Um modelo de camundongo de transplante de baço heterotópico vascularizado para estudar a biologia celular do baço e a imunidade a transplantes

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Summary

Este protocolo detalha as etapas cirúrgicas de um modelo do rato da transplantação Heterotopic vascularized do spleen, um modelo tecnicamente desafiante que possa serir como uma ferramenta poderosa em estudar o Fate e a longevidade de pilhas do spleen, os mecanismos do spleen distinto populações de células na progressão da doença e imunidade ao transplante.

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Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

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Abstract

O baço é um órgão linfoide único que desempenha um papel crítico na homeostase dos sistemas imunológico e hematopoiético. Os pacientes que foram submetidos a esplenectomia independentemente das causas precipitantes são propensos a desenvolver uma infecção pós-esplenectomia esmagadora e experimentam riscos aumentados de trombose venosa profunda e malignidades. Recentemente, estudos epidemiológicos indicaram que a esplenectomia pode estar associada à ocorrência de doenças cardiovasculares, sugerindo que as funções fisiológicas do baço ainda não foram totalmente reconhecidas. Aqui, nós introduzimos um modelo do rato do transplante Heterotopic vascularized do spleen, que pode não somente ser utilizado para estudar a função e a atividade comportável de subconjuntos imunes splenic da pilha em processos biológicos diferentes, mas igualmente pode ser uma ferramenta poderosa para testar o potencial terapêutico do transplante de baço em certas doenças. As etapas cirúrgicas principais deste modelo incluem a colheita fornecedora do spleen, a remoção do spleen nativo receptor, e o Revascularization do enxerto do spleen. Usando estirpes congênicas de camundongo (por exemplo, camundongos com CD de 1/1/CD 45,2 fundos), observamos que após o transplante sintémico, tanto os linfócitos esplênicos derivados do doador quanto as células mielóides migraram para fora do enxerto logo após o dia pós-operatório 1, concomitante com o influxo de vários tipos de células receptoras, gerando assim uma quimera única.  Apesar de técnicas relativamente desafiadoras, este procedimento pode ser realizado com > 90% de taxa de sucesso. Este modelo permite rastrear o destino, a longevidade e a função dos esplendócitos durante o estado estacionário e em um ambiente de doença após um transplante de baço, oferecendo assim uma grande oportunidade para descobrir o papel distinto para as células imunes do baço em diferentes processos de doença.

Introduction

O baço é o maior órgão linfóide secundário do corpo e é crítico nos sistemas imunológico e hematopoiético. Suas funções são realizadas principalmente por dois compartimentos morfologicamente distintos, a polpa vermelha e a polpa branca1. A polpa vermelha é uma malha tridimensional de seios venosos e de cordas esplênica que consistem em fibras reticulares, células reticulares e macrófagos associados. Esta estrutura original permite que a polpa vermelha aja como um filtro de sangue eficaz que remova materiais extrangeiros e eritrócitos velhos ou danificados. A polpa branca inclui folículos, zona marginal e bainhas linfoides periarteriolares (PALS) e é um local importante para a captura e processamento de antígenos, homing de linfócitos, transformação, proliferação e maturação2. No entanto, o baço tem sido comumente considerado como um órgão dispensável porque outros órgãos linfáticos, como linfonodos, também podem realizar algumas de suas funções e a perda do baço geralmente não leva à morte. A esplenectomia, portanto, tem sido amplamente realizada como um método terapêutico para pacientes com lesão esplênica ou doenças hematológicas benignas3. Entretanto, os pacientes com esplenectomia enfrentam um número de complicações a longo prazo. As infecções bacterianas são as complicações mais reconhecidas da esplenectomia4,5. Recentemente, o sepsis borne-esplenectomia oprimindo foi reconhecido como uma complicação intensiva do esplenectomia associado com uma mortalidade elevada6. Além disso, estudos epidemiológicos recentes indicam que a esplenectomia pode estar associada à ocorrência de doenças cardiovasculares, sugerindo que outras funções fisiológicas do baço continuem a ser exploradas7,8.

Tanto o autotransplante do baço quanto o alotransplante do baço têm sido utilizados na clínica. Atualmente, o autotransplante de baço por implante de seções de tecido esplênico em bolsas criadas no omento maior é considerado como a única possibilidade de preservação da função esplênica após a esplenectomia traumática9,10. Entretanto, a eficácia desta cirurgia é discutível porque as complicações da borne-cirurgia como a necrose asséptica do tecido splenic e a obstrução pequena das entranhas devido às adesões postoperative poderiam ocorrer11. O alotransplante de baço está envolvido na transplantação multivisceral12. A evidência clínica da transplantação multivisceral sugere que o allotransplante do spleen possa jogar um papel protetor na rejeição pequena do aloenxerto das entranhas sem causar a doença do transplantar-contra-anfitrião (GVHD)12. No entanto, a literatura sobre o efeito benéfico do alotransplante de baço como componente do transplante multivisceral ainda é limitada e os mecanismos subjacentes permanecem a ser definidos. Em 2006, Yair Reisner et al. relataram que o transplante de tecido esplênico embrionário de suínos que não tem células T para camundongos poderia curar Hemofilia A, uma doença genética sem causar a GVHD13, apoiando que a transplantação do baço detém a promessa terapêutica em certas doenças. Conseqüentemente, há uma necessidade para umas investigações mais adicionais no potencial terapêutico da transplantação do spleen.

Os modelos animais da transplantação do spleen são valiosos explorar a função não apreciada das pilhas imunes Spleen-derivadas na progressão da doença assim como para testar o efeito terapêutico potencial da transplantação do spleen. Modelos experimentais de transplante de baço inteiros foram documentados desde o início de 1900, como revisado por Cohen14. Em 1969, Coburn Richard J. e Lee et al. detalhou a técnica de transplante de baço em ratos15,16. Mais recentemente, Swirski FK et al. descreveram um modelo de camundongo de transplante de baço17. Comparado aos modelos do rato, os modelos do rato do transplante do spleen são mais atrativos devido a suas diversas vantagens inerentes. Por exemplo, utilizando um modelo de mouse, podemos acessar uma ampla variedade de reagentes não disponíveis para os modelos de ratos. Além disso, usando camundongos congênicos (por exemplo, camundongos com fundo CD/CD/45,2), um transplante de baço singeneico possibilita rastrear o destino, a longevidade e a função dos esócito18. Com base no trabalho de Swirski FK et al.17, estabelecemos ainda este protocolo simplificado e aprimorado de transplante de baço em camundongos. O protocolo descrito abaixo combina a confiabilidade e a viabilidade de forma padronizada e pode ser utilizado como uma ferramenta para estudar a biologia do baço e a imunidade ao transplante.

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Protocol

Todos os procedimentos e uso de animais neste estudo foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê interno de cuidado e uso de animais da Universidade do noroeste (IACUC). Neste estudo, 8 a 10 semanas de idade do sexo masculino CD 45,2 e CD (ambos no fundo BALB/c, do laboratório de Jackson) foram utilizados como doadores de baço e receptores, respectivamente, para criar modelos de transplante de baço singeneico. Todos os animais foram alojados no ambiente estéril nas instalações de animais da Northwestern University. O lubrificante ocular foi aplicado a todos os camundongos pós-anestesiarização para evitar a secura.

1. preparo cirúrgico, anestesia e regime de analgesia

  1. Coloc um drapeje descartável estéril (45,7 cm x 66 cm) na plataforma cirúrgica. Agarre suavemente o rato, injete cetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitonealmente (i. p) para anestesia, e injete 0, 5 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia.
  2. Assegure a profundidade da anestesia pelo dedo do pé-pinch, raspe o cabelo na área inteira do abdômen com uma lâmina e coloc o rato na plataforma cirúrgica estéril o microscópio de funcionamento na ampliação 6-10x.

2. colheita do baço doador

  1. Esterilize o abdômen com uma almofada da preparação do álcool, prenda os membros com fita cirúrgica, e faça uma incisão vertical da pele do midline de 3-4 cm do púbis ao processo do xifóide com tesouras.
  2. Retrair a parede abdominal com os afastadores estéreis feitos dos paperclips. Mova os intestinos para o flanco direito do lado do abdômen (esquerda do cirurgião) com um cotonete de algodão estéril para expor o baço. Cauterize a veia gástrica curta presa ao baço com um cauterização estéril de baixa temperatura (Figura 1a). Coloque um pedaço de gaze estéril embebido com 37 ° c salina sobre o baço para mantê-lo úmido (Figura 1b).
  3. Separar e mobilizar a veia porta do tecido pancreático (Figura 1C) por meio da ligante das ramificações da veia porta (veia pancreaticoduodenal superior e veia gástrica direita); coloc uma sutura em torno da veia portal longe do ponto de origem da veia splenic (Figura 1D).
  4. Vire o baço para o lado direito para expor a aorta e o tronco celíaco com a artéria esplênica (Figura 1e). Dissecar e mobilizar a artéria aórtica-celíaca-splenic ligando a artéria hepatic e a artéria gastric; coloc uma sutura em torno da aorta proximal à artéria celíaca (Figura 1F-G).
  5. Injete 100 unidades internacionais (UI) de heparina na veia cava inferior (IVC) para heparinizar todo o corpo e aguarde 3 min para garantir que a heparina tome efeitos. Ligate a aorta proximal à artéria celíaca, transecto a veia portal, e perfuse então o corpo inteiro usando 10 ml do frio heparinizado (4 ° c) salino (10 ml/20 s) da aorta abdominal longe do ponto de origem ao tronco celíaco (Figura 1h).
  6. Colete o enxerto de baço em bloco com o segmento aórtico-celíaco-esplênico associado e a veia porta, juntamente com um segmento de veia esplênica e uma pequena porção de tecido pancreático. Preservar o enxerto em 5 mL de soro fisiológico a 4 ° c antes do transplante. Eutanizar o rato por luxação cervical.

3. implante de SPLENECTOMY e do enxerto do spleen do receptor

  1. Coloque uma almofada de aquecimento na plataforma cirúrgica e ajuste a temperatura para 37 ° c. Coloc um Drape estéril (45,7 cm x 66 cm) sobre a almofada de aquecimento para criar uma plataforma cirúrgica estéril. Repita as etapas 2,1 e 2,2 para a preparação cirúrgica e a anestesiarização. Fazer uma incisão de 3-4 cm Midline e retrair a parede abdominal como descrito na etapa 2,1 e etapa 2,2.
  2. Mova cuidadosamente o intestino para o lado direito do rato com um cotonete de algodão estéril para expor o baço do receptor. Ligate a veia esplênica e artéria e retire o baço.
  3. Mova cuidadosamente o intestino para o lado esquerdo do rato e cubra os intestinos com gaze molhada (embebido em soro fisiológico estéril a 37 ° c). Dissecar e ligadura os ramos lombares da aorta infrarrenal e IVC; Cruz-braçadeira a aorta do infrarrenal e o IVC usando duas braçadeiras microvascular de 4 milímetros.
  4. Colocar uma sutura de nylon 11-0 através da aorta infrarrenal (uma espessura total) e retrair para criar uma aortotomia elíptica por um único corte com Microtesoura (o comprimento deve corresponder ao diâmetro da aorta fornecedora, Figura 2a). Perfure o IVC usando uma agulha de 30 G para criar uma venotomia elíptica e estenda a abertura ao comprimento combinado veia portal doador usando Microtesoura (Figura 2a).
  5. Limpe o sangue intraluminal ou coágulo sanguíneo (na aorta e IVC) com 500 μL de soro fisiológico heparinizado (10 unidades/mL).
  6. Coloc a corrupção do spleen no flanco direito do abdômen do rato do receptor; identificar cuidadosamente o manguito aórtico do doador e a veia porta do doador. Depois de certificar-se de que os vasos não são torcidos, cubra o enxerto de baço com gaze embebido com soro fisiológico (4 ° c) frio.
  7. Conecte o manguito aórtico do doador ao ápice proximal e distal da aortaotomia do receptor com duas suturas de permanência (11-0 sutura de náilon, igual a abaixo) (Figura 2b, C). Faça uma anastomose com 2-3 picadas de sutura contínua de nylon 11-0 entre o manguito aórtico do doador e a aortaotomia do receptor (parede anterior) (Figura 2D). Gire o enxerto do baço para o lado esquerdo do receptor; fazer a anastomose entre o manguito aórtico do doador e a aortotomia do receptor (parede posterior) (Figura 2e).
  8. Realize uma anastomose para conectar a veia porta do doador à parede posterior da VCI do receptor, usando 4 a 5 picadas de suturas contínuas no interior da VCI e, em seguida, feche a sutura do lado de fora do IVC (Figura 2F, G).
  9. Solte as braçadeiras do vaso e use cotonete estéril para tamponamento de sangramento até que a cor do baço seja recuperada (Figura 2h).
  10. Feche o abdômen com uma sutura 5-0 sintética absorvível Vicryl em um padrão contínuo. Feche a camada da pele com uma sutura de nylon 5-0 em um padrão interrompido.
    Nota: Para as etapas 4.7-4.8, alternativamente, faça uma anastomose entre a veia portal do doador e o IVC do receptor primeiramente (etapa 4,8); em seguida, faça uma anastomose entre o manguito aórtico do doador e a parede posterior da aortotomia do receptor, usando 2 a 3 suturas contínuas no interior da aorta e feche a sutura do lado de fora da aorta.

4. recuperação animal

  1. Injete 1 mL de soro fisiológico quente por via subcutânea através de 4 locais separados (0,25 mL/local) após fechar o abdômen.
  2. Mantenha o mouse em uma incubadora com temperatura controlada (30 ° c) durante as primeiras horas após a operação, monitore o mouse até recuperar a consciência suficiente e, em seguida, transfira o mouse para uma nova gaiola limpa com comida e água regulares, com uma almofada de aquecimento (30 ° c ) embaixo da gaiola. Mantenha o mouse após a cirurgia em uma gaiola separada.

5. gestão da dor pós-cirúrgica

  1. Injete 0, 5 mg/kg de buprenorfina subcutaneamente 24 h e 48 h após a cirurgia para manter o regime de analgesia.

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Representative Results

O procedimento inteiro da transplantação do spleen do rato pode ser terminado dentro de 90 minutos por microcirurgiões experientes. Nosso laboratório realizou mais de 100 transplantes de baço em camundongos. A taxa de sucesso é de mais de 90%, conforme definido pela sobrevida do rato receptor e do enxerto do baço para o dia pós-operatório (POD) 1 ou POD 7 (nosso ponto final do estudo). A sobrevivência da corrupção do spleen foi confirmada pela análise macroscópica da aparência e do fluxo citometria dos splenocytes. Com base em nossa experiência, a análise de citometria de fluxo (ensaios de viabilidade de células mortas/vivos) é muito sensível para determinar se um enxerto de baço é sobrevivido, pois a maioria das células do baço estaria morta se os enxertos de baço fossem necróticos. Os desafios técnicos deste procedimento, complicações comuns e sua solução de problemas estão resumidos na tabela 1.

Para testar a morfologia do enxerto pós-transplante, a coloração de Hemotoxylin e eosina (H & E) foi realizada em isoenxertos de baço de camundongos BALB/c no POD 1 e no POD 7. As figuras representativas são mostradas na Figura 3. A arquitetura dos isoenxertos do baço permaneceu intacta durante a primeira semana de pós-operatório. A polpa vermelha, a polpa branca e a zona marginal ainda eram claras e distinguíveis. Para investigar a migração celular após o transplante de baço, a citometria de fluxo foi realizada no POD 1 e no POD 7 para examinar os fenótipos de leucócitos nos isoenxertos do baço, linfonodos, sangue e medula óssea. Como mostrado na figura 4a, no pod 1, 51 ± 7% (média ± DP, igual a abaixo) das células do baço foram derivados do doador e 46 ± 3% foram derivados do receptor. No POD 7, os leucócitos derivados do doador representaram 32 ± 10% das células totais do baço, e as células derivadas do receptor foram de até 56 ± 13%. Observou-se também que os leucócitos do baço migraram para os linfonodos, sangue e medula óssea no início do dia 1 e mantidos no 7º dia (Figura 4B), gerando uma quimera única valiosa para a pesquisa do tráfico de esócito.

Tabela 1: Métodos de solução de problemas.

Figure 1
Figura 1: colheita do baço do doador. (A) cauterizar a veia gástrica curta presa ao baço. (B) Coloque um pequeno pedaço de gaze úmida quente estéril sobre o baço para mantê-lo úmido. (C) dissecar e isolar a veia portal atrás do pâncreas. (D) ligate os ramos laterais da veia porta e coloque uma sutura em volta da veia porta distal à veia esplênica. As linhas tracejadas representam o local que transecting mais tarde para a anastomose com o receptor IVC. (E) vire o baço para o lado direito do abdômen (esquerda do cirurgião) para expor a aorta e o tronco celíaco com seus ramos, incluindo a artéria esplênica. (F) dissecar e mobilizar a artéria aórtica-celíaca-splenic ligando os dois outros ramos. (G) coloc uma sutura em torno da aorta proximal à artéria celíaca. As linhas tracejadas representam o local que transecting usado mais tarde para a anastomose com a aorta abdominal destinatária. (H) após braquetes autoligáveis a aorta e transecting a veia portal, perfuse a corrupção do spleen com 10 ml do soro fisiológico heparinizado através da aorta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: implante de enxerto de baço. (A) após a isolação e a cruz que aperta a aorta e o IVC, faça um aortotomia longitudinal e uma venotomia na aorta e no IVC, respectivamente. (B-D) Coloque o enxerto do baço no lado direito do abdômen (lado esquerdo do cirurgião). Faça a anastomose fim-a-lado entre o manguito aórtico doador e a parede anterior da aortotomia do receptor, usando 2-3 picadas de sutura contínua. (E) Gire o enxerto do baço para o flanco esquerdo do receptor; Repita o procedimento prévio entre o manguito aórtico doador e a parede posterior da aortotomia do receptor e feche a sutura na parte externa da aorta. (F-G) Faça uma anastomose fim-a-lado entre a veia portal fornecedora e a parede do posterior do receptor ' IVC de s, usando 4 a 5 mordidas da sutura contínua do nylon 11-0 no interior do IVC e feche então a sutura na parte externa do IVC. (H) depois de completar a anastomose, solte as braçadeiras do vaso e coloque alguns cotonetes para ajudar a parar o sangramento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: histologia representativa de isoenxertos de baço no dia 1 e dia 7 pós-operação. Os transplantações do spleen de syngeneic foram executados usando ratos de BALB/c. Os isoenxertos de baço foram colhidos no dia 1 e dia 7 pós-transplante e fixados em formalina a 10% para 48 h. a coloração de H & E foi realizada por meio de seção de tecido embebido em parafina. A histologia representativa mostra que os isoenxertos do baço permanecem intactos em 1 semana após o transplante. Barra de escala = 250 μm. POD, dia pós-operatório. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A Quimera criada pela transplantação syngeneic do spleen. Três transplantações de baço singeneico foram realizadas utilizando camundongos BALB/c CD 45,2 como doadores e camundongos BALB/c CD-de-3 como receptores. Os enxertos de baço, sangue, linfonodo (LN) e medula óssea (BM) em camundongos beneficiários foram colhidos no dia 1 e dia 7 pós-transplante. Foram realizadas análises de isolamento e citometria de fluxo de células únicas para analisar o fenótipo das células. (A) parcelas representativas do ponto (gating de singlets vivos) que mostram as porcentagens do doador ou do receptor-leucócito derivado nas amostras indicadas. (B) porcentagens (média ± MeV) das populações indicadas em células derivadas de doadores nas amostras indicadas no dia 1 e 7º dia. POD = dia pós-operatório. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Figura 1: parcelas representativas (n = 3) mostrando as porcentagens de linfócitos derivados do doador versus receptor derivado no baço transplantado, linfonodo, sangue e medula óssea. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura complementar 2: parcelas representativas (n = 3) mostrando as porcentagens de monócitos derivados do doador versus receptor-derivados CD11b + Ly6C + no baço transplantado, linfonodo, sangue e medula óssea. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Evidências convincentes sugerem que os monócitos derivados do baço desempenham um papel importante em processos inflamatórios estéreis, como aterosclerose19, cérebro isquêmico agudo20 ou lesão pulmonar18, bem como lesão miocárdica I/R e remodelação21,22,23. Esses relatos destacam o papel de subreconhecimento do baço em muitas doenças crônicas, das quais a doença cardiovascular é importante (especialmente dado que é o assassino número um globalmente). O modelo do rato do transplante de baço oferece uma grande oportunidade para descobrir o papel das células imunes do baço em várias doenças, bem como como eles são aprontado no baço. Por exemplo, usando os modelos de camundongo do transplante de baço, Swirski et al. descobriram que, em resposta à lesão miocárdica isquêmica, os monócitos derivados do baço aumentam sua motilidade, migram para fora do baço, aderem ao tecido lesionado e contribuem para a cicatrização de feridas17. Além disso, este modelo é útil endereçar as longevidades de pilhas imunes maduras no spleen e nos mecanismos subjacentes e explorar potenciais terapêuticos do transplante do spleen.

Vários aspectos devem ser levados em consideração para melhorar o sucesso deste protocolo. Primeiro, é fundamental escolher os animais experimentais adequados durante o processo de desenho, uma vez que o peso do mouse, a cepa e a condição de saúde podem afetar a dificuldade das etapas cirúrgicas e os resultados experimentais. Nosso laboratório recomenda o uso de camundongos de 8 a 12 semanas de idade com mais de 25 g de peso para diminuir a mortalidade que pode ser causada por sangramento. Em segundo lugar, durante o procedimento de colheita do baço, demasiada manipulação dos vasos do baço poderia facilmente levar à reprodução ou vasoespasmo e potencialmente resultar em micro trombose no enxerto do baço. Familiarizando-se com a anatomia do abdômen do rato antes da cirurgia seria útil para acelerar o processo de aprendizagem. Em terceiro lugar, durante a cirurgia do receptor, o enxerto do baço deve ser sempre mantido úmido e fresco. A proteção adequada dos enxertos de baço pode reduzir a lesão de isquemia/reperfusão (I/R) do transplante e prevenir a falência do enxerto após o transplante. Além disso, Considerando que os vasos doadores para anastomose são relativamente longos, posicionando os enxertos de baço adequadamente antes que a anastomose seja crítica para evitar a torção dos vasos. Além disso, os diâmetros do aortotomia e do proximal do receptor de IVC devem sempre ser comparáveis àqueles da aorta fornecedora e da veia portal para assegurar o fluxo de sangue apropriado e para impedir o thrombosis.

O tempo médio de armazenamento dos enxertos de baço em soro fisiológico a 4 ° c é de cerca de 10 min. O tempo de isquemia total deve ser limitado a menos de 50 min para assegurar a falha mínima do transplante. Nós recomendamos usar a Universidade de Wisconsin (UW) solução de armazenamento a frio para preservar o enxerto do baço, se mais de 1 h frio, o tempo isquêmico é necessário em estudos. Deve-se notar que uma pequena porção do pâncreas intimamente anexar com o baço, e tentar remover o todo dos enxertos do baço levaria facilmente a enxerto ou complicações vasculares e acentuadamente aumentar o tempo de operação. Nós observamos que o tecido do pâncreas Unido ao enxerto do spleen se submeteria à atrofia no vagem 7 embora alguns permanecessem viáveis com os enxertos do spleen. Se remover ou não o tecido do pâncreas Unido com enxertos do spleen depende das finalidades da pesquisa.

A disponibilidade de camundongos congênicos possibilitou rastrear a origem das células esplênicas, doador versus receptor após o transplante. Neste estudo, foram utilizados os camundongos BALB/c CD 45,2 e BALB/c CD, com ratos congênicos, como doadores de baço e receptores para criar um modelo de transplante de baço singeneico. A transplantação do órgão ou do tecido entre estas estirpes congénicas do rato foi usada extensamente para seguir a origem e o desenvolvimento do sistema imunitário. Apesar do relatório recente a respeito de uma mutação de ponto associou com o CD-o-n que influencia a resposta da pilha NK24, nenhuma rejeição do transplante foi relatada entre estas combinações da tensão. Nós observamos um afluxo substancial de pilhas do receptor em corrupções do Spleen que ocorreram assim que no pod 1. É provável que as pilhas do receptor responderam ao ferimento do I/R da transplantação porque a maioria das pilhas do receptor era granulocytes. Nossos resultados mostraram que uma porcentagem relativamente elevada de linfócitos splenic remanesceu da origem fornecedora. Mais interessante, esses linfócitos migraram para (repovoada) em outros compartimentos linfóides (linfonodo, medula óssea e circulação). Estes resultados Alertem-nos especular que os linfócitos que originaram dos baços são muito importantes na imunidade adaptativa. No entanto, mais investigações são necessárias para delinear os distintos papéis dos linfócitos esplênico em imunidade adaptativa versus inata (Figura 4, complementar Figura 1 e complementar Figura 2).

A limitação principal deste protocolo é que exige o treinamento microsurgical extensivo para indivíduos com experiência microsurgical limitada para dominar esta técnica. Com base em nossa experiência de aprendizado em modelos globais de transplante de órgãos sólidos de mouse (por exemplo, coração de rato, pulmão ou transplante de rim), pode levar 6-10 meses para uma pessoa recém-treinada (sem qualquer técnica microcirúrgica experimental) para dominar habilmente esta Técnica. Comparado aos modelos do rato do coração, ou transplantação do rim, este modelo poderia ser mais desafiante desde que envolve etapas adicionais da dissecção do tecido para isolar a corrupção do spleen durante os procedimentos do doador. Além disso, o diâmetro da veia porta-doador (cerca de 0,6 mm) é menor que o IVC, o que dificulta a anastomose. Outra limitação é que não é claro se o baço enxertado seria massivamente invadido por células do receptor em fase posterior de transplante (por exemplo, POD 60). No entanto, este modelo também é muito atraente para suas várias vantagens inerentes. Firstly, os ratos e os seres humanos compartilham de uma escala substancial de genomes similares, permitindo desse modo uma respresentação relativamente exata de uma aplicação realística. Além disso, comparando com o modelo de camundongo de autotransplante de baço não vascularizado utilizando as secções do tecido esplênico, este modelo de transplante de baço vascularizado é menos susceptível de desenvolver complicações como necrose asséptica do tecido esplênico e obstrução das entranhas pequenas devido às adesões postoperative.

O modelo do rato do transplante de baço tem sido relatado anteriormente por Swirski FK et al. No entanto, as informações detalhadas não foram descritas.  Nosso estudo fornece um protocolo passo a passo detalhado da transplantação do spleen do rato para que os investigadores interessados sigam e Mater esta técnica. Além disso, este protocolo elimina várias etapas desnecessárias descritas no relatório de Swirski FK et al. (por exemplo, a ligadura do ducto biliar) e introduz a sutura 11-0 para anastomose, o que ajudaria a encurtar o tempo cirúrgico e prevenir o sangramento.

Em conclusão, este modelo pode ser uma ferramenta poderosa para explorar os mecanismos da população de células esplênicas em respostas a patógenos, lesões, inflamação ou rejeição de transplante e é valioso para o teste do potencial terapêutico do baço Transplante. Com treinamento e prática adequados, este procedimento pode ser realizado com > 90% de sucesso.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem o centro de transplantação detalhado da Universidade de Northwestern e o programa dos núcleos da pesquisa da escola de medicina de Feinberg para o apoio do recurso e Especificamente, os serviços de citometria de fluxo e histologia foram fornecidos pela Universidade do noroeste fluxo cytometry núcleo facilidade e mouse histologia e laboratório de fenotipagem, respectivamente, ambos os quais são apoiados por NCI p30-CA060553 concedido ao Robert H Centro de câncer abrangente de Lurie. Agradecemos ao Sr. Nate Esparza por revisar este manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

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References

  1. Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34, (5), 455-465 (2006).
  2. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5, (8), 606-616 (2005).
  3. Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9, (9), 428-437 (2017).
  4. Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99, (2), 392-398 (2014).
  5. Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95, (48), e5098 (2016).
  6. Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12, (12), 1314-1316 (2014).
  7. Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102, (8), 1333-1341 (2017).
  8. Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114, (14), 2861-2868 (2009).
  9. Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19, (2), 156-161 (2012).
  10. Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78, (3), 270-278 (1991).
  11. Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73, (2), 83-86 (1991).
  12. Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246, (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
  13. Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (50), 19075-19080 (2006).
  14. Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69, (6), 777-784 (1954).
  15. Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8, (1), 86-88 (1969).
  16. Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65, (3), 436-439 (1969).
  17. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, (5940), 612-616 (2009).
  18. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128, (7), 2833-2847 (2018).
  19. Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125, (2), 364-374 (2012).
  20. Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34, (8), 1411-1419 (2014).
  21. Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39, (5), 806-818 (2013).
  22. Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18, (2), 1470320317706653 (2017).
  23. Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111, (6), 62 (2016).
  24. Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200, (6), 1982-1987 (2018).

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