En muse model af vascularized Heterotopic milt transplantation for at studere milt cellebiologi og transplantations immunitet

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver de kirurgiske trin af en musemodel af vaskulariseret heterotop milt transplantation, en teknisk udfordrende model, der kan tjene som et kraftfuldt værktøj til at studere skæbne og levetiden af milt celler, mekanismerne i distinkte milt cellepopulationer i sygdomsprogression og transplantations immunitet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Milten er et unikt lymfoid organ, der spiller en afgørende rolle i homøostase af immun-og hæmatopoietiske systemer. Patienter, der har gennemgået splenektomi uanset udfældende årsager, er tilbøjelige til at udvikle en overvældende post-splenektomi infektion og opleve øget risiko for dyb venetrombose og maligniteter. For nylig indikerede epidemiologiske undersøgelser, at splenektomi kan være forbundet med forekomsten af hjerte-kar-sygdomme, hvilket tyder på, at de fysiologiske funktioner i milten endnu ikke er fuldt ud anerkendt. Her introducerer vi en musemodel af vaskulariseret heterotop milt transplantation, som ikke kun kan udnyttes til at studere funktion og adfærdsmæssige aktivitet af spleniske immuncelle undersæt i forskellige biologiske processer, men også kan være et kraftfuldt værktøj til at teste det terapeutiske potentiale af milt transplantation i visse sygdomme. De vigtigste kirurgiske trin i denne model omfatter donor milt høst, fjernelse af recipient indfødte milt, og milt graft revascularization. Ved hjælp af kongeniske muse stammer (f. eks. mus med CD 45.1/CD 45.2 baggrunde) observerede vi, at både donor-afledte spleniske lymfocytter og myeloide celler, der blev migreret ud af transplantatet så tidligt som postoperative dag 1, samtidig med tilstrømningen af flere typer af modtager celler, hvilket skaber en unik Chimera.  På trods af relativt udfordrende teknikker, denne procedure kan udføres med > 90% succesrate. Denne model gør det muligt at spore den skæbne, levetid, og funktion af splenocytes under Steady State og i en sygdom indstilling efter en milt transplantation, hvilket giver en stor mulighed for at opdage den særskilte rolle for milt-afledte immunceller i forskellige sygdomsprocesser.

Introduction

Milten er den største sekundære lymfoide organ i kroppen og er kritisk i immun og hæmatopoietiske systemer. Dens funktioner er primært udført af to morfologisk adskilte rum, den røde pulp og den hvide pulp1. Den røde pulp er en tredimensionel trabekelværket af venøse bihuler og milt ledninger, der består af rekulære fibre, rekulære celler, og tilhørende makrofager. Denne unikke struktur gør det muligt for den røde Pulp at fungere som et effektivt blod filter, der fjerner fremmede materialer og gamle eller beskadigede erythrocytter. Den hvide pulp omfatter follikler, marginal zone, og periarteriolar lymfoide skeder (Pals) og er et vigtigt sted for antigen fældefangst og forarbejdning, lymfocyt homing, transformation, proliferation, og modning2. Ikke desto mindre, milten har almindeligvis været betragtet som en udgivende organ, fordi andre lymfe organer, såsom lymfeknuder, kan også udføre nogle af sine funktioner og tabet af milt ikke normalt fører til døden. Splenektomi er derfor blevet bredt udført som en terapeutisk metode til patienter med milt skade eller benign hæmatologiske sygdomme3. Men, patienter med splenektomi står over for en række langsigtede komplikationer. Bakterielle infektioner er de bedst kendte komplikationer af splenektomy4,5. For nylig, den overvældende post-splenektomi sepsis er blevet anerkendt som en intensiv komplikation af splenektomi forbundet med en høj dødelighed6. Desuden tyder nylige epidemiologiske undersøgelser på, at splenektomi kan være forbundet med forekomsten af hjerte-kar-sygdomme, hvilket tyder på, at yderligere fysiologiske funktioner i milten stadig skal udforskes med7,8.

Både milt autotransplantation og milt allotransplantation er blevet udnyttet i klinikken. I øjeblikket anses milt autotransplantation ved at implanterer sektioner af splenisk væv i poser, der er skabt i Greater omentum, som den eneste mulighed for at bevare splenisk funktion efter traumatisk splenektomi9,10. Men, effekten af denne operation kan diskuteres som post-kirurgi komplikationer som aseptisk nekrose af milt væv og små tarmobstruktion på grund af postoperative klæbestoffer kan forekomme11. Milt allotransplantation er involveret i multi visceral transplantation12. Klinisk evidens fra multi visceral transplantation tyder på, at milt allotransplantation kan spille en beskyttende rolle i små tarm allograft afvisning uden at forårsage graft-versus-Host sygdom (GVHD)12. Men litteraturen om den gavnlige virkning af milt allotransplantation som bestanddel af multi visceral transplantation er stadig begrænset, og de underliggende mekanismer mangler at blive defineret. I 2006, Yair Reisner et al. rapporterede, at transplantations svin embryonale milt væv, der ikke har T-celler til mus kan helbrede hæmofili A, en genetisk sygdom uden at forårsage GVHD13, støtte, at milt transplantation holder terapeutiske løfte i visse sygdomme. Der er derfor behov for yderligere undersøgelser af det terapeutiske potentiale ved milt transplantation.

Dyremodeller af milt transplantation er værdifulde til at udforske den upåskønnede funktion af milt-afledte immunceller i sygdomsprogression samt til at teste den potentielle terapeutiske virkning af milt transplantation. Eksperimentelle hele milt transplantations modeller er blevet dokumenteret siden begyndelsen af 1900-tallet, som revideret af Cohen14. I 1969, Coburn Richard J. og Lee et al. detaljeret teknikken til milt transplantation i rotter15,16. For nylig beskrev Swirski FK et al. en musemodel af milt transplantation17. Sammenlignet med rotte modeller, musemodeller af milt transplantation er mere attraktive på grund af dens mange iboende fordele. For eksempel ved at udnytte en musemodel, kan vi få adgang til en ekspansiv række reagenser utilgængelige for at af rotte modeller. Ved at bruge kongeniske mus (f. eks. mus med CD 45.1/CD 45.2 baggrund) gør en syngeneisk milt transplantation det muligt at spore den skæbne, levetid og funktion af splenocytter18. Baseret på det arbejde, som Swirski FK et al.17, vi yderligere etableret denne forenklede og forbedrede protokol af milt transplantation i mus. Den protokol, der er beskrevet nedenfor kombinerer både pålidelighed og gennemførlighed på en standardiseret måde og kan udnyttes som et redskab til at studere milt biologi og transplantation immunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer og dyre brug i denne undersøgelse blev udført i henhold til protokoller godkendt af det nordvestlige Universitets interne udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC). I denne undersøgelse, 8 til 10 uge gamle mandlige CD 45.2 og CD 45.1 mus (både på Balb/c baggrund, fra Jackson laboratorium) blev brugt som milt donorer og recipienter, henholdsvis at skabe murinsynogene milt transplantation modeller. Alle dyr blev anbragt i det sterile miljø i dyre faciliteterne på Northwestern University. Øjen smøremidlet blev påført alle mus efter anæstesi for at forhindre tørhed.

1. kirurgisk præparat, Anæstetisering og analgetika regime

  1. Anbring en steril engangs drapere (45,7 cm x 66 cm) på Operations platformen. Tag forsigtigt fat i musen, Injicer ketamin (50 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) intraperitonealt (i. p) for anæstesi, og Injicer 0,05 mg/kg buprenorphin subkutant for analgesi.
  2. Sørg for dybden af anæstesi af tå-pinch, barbere håret i hele maven område med en barbermaskine og placere musen på den sterile kirurgiske platform under drift mikroskop ved 6-10x forstørrelse.

2. donor milt Harvest

  1. Steriliser maven med en alkohol prep pad, fastgør lemmer med kirurgisk tape, og gøre en 3-4 cm midterlinje lodret hud indsnit fra pubis til xiphoideus proces med saks.
  2. Træk bugvæggen tilbage med sterile retraktorer fremstillet af papirclips. Flyt tarmene til højre flanke af maven (kirurgens venstre) side med en steril vatpind til at eksponere milten. Den korte gastriske vene, der er fastgjort til milten med en steril lavtemperatur kauteri (figur 1a), skal være ætsende. Anbring et stykke sterilt gaze gennemblødt med 37 °C salt over milten for at holde det fugtigt (figur 1b).
  3. Adskille og mobilisere portalen vene fra bugspytkirtlen væv (figur 1c) ved at ligerende portalen vene grene (Superior pancreaticoduodenal vene og højre gastrisk vene); Anbring en sutur rundt om portalen, der er distalt fra den spleniske vene (figur 1d).
  4. Vend milten til højre side for at eksponere aorta-og cøliaki stammen med splenisk arterie (figur 1E). Dissekere og mobilisere aorta-cøliaki-splenic arterie ved ligerende den hepatiske arterie og gastrisk arterien; Læg en sutur rundt om aorta proksimal til cøliaki-arterie (figur 1f-G).
  5. Injicer 100 internationale enheder (IU) heparin i ringere Vena cava (IVC) til heparinize hele kroppen og vente 3 min at sikre heparin tage virkninger. Ligate aorta proksimal til cøliaki, transect portalen vene, og derefter perfuse hele kroppen ved hjælp af 10 ml hepariniseret kold (4 °c) saltvand (10 ml/20 s) fra abdominal aorta distale til cøliaki stammen (figur 1H).
  6. Saml milt transplantatet en bloc med det associerede aorta-Celiac-milt segment og Portal vene sammen med et segment af milt vene og en lille del af bugspytkirtlen væv. Opretholde transplantatet i 5 mL 4 °C saltvand før transplantation. Euthanize musen ved cervikal dislocation.

3. recipient splenektomi og Spleen graft implantation

  1. Anbring en varmepude på Operations platformen og justér temperaturen til 37 °C. Anbring en steril drapere (45,7 cm x 66 cm) oven på varmepuden for at skabe en steril kirurgisk platform. Gentag trin 2,1 og 2,2 for kirurgisk klargøring og anæstesi. Lav en 3-4 cm midterlinje indsnit og træk bugvæggen tilbage som beskrevet i trin 2,1 og trin 2,2.
  2. Flyt forsigtigt tarmen til højre side af musen med en steril vatpind for at afsløre modtagerens milt. Ligate den spleniske vene og arterien og fjerne milten.
  3. Flyt forsigtigt tarmen til venstre side af musen og dække tarmene med våd gaze (gennemblødt med steril 37 °C saltvand). Dissekere og fast lænde grene af infrarenal aorta og IVC; kryds klemme infrarenal aorta og IVC ved hjælp af to 4 mm mikrovaskulære klemmer.
  4. Placer en 11-0 nylon sutur gennem infrarenal aorta (en fuld tykkelse) og træk for at skabe en elliptisk aortotomi med en enkelt snit med mikrosaks (længden skal matche diameteren af donor aorta, figur 2a). Perforer IVC ved hjælp af en 30 G nål for at skabe en elliptisk venotomi og udvide åbningen til donor Portal vene-matchede længde ved hjælp af mikrosaks (figur 2a).
  5. Fjern det intraluminale blod eller blodprop (i aorta og IVC) med 500 μL hepariniseret saltvand (10 enheder/mL).
  6. Anbring milt transplantatet i højre flanke af modtagerens muse mave; omhyggeligt identificere donorens aorta manchet og donorens Portal vene. Efter at sikre, at beholderne ikke er snoet, dække milt transplantat med gaze gennemblødt med koldt (4 °C) saltvand.
  7. Tilslut donorens aorta manchet til den proksimale og distale spids af modtagerens ataotomi med to ophold suturer (11-0 nylon sutur, samme som nedenfor) (figur 2b, C). Lav en anastomose med 2-3 bid af kontinuerlige 11-0 nylon suturer mellem donorens aorta manchet og modtagerens aortaotomy (anterior væg) (figur 2D). Drej milten graft over til venstre side af modtageren; gøre anastomose mellem donorens aorta manchet og modtagerens atortotomi (posterior væg) (figur 2E).
  8. Udfør en anastomose til at forbinde donorens Portal vene til den bageste væg af modtagerens IVC, ved hjælp af 4 til 5 bid af kontinuerlige suturer på indersiden af IVC og derefter lukke sutur på ydersiden af IVC (figur 2F, G).
  9. Slip fartøjet klemmer og brug steril vatpind til tamponade blødning, indtil milt farven er genvundet (figur 2H).
  10. Luk maven med en 5-0 syntetisk absorber bar vicryl sutur i et kontinuerligt mønster. Luk hudlaget med en 5-0 nylon sutur i et afbrudte mønster.
    Bemærk: For trin 4.7-4.8, alternativt, lave en anastomose mellem donorens Portal vene og modtagerens IVC først (trin 4,8); derefter gøre en anastomose mellem donorens aorta manchet og den bageste væg af modtagerens atortotomi, ved hjælp af 2 til 3 kontinuerlige suturer i indersiden af aorta og lukke sutur på ydersiden af aorta.

4. inddrivelse af dyr

  1. Injicer 1 mL varm saltvandsindsprøjtning subkutant via 4 separate steder (0,25 mL/sted) efter lukning af maven.
  2. Hold musen i en temperaturkontrolleret kuvøse (30 °C) i de første timer efter operationen, Overvåg musen, indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed, og overfør derefter musen til et nyt, rent bur med regelmæssig mad og vand, med en varmepude (30 °C ) under buret. Hold musen efter operationen i et separat bur.

5. post-kirurgisk smertebehandling

  1. Injicer 0,05 mg/kg buprenorphin subkutant 24 timer og 48 h post-kirurgi for at opretholde analgetika regime.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele proceduren for mus milt transplantation kan afsluttes inden for 90 min af erfarne mikrokirurger. Vores laboratorium har udført over 100 milt transplantationer i mus. Succesraten er over 90%, som defineret ved overlevelse af både modtager mus og milt transplantatet til postoperative dag (POD) 1 eller POD 7 (vores undersøgelse Endpoint). Overlevelsen af milt transplantatet blev bekræftet af splenocytterne ved makroskopisk udseende og flow cytometri analyse. Baseret på vores erfaring, flow cytometri analyse (LIVE/DEAD Cell levedygtighed assays) er meget følsom over for at afgøre, om en milt transplantat er overlevet, da størstedelen af milt cellerne ville være død, hvis milt grafts var nekrotisk. De tekniske udfordringer ved denne procedure, almindelige komplikationer og deres fejlfinding er opsummeret i tabel 1.

For at teste transplantat morfologien efter transplantation blev Hætoxylin og eosin (H & E) farvning udført i milt isografts af BALB/c-mus ved POD 1 og POD 7. De repræsentative billeder er vist i figur 3. Arkitekturen i milten isografts forblev intakt i den første postoperative uge. Den røde Pulp, hvid Pulp, og den marginale zone var stadig klar og skelnes. At undersøge celle migration efter milt transplantation, flow cytometri blev udført på POD 1 og POD 7 til at undersøge fænotyper af leukocytter i milt isografts, lymfeknuder, blod, og knoglemarv. Som vist i figur 4aved Pod 1 var 51 ± 7% (gennemsnit ± SD, samme som nedenfor) af milt cellerne donor afledte, og 46 ± 3% var recipient afledte. Ved POD 7 tegnede leukocytter, der stammede fra donor, sig for 32 ± 10% af de samlede milt celler, og recipient afledte celler var op til 56 ± 13%. Vi bemærkede også, at milt leukocytter migreret ind i lymfeknuder, blod, og knoglemarv så tidligt på dag 1 og vedligeholdes på dag 7 (figur 4b), genererer en unik Chimera værdifuld for splenocyte menneskehandel forskning.

Tabel 1: Metoder til fejlfinding.

Figure 1
Figur 1: donor milt høst. (A) ætsende den korte gastriske vene, der er fastgjort til milten. (B) Anbring et lille stykke steril varm vådgaze over milten for at holde det fugtigt. (C) dissekere og isolere portalen vene bag bugspytkirtlen. (D) ligate de sidegrene af portalen vene og placere en sutur rundt Portalen vene distale til den spleniske vene. De stiplede linjer repræsenterer den placering, der gennemføres senere for anastomose med modtageren IVC. (E) Vend milt over til højre side af maven (kirurgens venstre) for at eksponere aorta og cøliaki stammen med sine grene, herunder milt arterie. (F) dissekere og mobilisere aorta-cøliaki-splenic arterie ved ligerende de to andre grene. G) Anbring en sutur rundt om aorta-proverale til cøliaki-arterie. De stiplede linjer repræsenterer den placering transecting senere bruges til anastomose med modtager abdominal aorta. (H) efter ligerende af aorta og transecting portalen vene, perfuse milten transplantatet med 10 ml hepariniseret saltvand gennem aorta. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: milt transplantat implantation. (A) efter isolation og kryds opspænding af aorta og IVC, fremstille en langsgående aortotomi og venotomi i henholdsvis aorta og IVC. (B-D) Anbring milt transplantatet på højre side af maven (kirurgens venstre side). Gør den ende-til-side anastomose mellem donor aorta manchet og den forreste væg af modtagerens aortotomi, ved hjælp af 2-3 bid af fortsættende sutur. E) Drej milt transplantatet over til modtagerens venstre flanke gentage den foregående procedure mellem donor aorta manchetten og den bageste væg af modtagerens atortotomi og lukke sutur på ydersiden af aorta. (F-G) Lav en ende-til-side anastomose mellem donor portalen vene og den bageste væg af modtagerens IVC, ved hjælp af 4 til 5 bid af kontinuerlig 11-0 nylon sutur i indersiden af IVC og derefter lukke sutur på ydersiden af IVC. (H) når du har fuldført anastomose, skal du frigive fartøjet klemmer og placere nogle bomulds knopper for at stoppe blødningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentativ histologi af milt isopoter på dag 1 og dag 7 efter operationen. Syngeneic milt transplantationer blev udført ved hjælp af BALB/c-mus. Milt isografts blev høstet på dag 1 og dag 7 efter transplantation og fast i 10% formalin for 48 h. H & E farvning blev udført ved hjælp af paraffin-indlejret væv sektion. Den repræsentative histologi viser, at milt isografterne forbliver intakte efter 1 uge efter transplantation. Skaleringsbar = 250 μm. POD, postoperativ dag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Chimera skabt af murinsynogene milt transplantation. Tre murinsynogene milt transplantationer blev udført ved hjælp af Balb/c CD 45.2 mus som donorer og Balb/c CD 45.1 mus som modtagere. Milt transplantationer, blod, lymfeknude (LN) og knoglemarv (BM) i recipient-mus blev høstet på dag 1 og dag 7 efter transplantation. Enkelt celle isolation og flow cytometri analyse blev udført for at analysere fænotype af cellerne. A) repræsentative prik områder (gating fra levende singletter), der viser procentdelen af donor eller recipient — afledte leukocytter i de angivne prøver. B) procenter (gennemsnit ± SEM) af de angivne populationer i donor-afledte celler i de angivne prøver på dag 1 og dag 7. POD = postoperativ dag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: repræsentative observationsområder (n = 3), der viser procentdelen af donor-afledt versus recipient-afledte lymfocytter i den transplanterede milt, lymfeknude, blod og knoglemarv. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: repræsentative observationsområder (n = 3), der viser procentdelen af donor-afledt versus recipient-afledt CD11b + Ly6C + monocytter i den transplanterede milt, lymfeknude, blod og knoglemarv. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Overbevisende beviser antyder, at milt-afledte monocytter spiller en vigtig rolle i sterile inflammatoriske processer såsom åreforkalkning19, akut iskæmisk hjerne20 eller lungeskade18, samt myokardial I/R skade og remodeling21,22,23. Disse rapporter fremhæver under-anerkendelse rolle milten i mange kroniske sygdomme, hvoraf hjerte-kar-sygdom er en vigtig en (især i betragtning af det er nummer et dræber globalt). Musen model af milt transplantation tilbyder en stor mulighed for at opdage den rolle, milt-afledte immunceller i forskellige sygdomme samt hvordan de er primet i milten. For eksempel, ved hjælp af musemodeller af milt transplantation, Swirski et al. fandt, at som reaktion på iskæmisk myokardial skade, milt-afledte monocytter øge deres motilitet, migrere ud af milten, overholde skadet væv, og bidrage til sårheling17. Endvidere, denne model er nyttig til at løse de Londe vities af modne immunceller i milten og underliggende mekanismer og til at udforske terapeutiske potentialer af milt transplantation.

Der bør tages hensyn til flere aspekter for at forbedre denne protokols succes. For det første er det afgørende at vælge de rigtige forsøgsdyr i løbet af designprocessen, da musens vægt, stamme og helbredstilstand kan påvirke sværhedsgraden af de kirurgiske trin og eksperimentelle resultater. Vores laboratorium anbefaler at bruge 8 til 12-ugers gamle mus med over 25 g vægt for at mindske dødeligheden, der kan være forårsaget af blødning. For det andet, under milt høst procedure, for meget manipulation af milt fartøjer kunne let føre til avl eller vasospasme og potentielt resultere i mikro trombose i milt transplantatet. At blive fortrolig med anatomien af musens abdomen før operationen ville være nyttigt at fremskynde læringsprocessen. For det tredje skal milt transplantatet altid holdes fugtigt og køligt under modtager operationen. Passende beskyttelse af milt transplantationer kan reducere transplantationen iskæmi/reperfusion (I/R) skade og forhindre transplantat fiasko efter transplantation. Desuden, i betragtning af, at Donorfartøjer til anastomose er relativt lange, positionering milt grafts korrekt før anastomose er afgørende for at forhindre vridning af fartøjerne. Desuden bør diametrene af recipient-aortotomi og venotomi af IVC altid være sammenlignelig med dem af donor aorta og Portal vene for at sikre korrekt blodgennemstrømning og forebygge trombose.

Den gennemsnitlige opbevaringstid for milt transplantationer i 4 °C saltvand er omkring 10 min. Den totale iskæmiske tid bør begrænses til mindre end 50 min for at sikre et minimum transplantations svigt. Vi anbefaler at bruge University of Wisconsin (UW) kold opbevaring løsning til at bevare milt transplantatet, hvis over 1 h kold, iskæmisk tid er nødvendig i undersøgelser. Det skal bemærkes, at en lille del af bugspytkirtlen tæt vedhæfte med milten, og forsøg på at fjerne hele fra milt grafts ville nemt føre til graft eller vaskulære komplikationer og markant øge operationstid. Vi bemærkede, at bugspytkirtlen væv knyttet til milt transplantatet ville undergå atrofi på POD 7 selv om nogle forblev levedygtig med milt grafts. Om ikke at fjerne bugspytkirtlen væv fastgjort med milt grafts afhænger af forskningsformål.

Tilgængeligheden af kongene mus har gjort det muligt at spore oprindelsen af milt cellerne, donor versus recipient efter transplantation. I denne undersøgelse brugte vi Balb/c CD 45.2 og Balb/c CD 45.1 kongene mus som milt donorer og modtagere til at skabe en murinsynogene milt transplantation model. Organ-eller vævstransplantation mellem disse kongene muse stammer er blevet udbredt til at spore oprindelsen og udviklingen af immunsystemet. På trods af den seneste rapport om en punkt mutation forbundet med CD 45.1, der påvirker NK celle respons24, ingen transplantation afvisning blev rapporteret mellem disse stamme kombinationer. Vi observerede en betydelig tilstrømning af modtager celler til milt transplantationer, der forekom så hurtigt som ved POD 1. Det er sandsynligt, at modtager cellerne reagerede på transplantations-I/R-skaden, da størstedelen af modtager cellerne var granulocytter. Vores resultater viste, at en relativ høj procentdel af spleniske lymfocytter forblev af donor oprindelse. Mere interessant, disse lymfocytter migreret til (genbefolket) i andre lymfoide rum (lymfeknude, knoglemarv, og cirkulation). Disse fund tilskynde os til at spekulere, at lymfocytter, der stammer fra milt er meget vigtigt i den adaptive immunitet. Der er imidlertid behov for flere undersøgelser for at afgrænse de særlige roller for spleniske lymfocytter i adaptiv versus medfødt immunitet (figur 4, supplerende figur 1 og supplerende figur 2).

Den største begrænsning af denne protokol er, at det kræver omfattende mikrokirurgisk træning for personer med begrænset mikrokirurgisk erfaring til at mestre denne teknik. Baseret på vores læringserfaring i overordnede mus solid organtransplantation modeller (f. eks, mus hjerte, lunge, eller nyretransplantation), det kan tage 6-10 måneder for en nyuddannet person (uden nogen eksperimentel mikrokirurgisk teknik) til dygtigt mestre denne Teknik. Sammenlignet med musemodeller af hjerte, eller nyretransplantation, denne model kunne være mere udfordrende, da det indebærer yderligere væv dissektion skridt til at isolere milt graft under donor procedurer. Desuden er diameteren af donor portalen vene (omkring 0,6 mm) mindre end IVC, hvilket gør det vanskeligere for anastomose. En anden begrænsning er, at det ikke er klart, om den podede milt ville blive massivt invaderet af modtagerens celler ved senere transplantation fase (f. eks POD 60). Men denne model er også meget attraktiv for sine mange iboende fordele. For det første, mus og mennesker deler en betydelig række af lignende genomer, hvilket giver mulighed for en forholdsvis præcis repræsentation af en realistisk anvendelse. Desuden, sammenligne med musen model af ikke-vaskulariseret milt autotransplantation ved hjælp af sektioner af milt væv, denne vaskulariseret milt transplantations model er mindre tilbøjelige til at udvikle komplikationer såsom aseptisk nekrose af milt væv og tarmobstruktion på grund af postoperative klæbestoffer.

Musemodellen for milt transplantation er tidligere blevet rapporteret af Swirski FK et al. De detaljerede oplysninger blev imidlertid ikke beskrevet.  Vores undersøgelse giver en omfattende trin-for-trin protokol af mus milt transplantation for interesserede forskere til at følge og til mater denne teknik. Desuden eliminerer denne protokol flere unødvendige trin, der er beskrevet i rapporten fra Swirski FK et al. (f. eks. galde kanalens ligation) og introducerer 11-0 sutur for anastomose, hvilket ville hjælpe med at forkorte den kirurgiske tid og forhindre blødning.

Afslutningsvis, denne model kunne være et effektivt redskab til at udforske mekanismerne i den milt cellepopulation i reaktioner på patogener, skade, betændelse, eller transplantation afvisning og er værdifuld for testen af det terapeutiske potentiale af milten Transplantation. Med ordentlig uddannelse og praksis, kan denne procedure udføres med > 90% succes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfattere tak Northwestern University omfattende transplantations Center og Feinberg School of Medicine Research Cores program for ressource-og finansieringsstøtte. Specifikt, flow cytometry og histologi tjenester blev leveret af Northwestern University flow cytometry Core Facility og Mouse histologi og phenotyping laboratorium, som begge er støttet af NIC P30-CA060553 tildelt Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi takker hr. Nate Esparza for korrekturlæsning af dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34, (5), 455-465 (2006).
  2. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5, (8), 606-616 (2005).
  3. Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9, (9), 428-437 (2017).
  4. Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99, (2), 392-398 (2014).
  5. Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95, (48), e5098 (2016).
  6. Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12, (12), 1314-1316 (2014).
  7. Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102, (8), 1333-1341 (2017).
  8. Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114, (14), 2861-2868 (2009).
  9. Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19, (2), 156-161 (2012).
  10. Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78, (3), 270-278 (1991).
  11. Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73, (2), 83-86 (1991).
  12. Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246, (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
  13. Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (50), 19075-19080 (2006).
  14. Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69, (6), 777-784 (1954).
  15. Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8, (1), 86-88 (1969).
  16. Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65, (3), 436-439 (1969).
  17. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, (5940), 612-616 (2009).
  18. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128, (7), 2833-2847 (2018).
  19. Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125, (2), 364-374 (2012).
  20. Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34, (8), 1411-1419 (2014).
  21. Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39, (5), 806-818 (2013).
  22. Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18, (2), 1470320317706653 (2017).
  23. Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111, (6), 62 (2016).
  24. Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200, (6), 1982-1987 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics