En mus modell av vascularized heterotopic Mjälttransplantation för att studera mjältens cell bio logi och transplantations immunitet

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll specificerar de kirurgiska stegen i en mus modell av vaskulariserad heterotopisk mjälttransplantation, en tekniskt utmanande modell som kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att studera öde och livs längd mjältceller, mekanismerna i distinkta mjälte cell populationer i sjukdomsprogression och transplantatimmunitet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mjälten är en unik lymfoida organ som spelar en kritisk roll i homeostasen av immun försvaret och hematopoetiska system. Patienter som har genomgått splenektomi oavsett utfällnings orsaker är benägna att utveckla en överväldigande post-splenektomi infektion och uppleva ökade risker för djup ventrombos och maligniteter. Nyligen visade epidemiologiska studier att splenektomi kan associeras med förekomst av hjärt-kärlsjukdomar, vilket tyder på att de fysiologiska funktionerna hos mjälten ännu inte är fullt erkända. Här introducerar vi en mus modell av vaskulariserad heterotopisk mjälttransplantation, som inte bara kan utnyttjas för att studera funktionen och beteendemässiga aktiviteten av mjälten immun celler under grupper i olika biologiska processer, men också kan vara ett kraftfullt verktyg för att testa den terapeutiska potentialen hos mjälttransplantation vid vissa sjukdomar. De viktigaste kirurgiska stegen i denna modell inkluderar givare mjältskörd, avlägsnande av mottagaren infödda mjälte, och mjälttransplantat revascularization. Med hjälp av congenic mus stammar (t. ex. möss med CD 45,1/CD 45,2 bakgrunder), observerade vi att efter syngen transplantation, både donator-derived spleniska lymfocyter och myeloida celler som migrerats ut ur transplantatet så tidigt som postoperativ dag 1, samtidigt med inflödet av flera typer av mottagar celler, vilket skapar en unik Chimera.  Trots relativt utmanande tekniker, kan detta förfarande utföras med > 90% framgångs frekvens. Denna modell gör det möjligt att spåra öde, livs längd, och funktion av splenocyter under Steady State och i en sjukdoms inställning efter en mjälttransplantation, vilket erbjuder en stor möjlighet att upptäcka den distinkta roll för mjältderived immun celler i olika sjukdoms processer.

Introduction

Mjälten är den största sekundära lymfoida organ i kroppen och är kritisk i immun försvaret och hematopoetiska system. Dess funktioner utförs främst av två morfologiskt åtskilda fack, den röda massan och den vita massan1. Den röda massan är en tredimensionell trabekelverket av venösa bihålor och mjältsladdar som består av retikulära fibrer, retikulära celler, och tillhör ande makro Fager. Denna unika struktur gör att den röda massan kan fungera som ett effektivt blod filter som avlägsnar främmande material och gamla eller skadade erytrocyter. Den vita massan innehåller folliklar, marginella zonen, och periarteriolar lymfoida slidor (PALS) och är en viktig plats för antigen fångst och bearbetning, lymfocyt homing, omvandling, proliferation, och mognad2. Ändå har mjälten vanligt vis ansetts som ett dispenserbart organ eftersom andra lymfatiska organ, såsom lymf körtlar, kan också utföra vissa av dess funktioner och förlusten av mjälte inte brukar leda till döden. Splenektomi har därför i stor utsträckning utförts som en terapeutisk metod för patienter med mjältrör eller godartade Hematologiska sjukdomar3. Patienter med splenektomi står dock inför ett antal långvariga komplikationer. Bakteriella infektioner är de mest erkända komplikationer av splenektomi4,5. Nyligen, den överväldigande post-splenektomi sepsis har erkänts som en intensiv komplikation av splenektomi i samband med en hög dödlighet6. Dessutom, nyligen epidemiologiska studier visar att splenektomi kan associeras med förekomsten av hjärt-kärlsjukdomar, vilket tyder på att ytterligare fysiologiska funktioner i mjälten återstår att utforskas7,8.

Både mjältens autotransplantation och mjältallotransplantation har använts på kliniken. För närvarande anses mjältens autotransplantation genom att implantera delar av mjältvävnad i påsar som skapas i större omentum som den enda möjligheten för att bevara mjältfunktion efter traumatisk splenektomi9,10. Emellertid, effekten av denna operation är diskutabel som post-kirurgi komplikationer som aseptisk nekros av mjälten vävnad och små tarm obstruktion på grund av postoperativa sammanväxningar kan inträffa11. Mjältallotransplantation är involverad i multiorgan transplantation12. Kliniska belägg från multiorgan transplantation tyder på att mjältallotransplantation kan spela en skyddande roll i avstötning av små tarm transplantat utan att orsaka transplantat-mot-värdsjukdom (GVHD)12. Men litteraturen om den gynnsamma effekten av mjältallotransplantation som en komponent i multiorgan transplantation är fortfarande begränsad och de bakomliggande mekanismerna återstår att definiera. I 2006, Yair Reisner et al. rapporterade att transplantation av svin embryonal mjältvävnad som inte har några T-celler till möss kan bota hemofili A, en genetisk sjukdom utan att orsaka GVHD13, stödja att mjälten transplantation innehar terapeutiska löfte i vissa sjukdomar. Därför finns det ett behov av ytterligare undersökningar om den terapeutiska potentialen av mjälttransplantation.

Djur modeller av mjälttransplantation är värdefulla för att utforska den ouppskattade funktionen hos de mjälthärledda immun cellerna i sjukdomsprogression samt för att testa den potentiella terapeutiska effekten av mjälttransplantation. Experimentella hela mjälten transplantations modeller har dokumenterats sedan början av 1900-talet, som granskats av Cohen14. I 1969, Coburn Richard J. och Lee et al. detaljerade tekniken för mjälttransplantation hos råttor15,16. Mer nyligen beskrev Swirski FK et al. en mus modell av mjälttransplantation17. Jämfört med råtta modeller, mus modeller av mjälttransplantation är mer attraktiva på grund av dess flera inneboende fördelar. Till exempel, genom att använda en mus modell, kan vi få till gång till en expansiv mängd reagenser otillgängliga för råtta modeller. Genom att använda congenic möss (t. ex. möss med CD 45,1/CD 45,2 bakgrund), en syngen mjälttransplantation gör det möjligt att spåra ödet, livs längd, och funktion av splenocyter18. Baserat på arbetet med Swirski FK et al.17, har vi vidare etablerat detta förenklade och förbättrade protokoll av mjälttransplantation hos möss. Protokollet som beskrivs nedan kombinerar både tillförlitlighet och genomförbarhet på ett standardiserat sätt och kan användas som ett verktyg för att studera mjältbiologi och transplantatimmunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer och djur användning i denna studie utfördes enligt protokoll som godkänts av den nordvästra universitets interna djur Vårds-och användnings kommitté (IACUC). I denna studie, 8 till 10 vecka gamla manliga CD 45,2 och CD 45,1 möss (både på BALB/c bakgrund, från Jackson laboratorium) användes som mjältgivare och mottagare, respektive, för att skapa syngena mjälte transplantation modeller. Alla djur var inhysta i den sterila miljön i djur anläggningarna vid Northwestern University. Ögon Smörj medlet applicerades på alla möss efter anestetisering för att förhindra torrhet.

1. kirurgisk beredning, Anestetization, och analgesi regim

  1. Placera en steril engångsdrape (45,7 cm x 66 cm) på den kirurgiska plattformen. Ta försiktigt tag i musen, injicera Ketamin (50 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) intraperitonealt (i. p) för anestesi och injicera 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant för analgesi.
  2. Kontrol lera djupet av anestesi med tå-nypa, raka håret i hela buken området med en rak kniv och placera musen på den sterila kirurgiska plattformen under drift Mikroskop på 6-10x förstoring.

2. givare mjälte skörd

  1. Sterilisera buken med en alkohol prep pad, säkra armar och ben med kirurgisk tejp, och göra en 3-4 cm mitt linjen vertikala hud snitt från pubis till Xiphoid processen med sax.
  2. Dra tillbaka buk väggen med sterila upprullnings Don gjorda av gem. Flytta tarmarna till höger flank av buken (kirurg vänster) sida med en steril bomullstuss att exponera mjälte. Cauterize den korta gastric ven fäst vid mjälte med en steril låg temperatur diatermi (figur 1a). Placera en bit steril gasväv indränkt med 37 ° c saltlösning över mjälten för att hålla den fuktig (figur 1b).
  3. Separera och mobilisera portalen ven från bukspottskörteln vävnad (figur 1c) genom ligating portalen ven grenar (överlägsen pancreaticoduodenal ven och höger gastric ven); Placera en sutur runt Portal ven distala från mjältrör (figur 1d).
  4. Vänd mjälten till höger för att exponera aorta och glutenintolerans stammen med mjältruptur artär (figur 1e). Dissekera och mobilisera aorta-celiaki-splenic artär genom ligating levern artären och gastric artär; Placera en sutur runt aorta proximala till celiaki artären (figur 1F-G).
  5. Injicera 100 internationella enheter (IE) heparin i Inferior Vena Cava (IVC) för att heparinize hela kroppen och vänta 3 min för att säkerställa att heparin ta effekter. Ligate aorta proximala till celiaki artär, transekera portalen ven, och sedan parfymera hela kroppen med 10 ml hepariniserad kallt (4 ° c) saltlösning (10 ml/20 s) från bukaorta distala till celiaki bålen (figur 1H).
  6. Samla mjälten transplantatet en Bloc med tillhör ande aorta-Celiac-mjältruptur segmentet och portalen ven tillsammans med ett segment av mjälten ven och en liten del av bukspottskörteln vävnad. Förvara transplantatet i 5 mL 4 ° c saltlösning före transplantation. Euthanize musen genom cervikal disloksering.

3. mottagare splenektomi och Mjälttransplantat implantation

  1. Placera en värme dyna på den kirurgiska plattformen och justera temperaturen till 37 ° c. Placera en steril drapera (45,7 cm x 66 cm) ovanpå värme plattan för att skapa en steril kirurgisk plattform. Upprepa steg 2,1 och 2,2 för kirurgisk beredning och anesthetization. Gör en 3-4 cm mitt linjen snitt och dra in buk väggen som beskrivs i steg 2,1 och steg 2,2.
  2. Flytta försiktigt tarmen till höger sida av musen med en steril bomullstuss för att exponera mottagarens mjälte. Ligate mjälten ven och artär och ta bort mjälte.
  3. Flytta försiktigt tarmen till vänster sida av musen och täck tarmarna med våt gasväv (indränkt med steril 37 ° c saltlösning). Dissekera och ligera länd ryggen grenar av infrarenala aorta och IVC; kors klämma infrarenala aorta och IVC med hjälp av två 4 mm mikrovaskulära klämmor.
  4. Placera en 11-0 nylon sutur genom infrarenala aorta (en full tjocklek) och dra tillbaka för att skapa en elliptisk aortotomy av en enda klippa med microsax (längden bör matcha diametern på donatorkroppspulsådern, figur 2A). Pierce IVC med en 30 G nål för att skapa en elliptisk venotomi och utvidga öppningen till givare Portal ven-matchad längd med hjälp av microsax (figur 2A).
  5. Rensa svalgmanometri blod eller blodpropp (i aorta och IVC) med 500 μl hepariniserad saltlösning (10 enheter/ml).
  6. Placera mjälttransplantatet i den högra flanken på mottagarens mus mage; noggrant identifiera givarens aortakrage och givarens Portal ven. Efter att se till att kärlen inte är vridna, täck mjälten transplantat med gasväv indränkt med kallt (4 ° c) saltlösning.
  7. Anslut givarens aorta krage till proximala och distala Apex av mottagarens aortaotomy med två bo suturer (11-0 nylon sutur, samma som nedan) (figur 2b, C). Gör en anastomos med 2-3 biter av kontinuerlig 11-0 nylon suturer mellan givarens aorta manschetten och mottagarens aortaotomy (främre väggen) (figur 2D). Vrid mjältens transplantat över till mottagarens vänstra sida. göra anastomosen mellan givarens aorta krage och mottagarens aortotomy (bakre väggen) (figur 2e).
  8. Utför en anastomos att ansluta givarens Portal ven till den bakre väggen av mottagarens IVC, med 4 till 5 biter av kontinuerliga suturer på insidan av IVC och sedan stänga suturen på utsidan av IVC (figur 2F, G).
  9. Släpp kärlet klämmor och Använd steril bomullstuss till hjärttamponad blödning tills mjältens färg återvinns (figur 2H).
  10. Stäng buken med en 5-0 syntetiskt absorberbara vicryl sutur i ett kontinuerligt mönster. Stäng hud lagret med en 5-0 nylonsutur i ett avbrutet mönster.
    Anmärkning: För stegen 4.7-4.8, alternativt, gör en anastomos mellan givarens Portal ven och mottagarens IVC första (steg 4,8); sedan göra en anastomos mellan givarens aorta manschetten och den bakre väggen av mottagarens aortotomy, med 2 till 3 kontinuerliga suturer i insidan av aorta och stänga suturen på utsidan av aorta.

4. återvinning av djur

  1. Injicera 1 mL varm saltlösning subkutant via 4 separata platser (0,25 mL/plats) efter stängning av buken.
  2. Håll musen i en temperaturkontrollerad inkubator (30 ° c) för de första timmarna efter operationen, övervaka musen tills den har återfått tillräckligt medvetande, och sedan överföra musen till en ny ren bur med regelbunden mat och vatten, med en värme dyna (30 ° c ) under buren. Håll musen efter operationen i en separat bur.

5. hantering av post-kirurgisk smärta

  1. Injicera 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant 24 timmar och 48 timmar efter operationen för att bibehålla analgesiregimen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hela förfarandet för mus mjälte transplantation kan slutföras inom 90 min av erfarna mikrokirurger. Vårt laboratorium har utfört över 100 mjälttransplantationer hos möss. Framgången är över 90%, som definieras av överlevnaden av både mottagare mus och mjälte transplantat till postoperativ dag (POD) 1 eller POD 7 (vår studie Endpoint). Överlevnaden av mjälttransplantatet bekräftades genom makroskopiska utseende och flödescytometri analys av splenocyter. Baserat på vår erfarenhet, flödescytometri analys (LIVE/DEAD cell livs kraft assays) är mycket känslig för att avgöra om en mjälttransplantat överlever, eftersom majoriteten av mjälten cellerna skulle vara död om mjälten transplantat var nekrotiska. De tekniska utmaningarna i detta förfarande, vanliga komplikationer och deras fel sökning sammanfattas i tabell 1.

För att testa transplantations morfologin efter transplantation utfördes Hemotoxylin och eosin (H & E) färgning i mjältisografterna av BALB/c-möss vid POD 1 och POD 7. De representativa bilderna visas i figur 3. Strukturen hos mjältisografterna förblev intakt under den första postoperativa veckan. Den röda massan, vit massa, och marginella zonen var fortfarande tydliga och urskiljbara. För att undersöka cellmigreringen efter mjälttransplantation utfördes flödescytometri vid POD 1 och POD 7 för att undersöka fenotyperna av leukocyter i mjältisografterna, lymf körtlarna, blodet och benmärgen. Som framgår av figur 4avar 51, vid Pod 1, ± 7% (medelvärde ± SD, samma som nedan) av mjältcellerna, och 46 ± 3% var mottagarhärledd. Vid POD 7 stod donerade leukocyter för 32 ± 10% av de totala mjältcellerna och de mottagar celler som härrörde upp till 56 ± 13%. Vi observerade också att mjältleukocyter migrerade till lymf körtlarna, blodet och benmärgen så tidigt på dag 1 och bibehölls dag 7 (figur 4b), vilket genererade en unik chimär som är värdefull för forskning på splenocyttrafficking.

I tabell 1: Metoder för fel sökning.

Figure 1
Figur 1: givar mjältens skörd. (A) cauterize den korta gastric ven bifogas mjälten. (B) placera en liten bit av steril varm våt gasväv över mjälten för att hålla den fuktig. (C) dissekera och isolera portalen ven bakom bukspottkörteln. (D) ligate den sida grenar av portalen ven och placera en sutur runt portalen ven distalt om mjältrör ven. De streckade linjerna representerar platsen transecting senare för anastomos med mottagaren IVC. (E) vänd mjälten över till höger sida av buken (kirurg vänster) för att exponera aorta och glutenintolerans stammen med sina grenar inklusive mjälten artär. (F) dissekera och mobilisera aorta-celiaki-splenic artär genom ligating de två andra grenar. (G) placera en sutur runt aorta proximala till celiaki artären. De streckade linjerna representerar den plats transecting senare används för anastomos med mottagare bukkroppspulsådern. (H) efter ligating aorta och transecting portalen ven, parfymera mjälttransplantatet med 10 ml hepariniserad saltlösning genom aorta. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: implantation av mjälttransplantat. (A) efter isolering och Cross fast spänning aorta och IVC, göra en längsgående aortotomy och venotomy i aorta och IVC, respektive. (B-D) Placera mjälttransplantatet på höger sida av buken (kirurgens vänstra sida). Gör slut-till-sida anastomos mellan givaren aorta manschetten och den främre väggen i mottagarens aortotomy, med 2-3 biter av fortsatta sutur. (E) vrid mjälttransplantatet till den vänstra flanken på mottagaren. Upprepa den tidigare proceduren mellan givaren aorta manschetten och den bakre väggen i mottagarens aortotomy och stänga suturen på utsidan av aorta. (F-G) Gör en end-to-Side anastomos mellan givar portalen ven och den bakre väggen av mottagarens IVC, med 4 till 5 bett av kontinuerlig 11-0 nylon sutur i insidan av IVC och sedan stänga suturen på utsidan av IVC. (H) efter att ha avslutat anastomosen, släpp kärlet klämmor och placera några bomulls knoppar för att stoppa blödningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativ histologi för mjältisografterna dag 1 och dag 7 efter operationen. Syngena mjälttransplantationer utfördes med BALB/c-möss. Mjältisografterna skördades dag 1 och dag 7 efter transplantation och fastställdes i 10% formalin för 48 h. H & E-färgning utfördes med paraffin-inbäddad vävnad avsnitt. Den representativa histologin visar att mjältisografterna förblir intakta vid 1 vecka efter transplantation. Skalbar = 250 μm. POD, postoperativ dag. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Den chimär som skapats av syngena mjälttransplantation. Tre syngena mjälttransplantationer utfördes med BALB/c CD 45,2 möss som donatorer och BALB/c CD 45,1 möss som mottagare. Mjälten transplantat, blod, lymf knutor (LN), och benmärg (BM) i mottagar möss skördades på dag 1 och dag 7 efter transplantation. Enkel cell isolering och flödescytometri analys utfördes för att analysera fenotyp av cellerna. Arepresentativa prickar (gating från levande singlets) som visar procent andelarna för givare eller mottagare – härledda leukocyter i de angivna proverna. B) procent satser (medelvärde ± SEM) för de angivna populationerna i donatorhärledda celler i de angivna proverna dag 1 och dag 7. POD = postoperativ dag. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: representativa observations områden (n = 3) som visar procent andelarna av de givare som härrör från lymfocyter jämfört med mottagar celler i den transplanterade mjälten, lymf knutor, blod och benmärg. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur 2: representativa tomter (n = 3) som visar procent andelarna av donatorhärlett kontra Mottagarhärledd CD11b + Ly6C + monocyter i den transplanterade mjälten, lymf knutor, blod och benmärg. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Övertygande bevis tyder på att mjältderived monocyter spelar en viktig roll i sterila inflammatoriska processer såsom åder förkalkning19, akut ischemisk hjärna20 eller lung skada18, samt hjärt infarkt i/R skada och remodeling21,22,23. Dessa rapporter belyser den under erkännande roll mjälten i många kroniska sjukdomar, varav hjärt-kärlsjukdom är en viktig en (särskilt med tanke på det är nummer ett mördare globalt). Mus modell av mjälttransplantation erbjuder en stor möjlighet att upptäcka rollen av mjältderived immun celler i olika sjukdomar samt hur de är grundmålas i mjälten. Till exempel, genom att använda mus modeller av mjälttransplantation, Swirski et al. fann att som svar på ischemisk hjärt infarkt, mjälte-härledda monocyter öka sin motilitet, migrera ut ur mjälten, hålla sig till skadad vävnad, och bidra till sårläkning17. Vidare, denna modell är användbar för att ta itu med de longeligheter av mogna immun celler i mjälte och bakomliggande mekanismer och att utforska terapeutiska potentialer av mjälttransplantation.

Flera aspekter bör tas i beaktande för att förbättra protokollets framgång. För det första är det viktigt att välja rätt försöks djur under konstruktions processen eftersom musen vikt, stam, och hälso tillstånd kan påverka svårigheten att de kirurgiska steg och experimentella resultat. Vårt laboratorium rekommenderar att man använder 8 till 12-veckors gamla möss med över 25 g vikt för att minska dödligheten som kan orsakas av blödning. För det andra, under mjältens skörd förfarande, för mycket manipulation av mjälten fartygen lätt kan leda till avel eller vasospasm och eventuellt resultera i mikrotrombos i mjälttransplantatet. Bekanta sig med anatomi musen buken innan operationen skulle vara till hjälp för att påskynda inlärnings processen. För det tredje bör mjälttransplantatet under mottagar operationen alltid hållas fuktigt och svalt. Lämpligt skydd av mjälttransplantat kan minska transplantation ischemia/reperfusion (I/R) skada och förhindra transplantat misslyckande efter transplantation. Dessutom, med tanke på att givar fartygen för anastomos är relativt långa, positionering mjälten transplantat ordentligt innan anastomos är avgörande för att förhindra vridning av kärlen. Dessutom bör dia metrar av mottagaren aortotomy och venotomi av IVC alltid vara jämförbar med de av donator aorta och Portal ven för att säkerställa korrekt blod flöde och förhindra trombos.

Den genomsnittliga lagrings tiden för mjälttransplantat i 4 ° c saltlösning är ca 10 min. Den totala ischemiska tiden bör begränsas till mindre än 50 min för att säkerställa minsta transplantations svikt. Vi rekommenderar att du använder The University of Wisconsin (UW) kyl förvaring lösning för att bevara mjälten transplantat, om över 1 h kallt, ischemisk tid behövs i studier. Det bör noteras att en liten del av bukspottkörteln intimt fästa med mjälte, och försök att ta bort hela från mjälten ympkvistar skulle lätt leda till transplantat eller vaskulära komplikationer och markant öka Operations tiden. Vi observerade att bukspottkörteln vävnad bifogas mjälten transplantatet skulle genomgå atrofi på POD 7 även om vissa förblev livskraftig med mjälten ympkvistar. Oavsett om att ta bort bukspottkörteln vävnad bifogas mjälttransplantat beror på forsknings ändamål.

Till gången på kongena möss har gjort det möjligt att spåra mjältens celler, givar kontra mottagare efter transplantation. I denna studie använde vi BALB/c CD 45,2 och BALB/c CD 45,1 congenic möss som mjältgivare och mottagare för att skapa en synergisk mjälttransplantations modell. Organ eller vävnads transplantation mellan dessa kongena mus stammar har använts i stor utsträckning för att spåra ursprunget och utvecklingen av immun systemet. Trots den senaste rapporten om en punkt mutation i samband med CD 45,1 som påverkar NK cell svar24, ingen transplantatavstötning rapporterades mellan dessa stammar kombinationer. Vi observerade en betydande tillströmning av mottagar celler i mjälttransplantat som inträffade så snart som på POD 1. Det är troligt att mottagar cellerna svarade på den transplanterade I/R-skadan eftersom majoriteten av mottagar cellerna var granulocyter. Våra resultat visade att en relativt hög andel av mjältlymfocyter förblev av donatorns ursprung. Mer intressant, dessa lymfocyter migrerat till (återbefolkas) i andra lymfoida fack (lymf körtel, benmärg, och cirkulation). Dessa fynd föranleda oss att spekulera att lymfocyter som härstammar från mjälte är mycket viktiga i den adaptiva immunitet. Det krävs dock fler undersökningar för att avgränsa de distinkta rollerna för mjältenlymfocyter i adaptiv kontra medfödd immunitet (figur 4, kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2).

Den stora begränsningen av detta protokoll är att det kräver omfattande mikrokirurgisk utbildning för personer med begränsad mikrokirurgisk erfarenhet att behärska denna teknik. Baserat på vår inlärnings erfarenhet av övergripande mus solida organ transplantations modeller (t. ex., mus hjärta, lunga, eller njur transplantation), det kan ta 6-10 månader för en nyutbildad person (utan någon experimentell mikrokirurgisk teknik) för att skickligt behärska denna Teknik. Jämfört med mus modeller av hjärta, eller njur transplantation, denna modell kan vara mer utmanande eftersom det innebär ytterligare vävnad dissektion steg för att isolera mjälten transplantat under givar förfaranden. Dessutom är diametern på givar portalen ven (runt 0,6 mm) mindre än IVC, vilket gör det svårare för anastomosen. En annan begränsning är att det inte är klart om den ympade mjälten skulle bli massivt invaderas av mottagarens celler vid senare transplantations fasen (t. ex., POD 60). Men denna modell är också mycket attraktiv för dess flera inneboende fördelar. För det första delar möss och människor ett stort antal liknande genom, vilket möjliggör en relativt korrekt representation av en realistisk tillämpning. Dessutom, jämföra med musen modell av icke-vaskulariserad mjältens autotransplantation med hjälp av avsnitten av mjälten vävnad, denna vaskulariserad mjältetransplantation modell är mindre benägna att utveckla komplikationer såsom aseptisk nekros av mjältvävnad och liten tarm obstruktion på grund av postoperativa adhesioner.

Mus modellen för mjälttransplantation har tidigare rapporter ATS av Swirski FK et al. Den detaljerade informationen beskrevs dock inte.  Vår studie ger en omfattande steg-för-steg-protokoll av mus mjältens transplantation för intresserade forskare att följa och mater denna teknik. Dessutom eliminerar detta protokoll flera onödiga steg som beskrivs i rapporten av Swirski FK et al. (t. ex. Gall gången ligatur) och introducerar 11-0 suturen för anastomosis, vilket skulle bidra till att förkorta Operations tiden och förhindra blödning.

Sammanfattnings vis kan denna modell vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka mekanismerna i mjälten cell populationen i svar på patogener, skada, inflammation, eller transplantatavstötning och är värdefull för testet av den terapeutiska potentialen av mjälte Transplantation. Med ordentlig träning och övning, kan denna procedur utföras med > 90% framgång.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författare tackar Northwestern University omfattande Transplant Center och Feinberg School of Medicine Research cores program för resurs-och finansierings stöd. Specifikt flödescytometri och histologi tjänster tillhandahölls av Northwestern University Flow Cytometri Core Facility och Mouse histologi och fenotypning laboratorium, respektive, som båda stöds av NCI P30-CA060553 tilldelas Robert H Lurie omfattande Cancer Center. Vi tackar Mr Nate Esparza för korrektur läsning Detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34, (5), 455-465 (2006).
  2. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5, (8), 606-616 (2005).
  3. Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9, (9), 428-437 (2017).
  4. Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99, (2), 392-398 (2014).
  5. Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95, (48), e5098 (2016).
  6. Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12, (12), 1314-1316 (2014).
  7. Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102, (8), 1333-1341 (2017).
  8. Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114, (14), 2861-2868 (2009).
  9. Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19, (2), 156-161 (2012).
  10. Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78, (3), 270-278 (1991).
  11. Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73, (2), 83-86 (1991).
  12. Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246, (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
  13. Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (50), 19075-19080 (2006).
  14. Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69, (6), 777-784 (1954).
  15. Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8, (1), 86-88 (1969).
  16. Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65, (3), 436-439 (1969).
  17. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, (5940), 612-616 (2009).
  18. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128, (7), 2833-2847 (2018).
  19. Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125, (2), 364-374 (2012).
  20. Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34, (8), 1411-1419 (2014).
  21. Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39, (5), 806-818 (2013).
  22. Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18, (2), 1470320317706653 (2017).
  23. Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111, (6), 62 (2016).
  24. Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200, (6), 1982-1987 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics