Un metodo di congelamento-thawing per preparare idrogel chitosan-Poly (alcool vinile) senza agenti cross-linking e studi di rilascio diflunisali

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Il metodo di congelamento-scongelamento viene utilizzato per produrre idrogel chitosan-polio(alcool vinile) senza agenti intertrainanti. Per questo metodo, è importante considerare le condizioni di congelamento (temperatura, numero di cicli) e il rapporto polimerico, che possono influenzare le proprietà e le applicazioni degli idrogel ottenuti.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Figueroa-Pizano, M. D., Vélaz, I., Martínez-Barbosa, M. E. A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Poly(vinyl alcohol) Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies. J. Vis. Exp. (155), e59636, doi:10.3791/59636 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Gli idrogel chitosan-polio(alcool vitile) possono essere prodotti con il metodo del congelamento-scongelamento senza l'uso di agenti antisciverba tossici. Le applicazioni di questi sistemi sono limitate dalle loro caratteristiche (ad esempio, porosità, flessibilità, capacità di gonfiore, carico di droga e capacità di rilascio di droga), che dipendono dalle condizioni di congelamento e dal tipo e dal rapporto dei polimeri. Questo protocollo descrive come preparare gli idrogel dal chitosan e dal polinoma alcool al 50/50 w/w % della composizione dei polimeri e a variare la temperatura di congelamento (-4 gradi centigradi, -20 gradi centigradi, -80 gradi centigradi) e cicli di congelamento (4, 5, 6 cicli di congelamento). Sono stati ottenuti dati di spettro FT-IR, micrografia SEM e porosimetria di idrogel. Inoltre, sono stati valutati la capacità di gonfiore e il carico di droga e il rilascio di diflunisal. I risultati delle micrografie SEM e della porosimetria mostrano che la dimensione dei pori diminuisce, mentre la porosità aumenta a temperature più basse. La percentuale di gonfiore era più alta alla temperatura di congelamento minore. È stato studiato il rilascio di diflunisal dagli idrogel. Tutte le reti mantengono il rilascio di droga per 30 h ed è stato osservato che un semplice meccanismo di diffusione regola il rilascio diflunisal secondo i modelli Korsmeyer-Peppas e Higuchi.

Introduction

Recentemente, gli idrogel hanno attirato grande interesse nel campo biomedico perché sono reti tridimensionali ad alto contenuto di acqua e sono morbidi e flessibili, in modo da poter imitare facilmente i tessuti naturali1. Inoltre, non si dissolvono in mezzo acquoso a temperatura fisiologica e pH, ma presentano un grande gonfiore2. Gli idrogel possono agire come scaffold di ingegneria tissutale, prodotti per l'igiene, lenti a contatto e medicazioni per ferite; perché possono intrappolare e rilasciare composti attivi e farmaci, sono utilizzati come sistemi di somministrazione di farmaci3. A seconda della loro applicazione, gli idrogel possono essere fatti da polimeri naturali o sintetici, o una combinazione di entrambi, al fine di ottenere le migliori caratteristiche4.

Le proprietà degli idrogel sono una conseguenza di molti fattori fisici e chimici. A livello fisico, la loro struttura e morfologia dipendono dalla loro porosità, dimensione dei pori e distribuzione deipori 5. A livello chimico e molecolare, il tipo di polimero, il contenuto di gruppo idrofilo nella catena polimerica, il tipo di punto di intercollegamento e la densità di collegamento incrociato sono i fattori che determinano la capacità di gonfiore e le proprietà meccaniche6,7.

A seconda del tipo di agente di collegamento incrociato utilizzato per formare la rete, gli idrogel sono classificati come idrogel chimici o idrogel fisici. Gli idrogel chimici sono uniti da interazioni covalenti tra le loro catene, che si formano attraverso l'irradiazione UV e gamma o utilizzando un agente intercollegato7,8. Gli idrogel chimici di solito sono forti e resistenti, ma, in generale, l'agente intercollegato è tossico per le cellule e la sua rimozione è difficile, quindi la sua applicazione è limitata. D'altra parte, gli idrogel fisici si formano con la connessione delle catene polimeriche attraverso interazioni non covalenti, evitando l'uso di agenti di collegamento incrociato4,9. Le principali interazioni non covalenti nella rete sono le interazioni idrofobiche, le forze elettrostatiche, i limiti complementari e di idrogeno7.

Poly(vinyl alcohol) (PVA, Figura 1a) è un polimero sintetico e solubile in acqua con eccellenti prestazioni meccaniche e biocompatibilità che può da idrogel senza agente crosslink attraverso il metodo di congelamento-scongelamento10,11. Questo polimero ha la capacità di formare zone concentrate di legami di idrogeno tra -OH gruppi delle loro catene (zone cristalline) quando sono congelamento12. Queste zone cristalline fungono da punti di interazione nella rete, e sono promosse da due eventi: l'avvicinamento delle catene polimeriche quando l'acqua cristallina si espande e il PVA conformazionale cambia da isotattico a sinoca PVA durante il congelamento13. A causa del congelamento, i cristalli d'acqua sono sublimati, lasciando spazi vuoti che sono i pori nell'idrogel14. Per ottenere idrogel con proprietà migliori, PVA può essere facilmente combinato con altri polimeri.

In questo senso, il chitosan costituisce un'opzione in quanto è l'unico biopolimero proveniente da fonti naturali con cariche positive. Si ottiene con la deacetlazione della chitina ed è composto da combinazioni casuali di D-glucosamina collegata (unità deacetilata) e N-acetyl-D-glucosamina (unità acetilata)15,16 (Figura 1b). Chitosan è biodegradabile dagli enzimi umani ed è biocompatibile. Inoltre, per la sua natura cationica, può interagire con la carica negativa della superficie cellulare, e questa proprietà è stata associata alla sua attività antimicrobica17. Questo polimero è facile da elaborare; tuttavia, le loro proprietà meccaniche non sono sufficienti e alcuni materiali sono stati aggiunti per formare complessi con caratteristiche migliori.

Considerando caratteristiche specifiche del chitosan e del PVA, la produzione di successo di idrogel è stata raggiunta con ilmetododi congelamento2,18 per evitare l'uso di agenti antiscianti tossici. Negli idrogel chitosan-PVA si formano anche le zone cristalline di PVA, e le catene chitosane sono interpenetrate e formano semplici legami di idrogeno con -NH2 gruppi e -OH gruppi in PVA. L'idrogel chitosan-PVA finale è meccanicamente stabile, con alti tassi di gonfiore e bassa tossicità, e con effetto antibatterico18. Tuttavia, a seconda delle condizioni di congelamento utilizzate nella preparazione (temperatura, tempo e numero di cicli), le caratteristiche finali possono cambiare. Alcuni studi riferiscono che aumentando il numero di cicli di congelamento diminuisce il grado di gonfiore e aumenta la forza di tensione19,20. Al fine di rafforzare la rete, altri agenti come radiazioni gamma e UV e crosslinker chimici sono stati utilizzati in aggiunta dopo la preparazione congelata21,22,23. Gli idrogel con una proporzione chitosana più alta hanno una rete più porosa e un'elevata capacità di gonfiore, ma meno resistenza e stabilità termica. In questo contesto, è importante considerare le condizioni di preparazione per ottenere idrogel adatti per l'applicazione di destinazione.

Lo scopo di questo lavoro è quello di presentare in dettaglio come le condizioni di congelamento (temperatura di congelamento e numero di cicli) influenzano le caratteristiche finali degli idrogel CS-PVA. Sono stati valutati spettri FT-IR, caratteristiche morfologiche e porosità e capacità di gonfiore, nonché il carico di droga e la capacità di rilascio. Negli studi di rilascio, diflunisal (Figura 1c) è stato utilizzato come farmaco modello, a causa delle sue dimensioni adatte alla struttura dell'idrogel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione di idrogel chitosan-PVA

  1. Preparare 2% (w/w) chitosan e 10% (w/w) soluzioni PVA. Sciogliere 0,2 g di chitosano in 10 mL di 0,1 M CH3soluzione COOH (precedentemente filtrata) a temperatura ambiente e mantenere la continua agitazione meccanica durante la notte. Sciogliere 1 g di PVA in 10 mL di acqua distillata e mescolare a 80 gradi centigradi per 1 ora.
  2. Mescolare entrambe le soluzioni 1:1 utilizzando un agitatore magnetico fino a quando non sono omogenei a temperatura ambiente, e versare le miscele sui piatti Petri. Lasciare i campioni per 2 h a pressione atmosferica a degas.
  3. Congelano a -4 gradi centigradi, -20 o -80 gradi per 20 h e 4 cicli (campioni rispettivamente CP4-4, CP4-20 e CP4-80). Congel a -80 gradi centigradi per 20 h utilizzando 5 o 6 cicli di congelamento (campioni CP5-80 e CP6-80). Dopo il terzo ciclo di congelamento, lavare gli idrogel con acqua deionizzata. Alla fine, congelare gli idrogel a -46 gradi centigradi per 48 h e conservarli per un'ulteriore caratterizzazione (metodologia adattata da2).

2. Caratterizzazione FT-IR

  1. Mettere un pezzetto (1 mm x 2 mm) di idrogel nello spettrometro FT-IR in modalità ATR. Prendere gli spettri FT-IR da 4000 a 600 cm-1 (2 cm-1 di risoluzione e media di 32 scansioni).

3. Saggi di gonfiore

  1. Ritaglia i dischi (13 mm di diametro e 10 mm di altezza) dall'idrogel e pesali. Incubare i dischi in 50 mL di acqua deionizzata con agitazione a 25 gradi centigradi. Ripetere tre volte.
  2. Ogni 30 min rimuovere il campione dal mezzo, blotter per eliminare l'eccesso di acqua, e pesare. Calcolare il grado di gonfiore utilizzando l'equazione 1 e Equation 1 calcolare lo stato di equilibrio del gonfiore, a 24 h utilizzando l'equazione 2.
    Equation 2)
    Dove Equation 3 è il peso dell'idrogel secco ed Equation 4 è il peso dell'idrogel bagnato.
    Equation 5

4. Microscopia elettronica

  1. Coprire un pezzetto di idrogel con un sottile strato d'oro (30 s e 10 mA) in un rivestimento sputter.
  2. Mettere il campione in un microscopio elettronico a scansione (SEM). Analizzare i campioni sotto vuoto a 20 kV e scattare le immagini con un ingrandimento 500x e 1500x.

5. Porosimetria

  1. Posizionare i dischi di 15 mm di diametro del peso di circa 0,26 g nel penetrometro (un penetrometro solido, con un volume di massa di 0,3660 mL e 5,7831 mL di volume del gambo). Analizzare la porosità e la dimensione dei pori di Mercurio Intrusion Porosimetry (MIP).
  2. Condurre l'esperimento in modalità isteresi (intrusione-estrusione). Misurare il volume totale di intrusione (mL/g), l'area totale dei pori (m2/g), il diametro dei pori (m), la porosità (%), la permeabilità (mDarcy) e la tortuosità. Ripetere due volte.

6. Carico e rilascio di farmaci

  1. Prima del caricamento, preparare 4 L di 15 mg/L di soluzione diflunisale e mescolare durante la notte. Confermare la concentrazione della soluzione mediante spettroscopia UV-Vis (concentrazione iniziale). Infatti, gonfiare 400 mg di campioni liofilizzati di idrogel in 6 mL di acqua distillata per 24 h.
  2. Per il caricamento, riempire un pallone con 50 mL di soluzione diflunisale e mantenersi a 25 gradi centigradi con agitazione costante. Immergere ogni idrogel gonfio nel pallone.
    1. Prendere aliquote di soluzione diflunisal rimanente (2 mL) in tempi diversi al fine di determinare la regione dell'altopiano della curva, per esempio: 3, 6, 24, 27, 30 e 48 h. Dopo 24 h sostituire la soluzione con una nuova.
  3. Misurare l'assorbimento a 252 nm di ciascuno e determinare la concentrazione di diflunisal presente nella soluzione, utilizzando una curva di calibrazione didiflunisal. Calcolare la quantità di diflunisal trattenuta nell'idrogel a 24 e 48 h, come differenza di concentrazioni iniziali e finali, tenendo conto del volume totale (56 mL).
    1. Determinare l'efficienza di incapsulamento (EE) utilizzando l'equazione 3.
      Equation 6
    2. Congel e liofilo liofilo a -50 gradi centigradi.
  4. Per il rilascio di farmaci, immergere 300 mg di idrogel carichi diflunisili liofilisti liofili in 50 mL di tampone di fosfato (pH 7,4) a 25 gradi centigradi. Mantenere agitazione costante. Ritirare aliquote di 2 mL in tempi diversi e sostituirle con un nuovo mezzo per mantenere un volume costante.
    1. Determinate la diflunisal rilasciata spettrofotometricamente a 252 nm, secondo una curva di calibrazione.
  5. Dedurre il meccanismo di rilascio di droga predominante negli idrogel che regolano i dati di rilascio del farmaco corrispondenti al primo 60%, al modello Korsmeyer-Peppas (Equazione 4), per ottenere le costanti cinetica (k) e la diffusione (n). I valori n indicano il meccanismo del rilascio farmacologico24,25. Quindi, i valori n vicini allo 0,5 sono legati alla diffusione fickiana, nel frattempo valori di 0,5-1,0 per il trasporto anomalo, dove sono coinvolti catene di diffusione e rilassamento, e infine, i valori di 1,0 sono legati al trasporto caso II.
    Equation 7
    1. Per confermare i risultati, utilizzare i modelli matematici Higuchi, First order e zero order (Equazioni da 5 a 7) e selezionare la misura migliore.
    2. Equation 8
      Equation 9
      Equation 10
      dove t rappresenta il tempo di rilascio, Mt la quantità di farmaco somministrato in un dato momento, e M- la quantità totale di farmaco consegnato alla fine del processo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Preparazione idrogel
Gli idrogel Chitosan-PVA sono stati ottenuti a -4 gradi centigradi, -20 gradi centigradi e -80 gradi centigradi con 4 cicli di congelamento e a -80 gradi centigradi con 5 e 6 cicli di congelamento con il metodo di congelamento del congelamento2precedentemente riportato. Tutti gli idrogel erano omogenei, semitrasparenti, flessibili e resistenti contro la manipolazione.

Caratterizzazione FT-IR
Gli spettri FT-IR sono illustrati nella Figura 2. Sono stati rilevati sette segnali caratteristiche di polimeri chitosani e PVA: a 3286 cm-1 la modalità di vibrazione di stiramento del gruppo idrossile PVA (-OH) e a 2918 cm-1 la modalità di vibrazione di stiramento del -CH gruppo26,27. I segnali dei gruppi di amide, rappresentativi della struttura chitostica, sono stati trovati a 1652 cm-1 alla modalità di vibrazione di stiramento di C-O (amide I), a 1560 cm-1 alla modalità di vibrazione flection di N-H (amide II) e 1325 cm-1 alla vibrazione dell'amide III28,29,30. Altri segnali, a 1418 cm-1 alla modalità di vibrazione della flessione di C-H e a 1086 cm-1 alla modalità di vibrazione di stiramento dei gruppi C-O, entrambi di PVA, sono stati rilevati27,31,32.

Microscopia elettronica
Tutti gli idrogel CS-PVA hanno mostrato una superficie altamente porosa (Figura 3, da sinistra a destra) e sono stati osservati cambiamenti distintivi in base alle condizioni di preparazione. Gli idrogel preparati a -4 gradi centigradi (CP4-4) presentavano pori più grandi rispetto agli idrogel preparati a -80 gradi (CP4-80). Inoltre, quest'ultimo sembra avere una rete più porosa. Questo effetto può essere dovuto al fatto che, a temperature più basse, la formazione di cristalli d'acqua è stata più veloce e molti piccoli cristalli sono emersi e sono stati sublimati durante il processo di congelamento, lasciando pori vuoti14,33. Nel frattempo, l'effetto del numero di cicli di congelamento sembra promuovere pori più definiti e circolari in idrogel CP6-80 (Figura 3, dall'alto verso il basso).

Porosimetria
I campioni CP4-4, CP4-80 e CP6-80 hanno presentato cambiamenti più pronunciati; al fine di integrare le informazioni sulla morfologia, sono stati analizzati dal MIP (Tabella 1). Il confronto tra gli idrogel CP4-4 e CP4-80 (Figura 3a) ha mostrato che, a una temperatura inferiore di congelamento, gli idrogel hanno sviluppato una rete più porosa, che presentava un grande volume totale di intrusione e una maggiore area totale dei pori. Tuttavia, gli idrogel CP6-80 mostravano una minore permeabilità rispetto al CP4-80 (Figura 3b), probabilmente a causa della loro elevata tortuosità, che si è riflessa anche in un volume di intrusione totale inferiore. Figura 3 presenta le diverse dimensioni dei pori di questi idrogel. Si sono distinte due dimensioni dei pori, una compresa tra 0,3-5,0 m e l'altra tra 5,0 e 30 m. Negli idrogel CP4-80 e CP6-80, la rete porosa aveva un numero maggiore di piccoli pori rispetto a quelli grandi, rispetto agli idrogel CP4-4. Questi risultati erano simili a quelli osservati dalle micrografie SEM e suggerivano che, a bassa temperatura, si favorivano le interazioni maggiori tra le catene PVA e si formassero più zone cristalline. In tal modo, la formazione di zone cristalline da catene PVA, è stata stimolata a bassa temperatura.

Saggi di gonfiore
Il comportamento gonfiore degli idrogel CS-PVA può essere visto nella Figura 4. Hanno rapidamente assorbito grandi quantità di acqua; per le prime 5 ore hanno mantenuto 10x il loro peso, e dopo 20 ore mantengono fino a 15 volte il loro peso (punto di equilibrio). Tuttavia, in relazione agli idrogel preparati allo stesso numero di cicli di congelamento, l'idrogel CP4-80 ha mostrato una capacità di gonfiore inferiore nelle prime 5 ore come conseguenza della temperatura utilizzata per la sua preparazione (-80 gradi centigradi). Nel caso di idrogel preparati a diversi numeri di cicli di congelamento (CP4-80, CP5-80 e CP6-80) non sono state riscontrate differenze in qualsiasi momento. Probabilmente, la diminuzione della capacità di gonfiore osservata negli idrogel preparati a -80 gradi centigradi è stata causata dalle piccole dimensioni dei pori della rete idrogel.

Caricamento e rilascio di farmaci
Per valutare la capacità degli idrogel CS-PVA come sistemi di somministrazione di farmaci, il farmaco antinfiammatorio diflunisal è stato caricato nella rete e successivamente rilasciato. L'efficienza di incapsulamento (EE) in tutti questi sistemi era di circa il 70%; tuttavia, l'idrogel CP4-80 presentava più leggermente EE al 73%(tabella 2). Nel frattempo, la cinetica di rilascio di diflunisal dagli idrogel CS-PVA sono stati mantenuti per circa 30 h in tutti i casi. L'idrogel CP4-80 ha rilasciato la più alta quantità di diflunisal (Figura 5). Ciò può essere dovuto al fatto che questo idrogel ha mostrato una struttura più porosa rispetto agli altri due tipi di idrogel. Questa caratteristica ha permesso alla piccola molecola di farmaco di entrare facilmente nella rete idrogel e, quindi, di essere rilasciata. Tra gli idrogel CP4-80 e CP6-80 non sono state osservate differenze durante i tempi di rilascio (Figura 6). Nessun effetto burst è stato osservato in nessuno degli idrogel CS-PVA, che è promettente per le applicazioni farmaceutiche. Sono stati utilizzati modelli matematici per determinare il meccanismo di rilascio principale negli idrogel CS-PVA. I risultati sono stati adattati a diversi modelli matematici (Tabella 3) e, in base ai valori n, si è scoperto che la diffusione di Fick domina il processo di rilascio di farmaci.

Figure 1
Figura 1: Struttura chimica di PVA (a), chitosan (b) e diflunisal (c). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Spettri FT-IR di chitosano puro e PVA e idrogel chitosan-PVA preparati a diverse condizioni di congelamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Micrografie SEM di idrogel chitosan-PVA con ingrandimento 1500x. Distribuzioni di dimensioni pore di idrogel chitosan-PVA: a) idrogel preparati con 4 cicli di congelamento e a -4 gradi centigradi e -80 gradi centigradi. b) Idrogel preparati a -80 gradi centigradi e 4 e 6 cicli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Gonfiore cinetica di idrogel chitosan-PVA: a) idrogel con 4 cicli di congelamento e b) idrogel preparati a -80 gradi centigradi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Profili di rilascio diflunisali inEquation 11 mg (a) e Mt/ (b) per idrogel CP4-4 e CP4-80. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Profili di rilascio diflunisali inEquation 11 mg (a) e Mt/ (b) per idrogel CP4-80 e CP6-80. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Idrogel Volume totale delle intrusioni (mL/g) Area totale dei pori (m2/g) Porosità (%) Permeabilità (mdarcy) Tortuosità
CP4-4 5.16 10.19 67.13 132.43 10.46
CP4-80 7.36 15.14 85.95 151.16 5.83
CP6-80 6.69 12.86 84.82 129.28 12.2

Tabella 1: Parametri di porosita della struttura porosa degli idrogel chitosan-PVA.

Esempio Diflunial caricato Diflunisal rilasciato
idrogel mg/g Efficienza di incapsulamento (%) % rilasciata rispetto al caricato
CP4-4 3,05 x 0,09 71 79 x 3,33
CP4-80 3.22 - 0,47 73 86 x 0,4
CP6-80 3.19 X 0,05 68 80 x 3,9

Tabella 2: Efficienze di incapsulamento e rilascio per idrogel chitosan-PVA.

Esempio Korsmeyer-Peppas Higuchi Primo Ordine Ordine zero
kKP x 102 N R2 kH x 102 R2 k1 x 102 R2 k0 x 102 R2
(min-n) (min-0,5) (min-1) (min-1)
CP4-4 4,3 x 0,39 0,44 x 0,02 0.99 3.1 - 0,1 0.98 0,29 x 0,03 0.803 0,18 - 0,02 0.54
CP4-80 3,6 x 0,33 0,50 - 0,02 0.99 3,7 - 0,1 0.99 0,42 - 0,03 0.894 0,27 - 0,02 0.7
CP6-80 2.3 - 0,24 0,54 x 0,02 0.99 2,9 - 0,1 0.99 0,27 - 0,02 0.925 0,17 - 0,01 0.77
k- costante cinetica; n- costante di diffusione.

Tabella 3: Parametri cinetici del rilascio diflunisale da idrogel chitosan-PVA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il metodo di congelamento è un processo adatto per preparare idrogel biocompatibili focalizzati in applicazioni biomediche, farmaceutiche o cosmetiche34,35,36. Il vantaggio più importante di questo metodo, rispetto ad altri metodi ben noti per preparare idrogel, è che l'uso di agente crosslinking è evitato, che potrebbe causare una risposta infiammatoria o effetti negativi nel corpo umano34. Questo è un metodo versatile perché offre la possibilità di preparare idrogel da PVA o le loro miscele con diversi polimeri11,37 in modo tale che nuove caratteristiche dagli altri polimeri possono essere ottenute nel nuovo materiale (ad esempio, grande capacità di assorbire acqua, proprietà antimicrobiche o antiossidanti2,18,35). Tuttavia, è importante considerare che l'incorporazione di altri polimeri potrebbe diminuire la forza degli idrogel19,37.

I principali parametri da considerare nel metodo di congelamento-scongelamento sono la temperatura di congelamento, il tempo e il numero di cicli di congelamento, e anche, il rapporto polimerico (in caso di miscele di polimeri)2,19,20. Con questo metodo è possibile ottenere un'ampia gamma di proprietà di gonfiore, morfologiche e meccaniche quando le condizioni di congelamento sono controllate. Questi parametri influenzano direttamente la configurazione di rete tridimensionale in idrogel chitosan-PVA perché le condizioni di congelamento promuove le disposizioni nelle catene PVA, che sono unite da interazioni fisiche, chiamate zone cristalline12,38. Queste zone cristalline sono regioni concentrate di legami di idrogeno che agiscono come punti di interazione negli idrogel, che mantengono e formano la rete tridimensionale ed è una forza retrattore quando gli idrogel sono nello stato di gonfiore2,39,40.

In questo studio, abbiamo valutato l'effetto di una nuova gamma di temperature di congelamento (-4 gradi centigradi, -20 gradi centigradi e -80 gradi centigradi) combinate con un numero diverso di cicli di congelamento (4, 5 e 6) ma allo stesso tempo di congelamento (20 h), per preparare idrogel chitosani-PVA 1:1. La capacità di gonfiore più bassa è stata osservata alla temperatura più bassa (-80 gradi centigradi). Infatti, gli idrogel a questa temperatura più bassa hanno ottenuto i pori più piccoli e le reti più porose. Queste differenze negli idrogel chitosan-PVA sono utili per diverse applicazioni come sistemi di somministrazione di farmaci o scaffold. In generale, gli idrogel chitosan-PVA presentano alti tassi di gonfiore, a causa di gruppi idrofili chitosani (-NH2)41,42, e sono morbidi, flessibili, facili da gestire e resistere alla manipolazione a causa delle caratteristiche PVA. In questo senso, il metodo di congelamento-scongelamento è facile, economico e veloce per produrre idrogel chitosan-PVA con proprietà diverse, evitando il crosslinking tossico.

Anche se il congelamento-scongelamento è un metodo facile e amichevole, ha alcuni inconvenienti. Una completa omogeneizzazione del chitosan, in questo caso, e delle miscele di polimeri è molto importante. Gli idrogel possono presentare zone più fragili e una struttura porosa irregolare. Inoltre, è necessario fare una corretta dissoluzione del PVA in acqua riscaldando a 70-80 c42,43 per 1 h in agitazione magnetica. Il raffreddamento di questa soluzione PVA deve essere lento con agitazione costante per evitare la formazione di uno strato solido di PVA.

Una limitazione di questo metodo, per i saggi di coltura cellulare, è la formazione di idrogel biancastri o semitrasparenti. In questo caso, l'applicazione di glicerolo o DMSO (composto tossico a temperatura ambiente) potrebbe essere utilizzata per migliorare l'aspetto di idrogel23,44. La fase di congelamento del metodo di congelamento-scongelamento per preparare idrogel CS-PVA è un passo fondamentale, perché gli idrogel potrebbero presentare una costrizione nella zona centrale, che complicano il lavoro e la caratterizzazione. Per evitare questo, il campione deve essere mantenuto completamente congelato prima della liofilizzazione. Per quanto riguarda gli studi di caricamento e rilascio del farmaco, è molto importante garantire che non vi sia alcuna interferenza con i segnali dai componenti dell'idrogel e dal farmaco da quantificare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori sono grati a C. Luzuriaga per il supporto nelle misurazioni della porosimetria. Autori anche grazie al Ministro di Econom à A y Competitividad della Spagna per il sostegno finanziario (Progetto MAT2014-59116-C2-2-R) e PIUNA (rif. 2018-15). Gli autori desiderano anche riconoscere il Dr. Amir Maldonado di Departamento de Fasica-UNISON per il supporto e commenti utili e il Dr. SE Burruel-Ibarra da DIPM-UNISON per le immagini SEM e Rubio Pharma y Asociados S. A. de C. V. per il sostegno finanziario. ME Martanez-Barbosa ringrazia i progetti n. 104931 e n. 256753, oltre al sostegno finanziario di Red Temtica de Nanociencias y Nanotecnologàa del programa de Redes Temàticas del CONACyT. E, anche il progetto USO316001081. MD Figueroa-Pizano vorrebbe riconoscere CONACyT per il sostegno finanziario (studio 373321).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials:
Chitosan medium molecular weight Sigma-Aldrich 448877 Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid) Merck
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 1005706
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich 341584 Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto TED PELLA INC
Cryodos Lyophilizator Telstar
Falcon tubes Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopy Nicolet iS50 in ATR mode
Lyophilizator LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500 Micromeritics
Scanning electron microscope Pemtron SS-300LV
UV-visible spectrophotometer Agilent 8453

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gyles, D. A., Castro, L. D., Silva, J. O. C., Ribeiro-Costa, R. M. A review of the designs and prominent biomedical advances of natural and synthetic hydrogel formulations. European Polymer Journal. 88, (01), 373-392 (2017).
  2. Abdel-Mohsen, aM., Aly, aS., Hrdina, R., Montaser, aS., Hebeish, a Eco-Synthesis of PVA/Chitosan Hydrogels for Biomedical Application. Journal of Polymers and the Environment. 19, 1005-1012 (2011).
  3. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. European Polymer Journal. 65, 252-267 (2015).
  4. Ahmadi, F., Oveisi, Z., Samani, M., Amoozgar, Z. Chitosan based hydrogels: Characteristics and pharmaceutical applications. Research in Pharmaceutical Sciences. 10, (1), 1-16 (2015).
  5. Siepmann, J., Siegel, R. A., Rathbone, M. J. Fundamentals and applications of controlled release drug delivery. Fundamentals and Applications of Controlled Release Drug Delivery. (2012).
  6. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, O. G. Hydrogels: Methods of Preparation, Characterisation and Applications. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications. 117-146 (2011).
  7. Ahmed, E. M. Hydrogel: Preparation, characterization, and applications. Journal of Advanced Research. 6, (2), 105-121 (2015).
  8. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sensors and Actuators, B: Chemical. 147, (2), 765-774 (2010).
  9. Patel, A., Mequanint, K. Hydrogel Biomaterials. Biomedical Engineering - Frontiers and Challenges. 275-296 (2012).
  10. Kenawy, E., Kamoun, E. A., El-meligy, M. A., Mohy, M. S. Physically crosslinked poly ( vinyl alcohol ) - hydroxyethyl starch blend hydrogel membranes Synthesis and characterization for biomedical applications. Arabian Journal of Chemistry. 7, (3), 372-380 (2014).
  11. Kamoun, E. A., Kenawy, E. R. S., Chen, X. A review on polymeric hydrogel membranes for wound dressing applications: PVA-based hydrogel dressings. Journal of Advanced Research. 8, (3), 217-233 (2017).
  12. Hassan, C. M., Peppas, N. A. Structure and Morphology of Freeze / Thawed PVA Hydrogels. Macromolecules. 33, 2472-2479 (2000).
  13. Tsou, Y. H., Khoneisser, J., Huang, P. C., Xu, X. Hydrogel as a bioactive material to regulate stem cell fate. Bioactive Materials. 1, (1), 39-55 (2016).
  14. Kumar, A., Mishra, R., Reinwald, Y., Bhat, S. Cryogels: Freezing unveiled by thawing. Materials Today. 13, (11), 42-44 (2010).
  15. Wu, T., Li, Y., Lee, D. S. Chitosan-based composite hydrogels for biomedical applications. Macromolecular Research. 25, (6), 480-488 (2017).
  16. Dutta, P. K., Dutta, J., Tripathi, V. S. Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications. Journal of Scientific and Industrial Research. 63, 20-31 (2004).
  17. Szymańska, E., Winnicka, K. Stability of Chitosan—A Challenge for Pharmaceutical and Biomedical Applications. Marine Drugs. 13, 1819-1846 (2015).
  18. Yang, X., Liu, Q., Chen, X., Yu, F., Zhu, Z. Investigation of PVA/ws-chitosan hydrogels prepared by combined gamma-irradiation and freeze-thawing. Carbohydrate Polymers. 73, (3), 401-408 (2008).
  19. Mathews, D. T., Birbey, Y. A., Cahill, P. A., McGuinness, G. B. Mechanical and Morphological Characteristics of Poly(vinyl alcohol)/Chitosan Hydrogels. Journal of Applied Polymer Science. 109, 1129-1137 (2008).
  20. Hosseini, M. S., Amjadi, I., Haghighipour, N. Preparation of Poly(vinyl alcohol)/Chitosan-Blended Hydrogels: Properties, in Vitro Studies and Kinetic Evaluation. Journal of Biomimetics, Biomaterials, and Tissue Engineering. 15, 63-72 (2012).
  21. Afshari, M. J., Sheikh, N., Afarideh, H. PVA/CM-chitosan/honey hydrogels prepared by using the combined technique of irradiation followed by freeze-thawing. Radiation Physics and Chemistry. 113, 28-35 (2015).
  22. Agnihotri, S., Mukherji, S. S., Mukherji, S. S. Antimicrobial chitosan-PVA hydrogel as a nanoreactor and immobilizing matrix for silver nanoparticles. Applied Nanoscience. 2, (3), 179-188 (2012).
  23. Yang, X., et al. Cytotoxicity and wound healing properties of PVA/ws-chitosan/glycerol hydrogels made by irradiation followed by freeze-thawing. Radiation Physics and Chemistry. 79, (5), 606-611 (2010).
  24. Machín, R., Isasi, J. R., Vélaz, I. Hydrogel matrices containing single and mixed natural cyclodextrins. Mechanisms of drug release. European Polymer Journal. 49, (12), 3912-3920 (2013).
  25. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A Simple Equation for Description of Solute Release. Journal of Controlled Release. 5, 37-42 (1987).
  26. Abureesh, M. A., Oladipo, A. A., Gazi, M. Facile synthesis of glucose-sensitive chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogel: Drug release optimization and swelling properties. International Journal of Biological Macromolecules. 90, 75-80 (2016).
  27. Mansur, H. S., Sadahira, C. M., Souza, A. N., Mansur, A. A. P. FTIR spectroscopy characterization of Poly(vinyl alcohol) hydrogel with different hydrolysis degree and chemically crosslinked with glutaraldehyde. Materials Science and Engineering C. 28, (4), 539-548 (2008).
  28. Parida, U. K., Nayak, A. K., Binhani, B. K., Nayak, P. L. Synthesis and Characterization of Chitosan-Polyvinyl Alcohol Blended with Cloisite 30B for Controlled Release of the Anticancer Drug Curcumin. Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology. 02, (04), 414-425 (2011).
  29. Zu, Y., et al. Preparation and characterization of chitosan-polyvinyl alcohol blend hydrogels for the controlled release of nano-insulin. International Journal of Biological Macromolecules. 50, (1), 82-87 (2012).
  30. Lejardi, A., Hernández, R., Criado, M., Santos, J. I., Etxeberria, A., Sarasua, J. R. Novel hydrogels of chitosan and poly ( vinyl alcohol ) -g-glycolic acid copolymer with enhanced rheological properties. Carbohydrate Polymers. 267-273 (2014).
  31. dos Reis, E. F., et al. Synthesis and characterization of Poly(vinyl alcohol) hydrogels and hybrids for rMPB70 protein adsorption. Materials Research. 9, (2), 185-191 (2006).
  32. Thanyacharoen, T., Chuysinuan, P., Techasakul, S., Nooeaid, P., Ummartyotin, S. Development of a gallic acid-loaded chitosan and polyvinyl alcohol hydrogel composite: Release characteristics and antioxidant activity. International Journal of Biological Macromolecules. 107, 363-370 (2018).
  33. Lozinsky, V. I., et al. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. Trends in Biotechnology. 21, (10), 445-451 (2003).
  34. Liu, Y., Vrana, N. E., Cahill, P. A., McGuinness, G. B. Physically crosslinked composite hydrogels of PVA with natural macromolecules: Structure, mechanical properties, and endothelial cell compatibility. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 90, (2), 492-502 (2009).
  35. Yang, W., et al. Polyvinyl alcohol/chitosan hydrogels with enhanced antioxidant and antibacterial properties induced by lignin nanoparticles. Carbohydrate Polymers. 181, (August 2017), 275-284 (2018).
  36. Park, H., Kim, D. Swelling and mechanical properties of glycol chitosan/poly(vinyl alcohol) IPN-type superporous hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 78, (4), 662-667 (2006).
  37. Zhang, H., Zhang, F., Wu, J. Physically crosslinked hydrogels from polysaccharides prepared by freeze-thaw technique. Reactive and Functional Polymers. 73, (7), 923-928 (2013).
  38. Hassan, C. M., Peppas, N. A. Structure and Applications of Poly ( vinyl alcohol ) Hydrogels Produced by Conventional Crosslinking or by Freezing / Thawing Methods. Advances in Polymer Science. 153, 37-65 (2000).
  39. Sung, J. H., et al. Gel characterisation and in vivo evaluation of minocycline-loaded wound dressing with enhanced wound healing using polyvinyl alcohol and chitosan. International Journal of Pharmaceutics. 392, (1-2), 232-240 (2010).
  40. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: Network design and mathematical modeling. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, (12-13), 1379-1408 (2006).
  41. Fan, L., Yang, H., Yang, J., Peng, M., Hu, J. Preparation and characterization of chitosan/gelatin/PVA hydrogel for wound dressings. Carbohydrate Polymers. 146, 427-434 (2016).
  42. Islam, A., et al. Evaluation of selected properties of biocompatible chitosan / poly ( vinyl alcohol) blends. International Journal of Biological Macromolecules. 82, 551-556 (2016).
  43. Physical Montaser, A. S. mechanical and antimicrobial evaluations of physically crosslinked PVA/chitosan hydrogels containing nanoparticles. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 6, (5), 1-6 (2016).
  44. Hou, Y., Chen, C., Liu, K., Tu, Y., Zhang, L., Li, Y. Preparation of PVA hydrogel with high-transparence and investigations of its transparent mechanism. RSC Advances. 5, (31), 24023-24030 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics