Author Produced

Shootward bevægelse af CFDA Tracer lastet i bunden vask væv af Arabidopsis

* These authors contributed equally
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Formålet med denne protokol er at vise, hvordan CFDA indlæses i forskellige steder i de nederste dele af Arabidopsis. Vi præsenterer derefter det resulterende distributions mønster af CF i skuddene.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis. J. Vis. Exp. (147), e59606, doi:10.3791/59606 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Symplastisk Tracer 5 (6)-carboxyfluorescein diacetat (CFDA) er blevet udbredt i levende planter for at demonstrere den intercellulære forbindelse, sivæv transport og vaskulære mønster. Denne protokol viser bund-til-top carboxyfluorescein (CF) bevægelse i Arabidopsis ved hjælp af root-skæring og hypocotyl-pinching procedure hhv. Disse to forskellige procedurer resulterer i forskellige effektivitetsgevinster af CF bevægelse: om 91% udseendet af CF i skud med hypocotyl-pinching procedure, hvorimod kun omkring 70% udseende af CF med rod-skæring procedure. Den enkle ændring af lastning sites, hvilket resulterer i betydelige ændringer i den mobile effektivitet af denne symplastiske farvestof, tyder CF bevægelse kan være underlagt den symplastiske regulering, sandsynligvis ved roden-hypocotyl Junction.

Introduction

Mange fluorescerende røbestoffer med en række spektral egenskaber, såsom 5 (6)-carboxyfluorescein (CF) 1,8-hydroxypyren-1, 3, 6-trisulfonsyre2, Lucifer Yellow CH (lych)3, esculin og cter4, er blevet udviklet og anvendes i planter til at overvåge symplastiske bevægelser og sivæv aktivitet. Generelt er et symplastisk farvestof indlæst i et snit i målvævet, og den sekventielle dispersion af indberetteren i andre dele af planten vil demonstrere intercellulær kommunikation. Selv om mekanismen for farve absorption ikke er fuldt forstået, er det princip underliggende CF bevægelse inde i levende celler blevet bredt anerkendt. Ester form af CF (CF diacetat, CFDA) er ikke-fluorescerende, men membran-gennemtrængelig. Denne egenskab giver mulighed for hurtig membran diffusion af farvestoffet i cellerne. Når inde i levende celler, intracellulære esteraser fjerne acetatgrupper på 3 ' og 6 ' position CFDA, frigive fluorescerende og membran-uigennemtrængelig CF (figur 1, alternativt henvise Wright et al.2); CF kan derefter bevæge sig gennem Plasmodesmata til andre dele af planter.

En veletableret procedure med CFDA er, at det kan indlæses i kilde blade og bruges til at overvåge sivæv streaming og sivæv losning i vasken væv af mange arter, fx som CF aflæsning i Arabidopsis root5, sivæv losning under kartoffel tuberization6, sivæv losning i Nicotiana Sink blade7, og så videre. Ved lignende loading tilgange, andre undersøgelser har vedtaget dette farvestof til at demonstrere den symplastiske forbindelse mellem vært og parasitisk8,9, eller at afsløre de symbiotiske relationer10,11.

En anden måde at gøre brug af dette farvestof er at indlæse det i specifikke celler eller enkelt celle ved mikroindsprøjtning for at bestemme dens fordeling mønster. Sådanne sofistikerede teknikker har i høj grad lettet vores dybere forståelse af Plasmodesmata-medieret intercellulære kommunikation, især i udviklingen af begrebet symplastisk domæne12,13. F. eks. resulterede mikroindsprøjtningen af CFDA i cotyledonarter-celler af Arabidopsis i farvestof koblings mønsteret i hypocotyl-epidermis, men ikke-kobling i de underliggende celler eller i roden af epidermis, og derfor danner hypocotyl-epidermis en symplastisk domæne14. Lignende domæner, såsom striber Guard celler15, sigte element-Companion celler16, root hårceller14 og root Cap17,18 er blevet identificeret ved microinjection teknik. Mest overraskende, nogle domæner tillader Tracer molekyler til at bevæge sig i en bestemt retning. Tag trichome domæne for eksempel, mikroindsprøjtning af en fluorescerende sonde i den støttende epidermal celle fører til strømmen af Tracer ind i trichome domæne, men den omvendte injektion ikke holder sandt19. En nylig rapport har også fundet lignende situationer i symplastisk domæner af Sedum embryo20. Således, alle ovennævnte tilfælde indebærer, at bytte af lastning sites kan føre til nye indblik i symplastisk kommunikation. Vores tidligere eksperiment, der har til formål at dissekere ruten af root-to-shoot mobile lyddæmpningen identificeret en roman symplastisk domæne, eller Hej (hypocotyl-epicotyl Junction) zone, som blev yderligere verificeret gennem root-loading (ikke-Canonical Sink-loading) CFDA forsøg21. Her uddyber vi yderligere den root-to-shoot CF bevægelse ved hjælp af en simpel metode og inddrive en potentiel symplastisk domæne ved at flytte lastning sites. Desuden kan denne procedure tilpasses til at skelne mellem genetiske baggrunde, der har ændret root-to-shoot langdistance transport.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Arabidopsis vertikal vækst i MS medium

  1. Det indvendige af laminar flow kabinet skal behandles med 30 min UV-lys og 15 min luftstrøm før brug. Sørg for at lukke glaslågen, når UV-lys er tændt. Spray alle værktøjer og plader med 70% ethanol, før du placerer dem i kabinettet.
  2. Forbered Murashige og Skoog (MS) medium i en standard 90 mm-diameter Petri skål under et laminar flow kabinet.
    Bemærk: MS medium indeholder følgende komponenter: 20,6 mM NH4No3, 18,8 mm kno3, 1,25 mM KH2po4, 1,5 mm Mgso4· 7h2o, 3 mm CaCl2· 2H2o, 0,1 mm mnso4· H2o, 1,03 μM na2Moo4· 2H2o, 0,1 mm H3bo3, 30 μm Znso4· 7h2o, 0,1 μm CuSO4· 5H2o, 0,1 μm cocl2· 6h2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μm ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA), 4,07 μm nicotinsyre, 2,44 μm pyridoxin hcl, 0,15 μm thiamin hcl, 2,68 mm glycin, 555 μm MYO-inositol, 87,7 mm saccharose og 10 g/L agar.
  3. Fugt de steriliserede spidser eller tandstikker ved at røre ved spidsen eller tandstikkere til MS-mediet, og dyp derefter de steriliserede frø en efter en på den faste position for hver Petri skål, der er angivet med det såede kort.
  4. Forsegl Petri skålen med paraffin film og klæbe tape, og anbring den lodret på et klart stativ i et vækst lokale (22 °C, 70% fugtighed) med en dags cyklus på 16 timer lys og 8 timer mørke (belysning fra 6 til 10 PM). Arabidopsis planten er klar til CFDA-ladning på dag 9-13 efter såning.
    Bemærk: følgende procedure udføres om eftermiddagen fra 2 PM til 5 PM.

2. CFDA-indlæsning med rodbearbejdnings proceduren

  1. Forbered frisk CFDA-arbejdsopløsning umiddelbart før brug. Udtynd 1 mm CFDA stamopløsning opbevaret i-20 °c fryser med sterilt ultrarent vand til en arbejds koncentration på 5 μM.
  2. Skær den mikro-porøse paraffin membran film (Se tabel over materialer) i små stykker af 3 mm x 3 mm størrelse.
  3. Afdæk de voksende planter i rummet ved 22 °C og Ryd overskydende fugt med et papirhåndklæde. Anbring de små film stykker under hver rod.
    Bemærk: fra dette til trin 2,6, hele processen skal være afsluttet inden for 15 min.
  4. Løft planterne på Petri skålen. Skær rødderne i en position omkring 5-10 mm under roden-hypocotyl krydset. Placer skyde delen tilbage på filmen på mediet.
  5. Anvend forsigtigt 0,25 μL CFDA på skære enden af hver rod under et dissekat mikroskop. Undgå sprøjt til andre dele af planten.
  6. Dæk pladen til, og lad planterne være under lys i 2-3 h (22 °C) i vækst lokalet.
  7. Skyl de farvede planter tre gange sekventielt i tre separate bægerglas fyldt med destilleret vand, og Observer derefter planterne under et stereo-fluorescens mikroskop med zoom fra 1,4 x til 3,3 x (Se tabellen over materialer). Til detektion af fluorescens skal der anvendes en højeffektiv filter kube (470/20 Nm excitation, 495 nm Split og 525/50 nm emission), der er monteret til at transmittere fluorescens signalet.

3. CFDA-indlæsning med hypocotyl-pinching-procedure

  1. Forbered frisk CFDA-arbejdsopløsning umiddelbart før brug. Fortynd 1 mm CFDA stamopløsning opbevaret i-20 °c fryser med sterilt ultrarent vand (Se tabellen over materialer) til en arbejds koncentration på 5 μM.
  2. Skær den mikro-porøse paraffin membran film (Se tabel over materialer) i små stykker af 3 mm x 3 mm størrelse.
  3. Afdæk de voksende planter i rummet ved 22 °C og Ryd overskydende fugt med et papirhåndklæde.
    Bemærk: fra dette til trin 3,7, hele processen skal være afsluttet inden for 15 min.
  4. Læg et lille stykke film under roden-hypocotyl krydset af hver plante.
  5. Brug pincet til forsigtigt at klemme hypocotyl nær ved roden-hypocotyl-krydset under et dissekere mikroskop.
  6. Anvend forsigtigt 0,1 μL CFDA på sårstedet under et dissekat mikroskop. Undgå sprøjt til andre dele af planten.
  7. Dæk pladen, og lad planterne være under lys (22 °C) i 2-3 h.
  8. Skyl de farvede planter tre gange sekventielt i tre separate bægerglas fyldt med destilleret vand, og Observer derefter planterne under et stereo-fluorescens mikroskop med zoom fra 1,4 x til 3,3 x (Se tabellen over materialer). Til påvisning af fluorescens skal der monteres en højeffektiv filter kube (470/20 Nm-excitation, 495 nm-Split og 525/50 nm-emission) til overførsel af fluorescens signalet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Symplastisk bevægelse er ofte udsat for miljømæssige udsving. Perturbation af planten voksende tilstand, og selv processen med vævs forberedelse vil påvirke størrelsen udelukkelse grænse for Plasmodesmata, således påvirker symplastisk transport22. For at forbedre farvning effektivitet, vi begrænser vores drift i vækst lokalet, hvor temperaturen og fugt er stramt kontrolleret, og også udføre hele proceduren så hurtigt som muligt (ideelt inden for 10-15 min efter løft låget af Petri skål). Disse forholdsregler under et eksperiment kan effektivt reducere antallet af mislykkede skyde pletter.

Vi beskrev to lidt forskellige procedurer for at demonstrere CF skyde-Ward bevægelse. Normalt kan begge procedurer føre til CF farvning i skuddene omkring 2 timer efter fodring (figur 2). Ikke desto mindre giver de to procedurer forskellige farvnings effektivitetsgevinster. Hypocotyl-pinching-proceduren resulterer i 91% farvnings effektivitet, hvorimod rodbearbejdnings proceduren producerer 70% (welchs t-test, p < 0,001) (figur 3). Vi har også forsøgt at indlæse farvestoffet ved en root-pinching metode og fundet en endnu lavere farvning effektivitet sammenlignet med root-skæring metode, tyder på, at tilgangen til at indlæse farvestoffet i roden ikke tegner sig for farvning forskellen mellem roden og hypocotyl læssesteder (figur 3). CF-signalet findes hovedsageligt i Vaskulaturen, men kun få planter viser halv bladet mønster (figur 2) som set i andre makromolekylære bevægelsesmønstre21. Når CF-signalet spredes til optagelsen, kan det vedligeholdes i mere end 72 timer, og signalet kan ikke fjernes yderligere til andre celletyper. Dette er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater17.

Figure 1
Figur 1 : En skematisk illustration af CFDA-optagelse og CF-bevægelse i anlæggets celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : CF-signal i skud på 9, 11 og 13 dage efter såning (DAS) Arabidopsis planter. CF signal kan detekteres i både kimbladene og sande blade (a, B, C). I de fleste planter observeres CF-signalet i Vaskulaturen efter 2-3 timers belastning med enten root-skæring eller hypocotyl-pinching metode. Kun i meget sjældne tilfælde (mindre end 0,5%) kan hypocotyl-pinching-metoden generere et delvist farvnings mønster i cotyledonarter på 7 DAS Arabidopsis (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Den farvnings effektivisering med root-loading metode (root-skæring og rod-klemme) og hypocotyl-pinching metode. Farvnings effektiviteten i 9 DAS-anlæg blev fastlagt i tre uafhængige eksperimenter (n = 26 i roden-pinching-forsøget; n = 335 i roden-cutting-forsøget; n = 522 i hypocotyl-pinching-metoden). Fejl linjen angiver standardfejl. indikerer p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nye undersøgelser har vist, at planter hurtigt kan reagere på eksterne stimuli23, herunder manipulation introduceret til de eksperimentelle procedurer22. I vores indledende eksperiment fører vores opsyn med denne viden ofte til en farvnings fejl. Med disse lektioner foreslår vi, at følgende forholdsregler skal tages i betragtning, når du udfører dette eksperiment: (1) frøene efter høsten skal opbevares i et opbevarings kabinet indstillet til lav temperatur og lav fugtighed; (2) manipulation af planter, især udsættelse for luft i kabinettet, bør holdes på et minimum tid; (3) forsøgsbetingelserne bør holdes konstante, for eksempel bør alle procedurer udføres i et vækst lokale.

Et andet aspekt i dette eksperiment, der skal påpeges, er, at CFDAS laste volumen skal holdes så lille som muligt. Overskydende løsning ofte fører til artefakter, hvor den overskydende CFDA løsning kan diffus op til skyde gennem kapillar handling, og derved toning trichomes af unge Sink blade. Selv om en vask skridt før billeddannelse kan mindske denne artefakt, den bedste fremgangsmåde er at indlæse et minimumbeløb for at undgå komplikationer forårsaget af overskydende løsning.

Når disse tekniske forholdsregler er løst, kan CFDA'S root-to-shoot-bevægelse fastholdes stabilt som vist i figur 2. Når planterne bliver ældre, siger over 24 dage, Arabidopsis planter synes at miste evnen til at sende CF til skuddet, som vi endnu ikke har fundet en præcis forklaring. En mulig ledetråd kommer fra dens intracellulære akkumulering. Ifølge rapporterne fra Wright et al.2, CF er ansvarlig for at blive beslaglagt af vacuoler, derfor, den intracellulære fri CF i løbet af translokation reducerer gradvist til binding i de større vacuoler af aldrende planter.

Et oplagt træk ved denne procedure er fordelingen mønster af CF i skuddet. Dette vaskulære mønster minder om dem ved at indlæse farvestoffet i kilde bladet1,24,25, hvilket fører til en illusion, at farvestoffet også bevæger sig gennem Phloem. Faktisk, den nederste-til-top translokation af CF kan ikke opnås gennem sivæv givet det faktum, at roden er en stærk vask væv og shootward bevægelse af CFDA går imod sivæv streaming. Denne proces kan snarere lettes af xylem transport, som det fremgår af Botha et al.25. Kort sagt, CFDA kan tages op gennem xylem fartøjer, forarbejdes i parenkym celler og yderligere translokaliseret til sien element af sivæv Stream25. Derfor kan lastnings forsøget på denne måde ikke afspejle phloems aktivitet, men den symplastiske bevægelse af CF skal forekomme, da den kraftige fluorescens kan påvises. Med andre ord kan denne bottom-to-top CF-bevægelse være resultatet af kombineret xylem-transport og symplastisk transport gennem parenkym-celler.

Symplastisk transport er ofte underlagt symplastisk domæne formation13, og under visse omstændigheder viser den envejstransport19,20. En måde for en hurtig kontrol er at flytte lastning sites. Faktisk, da vi udarbejdede denne proces ved hjælp af den samme metode, fandt vi den enkle ændring af lastning site, fra roden til hypocotyl side proksimal til root-hypocotyl Junction, ville resultere i en betydelig ændring af CFDA mobil effektivitet (figur 3). CF mobil differentiering på grund af de særskilte lastning sites ville antyde, at roden-hypocotyl krydset er en anden symplastisk domæne, hvor den symplastiske barriere er dannet for roden-afledte shootward signaler. Yderligere eksperimenterende design med andre molekyler er nødvendig for at undersøge denne mulighed.

Hidtil, denne enkle metode kan give stabile shootward bevægelse af CFDA. Denne funktion kan udforskes yderligere for at skelne planter med kompromitteret eller forbedret root-to-shoot bevægelse, som sjældent er blevet undersøgt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation i Kina (31671257) og Hubei Collaborative innovation Center for korn industrien (LXT-16-18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KNO3   Sinopharm Chemical Reagent 10017218
KH2PO4  Sinopharm Chemical Reagent 10017608
MgSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent 10013018
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent 20011160
MnSO4·H2 Sinopharm Chemical Reagent 10013418
Na2MoO4·2H2O Sinopharm Chemical Reagent 10019818
Boric Acid Sinopharm Chemical Reagent 10004818
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent 10024018
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent 10008218
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent 10007216
KI Sinopharm Chemical Reagent 10017160
FeSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent 10012118
EDTA  Sinopharm Chemical Reagent 10009717
NaOH Sinopharm Chemical Reagent 10019718
KOH Sinopharm Chemical Reagent 10017018
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent 10021418
Myo-inositol   MACKLIN I811835
Nicotinic Acid  MACKLIN N814565
Pyridoxine HCl MACKLIN V820447
Thiamine HCl MACKLIN T818865
Glycine MACKLIN G800880
Agar powder Novon ZZ14022
Fluorescence Microscope Zeiss Axio Zoom V16
Dissecting microscope SDPTOP SRE-1030
200μl pipette Dragon Laboratory Instruments 713111110000-20-200ul
2.5μl pipette Eppendorf 3120000011
Fine forceps  TWEEZERS ST-15
Parafilm PARAFILM PM-996
Stainless steel double-sided blade Gillette Platinum-Plus Double-Edge Blade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47, (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176, (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167, (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6, (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13, (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9, (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7, (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114, (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15, (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58, (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41, (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26, (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120, (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164, (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183, (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163, (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46, (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150, (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245, (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159, (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216, (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24, (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125, (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis? Journal of Experimental Botany. 59, (11), 2945-2954 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics