Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в клетках CAR-T

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы представляем протокол для генетического отсвагивая клетки CAR-T через систему CRISPR/Cas9.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (149), e59629, doi:10.3791/59629 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия является передний край и потенциально революционный новый вариант лечения рака. Тем не менее, существуют значительные ограничения на его широкое применение в лечении рака. Эти ограничения включают в себя развитие уникальных токсичностей, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT) и ограниченное расширение, функции эффектора и противоопухолевую активность в твердых опухолях. Одной из стратегий повышения эффективности CAR-T и/или контроля токсичности клеток CAR-T является редактирование генома самих клеток CAR-T во время производства клеток CAR-T. Здесь мы описываем использование редактирования генов CRISPR/Cas9 в клетках CAR-T с помощью трансдукции с лентивирусной конструкцией, содержащей направляющий РНК к гранулоцитной колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF) и Cas9. В качестве примера мы описываем CRISPR/Cas9 при посредничестве GM-CSF. Мы показали, что эти ГМ-CSFк / о CAR-T клетки эффективно производят меньше ГМ-CSF при сохранении критической функции Т-клеток и привести к повышению противоопухолевой активности in vivo по сравнению с дикими клетками типа CAR-T.

Introduction

Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия демонстрирует большие перспективы в лечении рака. 1 , 2 Две CAR-T клеточной терапии ориентации CD19 (CART19) были недавно утверждены в Соединенных Заявленные и в Европе для использования в злокачественных новообразованиях клеток B после демонстрации поразительных результатов в многоцентровых клинических испытаний. 3 , 4 , 5 Барьерами для более широкого использования CAR-T-клеток являются ограниченная активность в твердых опухолях и связанных с ними токсичности, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT). 3 , 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9 Для повышения терапевтического индекса клеточной терапии CAR-T, инженерные инструменты генома, такие как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR используются для дальнейшего изменения car-T-клеток в попытке создать менее токсичные или более эффективные клетки CAR-T. 10 Лет , 11 Год

В этой статье мы описываем метод создания CRISPR/Cas9, отредактированных CAR-T-ячеек. Конкретная цель этого метода заключается в том, чтобы генетически модифицировать CAR-T-клетки во время производства клеток CAR-T через CRISPR/Cas9 для создания менее токсичных или более эффективных клеток CAR-T. Обоснование для разработки этой методологии основывается на уроках, извлеченных из клинического опыта клеточной терапии CAR-T, что указывает на настоятельную необходимость новых стратегий для увеличения терапевтического окна клеточной терапии CAR-T и расширения применения в других опухолей и поддерживается последние достижения в синтетической биологии позволяет несколько модификаций CAR-T клеток, которые начали поступать в клинику. В то время как несколько инженерных инструментов генома разрабатываются и применяются в различных условиях, таких как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR, наша методология описывает модификацию CRISPR/Cas9 клеток CAR-T. 10 Лет , 11 CRISPR/Cas9 является РНК-механизм защиты от бактерий, который предназначен для устранения чужеродных ДНК. CRISPR полагается на эндонуклеазы, чтобы расщеплять целевую последовательность, идентифицированную через направляющий РНК (gRNA). CRISPR редактирования CAR-T клеток предлагает ряд преимуществ по сравнению с другими инструментами инженерного генома. К ним относятся точность последовательности gRNA, простота для разработки gRNA ориентации гена интереса, высокая эффективность редактирования генов, и способность целевых нескольких генов, поскольку несколько гРНК могут быть использованы в то же время.

В частности, в методах, описанных здесь, мы использовали лентивирус, кодируя CRISPR руководство РНК и Cas9 нарушить ген во время трансдукции Т-клеток CAR. При выборе подходящей техники для редактирования CAR-T-клеток, мы предлагаем метод, описанный здесь является эффективным механизмом для создания исследований класса CAR-T клеток, а потому, что долгосрочный эффект постоянной интеграции Cas9 в геном неизвестен, мы предложить эту методологию для разработки доказательства концепции исследования класса CAR-T клеток, но не для производства хорошей производственной практике класса CAR-T клеток.

В частности, здесь мы описываем генерацию гранулоцитов макрофагов колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) нокаутОМ CAR-T клеток ориентации человека CD19. Эти клетки CAR-T были созданы путем трансдукции с лентивирными частицами, кодируя направляющую РНК, специфичную для GM-CSF (генное название CSF2) и Cas9. Ранее мы обнаружили, что нейтрализация GM-CSF упрощает CRS и NT в модели ксенотрансплантата. 12 ГМ-CSFk/o CAR-T-клетки позволяют ингибировать ГМ-CSF в процессе производства, эффективно снижая производство ГМ-CSF при одновременном повышении противоопухолевой активности CAR-T и выживания в vivo по сравнению с клетками WILDtype CAR-T. 12 Таким образом, здесь мы предоставляем методологию для создания CRISPR/Cas9 отредактированные клетки CAR-T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол следует руководящим принципам Совета по институциональному обзору клиники Майо (IRB) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC).

1. производство клеток CART19

  1. Изоляция Т-клеток, стимуляция и культура бывших виво
    1. Выполняйте всю работу клеточной культуры в капюшоне клеточной культуры с использованием соответствующего средства индивидуальной защиты. Урожай периферических клеток крови (ПБМК) из деидентифицированных нормальных конусов донорской крови, собранных во время афереза, поскольку они, как известно, являются жизнеспособным источником ПБМК.13
    2. Чтобы изолировать ПБМК, добавьте 15 мл среды градиента плотности к 50 мл градиентной трубки. Разбавить донорскую кровь с равным объемом фосфат-буферизированного соления (PBS), содержащего 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), чтобы избежать клеточного улавливания.
      1. Добавить разбавленную донорскую кровь из конуса в сепарящую трубку, стараясь не нарушить интерфейс между кровью и градиентной средой плотности. Центрифуга при 1200 х г в течение 10 мин на RT.
      2. Декант супернатант в новый 50 мл конический, мыть с PBS 2% FBS, в результате чего до 40 мл, центрифуга на 300 х г в течение 8 минут на RT, аспират супернатант, resuspend в 40 мл буфера, и рассчитывать ячейки.
    3. Изолировать Т-клетки от PBMCs через отрицательный набор магнитного бисера выбор с помощью полностью автоматизированного сепаратора ячейки в соответствии с протоколом производителя.
    4. Чтобы культура изолированных Т-клеток, подготовить Т-клеточной среды (TCM), которая состоит из 10% человека AB сыворотки (v/v), 1% пенициллилин-стрептомицин-глютамин (v/v), и сыворотки свободной гематопоитической клеточной среде. Стерилизовать среду путем фильтрации через 0,45 мкм стерильный вакуумный фильтр, а затем с 0,22 мкм стерильный вакуумный фильтр.
    5. На день 0 (день стимуляции Т-клеток) мыть шарики CD3/CD28 до стимуляции Т-клеток. Для мытья поместите необходимый объем бисера (используйте достаточное количество бисера CD3/CD28 для соотношения 3:1 бисера:T-клеток; обратите внимание, что концентрация бисера может быть переменной) в стерильной микроцентрифуговой трубке 1,5 мл и переприкоситесь в 1 мл ТКМ.
    6. Поместите в контакт с магнитом.
    7. Через 1 мин, аспирировать TCM и resuspend в 1 мл свежих TCM для мытья бисера.
    8. Повторите эту процедуру в общей сложности три стирания.
    9. После третьей стирки, resuspend бисера в 1 мл TCM.
    10. Посчитайте Т-клетки.
    11. Передача бисера в Т-клетки в соотношении 3:1 бусинки: клетки.
    12. Разбавить клетки до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл.
    13. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 на 24 ч.
  2. Трансфекция и трансдукция Т-клеток
    1. Выполняйте лецивирные работы с использованием мер предосторожности BSL-2, включая вытяжки клеточной культуры, средства индивидуальной защиты и дезинфекцию использованных материалов с помощью отбеливателя перед удалением.
    2. Приобретите конструкцию CART19 в лентивирусном векторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: конструкция CART19, используемая здесь, была разработана, а затем синтезирована de novo с использованием коммерчески доступного поставщика синтеза белка. Конструкция ЦАР была впоследствии клонирована в третье поколение лентивирусподов под контролем промоутера EF-1. Фрагмент одной цепной переменной области получен от клона FMC63 и распознает CD19 человека. Конструкция CAR19 обладает вторым поколением 4-1BB costimulatory домена и CD3 "стимуляции (FMC63-41BBz). 12 Лет
    3. Выполните лентивирусное производство, как описано ранее. 12 Лет
      1. Короче говоря, для производства лентивирус, использовать 293T-клеток, которые достигли 70-90% confluency.
      2. Разрешить инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре трансфекционных реагентов, включая 15 мкг ленцивирусной плазмиды интереса, 18 мкг кляпа/поль/тат/рев упаковочного вектора, 7 мкг вектор конверта VSV-G, 111 л предварительно комплексного реагента, 129 трансфекционный реагент и 9,0 мл трансфекционного носителя перед добавлением в 293T-клетки. Затем культура транс-инфицированных клеток на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
      3. Урожай, центрифуга (900 х г на 10 мин), фильтр (0,45 мм нейлонового фильтра) и концентрат супернатант на 24 и 48 ч при ультрацентрифугации при 13 028 х г на 18 ч или 112 700 х г для 2 ч.
      4. Заморозить при -80 градусов по Цельсию для использования в будущем.
    4. На 1 день, осторожно resuspend Т-клеток, чтобы разбить розетки Т-клеток, которые были стимулированы на 1 х 106/мл на день 0.
    5. При соответствующих мерах предосторожности BSL-2 "для всех лецивирных работ, добавить свежий или замороженный собранный вирус в стимулированных Т-клеток при множественности инфекции (MOI) 3,0.
  3. Расширение ячейки CAR-T
    1. Во время фазы расширения, продолжать инкубировать трансиндуцированных Т-клеток при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Подсчитайте клетки CAR-T в 3 и 5 дней и добавьте свежие, предварительно разогретыеТКМ в культуру для поддержания концентрации клеток CAR-T 1 х 10 6/мл.
    2. Удалить бисер из трансиндуцированных Т-клеток через 6 дней после стимуляции (День 6) с помощью магнита. Урожай, resuspend, и место Т-клеток в 50 мл конических труб в магнит в течение 1 мин. Затем соберите супернатант (содержит клетки CAR-T) и отбросьте бусины.
    3. Поместите собранные клетки CAR-T обратно в культуру в концентрации 1 х 106 клеток/мл, чтобы возобновить расширение.
    4. На 6-й день оцените поверхностное выражение ЦАР по цитометрии потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько методов могут быть использованы для обнаружения поверхности выражение ЦАР, таких как окрашивание с козой анти-мышь IgG (H'L) кросс-адсорбированных вторичного антитела или путем окрашивания с CD19 конкретный пептид, конъюгированный для фторхрома. Здесь возьмите аликот (около 100 000 Т-клеток) из культуры и смойте буфером потока, подготовленным с фосфатным солевым раствором Dulbecco, 2% сыворотки плода и 1% азид натрия. Попятнать клетки анти-CAR антитела и мыть дважды. Пятно клеток с живым / мертвым пятном и CD3 моноклональных антител (OKT3). Вымойте ячейки и повторно приостановите в буфере потока. Приобрести на цитометр для определения эффективности трансдукции.
  4. Криоконсервация клеток CAR-T
    1. Для сбора урожая и криоконсервирования CAR-T-клеток через 8 дней после стимуляции (День 8 расширения Т-клеток), урожай клеток из культуры.
    2. Спин вниз в течение 5 мин на 300 х г.
    3. Resuspend в замораживании среды на 10 миллионов клеток на мл на флакон в замораживании среды, состоящей из 10% диметил сульфоксид и 90% плода крупного рогатого скота сыворотки.
    4. Заморозить в замораживающем контейнере для достижения скорости охлаждения -1 кв/мин в морозильной камере -80 градусов, а затем передать в жидкий азот после 48 ч.
    5. До их использования для экспериментов in vitro или in vivo, оттаивать клетки CAR-T в теплом ТКМ.
    6. Вымойте клетки, чтобы разбавить и удалить диметилсульфод и повторно до концентрации 2 х 106 клеток / мл в теплой TCM. Отдых на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.

2. Производство GM-CSF k/o CART19

  1. Чтобы нарушить GM-CSF, используйте руководство РНК (gRNA) ориентации экзон 3 человека GM-CSF (CSF2), выбранных с помощью скрининга gRNAs ранее сообщалось, что высокая эффективность для гена CSF2, который кодирует для человека цитокина ГМ-CSF. 14 Год
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески синтезированный исследовательский класс Cas9 третьего поколения лентивирусной конструкции, содержащей эту gRNA (под U6 промоутер) был использован. Конструкция содержит ген устойчивости к пуромицину. Последовательность gRNA является GACCTGCCTACACCACCCGCGCCCCCC. 12 Лет
  2. Для производства лентивирус, использовать 293T-клеток, которые достигли 70-90% confluency.
  3. Разрешить 15 мкг лецивирусной плазмиды интереса, 18 мкг кляп / поль / тат / оборот упаковки вектор, 7 мкг вектор конверта VSV-G, 111 л докомплексного реагента, 129 л трансфекционного реагента, и 9,0 мл трансфекционного среднего инкубировать в течение 30 минут в комнате tefection te мпературы.
  4. Добавьте трансфекционные реагенты в 293T-клетки. Затем культура при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
  5. Урожай, центрифуга (900 х г на 10 мин), фильтр (0,45 мм нейлонового фильтра) и концентрат супернатант на 24 и 48 ч при ультрацентрифугации при 13 028 х г на 18 ч или 112 700 х г для 2 ч и заморозить при -80 градусов по Цельсию для будущего использования.
  6. На 1-й день, осторожно resuspend Т-клеток, чтобы разбить розетки.
  7. В одобренной лаборатории BSL-2 ' добавьте замороженный или свежесобранный вирус в стимулируемые Т-клетки для генерации клеток CAR-T. Преобразуйте Т-клетки как с лентивирусом CAR19, так и с ГМ-CSF, нацеленным на лентивирус CRISPR. Добавить лентивирус CAR19 в МВД 3. Поскольку титрование лецивируса CRISPR было неосуществимо, используйте вирусные частицы, генерируемые из 15-ug плазмидного препарата, чтобы преобразовать 10 х 106 Т-клеток.
  8. Ознакомьтесь с оставшимися шагами стимуляции Т-клеток, расширения и криоконсервации, которые обсуждаются в шаге 1.
  9. Для lentiCRISPR-отредактированные Т-клетки, несущие устойчивость к пуромицину, лечить клетки с пуромицин дигидрохлоридом в концентрации 1 мкг пуромицина на 1 мл на 3 день и день 5 .

3. Эффективность сбоев ГМ-КСФ и функциональная оценка GM-CSF k/o CART19

  1. Эффективность сбоев GM-CSF: отслеживание инделов путем секвенирования и анализа разложения (TIDE)
    1. Чтобы секвенировать экзон, представляющий интерес к гену GM-CSF, используйте следующие грунтовки. Используйте последовательность переднего грунта для GM-CSF (CSF2) TGACTAGAGAGGAGA, а также обратную последовательность грунтовки TCACCTCTGACCCATTAACC.
    2. Извлеките ДНК из до 5 миллионов клеток CAR-T с набором геномной экстракции. Для реакции ПЦР используйте 25 qL taq mastermix за реакцию с конечной концентрацией каждого грунтовки в реакции ПЦР в реакции ПЦР, 0,1-0,5 мкг ДНК шаблона, а общий объем реакции ПЦР доведен до 50 л с нуклеайозом свободной воды.
    3. Смотрите условия цикла PCR, описанные в таблице 1.
    4. Выполнить образцы ПЦР на 1-2% агарозный гель при 100 В в течение 30 минут и экстракт с помощью комплекта извлечения геля.
    5. Последовательность ампулконов ПЦР. Рассчитайте частоту изменений аллелей, загрузив необработанные данные в соответствующее программное обеспечение TIDE. 15 лет
  2. ГМ-CSF производства и функциональной оценки GM-CSFк / o CART19
    1. Для определения производства цитокинов CAR-T-клеток, инкубировать дикий тип CART19 клеток и GM-CSFк / о CART19 с CD19, выражающий острый лимфальный лейкоз клеточной линии NALM6 в 1:5 соотношение для 4 ч при 37 c, 5% CO2 в присутствии монезина решение, анти-человеческий CD49d, анти-человек CD28, и анти-человек CD107a.
    2. Урожай ные клетки из культуры для потока цитометрии. Вымойте клетки с потоком цитометрии буфера. Пятно клетки с живой / мертвый комплект окрашивания. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Зафиксировать клетки с фиксацией среды и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.
    3. После мытья, пятно клеток внутриклеточного с пермяковской средой в сочетании с анти-человеческой IFN ' моноклонального антитела, анти-человеческого ГМ-CSF, анти-человека MIP-1, анти-человека IL-2, и анти-человека CD3 и инкубировать в темноте при комнатной температуре для 30 мин. Вымойте и повторно приостановите образцы. Приобретайте образцы на цитометр потока и анализируйте процент внутриклеточного выражения GM-CSF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показано сокращение ГМ-CSF в клетках GM-CSFk/o CART19. Чтобы убедиться, что геном Т-клеток был изменен на нокаут ГМ-CSF, tide секвенирования был использован в GM-CSFк / о CART19 клеток (Рисунок 1A). CAR-T клеточной поверхности окрашивания проверяет, что Т-клетки успешно выразить CAR поверхности рецептора in vitro путем gating на живых клетках CD3 "(Рисунок1B). Внутриклеточные окрашивания ГМ-CSF по потоку цитометрии демонстрирует снижение экспрессии ГМ-CSF в GM-CSFк / o CART19 клеток путем gating на живых клетках CD3 ", проверка функционального успеха нокаута (Рисунок 1C). GM-CSFk/o CAR-T клетки демонстрируют снижение ГМ-CSF по сравнению с дикими анти-CD19 CAR-T-клеток (CART19) через внутриклеточное окрашивание(рисунок 1B). Кроме того, мы ранее показали, что ГМ-CSFк / о CAR-T клетки снижают производство ГМ-CSF при одновременном повышении противоопухолевой активности и выживания по сравнению с диким типом CAR-T клеток in vivo. 12 Лет 

Шаг Температура (КК) Время Циклов
Первоначальная денатурация 94 г. 3 мин. 1
Денатурация 94 г. 45 сек 35 лет
Отжига 60 лет 30 сек
Расширение 72 год 2 мин.
После удлинения 72 год 10 мин. 1
4

Таблица 1: Условия цикла PCR для секвенирования TIDE клеток GM-CSFk/o CART19.

Figure 1
Рисунок 1 : GM-CSFк/о Клетки CART19 показывают снижение гм-ксф. A) Репрезентативная последовательность TIDE проверяет изменение генома гм-csF CRISPR/Cas9 GM-CSFk/o CART19 с эффективностью нарушения в 71%. B) Представитель потока участков изображают успешное производство car-T ячейки с аналогичным выражением CAR на дикий тип CART19 и GM-CSFк / о CART19. C) Как было сказано внутриклеточного окрашивания, GM-CSFк / о CART19 клетки показывают снижение ГМ-CSF по сравнению с диким типом CART19, когда стимулируется с CD19 положительной ВСЕ клеточной линии NALM6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом отчете мы описываем методологию использования технологии CRISPR/Cas9 для индуцирования вторичных изменений в клетках CAR-T. В частности, это продемонстрировано с помощью лентивирусной трансдукции с вирусным вектором, который содержит gRNA ориентации гена интереса и Cas9 для создания ГМ-CSFк / о CART19 клеток. Ранее мы показали, что нейтрализация GM-CSF упрощает CRS и NT в модели ксенотрансплантата. 12 Как уже говорилось ранее, ГМ-CSFk/o CAR-T-клетки позволяют ингибировать ГМ-CSF в процессе производства, эффективно снижают производство GM-CSF при сохранении других критических функций Т-клеток, и приводят к усилению противоопухолевая активность in vivo по сравнению с клетками WILDtype CAR-T. 12 Лет

Поскольку постоянная интеграция Cas9 в геном может быть связана с нежелательными эффектами при переводе на клинически жизнеспособный продукт, мы предлагаем эту конкретную методологию как способ создания исследовательского сорта CRISPR/Cas9 модифицированный CART19 для доказательства концепции Эксперименты.

В то время как CAR-T клетки обещают в терапии рака,1,2 их эффективность может продолжать быть повышена и связанные с ними токсичности лучше контролируется. Технология CRISPR/Cas9 обеспечивает стратегию, направленную непосредственно на геном клеток CAR-T для разработки решений текущих клинических недостатков. В этой статье мы описываем генерацию клеток GM-CSFk/o CART19.

ГМ-CSFk/o CAR-T-клетки были созданы путем трансдукции с лентивирусным вектором для плазмида клетки CAR-T и лентивирусной конструкцией, содержащей направляющий РНК к GM-CSF и Cas9. Для создания GM-CSFк / о, третьего поколения лентивирусной конструкции (lentiCRISPRv2), содержащий Cas9 и сообщили высокой эффективности руководства РНК (gRNA) ориентации экзон 3 человека GM-CSF (CSF2)14 под контролем промоутера U6 был использован. Особая осторожность должна быть предпринята во время этапов трансдукции процедуры, поскольку они являются наиболее важными для развития модифицированных клеток CAR-T. Эффективность нокаута может быть проверена и оценена с помощью отслеживания indels путем разложения (TIDE) последовательностей. Функциональная активность клеток CAR-T исследуется с помощью специфической стимуляции антигена конструкции CAR с помощью клеток-мишеней CD19, после чего следует измерение различных функций Т-клеток, включая производство ГМ-CSF. 12 Примечательно, окрашивание для экспрессии CAR с козой анти-мышь антитела должны произойти до других антител окрашивания с двумя стирания, происходящих до поверхности окрашивания из-за одной цепи переменной области фрагмент CART19 время мыши происхождения. Это точка внимания в неполадке съемки, если хорошее выражение ЦАР изначально не наблюдается.

Эти модифицированные клетки CAR-T могут быть использованы в исследованиях in vitro и in vivo xenograft для доказательства концептуальных экспериментов. Преимущество этого метода является то, что производство клеток CAR-T и генетические манипуляции могут происходить в один шаг с хорошей эффективностью по сравнению с другими методами. 10 Лет , 11 В то время как двойная лентивирная трансдукция является удобным и эффективным методом для создания исследовательских классов GM-CSFk/o CART19 клеток, ДНК включена в геном и длительное выражение Cas9 может дестабилизировать геном и увеличить риск нецелевых эффектов. Ограничение этого метода является то, что хорошее производство практике класса нокауты потребует модификации техники рибонуклеопротеин CRISPR/Cas9 системы, как эта методология не приводит к постоянному включению Cas9 в геном и снижает потенциал для внецелевых эффектов. Методология, описанная в протоколе здесь, потенциально может быть применена к различным генам для генетической модификации клеток CAR-T через CRISPR/Cas9, чтобы помочь генерировать менее токсичные или более эффективные клетки CAR-T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SSK является изобретателем патентов в области Т-клеточной терапии CAR, которые лицензированы Novartis (в соответствии с соглашением между клиникой Майо, Университетом Пенсильвании и Novartis). Эти исследования частично финансировались за счет гранта от Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS и SSK являются изобретателями патентов, связанных с этой работой. Лаборатория (SSK) получает финансирование от Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys и Actinium.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана за счет грантов от K12CA090628 (SSK), Национальной комплексной онкологической сети (SSK), Клиника Майо Центр индивидуальной медицины (SSK), Фонд Предолин (SSK), клиника Майо Бюро перевода на практике (SSK), и Клиника Майо Медицинская Программа обучения ученых Роберт Л. Хауэлл Врач-ученый стипендий (RMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience Invitrogen 17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix Denville Scientific C775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit  STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a  BD Pharmingen 555800
Fixation Medium (Medium A) Invitrogen GAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2
CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector:
pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number:
High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free
of charge)
GenScript N/A custom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
https://tide.nki.nl. Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience Invitrogen 47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Monensin Solution, 1000X BioLegend 420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 BD Pharmingen 559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 BD Pharmingen 561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 BD Pharmingen 560687
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
NALM6, clone G5  ATCC CRL-3273 acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free Water Promega P119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile Genesee Scientific 25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM Thermo Scientific Nalgene 450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid Gibco 31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 BD Horizon 562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid Gibco 10378-016
Permeabilization Medium (Medium B) Invitrogen GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen K182001
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421 BD Horizon 562930
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74, (22), 6383-6389 (2014).
  2. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168, (4), 724-740 (2017).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377, (26), 2531-2544 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378, (5), 439-448 (2018).
  5. Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377, (26), 2545-2554 (2017).
  6. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368, (16), 1509-1518 (2013).
  7. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365, (8), 725-733 (2011).
  8. Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7, (12), 1404-1419 (2017).
  9. Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45, (2), e124-e131 (2017).
  10. Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66, (2), 39-42 (2018).
  11. Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8, (9), 634-643 (2017).
  12. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. (2018).
  13. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46, (12), 2083-2089 (2006).
  14. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, (8), 783-784 (2014).
  15. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, (22), e168 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics