Un modèle de souris de transplantation de rate Hétérootopique vascularisée pour étudier la biologie cellulaire de la rate et l’immunité aux greffes

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Summary

Ce protocole détaille les étapes chirurgicales d’un modèle de souris de transplantation hétérotopique vascularisée de la rate, un modèle techniquement stimulant qui peut servir d’outil puissant dans l’étude du sort et de la longévité des cellules de la rate, les mécanismes de la rate distincte populations cellulaires dans la progression de la maladie et l’immunité aux greffes.

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Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

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Abstract

La rate est un organe lymphoïde unique qui joue un rôle crucial dans l’homéostasie des systèmes immunitaires et hématopoïétiques. Les patients qui ont subi une splénectomie, quelles que soient les causes précipitantes, sont enclins à développer une infection post-splénectomie écrasante et éprouvent des risques accrus de thrombose veineuse profonde et de tumeurs malignes. Récemment, des études épidémiologiques ont indiqué que la splénectomie pourrait être associée à l’apparition de maladies cardiovasculaires, suggérant que les fonctions physiologiques de la rate n’ont pas encore été pleinement reconnues. Ici, nous introduisons un modèle de souris de transplantation de rate hétérootopique vascularisée, qui non seulement peut être utilisé pour étudier la fonction et l’activité comportementale des sous-ensembles de cellules immunitaires spléniques dans différents processus biologiques, mais peut également être un outil puissant pour tester le potentiel thérapeutique de la transplantation de la rate dans certaines maladies. Les principales étapes chirurgicales de ce modèle comprennent la récolte de la rate des donneurs, l’élimination de la rate indigène du receveur et la revascularisation de la greffe de la rate. En utilisant des souches de souris congéniques (p. ex., des souris ayant des antécédents de CD 45,1/CD 45,2), nous avons observé qu’après une transplantation syngénique, les lymphocytes spléniques dérivés des donneurs et les cellules myéloïdes ont migré hors de la greffe dès le jour post-opératoire 1, en concomitance avec l’afflux de plusieurs types de cellules réceptrice, générant ainsi une chimère unique.  Malgré des techniques relativement difficiles, cette procédure peut être réalisée avec > taux de réussite de 90%. Ce modèle permet de suivre le destin, la longévité et la fonction des splénocytes pendant l’état d’équilibre et dans un contexte de maladie après une transplantation de la rate, offrant ainsi une excellente occasion de découvrir le rôle distinct des cellules immunitaires dérivées de la rate dans différents processus de la maladie.

Introduction

La rate est le plus grand organe lymphoïde secondaire dans le corps et est critique dans les systèmes immunitaires et hématopoïétiques. Ses fonctions sont principalement réalisées par deux compartiments morphologiquement distincts, la pulpe rouge et la pulpe blanche1. La pulpe rouge est un trabéculum tridimensionnel de sinus veineux et de cordons spléniques constitués de fibres réticulaires, de cellules réticulaires et de macrophages associés. Cette structure unique permet à la pulpe rouge d’agir comme un filtre sanguin efficace qui élimine les matières étrangères et les érythrocytes anciens ou endommagés. La pulpe blanche comprend les follicules, la zone marginale et les gaines lymphoïdes périartériolaires (PALS) et est un site important pour le piégeage et le traitement des antigènes, l’homing lymphocytes, la transformation, la prolifération et la maturation2. Néanmoins, la rate a souvent été considérée comme un organe dispensable parce que d’autres organes lymphatiques, tels que les ganglions lymphatiques, peuvent également effectuer certaines de ses fonctions et la perte de la rate ne conduit pas habituellement à la mort. La splénectomie a donc été largement pratiquée comme méthode thérapeutique pour les patients souffrant de lésions spléniques ou de maladies hématologiques bénignes3. Cependant, les patients atteints de splénectomie sont confrontés à un certain nombre de complications à long terme. Les infections bactériennes sont les complications les mieux reconnues de la splénectomie4,5. Récemment, l’écrasante septicémie post-splénectomie a été reconnue comme une complication intensive de la splénectomie associée à une mortalité élevée6. En outre, des études épidémiologiques récentes indiquent que la splénectomie peut être associée à l’apparition de maladies cardiovasculaires, suggérant que d’autres fonctions physiologiques de la rate restent à explorer7,8.

L’autogreffe de la rate et l’allotransplantation de la rate ont été utilisés dans la clinique. Actuellement, l’autogreffe de la rate en implantant des sections de tissu splénique dans des sachets créés dans le plus grand épiploon est considérée comme la seule possibilité de préserver la fonction splénique après la splénectomie traumatique9,10. Cependant, l’efficacité de cette chirurgie est discutable en tant que complications post-chirurgicales comme la nécrose aseptique du tissu splénique et l’obstruction de l’intestin grêle due à des adhérences postopératoires pourrait se produire11. L’allotransplantation de la rate est impliquée dans la transplantation multiviscérale12. Les données cliniques issues de la transplantation multiviscérale suggèrent que l’allotransplantation de la rate peut jouer un rôle protecteur dans le rejet de l’allogreffe de l’intestin grêle sans causer de maladie du greffon contre l’hôte (GVHD)12. Pourtant, la littérature concernant l’effet bénéfique de l’allotransplantation de la rate en tant que composante de la transplantation multiviscérale est encore limitée et les mécanismes sous-jacents restent à définir. En 2006, Yair Reisner et coll. ont rapporté que la transplantation de tissu de la rate embryonnaire de porc qui n’a pas de lymphocytes T aux souris pourrait guérir l’hémophilie A, une maladie génétique sans causer de GVHD13, soutenant que la greffe de la rate détient une promesse thérapeutique dans certaines maladies. Par conséquent, il est nécessaire d’approfondir les investigations sur le potentiel thérapeutique de la transplantation de la rate.

Les modèles animaux de transplantation de la rate sont utiles pour explorer la fonction non appréciée des cellules immunitaires dérivées de la rate dans la progression de la maladie ainsi que pour tester l’effet thérapeutique potentiel de la transplantation de la rate. Des modèles expérimentaux de transplantation de la rate ont été documentés depuis le début des années 1900, tel que révisé par Cohen14. En 1969, Coburn Richard J. et Lee et coll. détaillent la technique de transplantation de la rate chez le rat15,16. Plus récemment, Swirski FK et coll. ont décrit un modèle de souris de transplantation de la rate17. Par rapport aux modèles de rats, les modèles de souris de transplantation de la rate sont plus attrayants en raison de ses nombreux avantages inhérents. Par exemple, en utilisant un modèle de souris, nous pouvons accéder à une grande variété de réactifs non disponibles à celui des modèles de rat. En outre, en utilisant des souris congéniques (par exemple, des souris avec CD 45,1/CD 45,2), une transplantation de la rate syngénique permet de suivre le destin, la longévité et la fonction des splénocytes18. Sur la base des travaux de Swirski FK et al.17, nous avons en outre établi ce protocole simplifié et amélioré de transplantation de la rate chez la souris. Le protocole décrit ci-dessous combine à la fois la fiabilité et la faisabilité d’une manière standardisée et peut être utilisé comme un outil pour étudier la biologie de la rate et l’immunité aux greffes.

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Protocol

Toutes les procédures et l’utilisation des animaux dans cette étude ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité interne de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Northwestern (IACUC). Dans cette étude, des souris mâles de 8 à 10 semaines, CD 45,2 et CD 45,1 (à la fois sur fond BALB/c, du laboratoire Jackson) ont été utilisés comme donneurs de rate et receveurs, respectivement, pour créer des modèles de transplantation de la rate syngénique. Tous les animaux étaient logés dans l’environnement stérile dans les installations animales de l’Université Northwestern. Le lubrifiant oculaire a été appliqué à toutes les souris post-anesthésiant pour prévenir la sécheresse.

1. préparation chirurgicale, anesthésie et traitement de l’analgésie

  1. Placer un drapé jetable stérile (45,7 cm x 66 cm) sur la plate-forme chirurgicale. Prenez doucement la souris, injectez de la kétamine (50 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) intrapéritonéale (i. p) pour l’anesthésie et injectez 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée pour l’analgésie.
  2. Assurez la profondeur de l’anesthésie par pincement, rasez les cheveux dans toute la zone abdominale avec un rasoir et placez la souris sur la plate-forme chirurgicale stérile sous le microscope d’opération à grossissement de 6-10x.

2. récolte de la rate des donateurs

  1. Stériliser l’abdomen avec un tampon de préparation à l’alcool, sécuriser les membres avec du ruban chirurgical, et faire une incision de la peau verticale de 3-4 cm de la ligne médiane du pubis au processus xiphoïde avec des ciseaux.
  2. Rétracter la paroi abdominale avec des enrouleurs stériles fabriqués à partir de trombones. Déplacez les intestins sur le flanc droit du côté de l’abdomen (gauche du chirurgien) avec un coton-tige stérile pour exposer la rate. Cauterize la veine gastrique courte attachée à la rate avec un cautère stérile à basse température (figure 1a). Placer un morceau de gaze stérile imbibé d’une solution saline de 37 ° c sur la rate pour le maintenir humide (figure 1b).
  3. Séparer et mobiliser la veine portale du tissu pancréatique (figure 1c) en ligant les branches de la veine portante (veine pancréatite supérieure et veine gastrique droite); placer une suture autour de la veine du portail distale de la veine splénique (figure 1d).
  4. Retournez la rate sur le côté droit pour exposer l’aorte et le tronc coeliaque à l’artère splénique (figure 1e). Disséquer et mobiliser l’artère aortique-coeliaque-splénique en ligant l’artère hépatique et l’artère gastrique; placer une suture autour de l’aorte proximale de l’artère coeliaque (figure 1F-G).
  5. Injecter 100 unités internationales (UI) d’héparine dans la veine cave inférieure (IVC) pour hépariniser le corps entier et attendre 3 min pour assurer l’héparine prendre des effets. LIGATURE l’aorte proximale à l’artère coeliaque, transect la veine porte, puis perfuser le corps entier en utilisant 10 mL de sérum physiologique hépariné (4 ° c) (10 mL/20 s) de l’aorte abdominale distale au tronc coeliaque (figure 1H).
  6. Recueillir la greffe de la rate en bloc avec le segment aortique-coeliaque-splénique associé et la veine portale avec un segment de veine splénique et une petite portion de tissu pancréatique. Conserver la greffe dans 5 mL de solution saline à 4 ° c avant la transplantation. Euthanasier la souris par dislocation cervicale.

3. implantation de la splénectomie et de la greffe de la rate

  1. Placez un coussin chauffant sur la plate-forme chirurgicale et réglez la température à 37 ° c. Placer un drapé stérile (45,7 cm x 66 cm) sur le dessus du coussin chauffant pour créer une plate-forme chirurgicale stérile. Répétez les étapes 2,1 et 2,2 pour la préparation chirurgicale et l’anesthésie. Faire une incision de la ligne médiane de 3-4 cm et rétracter la paroi abdominale comme décrit à l’étape 2,1 et à l’étape 2,2.
  2. Déplacez délicatement l’intestin sur le côté droit de la souris avec un coton-tige stérile pour exposer la rate du receveur. Ligate la veine splénique et l’artère et enlever la rate.
  3. Déplacez délicatement l’intestin sur le côté gauche de la souris et couvrez les intestins avec de la gaze mouillée (imbibé de solution saline stérile de 37 ° c). Disséquer et Liger les branches lombaires de l’aorte infrarénale et de la FIV; l’aorte infrarénale et la IVC en utilisant deux pinces microvasculaires de 4 mm.
  4. Placer une suture en nylon 11-0 à travers l’aorte infrarénale (une pleine épaisseur) et se rétracter pour créer une aortotomie elliptique par une seule coupe avec des microciseaux (la longueur doit correspondre au diamètre de l’aorte du donneur, figure 2a). Percer l’IVC à l’aide d’une aiguille de 30 G pour créer une venotomie elliptique et étendre l’ouverture à la longueur de la veine du portail donneur en utilisant des microciseaux (figure 2a).
  5. Effacer le sang intraluminale ou le caillot sanguin (dans l’aorte et la IVC) avec 500 μL de sérum physiologique hépariné (10 unités/mL).
  6. Placer la greffe de la rate dans le flanc droit de l’abdomen de la souris receveur; identifier attentivement le brassard aortique du donneur et la veine portale du donneur. Après s’être assuré que les vaisseaux ne sont pas tordus, couvrez le greffon de la rate avec de la gaze imbibée de solution saline froide (4 ° c).
  7. Relier le brassard aortique du donneur au sommet proximale et distal de l’aortaotomie du receveur avec deux sutures de suspension (suture en nylon 11-0, idem comme ci-dessous) (figure 2b, C). Faire une anastomose avec 2-3 piqûres de sutures continues de nylon 11-0 entre le brassard aortique du donneur et l’aortaotomie du receveur (paroi antérieure) (figure 2D). Tournez la greffe de la rate sur le côté gauche du receveur; faire l’anastomose entre le brassard aortique du donneur et l’aortotomie du receveur (paroi postérieure) (Figure 2e).
  8. Effectuer une anastomose pour relier la veine porte du donneur à la paroi postérieure de la IVC du receveur, en utilisant 4 à 5 piqûres de sutures continues à l’intérieur de la IVC, puis fermer la suture à l’extérieur de la IVC (Figure 2F, G).
  9. Relâchez les pinces du récipient et utilisez un coton-tige stérile pour tamponner les saignements jusqu’à ce que la couleur de la rate soit récupérée (figure 2H).
  10. Fermez l’abdomen avec une suture de Vicryl synthétique absorbable 5-0 dans un motif continu. Fermez la couche de peau avec une suture en nylon 5-0 dans un motif interrompu.
    Remarque: Pour les étapes 4.7 à 4.8, alternativement, faire une anastomose entre la veine portante du donneur et la IVC du receveur d’abord (étape 4,8); puis faire une anastomose entre le brassard aortique du donneur et la paroi postérieure de l’aortotomie du receveur, en utilisant 2 à 3 sutures continues à l’intérieur de l’aorte et fermer la suture à l’extérieur de l’aorte.

4. récupération des animaux

  1. Injecter 1 mL de solution saline tiède par voie sous-cutanée via 4 emplacements distincts (0,25 mL/emplacement) après la fermeture de l’abdomen.
  2. Maintenez la souris dans un incubateur à température contrôlée (30 ° c) pendant les premières heures après l’opération, surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle ait retrouvé une conscience suffisante, puis transférez la souris dans une nouvelle cage propre avec de la nourriture et de l’eau régulières, avec un tampon chauffant (30 ° c ) sous la cage. Gardez la souris post-chirurgie dans une cage séparée.

5. gestion de la douleur post-chirurgicale

  1. Injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée 24 h et 48 h après la chirurgie pour maintenir le régime d’analgésie.

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Representative Results

L’ensemble de la procédure de greffe de la rate de souris peut être complété dans 90 min par des microchirurgiens expérimentés. Notre laboratoire a effectué plus de 100 greffes de rate chez la souris. Le taux de réussite est de plus de 90%, tel que défini par la survie de la souris réceptrice et de la greffe de la rate au jour post-opératoire (POD) 1 ou POD 7 (notre point de terminaison d’étude). La survie de la greffe de la rate a été confirmée par l’aspect macroscopique et l’analyse de cytométrie de flux des splénocytes. D’après notre expérience, l’analyse de la cytométrie en flux (essais de viabilité des cellules vivantes/mortes) est très sensible pour déterminer si une greffe de la rate a survécu, car la majorité des cellules de la rate seraient mortes si les greffes de la rate étaient nécrotiques. Les défis techniques de cette procédure, les complications courantes et leur dépannage sont récapitulés dans le tableau 1.

Pour tester la morphologie du greffon post-transplantation, la coloration de l’Hémotoxyline et de l’éosine (H & E) a été effectuée dans les isogreffes de la rate des souris BALB/c au POD 1 et au POD 7. Les images représentatives sont illustrées à la figure 3. L’architecture des isogrefftes de la rate est restée intacte pendant la première semaine postopératoire. La pulpe rouge, la pulpe blanche et la zone marginale étaient encore claires et distinguées. Pour étudier la migration cellulaire après la transplantation de la rate, la cytométrie en flux a été effectuée au POD 1 et au POD 7 pour examiner les phénotypes des leucocytes dans les isogreffes de la rate, les ganglions lymphatiques, le sang et la moelle osseuse. Comme le montre la figure 4a, à la cosse 1, 51 ± 7% (moyenne ± écart-type, même que ci-dessous) des cellules de la rate ont été dérivées du donneur et 46 ± 3% ont été dérivées du receveur. Au POD 7, les leucocytes dérivés des donneurs représentaient 32 ± 10% des cellules de la rate totale, et les cellules dérivées des receveurs étaient jusqu’à 56 ± 13%. Nous avons également observé que les leucocytes de la rate migraient dans les ganglions lymphatiques, le sang et la moelle osseuse dès le premier jour et maintenus au jour 7 (figure 4b), générant une chimère unique précieuse pour la recherche sur le trafic de splénocytes.

Tableau 1: Méthodes de dépannage.

Figure 1
Figure 1: récolte de la rate des donneurs. (A) Cauterize la veine gastrique courte attachée à la rate. (B) placer un petit morceau de gaze humide chaude stérile sur la rate pour le garder humide. (C) disséquer et isoler la veine portale derrière le pancréas. (D) ligate les branches latérales de la veine porte et placer une suture autour de la veine porte distale à la veine splénique. Les lignes pointillées représentent l’emplacement qui transite ultérieurement pour l’anastomose avec le récepteur IVC. (E) Retournez la rate sur le côté droit de l’abdomen (gauche du chirurgien) pour exposer l’aorte et le tronc coeliaque avec ses branches, y compris l’artère splénique. (F) disséquer et mobiliser l’artère aortique-coeliaque-splénique en ligant les deux autres branches. (G) placer une suture autour de l’aorte proximale de l’artère coeliaque. Les lignes pointillées représentent le lieu de sectionnant plus tard utilisé pour l’anastomose avec l’aorte abdominale du receveur. (H) après avoir ligné l’aorte et transecter la veine porte, perfuser la greffe de la rate avec 10 ml de sérum physiologique hépariné dans l’aorte. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: implantation de greffes de la rate. (A) après isolement et serrage croisé de l’aorte et de la IVC, faire une aortotomie longitudinale et une venotomie dans l’aorte et la IVC, respectivement. (B-D) Placez la greffe de la rate sur le côté droit de l’abdomen (côté gauche du chirurgien). Faire l’anastomose de bout en côté entre le brassard aortique du donneur et la paroi antérieure de l’aortotomie du receveur, en utilisant 2-3 piqûres de suture continue. (E) faire tourner la greffe de la rate sur le flanc gauche du receveur; répéter la procédure précédente entre le brassard aortique du donneur et la paroi postérieure de l’aortotomie du receveur et fermer la suture à l’extérieur de l’aorte. (F-G) Faire une anastomose de bout en côté entre la veine portante du donneur et la paroi postérieure de la IVC du receveur, en utilisant 4 à 5 piqûres de suture continue de nylon 11-0 à l’intérieur de la IVC, puis fermer la suture à l’extérieur de la IVC. (H) après avoir terminé l’anastomose, relâchez les pinces du récipient et placez quelques bourgeons de coton pour aider à stopper le saignement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: histologie représentative des isogrefftes de la rate le jour 1 et le jour 7 après l’opération. Des transplantations de la rate syngénique ont été effectuées à l’aide de souris BALB/c. Les isogreffes de la rate ont été récoltées le jour 1 et le jour 7 après la transplantation et fixées dans 10% de formol pour 48 h. H & E la coloration a été effectuée à l’aide de la section tissulaire incorporée à la paraffine. L’histologie représentative montre que les isogreffes de la rate demeurent intactes à une semaine après la transplantation. Barre d’échelle = 250 μm. POD, jour post-opératoire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: La chimère créée par la greffe de la rate syngénique. Trois transplantations de la rate syngénique ont été effectuées à l’aide de souris BALB/c CD 45,2 comme donneurs et de souris BALB/c CD 45,1 en tant que receveurs. Les greffes de la rate, le sang, le ganglion lymphatique (LN) et la moelle osseuse (BM) chez les souris receveurs ont été récoltés le jour 1 et le jour 7 après la transplantation. Une analyse de l’isolement et de la cytométrie de flux a été effectuée pour analyser le phénotype des cellules. (A) parcelles représentatives de points (gating à partir de singlets vivants) montrant les pourcentages de donneurs ou de receveurs — leucocytes dérivés dans les échantillons indiqués. (B) les pourcentages (moyenne ± SEM) des populations indiquées dans les cellules dérivées des donneurs dans les échantillons indiqués au jour 1 et au jour 7. POD = jour post-opératoire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1: parcelles représentatives (n = 3) montrant les pourcentages des lymphocytes dérivés de donneurs et de récepteurs dans la rate transplantée, le ganglion lymphatique, le sang et la moelle osseuse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2: parcelles représentatives (n = 3) montrant les pourcentages des monocytes de CD11b + Ly6C + dérivés des donneurs et des receveurs dans la rate transplantée, le ganglion lymphatique, le sang et la moelle osseuse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Des preuves convaincantes suggèrent que les monocytes dérivés de la rate jouent un rôle important dans les processus inflammatoires stériles tels que l’athérosclérose19, le cerveau ischémique aigu20 ou la lésion pulmonaire18, ainsi que les lésions I/R myocardiques et remodelage21,22,23. Ces rapports soulignent le rôle de sous-reconnaissance de la rate dans de nombreuses maladies chroniques, dont la maladie cardiovasculaire est importante (surtout étant donné qu’il est le tueur numéro un dans le monde entier). Le modèle de souris de transplantation de la rate offre une excellente occasion de découvrir le rôle des cellules immunitaires dérivées de la rate dans diverses maladies, ainsi que la façon dont ils sont amorties dans la rate. Par exemple, en utilisant les modèles de souris de la transplantation de la rate, Swirski et coll. ont constaté que, en réponse à une lésion myocardique ischémique, les monocytes dérivés de la rate augmentent leur motilité, migrent hors de la rate, adhèrent aux tissus blessés et contribuent à la cicatrisation17. En outre, ce modèle est utile pour traiter les longevités des cellules immunitaires matures dans la rate et les mécanismes sous-jacents et pour explorer les potentiels thérapeutiques de la greffe de la rate.

Plusieurs aspects devraient être pris en considération pour améliorer le succès de ce protocole. Premièrement, il est essentiel de choisir les animaux expérimentaux appropriés pendant le processus de conception, car le poids de la souris, la souche et l’état de santé pourraient affecter la difficulté des étapes chirurgicales et des résultats expérimentaux. Notre laboratoire recommande d’utiliser des souris âgées de 8 à 12 semaines avec plus de 25 g de poids pour diminuer la mortalité qui pourrait être causée par un saignement. Deuxièmement, au cours de la procédure de prélèvement de la rate, une trop grande manipulation des vaisseaux de la rate pourrait facilement conduire à la reproduction ou au vasospasme et entraîner potentiellement une micro-thrombose dans la greffe de la rate. Se familiariser avec l’anatomie de l’abdomen de la souris avant la chirurgie serait utile pour accélérer le processus d’apprentissage. Troisièmement, pendant la chirurgie du receveur, la greffe de la rate doit toujours être maintenue humide et fraîche. Une protection appropriée des greffes de la rate pourrait réduire la lésion d’ischémie/reperfusion (I/R) de greffe et prévenir la défaillance du greffon après la transplantation. En outre, étant donné que les vaisseaux donneurs pour l’anastomose sont relativement longs, le positionnement correct des greffes de la rate avant l’anastomose est essentiel pour empêcher la torsion des vaisseaux. De plus, les diamètres de l’aortotomie et de la venotomie de l’IVC doivent être toujours comparables à ceux de l’aorte et de la veine portale du donneur pour assurer le bon écoulement sanguin et prévenir la thrombose.

Le temps de stockage moyen des greffés de rate dans une solution saline à 4 ° c est d’environ 10 min. Le temps ischémique total devrait être limité à moins de 50 min pour assurer une défaillance minimale de la greffe. Nous recommandons d’utiliser la solution de stockage à froid de l’Université du Wisconsin (UW) pour préserver la greffe de la rate, si plus de 1 h de froid, le temps ischémique est nécessaire dans les études. Il convient de noter qu’une petite portion du pancréas étroitement attacher à la rate, et tenter d’éliminer l’ensemble des greffes de la rate conduirait facilement à des complications de greffe ou vasculaires et augmenter sensiblement le temps de fonctionnement. Nous avons observé que le tissu pancréatique attaché à la greffe de la rate subirait une atrophie au POD 7, bien que certains demeuraient viables avec les greffes de la rate. Le fait d’enlever ou non le tissu pancréatique attaché aux grefftes de la rate dépend des fins de recherche.

La disponibilité des souris congéniques a permis de suivre l’origine des cellules de la rate, donneur versus receveur après transplantation. Dans cette étude, nous avons utilisé des souris congéniques BALB/c CD 45,2 et BALB/c CD 45,1 comme donneurs et receveurs de la rate pour créer un modèle de transplantation de la rate syngénique. La transplantation d’organes ou de tissus entre ces souches de souris congéniques a été largement utilisée pour suivre l’origine et le développement du système immunitaire. Malgré le récent rapport concernant une mutation ponctuelle associée au CD 45,1 qui influe sur la réponse des cellules NK24, aucun rejet de greffe n’a été rapporté entre ces combinaisons de souches. Nous avons observé un afflux substantiel de cellules réceptrice dans les greffes de rate qui ont eu lieu dès qu’au POD 1. Il est probable que les cellules réceptrice ont répondu à la lésion d’I/R de transplantation car la majorité des cellules réceptrice étaient des granulocytes. Nos résultats ont montré qu’un pourcentage relativement élevé de lymphocytes spléniques restait d’origine des donneurs. Plus intéressant, ces lymphocytes ont migré vers (repeuplés) dans d’autres compartiments lymphoïdes (ganglion lymphatique, moelle osseuse, et la circulation). Ces résultats nous incitent à spéculer que les lymphocytes qui proviennent de rates sont très importants dans l’immunité adaptative. Cependant, plus d’investigations sont nécessaires pour délimiter les rôles distincts des lymphocytes spléniques dans l’immunité adaptative versus innée (figure4, figure supplémentaire 1 et figure supplémentaire 2).

La principale limitation de ce protocole est qu’il nécessite une formation microchirurgicale extensive pour les personnes ayant une expérience microchirurgicale limitée pour maîtriser cette technique. Basé sur notre expérience d’apprentissage dans l’ensemble des modèles de transplantation d’organe solide de souris (p. ex., coeur de souris, poumon, ou greffe de rein), il peut prendre 6-10 mois pour une personne nouvellement formée (sans aucune technique expérimentale microchirurgicale) pour maîtriser habilement cette technique. Comparé aux modèles de souris de coeur, ou transplantation rénale, ce modèle pourrait être plus difficile car il implique des étapes supplémentaires de dissection tissulaire pour isoler la greffe de la rate pendant les procédures de donneur. De plus, le diamètre de la veine portante du donneur (environ 0,6 mm) est plus petit que le IVC, ce qui le rend plus difficile pour l’anastomose. Une autre limitation est qu’il n’est pas clair si la rate greffée serait massivement envahie par les cellules du receveur lors de la phase de transplantation ultérieure (p. ex., POD 60). Cependant, ce modèle est également très attrayant pour ses nombreux avantages inhérents. Premièrement, les souris et les humains partagent une gamme substantielle de génomes similaires, ce qui permet une représentation relativement précise d’une application réaliste. En outre, en comparant au modèle de souris de l’autogreffe de rate non vascularisée utilisant les sections du tissu splénique, ce modèle de greffe de rate vascularisée est moins susceptible de développer des complications telles que la nécrose aseptique du tissu splénique et obstruction de l’intestin grêle due aux adhérences postopératoires.

Le modèle de souris de transplantation de la rate a déjà été rapporté par Swirski FK et al. Toutefois, les informations détaillées n’ont pas été décrites.  Notre étude fournit un protocole complet étape par étape de la greffe de la rate de souris pour les chercheurs intéressés à suivre et à mater cette technique. En outre, ce protocole élimine plusieurs étapes inutiles décrites dans le rapport par Swirski FK et coll. (par exemple, la ligature du canal biliaire) et introduit la suture 11-0 pour l’anastomose, ce qui aiderait à raccourcir le temps chirurgical et à prévenir le saignement.

En conclusion, ce modèle pourrait être un outil puissant pour explorer les mécanismes de la population de cellules spléniques dans les réponses aux agents pathogènes, blessure, inflammation, ou rejet de greffe et est précieux pour l’essai du potentiel thérapeutique de la rate transplantation. Avec une formation et une pratique adéquates, cette procédure peut être réalisée avec > 90% de succès.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Centre complet de transplantation de l’Université Northwestern et le programme de carottes de recherche de l’école de médecine de Feinberg pour le soutien des ressources et du financement. Plus précisément, les services de cytométrie en flux et d’histologie ont été fournis par le centre de cytométrie en flux de l’Université Northwestern et le laboratoire d’histologie et de phénotypage des souris, respectivement, qui sont tous deux soutenus par le NCI CA060553, attribué au Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Nous remercions m. Nate Esparza pour avoir corrigé ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

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References

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