تشكيل كربونات الكالسيوم في وجود المضافات البوليمرية الحيوية

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نحن نصف بروتوكول لهطول الأمطار وتوصيف بلورات كربونات الكالسيوم التي تشكل في وجود البوليمرات الحيوية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التمعدن الحيوي هو تشكيل المعادن في وجود جزيئات عضوية، وغالبا ما ترتبط مع الأدوار الوظيفية و / أو الهيكلية في الكائنات الحية. وهي عملية معقدة، وبالتالي مطلوب نظام بسيط، في المختبر، لفهم تأثير الجزيئات المعزولة على عملية التمعدن الحيوي. في كثير من الحالات، يتم توجيه المعادن الحيوية بواسطة البوليمرات الحيوية في المصفوفة خارج الخلية. من أجل تقييم تأثير البوليمرات الحيوية المعزولة على مورفولوجيا وهيكل الكالسيت في المختبر، استخدمنا طريقة انتشار البخار لهطول الأمطار من كربونات الكالسيوم، المسح المجهري الإلكترون ورامان الجزئي للتوصيف، والأشعة فوق البنفسجية المرئية (الأشعة فوق البنفسجية / فيس) امتصاص لقياس كمية البوليمر الحيوي في البلورات. في هذه الطريقة، نقوم بتعريض البوليمرات الحيوية المعزولة، المذابة في محلول كلوريد الكالسيوم، إلى الأمونيا الغازية وثاني أكسيد الكربون التي تنشأ من تحلل كربونات الأمونيوم الصلبة. في ظل الظروف التي يتم فيها الوصول إلى منتج الذوبان من كربونات الكالسيوم، يتم تشكيل كربونات الكالسيوم والبلورات. كربونات الكالسيوم لديها polymorphs مختلفة تختلف في استقرارها الدينامي الحراري: كربونات الكالسيوم غير متبلور، vaterite، أراغونيت، والكالسيت. في غياب البوليمرات الحيوية ، في ظل ظروف نظيفة ، كربونات الكالسيوم موجودة في الغالب في شكل الكالسيت ، وهو أكثر متعدد الأشكال المستقرة حراريا من كربونات الكالسيوم. هذا الأسلوب يدرس تأثير المضافات البوليمرية الحيوية على مورفولوجيا وهيكل بلورات كربونات الكالسيوم. هنا، ونحن نعرض البروتوكول من خلال دراسة بروتين بكتيري خارج الخلية، تابا، على تشكيل بلورات كربونات الكالسيوم. وعلى وجه التحديد، نركز على الإعداد التجريبي، وأساليب التوصيف، مثل الفحص المجهري البصري والإلكترون وكذلك التحليل الطيفي لرامان.

Introduction

التمعدن الحيوي هو تشكيل المعادن في وجود جزيئات عضوية، وغالبا ما ترتبط مع الأدوار الوظيفية و / أو الهيكلية في الكائنات الحية. قد يكون التمعدن الحيوي داخل الخلايا، كما هو الحالفي تشكيل المغنطيسية داخل البكتيريا المغناطيسية 1، أو خارج الخلية، كما هو الحال في تشكيل كربونات الكالسيوم في قنفذ البحر المساميرمن هيدروكسيباتيت التي ترتبط مع الكولاجين في العظام3 والمينا التي ترتبط مع amelogenin في الأسنان4. التمعدن الحيوي هو عملية معقدة تعتمد على العديد من المعلمات في الكائن الحي. ولذلك، من أجل تبسيط النظام قيد الدراسة، من الضروري تقييم أثر المكونات المنفصلة على العملية. في كثير من الحالات، يتم التمعدن الحيوي عن طريق وجود البوليمرات الحيوية خارج الخلية. الغرض من الطريقة المعروضة هنا هي كما يلي: (1) لتشكيل بلورات كربونات الكالسيوم في وجود البوليمرات الحيوية المعزولة في المختبر، وذلك باستخدام طريقة نشر البخار. (2) دراسة تأثير البوليمرات الحيوية على مورفولوجيا وهيكل كربونات الكالسيوم.

وتستخدم ثلاث طرق رئيسية للتعجيل كربونات الكالسيوم في المختبر في وجود المضافات العضوية5،6. الطريقة الأولى، والتي سوف نشير إلى طريقة الحل، ويستند على خلط ملح قابل للذوبانمن الكالسيوم (على سبيل المثال، CaCl 2) مع ملح قابل للذوبان من كربونات (على سبيل المثال، كربونات الصوديوم). يمكن إجراء عملية الخلط بعدة طرق: داخل مفاعل مع ثلاث خلايا مفصولة بأغشية مسامية7. هنا، كل من الخلايا الخارجية يحتوي على ملح قابل للذوبان والخلية المركزية يحتوي على حل مع المضافة ليتم اختبارها. الكالسيوم والكربونات تنتشر من الخارج إلى الخلية الوسطى، مما يؤدي إلى هطول الأمطار من كربونات الكالسيوم أقل قابلية للذوبان عندما تتجاوز تركيزات الكالسيوم وكربونات المنتج الذوبان، Ksp = [Ca2+] [CO3 2-]. طريقة خلط إضافية هي إجراء طائرة مزدوجة8. في هذه الطريقة، يتم حقن كل ملح قابل للذوبان من حقنة منفصلة إلى حل أثار تحتوي على المضافة، حيث يعجل كربونات الكالسيوم. هنا، يتم التحكم في الحقن وبالتالي معدل الخلط بشكل جيد، على النقيض من الطريقة السابقة حيث يتم التحكم في الخلط عن طريق الانتشار.

الطريقة الثانية المستخدمة لبلورة كاكو3 هي طريقة كيتانو9. ويستند هذا الأسلوب على توازن كربونات / كربونات الهيدروجين (2HCO3- (AQ) + Ca2+(AQ) Image 1 CaCO3 (ق) + CO 2(ز) + H2O (l)). هنا، يتم فقاعات CO2 في حل يحتوي على كاكو3 في شكل صلب، وتحويل التوازن إلى اليسار وبالتالي حل كربونات الكالسيوم. يتم تصفية كربونات الكالسيوم غير المذابة وتضاف الإضافات المطلوبة إلى الحل الغني بالبيكربونات. ثم يسمح CO2 لتبخر، وبالتالي تحويل رد الفعل إلى اليمين، وتشكيل كربونات الكالسيوم في وجود الإضافات.

الطريقة الثالثة لتبلور كربونات الكالسيوم، والتي سوف نصفهنا، هو طريقة انتشار بخار10. في هذه المجموعة، يتم وضع المضافة العضوية، المذابة في محلول كلوريد الكالسيوم، في غرفة مغلقة بالقرب من كربونات الأمونيوم في شكل مسحوق. وعندما يتحلل مسحوق كربونات الأمونيوم إلى ثاني أكسيد الكربون والأمونيا، فإنها تنتشر فيالحل الذي يحتوي على أيونات الكالسيوم (مثل CaCl 2)، ويُترسب كربونات الكالسيوم (انظر الشكل 1 للاطلاع على التوضيح). يمكن أن تنمو بلورات كربونات الكالسيوم عن طريق هطول الأمطار البطيء أو عن طريق هطول الأمطار السريع. لطول الأمطار البطيء، يتم وضع حل يحتوي على المضافة في محلول CaCl2 في المجفف بجوار مسحوق كربونات الأمونيوم. في هطول الأمطار السريع، الموصوفة في الطول في البروتوكول، يتم وضع كل من الحل المضافة وكربونات الأمونيوم أقرب معا في لوحة متعددة الآبار. وسوف تنتج طريقة هطول الأمطار بطيئة عدد أقل من مراكز النويات وبلورات أكبر، وسوف يؤدي هطول الأمطار السريع إلى المزيد من مراكز النويات والبلورات الصغيرة.

وتختلف الأساليب الموصوفة أعلاه في تعقيدها التقني، وفي مستوى المراقبة، وفي معدل عملية هطول الأمطار. تتطلب طريقة الخلط إعداد خاص6 لكل من الطائرة المزدوجة ونظام الخلايا الثلاث. في طريقة الخلط، وجود أيونات مضادة أخرى قابلة للذوبان (على سبيل المثال، Na+، Cl-)6 أمر لا مفر منه، في حين أن في طريقة كيتانو، والكالسيوم و (بي) كربونات هي الأيونات الوحيدة في الحل، وأنه لا ينطوي على وجود إضافية الأيونات المضادة (على سبيل المثال، Na+، Cl-). وعلاوة على ذلك، فإن طريقة الخلط تتطلب كميات كبيرة نسبيا، وبالتالي فهي ليست مناسبة للعمل مع البوليمرات الحيوية باهظة الثمن. ميزة طائرة مزدوجة هو أنه من الممكن للسيطرة على معدل حقن الحل وأنه هو عملية سريعة بالمقارنة مع أساليب أخرى.

ميزة طريقة كيتانو وطريقة انتشار البخار هو أن يتم التحكم في تشكيل كربونات الكالسيوم عن طريق نشر CO2 إلى / خارج محلول CaCl مما يسمح للتحقيق أبطأ عمليات النويات وهطول الأمطار 11 , 12.وعلاوة على ذلك، تشكيل كربونات الكالسيوم عن طريق نشر ثاني أكسيد الكربون قد تشبه عمليات التكلس في الجسم الحي13،14،15. في هذه الطريقة، يتم تشكيل بلورات محددة جيدا ومنفصلة16. وأخيرا، يمكن اختبار تأثير البوليمرات الحيوية واحدة أو متعددة على تشكيل كربونات الكالسيوم. وهذا يتيح دراسة منهجية لتأثير سلسلة من التركيزات المضافة على تشكيل كربونات الكالسيوم، فضلا عن دراسة خليط من البوليمرات الحيوية - كل ذلك يتم بطريقة خاضعة للرقابة. هذه الطريقة مناسبة للاستخدام مع مجموعة كبيرة من التركيزات وكميات من المواد المضافة. الحد الأدنى من الحجم المستخدم هو ما يقرب من 50 درجة مئوية، وبالتالي فإن هذه الطريقة مفيدة عندما يكون هناك كمية محدودة من البوليمرات الحيوية المتاحة. يعتمد الحجم الأقصى على إمكانية الوصول إلى لوحة بئر أكبر، أو المجفف الذي يتم إدخال اللوحة أو الكأس التي تحتوي على CaCl 2. وقد تم تحسين الطريقة الموضحة أدناه للعمل في لوحة 96 جيدا مع البوليمر الحيوي اختار أن يكون البروتين تابا17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تبلور كربونات الكالسيوم

  1. إعداد التحكم وتحسينه
    1. إعداد قطع زجاجية نظيفة. استخدم نفس إجراء التنظيف لتنظيف الأواني الزجاجية.
      1. استخدام قلم الماس لقطع قطعة من شريحة المجهر الزجاجي بحيث تناسب في بئر من لوحة 96 جيدا.
        ملاحظة: 5 مم × 5 مم قطعة يجب أن تناسب إلى حد كبير.
      2. ضع القطع الزجاجية في كوب مع الماء المقطر الثلاثي (TDW) بحيث تغطي المياه الشرائح الزجاجية وsonicate في حمام sonicator لمدة 10 دقائق.
      3. Decant الماء، إضافة الإيثانول لتغطية الشرائح الزجاجية، وsonicate في سونيكاتور حمام لمدة 10 دقيقة.
      4. تجفيف الشرائح والأواني الزجاجية مع تيار من غاز النيتروجين ووضعها في منظف بلازما الهواء لمدة 10 دقائق في 130 W.
    2. تحسين تركيز CaCl2 المستخدمة في تجارب التكلس التي أجريت في ظل الظروف التجريبية المطلوبة لتحقيق عينة غنية ببلورات الكالسيت السلسة الأوجه (بدون أو على الأقل مع عدد نادر من الفاتيت بلورات).
      1. ملء الآبار في زوايا لوحة 96 جيدا مع مسحوق كربونات الأمونيوم وختم لوحة باستخدام رقائق الألومنيوم. تغطية احباط مع فيلم البارافين. تنظيف أي كربونات الأمونيوم المتبقية باستخدام غاز النيتروجين.
        تحذير: كربونات الأمونيوم تهيج الأنف والرئتين. استخدام فقط داخل غطاء محرك السيارة الدخان.
      2. إعداد حل الأسهم من 0.5 M CaCl2. سيتم استخدام هذا الحل الأسهم لإعداد تدرج من تركيزات حلول CaCl2 في لوحة متعددة الآبار.
        ملاحظة: حل مخزون 10 مل كافية للتجربة بأكملها.
      3. ضع القطع الزجاجية المقطوعة والنظيفة سابقاً في خمس آبار مختلفة. استخدام أقرب الآبار إلى المركز.
      4. ملء كل بئر تحمل قطعة زجاجية مع 100 درجة مئوية من محلول CaCl2 16. مزيج TDW و 0.5 M CaCl2 (الأسهم) لتحقيق تدرج تركيز متزايد من CaCl2 عبر الآبار المختلفة. إذا تم استخدام لوحة جيدة مختلفة الحجم، ضبط تركيز CaCl2 لتحقيق بلورات كالسيت منفصلة (الخطوة 1.1.2.10، وانظر قسم المناقشة).
        ملاحظة: يتم استخدام تدرج CaCl2 زيادة من تركيزات 10 و 20 و 30 و 40 و 50 mM في آبار منفصلة في هذا البروتوكول. ولزيادة نطاق التركيز أو عدد التركيزات التي تم اختبارها، استخدم آباراً إضافية.
      5. ثقب غطاء كل من الآبار التي تحتوي على كربونات الأمونيوم 3X مع إبرة.
      6. وضع الغطاء مرة أخرى، وختم الحدود مع فيلم البارافين والاحتفاظ بها في 18 درجة مئوية في حاضنة لمدة 20 ساعة.
      7. بعد الحضانة، افتح الغطاء بعناية داخل غطاء الدخان وإزالة البلورات التي تشكلت في واجهة الماء / الهواء مع حلقة.
      8. استخدم ملاقط لنقل القطع الزجاجية إلى كوب يحتوي على ماء مقطر مزدوج (DDW). إزالة العينات من الكأس واستخدام شريط على الوجهين لإصلاح القطع الزجاجية على الجزء السفلي من طبق بيتري.
      9. المياه الجافة المفرطة لمس حدود الشريحة مع مناديل الأنسجة. يُغطّى طبق البتري ويُوضع في المجفف لمدّة 24 ساعة.
      10. مراقبة بلورات شكلت على القطع الزجاجية مع منظار ستيريو (3.5x التكبير) و / أو المجهر البصري تستقيم (10x-40x التكبير). إذا كانت حلول التحكم نظيفة، سيتم ملاحظة بلورات rhombohedral (على الأرجح كالسيت) مع المجهر البصري (الشكل2A).
      11. إذا بالإضافة إلى بلورات rhombohedral، والسيطرة يحتوي على بلورات كروية (على الأرجح vaterite، الشكل 2B)،أو إذا مسح المجهر الإلكتروني (SEM) الصور تظهر بلورات rhombohedral مع وجوه خشنة بدلا من السلس ( الشكل 3 A,B)،كرر بروتوكول التبلور مع التأكد من تنفيذ خطوة التنظيف (1.1.1) بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، جعل الرعاية أفضل أنه لا يوجد كربونات الأمونيوم في المناطق على لوحة أخرى من الآبار المخصصة. وإلا، تابع إلى الخطوة التالية.
  2. التبلور في وجود الإضافات
    1. لدراسة تأثير المواد المضافة على تبلور CaCO3، قم بإعداد لوحة متعددة الآبار التي تحتوي على (في آبار مختلفة) ، والسيطرة CaCl2 الحل دون إضافات ، وحلول CaCl2 مع الإضافات. استخدم التركيز الأمثل لـ CaCl2 الموجود في القسم 1-1-2 للتجربة.
      ملاحظة: يستخدم البروتوكول أدناه الظروف المثلى مثل تلك التي تم الإبلاغ عنها في دراسة سابقة16.
    2. كرر الخطوة 1.1.2.2.
    3. ضع مسحوق كربونات الأمونيوم في زوايا اللوحة كما هو موضح في الخطوة 1-1-2-1.
    4. في كل بئر حيث سيحدث هطول الأمطار، ضع قطعة زجاجية تم قطعها وتنظيفها على النحو المبين في القسم 1-1-1.
    5. لإعداد آبار التحكم، ماصة 90 درجة مئوية من TDW في آبار التحكم. إعداد واحد على الأقل تكرار كل بئر بما في ذلك عنصر التحكم. إذا كانت المادة المضافة المستخدمة في حل المخزن المؤقت، ثم ماصة 90 €L من العازلة بدلا من المياه TDW.
    6. إعداد الآبار التي تحتوي على المواد المضافة. كرر الخطوة 1.2.5 بإضافة 90 ميكرولتر من الحل المضاف في الماء. إذا كانت المادة المضافة في المخزن المؤقت (بدلاً من TDW)، قم بضبط تركيز المضاف مع المخزن المؤقت مسبقًا لتلبية التركيز النهائي المطلوب. الحفاظ على حجم إجمالي قدره 90 درجة مئوية. ماصة أولا المضافة، ثم المخزن المؤقت.
      ملاحظة: يتم استخدام تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر من بروتين تابا في 100 مل من حمض الكلر، 25 mM Tris pH 8.0 buffer16 في هذا البروتوكول.
    7. إضافة 10 μL من 0.5 M CaCl2 حل الأسهم (أعدت في الخطوة 1.2.2) إلى كل من الضوابط والآبار التي تحتوي على المواد المضافة للوصول إلى تركيز نهائي من 50 مل CaCl2.
    8. كرر الخطوات 1-1-2-5-1-1-2-9.

2. توصيف بلورات كربونات الكالسيوم

  1. باستخدام المجهر الإلكتروني المسحي، لاحظ بلورات كربونات الكالسيوم التي تشكلت في وجود الإضافات بدقة أعلى من تلك التي تم الحصول عليها بواسطة الميكروسكوب البصري (انظر الخطوة 1.1.2.10).
    1. جبل القطع الزجاجية التي تحتوي على بلورات على كعب الألومنيوم مع الشريط الكربون على الوجهين.
    2. معطف مع طبقة من الاتحاد الافريقي / Pd لمدة 40-50 ق.
    3. الحصول على الصور في 5 كيلوفولت الجهد التسارع.
      ملاحظة: الشكل 3A يظهر صورة SEM تمثيلية لبلورات كربونات الكالسيوم التي تشكلت في تجربة التحكم السليم، في حين يظهر الشكل 4 صور تمثيلية لبلورات كربونات الكالسيوم التي تشكلت في وجود البروتين تابا .
  2. إجراء مطياف رامان الجزئي لتحديد polymorphs كربونات الكالسيوم شكلت. يسمح Micro Raman بجمع طيف رامان من بلورات واحدة بدلاً من مسحوق كامل.
    1. استخدام هدف 20X من المجهر لاختيار الكريستال من الفائدة.
    2. جمع طيف رامان في نطاق 100-3200 سم-1 باستخدام ليزر الأرجون 514 نانومتر.
      ملاحظة: يبين الشكل 5 الأطياف التمثيلية للكالسيت (ألف) والفاتيت (باء). للطيف من أراغونيت، يرجى الرجوع إلى المرجع18.
  3. التحديد الكمي للنسبة المئوية للكتلة من المواد المضافة في CaCO3 يعجل
    1. التحقق من/قياس معامل الانقراض (و) من المضافة المستخدمة. يمكن إعطاء معامل الانقراض من البروتين من قبل خوادم على الانترنت19. إذا كان معامل الانقراض غير معروف، قم بقياس امتصاص المادة المضافة بتركيزات مختلفة، ورسم الامتصاص مقابل التركيز، وحساب معامل الانقراض من منحدر المنحنى.
    2. وزن القطع الزجاجية حيث شكلت بلورات، ويفضل استخدام التوازن الدقيق.
    3. كشط بلورات قبالة الزجاج في 1.2 مل من 0.1 M محلول حمض الخليك، دوامة وsonicate العينة. تخزين العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
      تحذير: حمض الخليك خطير جدا في حالة الجلد أو الاتصال بالعين. التعامل بحذر والتخلص من اتباع اللوائح.
    4. وزن الشريحة الزجاجية بعد كشط قبالة بلورات.
    5. قياس الأشعة فوق البنفسجية / مقابل امتصاص (A) الطيف من الحل. إذا كانت المادة المضافة بروتينًا، قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر وحساب تركيزه (C)،باستخدام معادلة البيرة لامبرت:
      Equation 1
      حيث أنا هو المسار البصري داخل كوفيت.
    6. استخدم التركيز (C) الموجود في 2.3.5 والحجم المستخدم (V = 1.2 مل) لحساب كتلة (م) من الإضافات في / على البلورات. إذا كان التركيز في مغ/مل، استخدم المعادلة CV = m.
      1. إذا كان التركيز في مول / لتر، ثم حساب الشامات (ن) تطبيق CV = ن. ثم استخدام الوزن الجزيئي (Mw) لحساب كتلة (م) من المواد المضافة (م = نميغاواط).
    7. حساب نسبة الوزن من المواد المضافة في / Equation 2 على بلورات باستخدام المعادلة: ، حيث م هو كتلة من المواد المضافة، وΔm s هو كتلة بلورات كربونات الكالسيوم التي تم التخلص منها من الزجاج قطعه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر مخطط الإعداد التجريبي في الشكل 1. باختصار، يتم استخدام طريقة الانتشار من أجل تشكيل بلورات كربونات الكالسيوم في لوحات 96-well واختبار تأثير البوليمرات الحيوية على مورفولوجيا وهيكل بلورات كربونات الكالسيوم. في هذه التجارب، يتم تحلل كربونات الأمونيوم في الأمونيا وثاني أكسيد الكربونوالتي تنتشر في حلول كربونات الكالسيوم، مما أدى إلى تشكيل بلورات كربونات الكالسيوم (الشكل1 والشكل 2).

يتم تقييم تأثير البوليمرات الحيوية بالمقارنة مع بلورات كربونات الكالسيوم التي شكلت مع وبدون (السيطرة) المضافات. قبل إضافة الإضافات، يتم اختيار تركيز كربونات الكالسيوم الأمثل ويتم اختبار نظافة الحلول والأواني الزجاجية. الشكل 2 يظهر صورة تمثيلية لتجربة التحكم، حيث يتم تشكيل بلورات كربونات الكالسيوم rhombohedral متميزة. هذه البلورات هي على الأرجح الكالسيت (انظر الشكل 5). إذا لم يتم تنظيف الحلول أو البلاستيك أو الأواني الزجاجية بشكل صحيح ثم بلورات كروية سوف تشكل (الشكل2ملحوظ مع الدوائر الحمراء)، بالإضافة إلى بلورات الكالسيت rhombohedral. البلورات الكروية هي على الأرجح vaterite (انظر الشكل5). مؤشر إضافي لاستخدام الظروف المناسبة، هو نعومة وجوه الكالسيت في تجربة التحكم. ويمكن ملاحظة ذلك مع SEM، كما هو مبين في الشكل 3. الشكل 3 يظهر عنصر تحكم مناسب مع وجوه الكالسيت السلسة، في حين يظهر الشكل 3B بلورات الكالسيت مع وجوه تتألف من خطوات. البلورات الكروية هنا هي فاتيت. بلورات التحكم تحتاج إلى فصل وسلس الأوجه بحيث يكون تأثير المواد المضافة على مورفولوجيا الكريستال واضحة.

لإثبات تأثير البوليمر الحيوي على مورفولوجيا كربونات الكالسيوم، استخدمنا هنا البروتين تابا. يظهر الشكل 4 بلورات كربونات الكالسيوم التي تشكلت في وجود تابا في الحل. بلورات متميزة عن بلورات التحكم. وهي تشكل تجميعكربونات الكالسيوم الكروية المعقدة، وتتألف من بلورات دقيقة متعددة كالسيت (انظر طيف رامان في الشكل5). إحدى الطرق لوصف بنية البلورات هي التحليل الطيفي لرامان. ويبين الشكل 5 الأطياف النموذجية للكالسيت (الشكل5ألف)والفاتيت (الشكل5باء)،المأخوذة من تجارب التحكم الناجحة (أ) وغير الناجحة (باء). قمم امتصاصنموذجية 20 هي في نطاق 100-400 سم-1 (وسائط شعرية)، ذروة في ~ 710 سم-1 (الانحناء متناظرة من CO32-) و ~ 1090 سم-1 (تمتد متناظرة من CO3 2-). لاحظ انقسام تحول رامان في ~ 1080 سم-1 وهذا هو السمة الأكثر وضوحا من vaterite21. الرجوع إلى المرجع22 للحصول على مجموعة كاملة من أراغونيت. طيف رامان من بلورات شكلت في وجود تابا يشبه طيف الكالسيت (الشكل5A). وفي الحالات التي تظهر فيها قمم إضافية لا تتوافق مع طيف واحد من متعدد الأشكال كربونات الكالسيوم، أو مزيج من تلك، يمكن أن تعزى إلى فائض من كلوريد الكالسيوم لم يتم غسله بدقة في الخطوة 1-1-2-8.

في القسم الأخير من البروتوكول، قمنا بقياس النسبة المئوية (الوزن/ الوزن) للمحتوى العضوي داخل أو على بلورات كربونات الكالسيوم. تم حل البلورات في حمض الخليك وأفرج عن البوليمر الحيوي في الحل. في الحالات التي يكون فيها البوليمر الحيوي طيف امتصاص مميز، يمكن تحديد تركيزه في الحل. في حالة البروتينات التي تحتوي على مجموعات جانبية عطرية، كما هو الحال في دراسة الحالة هنا من تابا، يتم استخدام امتصاص في 280 نانومتر. يظهر طيف امتصاص تابا، الذي يقاس بعد انحلال البلورات في الحمض، في الشكل 6 (الأخضر) جنبا إلى جنب مع طيف التحكم (بلورات كربونات الكالسيوم المذابة بالحمض دون المضافة؛ أسود). باستخدام قانون البيرة لامبرت (انظر الخطوة 2.3.5) واستخدام معامل الانقراض من 29700 M-1 سم-1، وجدنا أن النسبة المئوية للكتلة من TapA كان 1.8٪ ± 0.2٪. قياس امتصاص الحل بعد انحلال الكريستال في حمض ممكن عندما البوليمرات الحيوية لا تتجمع في درجة الحموضة المنخفضة. إشارة فارغة لامتصاص الحل الذي يحتوي على المضافة يدل على تجميعها. في هذه الحالة، يمكن استخدام طرق تحليل مختلفة، مثل تحليل الجاذبية الحرارية (TGA) لتقدير كتلة الإضافات الموجودة داخل / على البلورات.

Figure 1
الشكل 1 وصف تخطيطي لطريقة انتشار بخار سريع لتشكيل بلورات كربونات الكالسيوم: يتم وضع الملح القابل للذوبان المحتوي على الكالسيوم (مثل كلوريد الكالسيوم) بالقرب من مسحوق كربونات الأمونيوم. هنا نعرض بئرين في طبق 96 بئر. ثم يتم ختم اللوحة، وكربونات الأمونيوم تتحلل في الأمونيا وثاني أكسيد الكربون التي تنتشر في البئر التي تحتوي على الكالسيوم، مما أدى إلى هطول الأمطار من بلورات كربونات الكالسيوم (كما هو موضح هنا من قبل صورة SEM من الكريستال الكالسيت). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 صور المجهر البصري لبلورات كربونات الكالسيوم: تحكم نظيف يحتوي في الغالب على الكالسيت ، والذي يتميز بلورات الريوموندرال (أ). عندما تتضمن عينة التحكم بلورات كروية (مثل تلكالتي تم وضع علامة عليها بدائرة حمراء) (B)، كرر بروتوكول التنظيف كما هو مقترح في القسم 1.1.1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 المسح المجهري الإلكتروني لبلورات كربونات الكالسيوم التي تشكلت في تجربتين للتحكم: (أ) صورة عينة تحتوي في الغالب على بلورات الريومبهيدريال (كالسيت). (ب) صورة مجهرية لعينة ذات أوجه كالسيت مكسورة وبلورات كروية هي على الأرجح فاتيت. في هذه الحالة، يجب تكرار تجارب التحكم. تم تعديل هذا الرقم من Azulay وآخرون16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 صور SEM من بلورات الكالسيت شكلت في وجود البروتين تابا. قضبان مقياس تمثل 50درجة (A) و 10 ميكرومتر (B)، على التوالي. تم تعديل هذا الرقم من Azulay وآخرون16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 رامان الأطياف من اثنين من polymorphs من كربونات الكالسيوم. (أ) كالسيت. (ب) فاتيريت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 الأشعة فوق البنفسجية / مقابل امتصاص أطياف تابا (الأخضر) والحل العازلة (100 مل NaCl، 25 mM تريس الحموضة 8.0؛ أسود). تم استخدام الامتصاص لحساب تركيز تابا في بلورات كربونات الكالسيوم، بعد انحلالها في الحمض. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا تهدف إلى تشكيل بلورات كربونات الكالسيوم في وجود المضافات العضوية وتقييم تأثير البوليمرات الحيوية العضوية على مورفولوجيا وهيكل بلورات كربونات الكالسيوم في المختبر. ويستند الأسلوب على مقارنة بلورات شكلت في وجود المضافات العضوية لبلورات الكالسيت شكلت في تجربة التحكم. لقد أظهرنا كيفية استخدام طريقة الانتشار لتشكيل بلورات كربونات الكالسيوم، وكيفية توصيف مورفولوجيا باستخدام الفحص المجهري البصري والإلكترون، وكيفية توصيف هيكلها باستخدام مطياف رامان، وكيفية تحديد المحتوى العضوي (الوزن / الوزن النسبة المئوية) من البلورات.

وصفنا البروتوكول الذي استخدمناه لتقييم تأثير البروتين البكتيري خارج الخلية، تابا، على مورفولوجيا وهيكل كربونات الكالسيوم، ولكن يمكن أن تنفق البروتوكول على أي بوليمر الأخرى التي يتم تنقيتها بيولوجيا أو توليفها. بالإضافة إلى تأثير البوليمر الحيوي واحد، يمكن استخدام هذه الطريقة مع خليط من البوليمرات الحيوية من أجل تقييم أي تبادل بين البوليمرات المختلفة في تأثيرها على هطول الأمطار كربونات الكالسيوم. لقد قصرنا الإعداد التجريبي على لوحة 96 بئر; ومع ذلك، فإن أي مجموعة أخرى حيث يتم وضع حلول كربونات الكالسيوم وفصلها ماديا عن مصدر كربونات الأمونيوم (أي، يتم وضع الحلول ومسحوق في وعاء مختوم)، هو ممكن. السفن النموذجية المستخدمة هي لوحات متعددة الآبار ويتم استخدام نطاق تركيز نموذجي من 10-50 mM لإعداد تجريبي مع لوحات 96 جيدا10،16،23. كما يمكن استخدام الكأس المختوم أو المجفف.

هذه الطريقة سهلة الاستخدام ومتوافقة مع تركيزات منخفضة وكميات منخفضة من المضافات البوليمرية الحيوية. العمل في لوحة متعددة جيدا يسمح بفحص المعلمات متعددة في نفس الوقت في تجربة واحدة لوحة متعددة جيدا. قد تكون هذه الطريقة حساسة للموقف النسبي لآبار كربونات الكالسيوم فيما يتعلق بوضع مسحوق كربونات الأمونيوم. لذلك، يجب توخي الحذر لاستخدام الآبار دائما في نفس الموقف في لوحة متعددة الآبار وأيضا للتحقق من أن تغيير موقع الآبار لا يؤثر على النتائج. عادة، باستخدام مسافة كبيرة بما فيه الكفاية بين الآبار حيث تجري التجارب ومسحوق كربونات الأمونيوم، يضمن أن النتائج قابلة للاستنساخ. وبالإضافة إلى ذلك، من الأهمية بمكان ضبط تركيز محلول CaCl2 بحيث تتشكل بلورات منفصلة في تجربة التحكم، كما هو موضح في القسم 1-1-2. كما ينبغي تحسين تركيز المواد المضافة ليتجاوز الحد الأدنى من التركيز الذي لا يلاحظ دونه أي تأثير. لاحظ أن الطريقة حساسة للغاية لتركيز المواد المضافة؛ تركيزات مضافة مختلفة قد تحفز تأثير مختلف على مورفولوجيا وهيكل بلورات كربونات الكالسيوم24.

أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو أن الأمونيا وثاني أكسيد الكربون ينتشران في حلول اختبار كلوريد الكالسيوم، وبالتالي هناك سيطرة ضعيفة على درجة الحموضة طوال التجربة. نتيجة لنشر الأمونيا، يزيد الرقم الهيدروجيني في الحل (عندما تصبح الأمونيا الأمونيوم)، كماهو مبين في معادلات التوازن 5،6 ((NH 4)2CO3 (s) → 2NH3 (ز) + CO2 (ز) + H 2 O(l), NH3 (aq) + H2O(l) → NH4+(aq) + OH-(aq), Ca2+(aq) + CO2(aq) +2OH-(aq) Image 1 كاكو3 (ق) + H2O (ل)) ويفضل تشكيل كربونات الكالسيوم. 

بالمقارنة مع الأساليب الإضافية الموضحة في المقدمة، هذه الطريقة بسيطة من الناحية الفنية. بسبب بطء عملية هطول الأمطار، يمكن اتباع نمو الكريستال في الوقت الحقيقي، وذلك باستخدام تقنيات الامتصاص أو التشتت من تقنية شفافة متعددة الآبار. [إين دّيأيشن], [إين وردر تو] تبعت الحركيّة من ال [كرستل غروون], واحدة يستطيع أيضا تحرّكت البلورة مورفولوجيا وبنية في مختلفة وقت نقطات, [رثر ثن] بعد 20 ساعات, بما أنّ ينجز في دراستنا. ويمكن توسيع هذه الطريقة لدراسة هطول الأمطار من أملاح أخرى من الكربونات تحمل Ksp صغيرة بما فيه الكفاية، مثل المغنيسيوم والباريوم وكربونات الكادميوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يشكرا البروفيسور ليا آدي، والبروفيسور جوناثان إيريز، والدكتور يائيل بوليتي على المناقشات المثمرة. وقد تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF)، منحة 1150/14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Gadot 64-19-7
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 506-87-6
Calcium chloride dihydrate Merck KGaA 10035-04-8
Ethanol Absolute Gadot 64-17-5
Micro-Raman Renishaw inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope Nikon Eclipse 90i model
Nis elements Br software Nikon For microscope imaging
Scanning Electron Microscope ThermoFisher Scientific FEI Sirion microscope
Spectrophotometer JASCO V-670 model
Sputter coater Polaron SC7640 model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, (4212), 377-379 (1975).
  2. Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306, (5699), 1161-1164 (2004).
  3. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183, (2), 258-269 (2013).
  4. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
  5. Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
  6. Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6, (8), 1915-1920 (2006).
  7. Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11, (3), 301-308 (2013).
  8. Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199, (2), 247-254 (1998).
  9. Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67, (12), 4873-4874 (1962).
  10. Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9, (12), 1171-1177 (2007).
  11. Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5, (4), 1317-1319 (2005).
  12. Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203, (4), 627-635 (2002).
  13. Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
  14. Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54, (1), 151-187 (2003).
  15. Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
  16. Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18, (9), 5582-5591 (2018).
  17. Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. (2018).
  18. Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118, (3), 753-757 (1997).
  19. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. Springer. 571-607 (2005).
  20. Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37, (9), 892-899 (2006).
  21. Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
  22. Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293, (5), 478-491 (2002).
  23. Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
  24. Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20, (30), 4221-4224 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics