x 89 mm). Flasken skal være kompatibel med en fast vinkel ultracentrifuge rotor. Andre rør og/eller rotorer kan udskiftes, men den endelige gravitation kraft bør opretholdes.
  5. Centrifuger i 60 min ved 120.000 x g ved 4 °C. Cellulære snavs vil danne en pellet. Supernatanten kan forekomme gul.
    1. Pellet kan indgå i den efterfølgende SDS-Sideanalyse for at bestemme opløseligheden af PCD (figur 1B). Solubilize pellet ved vortexning i 10 mL PBS. Overfør 150 μL til et 1,5 mL rør. Forbered prøven til SDS-side som i 1,3.
  6. Hæld supernatanten i en kold 50 mL konisk slange. Bemærk lydstyrken. Kontaminering af supernatanten med bakteriel DNA kan give en viskøs prøve. Det bakterielle genomiske DNA kan blokere for spalte strømmen. Ultracentrifugering Step 2,2 skal gentages for at pille det bakterielle DNA. En pellet fra denne anden spin er muligvis ikke umiddelbart synlig eller kan være gennemsigtig.
  7. Lav 500 mL ni-buffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 og 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin og 87,1 μg/mL PMSF) og 500 mL ni buffer B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin og 87,1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazol, pH 8,0). Pass begge ni buffere gennem 0,2 μm pore filtre.
  8. Prøven, bufferne og FPLC (fast protein Liquid kromatografi) systemet er i et kølerum ved 4 °C. Vask pumpen A med ni buffer A og Pump B med ni buffer B. vask systemet med 20 mM imidazol (8% ni buffer B, 92% ni buffer A), indtil UV og ledningsevne stabiliseres. Vi rutinemæssigt flow buffere på 5 mL/min med en 1,0 MPa tryk grænse. Strømningshastigheden og tryk grænsen bør bestemmes af specifikationerne for det anvendte FPLC-instrument.
  9. Forbered en søjle med 1,5 mL nikkel ladet harpiks (mål: 110 mm lang x 5 mm). Harpiks bindings evnen er 50 mg/mL og kan tåle 1 MPa tryk. En kolonne kan hældes og opbevares ved 4 °C før rensning.
    Bemærk: Kolonnens størrelse kan forøges proportionalt for at rumme mere end 1 50 mL rør af inducerede celler, hvis der kræves mere protein. Vi foretrækker en frisk kolonne for hvert præparat for at sikre, at ingen rest proteiner forurener vores ønskede protein. Nikkel harpiks kan dog genbruges i henhold til producentens anvisninger.
  10. Fastgør kolonnen af nikkel ladet harpiks til FPLC. Der køres 20 mL 92% ni buffer A og 8% ni buffer B (20 mM imidazol) ved 0,5 mL/min med en 0,5 MPa tryk grænse gennem søjlen for at ækvibrere. I realtid skal FPLC måle en280 (280 Nm UV-absorbans) samt ledningsevne. Hvis disse værdier ikke er stabiliseret, efter at 20 mL volumen er passeret gennem kolonnen, skal du flyde bufferne, indtil de er stabiliseret.
  11. Læg prøven i kolonnen (~ 10 mL) ved 0,15 mL/min. Indstil tryk grænsen til 0,5 MPa. Saml strømmen igennem.
  12. Kolonnen vaskes med 20 mL ni-buffer ved 20 mM imidazol (92% ni buffer A og 8% ni buffer B). Opbevar vask i et 50 mL rør til analyse. Kolonnen vaskes med 15 mL 50% ni buffer A og 50% ni buffer B (125 mM imidazol). Opløsningen opsamles i 19 fraktioner af 0,8 mL volumen. Kolonnen vaskes med 15 mL 100% ni buffer B. Saml yderligere 75 fraktioner af 0,2 mL. Nogle PCD heterodimer vil elueres i 50% ni buffer b vask, men størstedelen af heterodimer vil elueres i 100% ni buffer b vask.
  13. Analysér indsamlede fraktioner på 12% SDS-PAGE gels for at bekræfte tilstedeværelsen af PCD. Tilføj lige store mængder af 2X loading Dye til strømmen gennem, vask, og Peak en280 fraktioner. Kog i 3 min. overførsel til is. Hæld 2 12% SDS-PAGE gels (som i trin 1,7). Gel-metoden gentages som beskrevet i 1,7.

3. analyse af nukleaseaktivitet

  1. Baseret på SDS-Sideanalyse, identificere nikkel affinitets fraktioner, der indeholder næsten ren PCD. Kombiner 5 μL kromatografi fraktion og 500 NG 3 KB Supercoiled plasmid pXba + i reaktionsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT) med en endelig volumen på 50 μl.
    1. Inkuber ved 37 °C i 1 time.
    2. Medtag en negativ kontrol (ingen tilsat protein) og en positiv kontrol (kommercielt tilgængelige PCD). Reaktionen stoppes med 10 μL stopopløsning (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glycerol, 0,15% orange G).
    3. Prøverne kan opbevares i en-20 °C fryser, der skal analyseres senere. Enhver Supercoiled plasmid kan anvendes i en nuclease analyse, så længe de Supercoiled og afslappet cirkel reaktionsprodukter kan løses ved agrose gel elektroforese.
  2. Hæld en 120 mL 1% agopstået gel i 1X TAE ethidium buffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA, 0,5 μg/mL ethidium bromid) i en gel støbt (mål: 15 x 10 cm). Brug en 15 brønd kam (godt mål: 5mm x 1,5 mm). Når gelen er indstillet, skal den nedsænkes i 1X TAE ethidium-buffer.
  3. Analysér 30 μL af reaktionerne ved agrose gel. Elektrophorese ved 10 V/cm ved omgivelsestemperatur i ca. 1 time. Den orange G farvestof front skal være i slutningen af gelen.
  4. Brug en fluorescens scanner til straks at afbilde ethidium bromid-signalet fra gelen. Hvis en 3 KB plasmid blev brugt, vil det langsomste band være afslappet cirkler på ~ 3,5 KB, lineær DNA vil køre på 3 KB, og Supercoiled plasmid vil have den hurtigste mobilitet på ~ 2 KB.
    1. Beregn den samlede pixel volumen af hver bane med billedanalyse software.
    2. Bestem pixel volumen af de forskellige DNA-arter, såsom Supercoiled, lineære, og spinalis cirkler. Brug disse værdier til at bestemme procentdelen af hver DNA-art. For eksempel, øget tilstedeværelse af spinalis cirkler forbundet med en brøkdel i forhold til den negative kontrol indikerer tilstedeværelsen af nuklease. Pixel volumen af spinalis cirkler i en bane er divideret med pixelværdien af total DNA. Bestem en procentdel ved at multiplicere dette tal med 100.
  5. Kombiner fraktioner fra den anden elueringstop, der indeholder næsten ren PCD heterodimer baseret på SDS-Sideanalyse og har minimal til målbart nukleaseaktivitet. Vores typiske samlede volumen er ~ 2 mL.
  6. Læg prøven til en centrifugal filterenhed med en 10 kDa molekylvægt cutoff. Centrifuge i en svingende spand centrifuge ved 4000 x g for 40 min ved 4 °C. Alternativt kan en 35 ° fast vinkel rotor anvendes ved 7500 x g i 20 minutter ved 4 °C.
    1. Centrifugerings enheden gentages, indtil den endelige retentat volumen er 100-200 μl.
    2. Vend filterenheden om, og Genopret retentatet ved centrifugering ved 1000 x g i 2 minutter ved 4 °C.

4. størrelses udelukkelse kromatografi rensning af PCD

  1. 250 mL-kromatografi med størrelses udelukkelse (SEC) løbe buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glycerol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin og 87,1 μg/mL PMSF). Buffer gennem et 0,2 μm pore filter og opbevares ved 4 °C.
    Bemærk: Udfør alle trin i et kølet rum ved 4 °C. SEC rensning er valgfri, men proteinet skal opbevares i SEC kører buffer. Hvis SEC oprensning udelades, er det retentat, der opsamles i 3.6.2. skal dialyseres mod 1 L SEC-buffer i 10 kDa MWCO (molekylvægt afskåret) dialyse slange ved 4 °C natten over.
  2. Ækvibrere en tvær kædet agrose SEC (størrelses udelukkelse kromatografi) kolonne (dimesions: 10 mm x 300 mm; 24 mL seng volumen; 25-500 μL prøvevolumen; 1,5 MPa tryk grænse; 2 x 106 da udelukkelses grænse; 1 til 300 kDa-separation) med SEC-løbe Buffer ved 0,5 ml/min.
    Bemærk: Hvis det ønskes alternativ størrelse SEC kolonner kan anvendes.
  3. Læg de koncentrerede fraktioner i en 200 μL volumen injektionløkke. Læg prøven på 0,5 mL/min i kolonnen. SEC-opløsning forøges med mindre belastnings volumen. Elute med 23 mL SEC løbe buffer og indsamle 94 fraktioner af 250 μL. SEC kromatogrammet skal løse en enkelt a280 peak, der er PCD heterodimer. Vi finder, at PCD PS 8,9 ml. Elueringstimingen vil ændre sig med alternative SEC-kolonner.

5. PCA oxidation og nuclease aktivitet assays

  1. Reaktioner på assay både oxidation af PCA og nuclease aktivitet udføres i en 96-godt flad bundplade. Saml reaktioner i en 96 brønd plade på is i et 4 °C koldt rum for at forhindre for tidlig katalyse. Kombineres i en endelig volumen på 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT, 5 mm PCA, 10 ng/ml Supercoiled plasmid pxba + og 10 μl af individuelle PCD SEC fraktioner.
    Bemærk: PCD SEC fraktioner skal tilsættes sidste og umiddelbart før analyse som proteinet vil begynde katalyse på tidspunktet for tilsætning.
  2. PCD-oxidation af PCA resulterer i en reduceret absorbans af PCA ved 290 nm (A290). 96 brønd pladen overføres til plade holderen på en plade læser, der er indstillet til en indre temperatur på 37 °C. Træk plade holderen tilbage til instrumentet, og mål en290 med 20 s intervaller i 1 time. Har instrumentet ryste pladen 5 s før hver aflæsning.
  3. Efter 1 time afsluttes Reaktionerne ved at tilføje 10 μL stopopløsning (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glycerol, 0,15% orange G).
  4. Forbered, Indlæs og Kør en agrose gel som i trin 3,2.
  5. Billede og analysér agrose gel som i trin 3,3.
  6. Vælg fraktioner med den mest PCA-oxidations aktivitet og ingen observeret nukleasekontaminering ved langtidsopbevaring ved-80 °C. Mål A280.
  7. Den totale PCD-koncentration beregnes ved hjælp af A280 og ekstinktionskoefficienten (ε280) på 734.700 M-1cm-1.
  8. Snap fryse individuelle fraktioner i flydende nitrogen. Opbevares i en-80 °C fryser. Alternativt kan du kombinere aktive, nuklease frie fraktioner, alikvot og fryse på samme måde. Vores typiske udbytte er 1-2 mg PCD per L kultur. Typisk brug i et SM-eksperiment er 3 μg PCD. Vi har brugt PCD opbevaret ved-80 °C i op til 1 år uden nedsat aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kommercielt tilgængelige ilt Scavenger PCD er ofte forurenet med en DNA-nuklease. Kontaminerende nukleaseaktivitet kan føre til falske resultater i fluorescerende undersøgelser, især undersøgelser, der analyserer DNA-eller DNA-interagere proteiner. Vi har konstateret, at rekombinant PCD, en heterodimer af hexahistidin Tagged pcaH og pcaG, kan udtrykkes i E. coli (figur 1). Heterodimeren renses først ved nikkel affinitets kromatografi (figur 2). PCD eluppes i 2 trin af koncentrationen af imidazol. Kromatografi fraktioner analyseres af SDS-PAGE. Fraktioner af næsten ren PCD er koncentreret og yderligere renset ved SEK (figur 3). SEC-fraktioner analyseres individuelt for både PCA-oxidations aktivitet og nukleaseaktivitet (figur 4). Fraktioner, der viste høj oxidations aktivitet og ingen tilsyneladende nukleaseaktivitet, er analyseret for proteinkoncentrationen og opbevares i en-80 °C fryser til eksperimentel brug.

Figure 1
Figur 1: induktion af PCD i E. coli. A) PVP91A-pcaHG er vist med pcag (α) og hexahistidine-mærkede pcah (β) PCD-under enheder. B) repræsentativ SDS-side gel af PCD-induktion. Molekylvægte er indikeret til venstre. 28,3 kDa hexahistidine-Tagged pcaH og 22,4 kDa pcaG er til højre. Ikke-induceret e. coli (un), induceret e. coli (in), pellet efter e. coli lysis og ultracentrifugering (P), supernatanten efter ultracentrifugering at blive lastet til en nikkel kolonne (r), repræsentativ fraktion efter nikkel kromatografi (ni), og repræsentativ fraktion efter SEC (Se). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: nikkel affinitets kromatografi rensning af PCD. (A) kromatogram af nikkel affinitets chromatografi af PCD. A280 er vist med blåt, og procent koncentrationen af ni buffer B vises med rødt. Prøven blev indlæst i en lav 20 mM imidazolkoncentration. Strømning (FLW thr) viser de opløselige bakterielle proteiner, der ikke binder sig til nikkel harpiks. Søjlen blev vasket med 20 mL 20 mM imidazolbuffer. En anden 15 mL vask blev udført med 125 mM imidazol. Eluering af PCD blev udført med 250 mM imidazol. Nogle PCD elueret i nærværelse af 125 mm imidazol, men størstedelen af proteinet elueret i 250 mm imidazol. B) repræsentativ SDS-Sideanalyse af fraktioner af nikkel affinitet. Belastningen, flyde gennem (FLW thr), og første vask viste den vellykkede induktion af PCD, de opløselige bakterielle proteiner, der ikke binder nikkel harpiks, og de minimale proteiner observeret under den første vask, hhv. Der vises flere fraktioner i den anden skylle-og elueringstrin. Fraktioner fra den anden vask inkluderede PCD-protein, men viste også påviselige forurenende stoffer med højere molekylvægt. Fraktioner fra elueringstrinnet syntes at være fri for forurenende stoffer. Molekylvægte vises til venstre. PcaH og pcaG er vist til højre. C) agopstået gel af nukleaseassay. Den nikkel affinitet kolonne belastning, flyde gennem, vask, og flere fraktioner blev testet for nukleaseaktivitet. En negativ kontrol (kontrol) er plasmid uden tilsat protein. En positiv kontrol (PCDa) er en kommercielt tilgængelig PCD kendt for at være forurenet med en DNA-nuklease. DNA-arter er angivet til højre som små fragmenter (SF), Supercoiled (SC), lineær (LN), spinalis cirkel (NC), og spinalis dimer (ND). D) kvantitering af de forskellige DNA-arter, som er observeret i agrose gel-nukleaseanalysen. Den totale pixel volumen for hver bane blev målt. Pixel volumenet for hver DNA-art blev bestemt og udtrykt som en procentdel af den totale pixel volumen i vognbanen. Den negative kontrol var 81,7% Supercoiled med 14,4% spinalis cirkler. Den positive kontrol viste en betydelig stigning på 46,0% spinalis cirkler. Belastningen og flyde gennem indeholdt bakterielle nukleaser, der konverterede plasmid og kontaminerende bakterier DNA til små fragmenter. Den første vask ved 20 mm imidazol syntes også at indeholde signifikant nukleaseaktivitet, hvilket resulterede i lineære og spinalis cirkler. Fraktioner 4-7 fra den anden vask ved 125 mM imidazol viste også signifikant nukleaseaktivitet (især fraktioner 4 og 5, der genererede observeret lineariseret plasmid). Fraktionerne 29-38 fra elueringstrinnet syntes mere lig den negative kontrol. I dette eksempel blev fraktionerne 29-38 valgt til at blive kombineret, koncentreret og yderligere renset af SEC. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: SEC rensning af PCD. A) kromatogram af SEC af PCD-fraktioner efter nikkel affinitets kromatografi. A280 er vist med blåt, og elueringsfraktioner er angivet. PCD elueret fra SEC som en enkelt tilsyneladende Peak. B) repræsentativ SDS-Sideanalyse af SEC-fraktioner 33-48. Belastningen er den koncentrerede PCD efter nikkel affinitet rensning. Fraktionerne 33-48 spænder over den tilsyneladende SEC Peak. Der blev ikke observeret påviselige forurenende stoffer. C) agopstået gel af nukleaseassay. SEC-belastningen og flere fraktioner blev testet for nukleaseaktivitet. En negativ kontrol (kontrol) er plasmid uden tilsat protein. En positiv kontrol (PCDa) er en kommercielt tilgængelig PCD kendt for at være forurenet med en DNA-nuklease. DNA-arter er angivet til venstre som Supercoiled (SC), spinalis cirkel (NC), og spinalis dimer (ND). D) kvantitering af de forskellige DNA-arter, som er observeret i agrose gel-nukleaseanalysen. Den totale pixel volumen for hver bane blev målt. Pixel volumenet for hver DNA-art blev bestemt og udtrykt som en procentdel af den totale pixel volumen i vognbanen. Den negative kontrol var 82,1% Supercoiled med kun 13,7% spinalis cirkler. Den positive kontrol viste en betydelig stigning på 64,8% spinalis cirkler. SEC-belastningen viste ingen tilsyneladende nukleaseaktivitet på grund af velovervejet valg af fraktioner fra nikkel affinitets rensningen. Tilsvarende, fraktioner 33-48 syntes ligner den negative kontrol. For eksempel, fraktion 36 var 82,5% Supercoiled og 13,2% spinalis cirkel. I dette eksempel blev fraktionerne 36 og 37 valgt til at blive kvantificeret, frosset og opbevaret i a-80 °C fryser til fremtidig eksperimentel brug. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: PCA oxidation og nuclease aktivitet af PCD SEC fraktioner. PCA oxidation blev målt ved en290. Da PCD oxiderede PCA-molekylet, faldt A290 . PCA oxidation blev målt hver 20 s for 1 h. En negativ kontrol uden tilsat PCD-fraktion (blå linje) viste ingen ændring i en290, hvilket indikerer, at PCA-molekylet var stabilt. Data fra tre repræsentative SEC-fraktioner (36 i rødt, 33 i orange, 39 i gult) viser, at renset PCD reducerede A290, hvilket indikerer OXIDATION af PCA. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oxygen skylle systemer er almindeligvis inkluderet i enkelt molekyle Fluorescens mikroskopi for at reducere foto blegning3,7,8. Disse mikroskopi teknikker bruges ofte til at observere nukleinsyre eller protein interaktioner med nukleinsyrer1,13,14. Kontaminering af OSSs med nukleaser kan føre til falske resultater.

Kommercielt tilgængelige OSSs, herunder GODCAT og PCD, har vist sig at omfatte signifikant nukleasekontaminering11. Det er muligt at købe PCD og ansætte sek til at fjerne nuklease kontaminanten11. Men prisen på kommercielt tilgængelige PCD fra én leverandør steg 5 gange efter offentliggørelsen af denne metode. Denne metode genererer en meget aktiv, nuclease gratis PCD heterodimer og kan tænkes udføres inden for 1 uge. Det er vores erfaring, at mængden af PCD genereret af en 1 L kultur (1-2 mg) er tilstrækkelig til et års eksperimenter (3 μg/eksperiment) i et produktivt laboratorium med 2 fluorescerende billedbehandlingssystemer.

Induktions effektivitet er nøglen til denne metodes succes. Hvis PCD heterodimer ikke er effektivt induceret og tilsyneladende af SDS-side, vil rensningen mislykkes. Der kan prøves to alternative strategier. Først forsøge induktion fra en anden koloni på E. coli transformation pladen. For det andet har vi haft tidligere succes med BL21, men en alternativ E. coli stamme for udtryk, såsom BL21 plyss, kan prøves. Succesen med PSA-oxidations analysen er afhængig af minimal eksponering af substratet til PCD, før analysen påbegyndes. Det anbefales stærkt at samle 96-brønd plade Reaktionerne på is i et kølerum og tilføje protein prøven umiddelbart før pålæsningen af pladen til læseren.

Nikkel affinitets kromatografi kan være tilstrækkelig til at identificere fraktioner af ren PCD uden kontaminerende nukleaseaktivitet. I dette tilfælde er det muligt at eliminere SEC rensning. Nikkel kromatografi fraktioner skal dog kombineres og dialyseres natten over ved 4 °C i SEC-løbe buffer. Det glycerol, der er til stede i SEC-løbe bufferen, er vigtigt for opbevaring ved-80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH GM121284 og AI126742 til KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics