Kalciumkarbonatbildning i närvaro av Biopolymera tillsatser

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver ett protokoll för utfällning och karakterisering av kalciumkarbonatkristaller som bildas i närvaro av biopolymerer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biomineralization är bildandet av mineraler i närvaro av organiska molekyler, ofta relaterade till funktionella och/eller strukturella roller i levande organismer. Det är en komplicerad process och därför ett enkelt, in vitro-system krävs för att förstå effekten av isolerade molekyler på biomineralisering processen. I många fall styrs biomineralisering av biopolymerer i den extracellulära matrisen. För att utvärdera effekten av isolerade biopolymerer på morfologin och strukturen av kalcit in vitro, har vi använt ång diffusions metoden för utfällning av kalciumkarbonat, scanning elektronmikroskopi och Micro Raman för karakterisering, och ultraviolett-synligt (UV/VIS) absorbans för att mäta antalet av en Biopolymer i kristallerna. I denna metod utsätter vi isolerade biopolymerer, lösta i en kalciumkloridlösning, till gasformig ammoniak och koldioxid som härstammar från nedbrytningen av fast ammoniumkarbonat. Under de förhållanden där löslighets produkten av kalciumkarbonat är nådd bildas kalciumkarbonatutfällningarna och kristallerna. Kalciumkarbonat har olika polymorfer som skiljer sig i deras termodynamiska stabilitet: amorft kalciumkarbonat, vaterite, aragonite, och kalcit. I avsaknad av biopolymerer, under rena förhållanden, är kalciumkarbonat mestadels närvarande i kalcit form, som är den mest termodynamiskt stabila polymorph av kalciumkarbonat. Denna metod undersöker effekten av de biopolymera tillsatser på Morfologi och struktur av kalciumkarbonat kristaller. Här demonstrerar vi protokollet genom studiet av ett extracellulärt bakterie protein, TapA, om bildandet av kalciumkarbonatkristaller. Specifikt fokuserar vi på de experimentella metoderna för att skapa och karakterisera, såsom optisk och elektronmikroskopi samt Raman-spektroskopi.

Introduction

Biomineralization är bildandet av mineraler i närvaro av organiska molekyler, ofta relaterade till funktionella och/eller strukturella roller i levande organismer. Biomineralization kan vara intracellulär, som i bildandet av magnetit inuti magnetotaktiska bakterier1, eller extracellulära, som i bildandet av kalciumkarbonat i havet urchin spikes2, av hydroxyapatit som är relaterad med kollagen i Ben3 och emalj som är associerad med amelogenin i tänderna4. Biomineralization är en komplicerad process som beror på många parametrar i den levande organismen. Därför, för att förenkla det system som studeras, är det nödvändigt att utvärdera effekten av separata komponenter på processen. I många fall induceras biomineralisering av närvaron av extracellulära biopolymerer. Syftet med den metod som presenteras här är följande: (1) för att bilda kalciumkarbonatkristaller i närvaro av isolerade biopolymerer in vitro, med hjälp av en ång diffusions metod. (2) att studera effekten av biopolymerer på Morfologi och struktur av kalciumkarbonat.

Tre huvudsakliga metoder för att fälla ut kalciumkarbonat in vitro i närvaro av organiska tillsatser används5,6. Den första metoden, som vi kommer att hänvisa till som lösningsmetod, är baserad på blandning av ett lösligt salt av kalcium (t. ex., CaCl2) med ett lösligt salt av karbonat (t. ex. natriumkarbonat). Blandningsprocessen kan utföras på flera sätt: inuti en reaktor med tre celler som skiljs åt av porösa membran7. Här innehåller var och en av de yttre cellerna ett lösligt salt och den centrala cellen innehåller en lösning med den tillsats som ska testas. Kalcium och karbonat diffus från den yttre till mellersta cellen, vilket resulterar i utfällning av mindre lösliga kalciumkarbonat när koncentrationerna av kalcium och karbonat överstiga deras löslighet produkt, KSP = [ca2 +] [co3 2-]. En ytterligare Blandningsmetod är dubbel-Jet förfarande8. I denna metod injiceras varje lösligt salt från en separat spruta till en omrörd lösning som innehåller tillsatsen, där kalciumkarbonat fälls ut. Här, injektionen och därför blandnings hastigheten är väl kontrollerad, i motsats till den tidigare metoden där blandningen styrs av diffusion.

Den andra metoden som används för att kristallisera CaCO3 är Kitano metod9. Denna metod är baserad på balansen mellan karbonat och vätekarbonat (2hco3- (AQ) + ca2 +(AQ) Image 1 Caco3 (s) + Co2 (g) + H2O (l)). Här är CO2 bubblade in i en lösning som innehåller Caco3 i en solid form, flytta balansen till vänster och därför upplösning av kalciumkarbonat. Det oupplösta kalciumkarbonat filtreras och de önskade tillsatser läggs till bikarbonat-rik lösning. CO2 får sedan avdunta, och därmed flytta reaktionen till höger, bildar kalciumkarbonat i närvaro av tillsatser.

Den tredje metoden för kalciumkarbonat kristallisation, som vi kommer att beskriva här, är ångdiffusions metoden10. I denna uppsättning, den organiska tillsatsen, upplöst i en lösning av kalciumklorid, placeras i en sluten kammare nära ammoniumkarbonat i en pulverform. När ammoniumkarbonatpulver bryts ned till koldioxid och ammoniak, diffunderar de in i lösningen som innehåller kalciumjoner (t. ex. CaCl2), och kalciumkarbonat fälls ut (se figur 1 för illustration). Calciumkarbonatkristaller kan växa vid långsam nederbörd eller vid fastar nederbörd. För den långsamma nederbörden placeras en lösning som innehåller tillsatsen i CaCl2 -lösning i en exsickator bredvid ammoniumkarbonatpulvret. I den snabba nederbörden, som beskrivs utförligt i protokollet, placeras både additiv lösningen och ammoniumkarbonat närmare varandra i en multi-well-platta. Den långsamma nederbörden metoden kommer att producera färre nukleation centra och större kristaller, och den snabba nederbörden kommer att resultera i fler nukleation centra och mindre kristaller.

De metoder som beskrivs ovan skiljer sig i deras tekniska komplexitet, i nivån av kontroll och i takt med nederbörden processen. Blandnings metoden kräver en särskild uppsättning6 för både dubbel stråle och trecellssystem. I blandnings metoden är närvaron av andra lösliga Counter-joner (t. ex., na+, cl-)6 oundviklig, medan i Kitano-metoden är kalcium och (BI) karbonat de enda joner i lösning och det innebär inte förekomst av ytterligare (t. ex., na+, cl-). Dessutom kräver blandnings metoden relativt stora volymer och därför är den inte lämplig för arbete med dyra biopolymerer. Fördelen med dubbel stråle är att det är möjligt att kontrollera graden av lösning injektion och att det är en snabb process i jämförelse med andra metoder.

Fördelen med Kitano-metoden och ång diffusions metoden är att bildandet av kalciumkarbonat styrs genom diffusion av CO2 till/från en CaCl2 -lösning, vilket gör det möjligt att söka långsammare kärnbildning och nederbörd processer elva , 12. Dessutom kan kalciumkarbonatbildningen genom diffusion av co2 likna förkalkning processer in vivo13,14,15. I denna metod bildas väldefinierade och separerade kristaller16. Slutligen kan effekten av enstaka eller flera biopolymerer på kalciumkarbonatbildning testas. Detta möjliggör en systematisk studie av effekten av en serie additiva koncentrationer på kalciumkarbonatbildningen samt en studie av blandningar av biopolymerer-allt utfört på ett kontrollerat sätt. Denna metod är lämplig för användning med ett stort utbud av koncentrationer och volymer av tillsatser. Den minimala volym som används är ungefär 50 μL och därför är denna metod fördelaktig när det finns en begränsad mängd av de tillgängliga Biopolymererna. Den maximala volymen beror på tillgängligheten för en större brunn-platta eller exsickatorn i vilken plattan eller bägaren som innehåller CaCl2 skall sättas in. Den metod som beskrivs nedan har optimerats för att arbeta i en 96-brunn tallrik med en Biopolymer valt att vara proteinet TapA17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kristallisation av kalciumkarbonat

  1. Kontroll beredning och optimering
    1. Förbered rena glasbitar. Använd samma rengöringsprocedur för att rengöra glas.
      1. Använd en diamantpenna för att skära bitar av ett glas Mikroskop Slide så att de passar i en brunn på en 96-bra tallrik.
        Obs: 5 mm x 5 mm bitar bör i hög grad passa.
      2. Placera glasbitarna i en bägare med Triple destillerat vatten (TDW) så att vattnet täcker glas rutschbanorna och Sonikera i ett bad sonikator i 10 min.
      3. Dekanera vattnet, tillsätt etanol för att täcka glaset diabilder, och Sonikera i ett bad sonikator för 10 min.
      4. Torka av glasen och glas med en ström av kvävgas och placera dem i en luft plasma renare för 10 min vid 130 W.
    2. Optimera koncentrationen av CaCl2 används i förkalkning experiment utförs under de önskade experimentella förhållanden för att uppnå ett prov rik med slät-facetterade kalcit kristaller (utan eller åtminstone med ett knappa antal vaterite kristaller).
      1. Fyll brunnarna i hörnen på en 96-brunn tallrik med ammoniumkarbonatpulver och försegla plattan med aluminiumfolie; Täck folien med paraffin film. Rengör eventuellt kvarvarande ammoniumkarbonat med hjälp av kvävgas.
        FÖRSIKTIGHET: ammoniumkarbonat irriterar näsa och lungor; Använd endast inuti draghuv.
      2. Förbered en stamlösning av 0,5 M CaCl2. Denna stamlösning kommer att användas för att förbereda en gradient av koncentrationer av CaCl2 -lösningar i multi-well plattan.
        Anmärkning: en 10 mL stamlösning är tillräcklig för hela experimentet.
      3. Placera de tidigare skurna och rengjorda glasbitarna i fem olika brunnar. Använd de närmaste brunnarna till centrum.
      4. Fyll varje brunn bär en glasbit med 100 μL av en CaCl2 lösning16. Blanda TDW och 0,5 M CaCl2 (lager) för att uppnå en ökande koncentrations lutning av CaCl2 över de olika brunnarna. Om en annan storlek brunn-plattan används, justera koncentrationen av CaCl2 för att uppnå separata kalcit kristaller (steg 1.1.2.10, och se diskussions avsnitt).
        Anmärkning: en ökande CaCl2 -gradient på 10, 20, 30, 40, 50 mm koncentrationer i separata brunnar används i detta protokoll. För att öka koncentrationsintervallet eller antalet testade koncentrationer, Använd ytterligare brunnar.
      5. Punktera locket på var och en av brunnarna som innehåller ammoniumkarbonat 3x med en nål.
      6. Sätt tillbaka locket, täta kanterna med paraffin film och hålla den vid 18 ° c i en inkubator för 20 h.
      7. Efter inkuberingen, öppna locket försiktigt inuti en draghuv och ta bort kristallerna som bildas vid vatten/luft-gränssnittet med en slinga.
      8. Använd en pincett för att överföra glasbitarna till en bägare som innehåller dubbelt destillerat vatten (DDW). Ta bort proverna från bägaren och Använd en dubbelhäftande tejp för att fixera glasbitarna på botten av petriskål.
      9. Torr överdriven vatten vidrör kanterna på bilden med vävnad våtservetter. Täck petriskål och placera den i en exsickator för 24 h.
      10. Observera kristallerna bildas på glasbitarna med en stereoskop (3.5 x förstoring) och/eller ett upprätt optiskt mikroskop (10X-40x förstoring). Om kontroll lösningarna är rena, kommer rhombohedral kristaller (troligen kalcit) observeras med ett optiskt mikroskop (figur 2a).
      11. Om förutom de rhombohedral kristaller, kontrollen innehåller sfäriska kristaller (troligen vaterite, figur 2B), eller om Scanningelektronmikroskop (SEM) bilder visar rhombohedral kristaller med grov snarare än släta ansikten ( Figur 3 A, B), upprepa kristalliserings protokollet och se till att rengörings steget (1.1.1) utförs korrekt. Se dessutom till att det inte finns något ammoniumkarbonat i andra områden på plattan än de avsedda brunnarna. Annars fortsätter du till nästa steg.
  2. Kristallisation i närvaro av tillsatser
    1. För att studera effekten av tillsatser på kristallisation av CaCO3, inrätta en multi-well tallrik som innehåller (i olika brunnar), en kontroll CaCl2 lösning utan tillsatser, och CaCl2 lösningar med tillsatser. Använd den optimala koncentrationen av CaCl2 som finns i avsnitt 1.1.2 för experimentet.
      Anmärkning: i protokollet nedan används optimala förhållanden som de som rapporterades i en tidigare studie16.
    2. Upprepa steg 1.1.2.2.
    3. Placera ammoniumkarbonatpulver i hörnen på plattan enligt beskrivningen i steg 1.1.2.1.
    4. I varje brunn där nederbörden kommer att inträffa, placera en glasbit som klipptes och rengöras som beskrivs i avsnitt 1.1.1.
    5. För att bereda kontrollbrunnar, Pipettera 90 μL TDW i kontroll brunnarna. Förbered minst en replikat av varje brunn inklusive kontrollen. Om den tillsats som används är i en buffertlösning, Pipettera sedan 90 μL buffert i stället för TDW vatten.
    6. Förbered de additiva-innehållande brunnarna. Upprepa steg 1.2.5 genom att tillsätta 90 μL av additiv lösningen i vatten. Om tillsatsen är i buffert (i stället för TDW), förjustera koncentrationen av tillsatsen med buffert för att möta den önskade slutkoncentrationen. Behåll en total volym på 90 μL; Pipettera först tillsatsen, sedan bufferten.
      Anmärkning: en slutkoncentration på 10 μM av proteinet TapA i 100 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8,0 buffer16 används i detta protokoll.
    7. Tillsätt 10 μL av 0,5 M CaCl2 -lagerlösningen (beredd i steg 1.2.2) till både kontrollerna och tillsatserna som innehåller brunnar för att nå en slutlig koncentration på 50 mm CaCl2.
    8. Upprepa steg 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. karaktärisering av kalciumkarbonatkristaller

  1. Med ett Scanningelektronmikroskop, Observera kalciumkarbonat kristaller bildas i närvaro av tillsatser med en högre upplösning än den som erhålls genom optisk mikrokopia (se steg 1.1.2.10).
    1. Montera glasbitarna som innehåller kristallerna på en aluminium stub med dubbelsidig koltejp.
    2. Kappa med ett skikt av au/PD för 40-50 s.
    3. Hämta bilderna vid 5 kV accelerations spänning.
      Anmärkning: figur 3a visar en representativ SEM bild av kalciumkarbonat kristaller bildas i en ordentlig kontroll experiment, medan figur 4 visar representativa bilder av kalciumkarbonat kristaller bildas i närvaro av proteinet TapA .
  2. Utför Micro Raman spektroskopi för att bestämma kalciumkarbonat polymorphs bildas. Micro Raman tillåter insamling av ett Raman spektrum från enskilda kristaller snarare än från en hel pulver.
    1. Använd en 20x mål av mikroskopet att välja kristallen av intresse.
    2. Samla in Raman spektrum i en räckvidd på 100 − 3200 cm-1 med hjälp av en 514 nm argon laser.
      Anm.: i figur 5 visas representativa spektra av kalcit (a) och vaterite (B). För spektrumet av aragonit, hänvisa till referens18.
  3. Kvantifiering av Massprocenten av tillsatserna i CaCO3 -fällningsämnen
    1. Kontrollera/Mät utdöningskoefficienten (ε) för den tillsats som används. Utrotningskoefficienten för ett protein kan ges av Online-servrar19. Om utrotningskoefficienten är okänd, Mät tillsatsens absorbans vid olika koncentrationer, rita upp absorbansen kontra koncentrationen och beräkna utrotningskoefficienten från kurvans lutning.
    2. Väg glasbitarna där kristallerna bildas, helst använda en Microbalance.
    3. Skrota kristallerna från glaset till 1,2 mL 0,1 M ättiksyralösning, Vortex och Sonikera provet. Förvara provet i rumstemperatur i 24 timmar.
      FÖRSIKTIGHET: ättiksyra är mycket farligt vid hud-eller ögonkontakt; hantera med försiktighet och kassera enligt föreskrifterna.
    4. Väg glas bilden efter skrapning av kristaller.
    5. Mät den UV/VIS-absorbans (a) spektrum av lösningen. Om tillsatsen är ett protein, Mät absorbansen vid 280 nm och beräkna dess koncentration (C)med hjälp av ekvationen för Beer-Lambert:
      Equation 1
      där l är den optiska banan inne i kuvette.
    6. Använd koncentrationen (C) som finns i 2.3.5 och den använda volymen (V = 1,2 ml) för att beräkna massan (m) av tillsatserna i/på kristallerna. Om koncentrationen är i mg/ml, Använd ekvationen CV = m.
      1. Om koncentrationen är i mol/L, sedan beräkna mullvadar (n) tillämpa CV = n. Använd sedan molekylvikt (MW) för att beräkna massan (m) av tillsatserna (m = nMW).
    7. Beräkna viktprocenten av tillsatserna i/på kristallerna med ekvationen: Equation 2 , där m är massan av tillsatser, och δms är massan av kalciumkarbonat kristaller som skrotades av glaset Bit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En schematisk av den experimentella uppsättningen visas i figur 1. Kortfattat används diffusions metoden för att bilda kalciumkarbonatkristaller i 96-well-plattor och testa effekten av biopolymerer på morfologin och strukturen av kalciumkarbonatkristaller. I dessa experiment bryts ammoniumkarbonat till ammoniak och CO2, som sprids till kalciumkarbonatlösningar, vilket resulterar i bildandet av kalciumkarbonatkristaller (figur 1 och figur 2).

Verkställa av Biopolymererna utvärderas av jämförelsen av kalciumkarbonatkristaller som bildas med och without (kontrollera) tillsatserna. Före tillsats av tillsatser väljs den optimerade kalciumkarbonatkoncentrationen och renheten hos lösningarna och glasföremål testas. Figur 2 A visar en representativ bild av ett kontroll experiment, där distinkta rhombohedral kalciumkarbonatkristaller bildas. Dessa kristaller är troligen kalcit (se figur 5). Om lösningarna eller plast-eller glasföremål inte har rengjorts på rätt sätt kommer sfäriska kristaller att bildas (figur 2B, märkt med röda cirklar), förutom de rhombohedral kalcit kristaller. De sfäriska kristallerna är troligen vaterite (se figur 5). En ytterligare indikation för användning av lämpliga förhållanden, är jämnhet i kalcit ansikten i kontroll experimentet. Detta kan observeras med SEM, som visas i figur 3. Figur 3 A visar en ordentlig kontroll med släta kalcit ansikten, medan figur 3B visar kalcit kristaller med ansikten består av steg. De sfäriska kristallerna här är vaterite. Kontroll kristallerna måste separeras och slätfasetterade så att effekten av tillsatser på kristallmorfologin är klar.

För att demonstrera effekten av en Biopolymer på morfologin av kalciumkarbonat, har vi använt här proteinet TapA. Figur 4 visar de kristaller av kalciumkarbonat som bildas i närvaro av TapA i lösningen. Kristallerna skiljer sig från kontroll kristaller. De bildar en komplex sfärisk kalciumkarbonat församling, sammansatt av flera kalcit mikrokristaller (se Raman Spectrum i figur 5). En metod för att karakterisera kristallens struktur är Raman-spektroskopi. Figur 5 visar den typiska spektrat av kalcit(figur 5A) och vaterite (figur 5B), tagen från lyckade (a) och misslyckade (B) kontroll experiment. Typiska absorbans toppar20 är i intervallet 100 − 400 cm-1 (gitter lägen), en topp på ~ 710 cm-1 (symmetrisk böjning av co32-) och vid ~ 1090 cm-1 (symmetrisk sträckning av co3 2-). Notera uppdelningen av Raman Shift på ~ 1080 cm-1 som är den mest uppenbara kännetecknande för vaterite21. Hänvisa till referens22 för ett fullt spektrum av aragonit. Det Raman spektrum av kristaller som bildas i närvaro av TapA liknar spektrumet av kalcit (figur 5a). I de fall då ytterligare toppar uppträder som inte motsvarar ett enda spektrum av en enstaka kalciumkarbonatpolymorph, eller en kombination av dessa, kan de hänföras till ett överskott av kalciumklorid som inte har tvättats grundligt i steg 1.1.2.8.

I den sista delen av protokollet har vi mätt procentandelen (vikt/vikt) av det organiska innehållet inuti eller på kalciumkarbonatkristaller. Kristallerna upplöstes i ättiksyra och Biopolymer släpptes in i lösningen. I de fall där Biopolymeren har ett karakteristiskt absorbansspektrum kan koncentrationen i lösningen bestämmas. När det gäller proteiner som innehåller aromatiska sido grupper, som i fallstudien här i TapA, används absorbansen vid 280 nm. Den absorbans spektrum av TapA, mätt efter upplösning av kristaller i syra, visas i figur 6 (grön) tillsammans med spektrat av kontrollen (syra-upplöst kalciumkarbonat kristaller utan tillsats; svart). Med hjälp av Beer-Lamberts lag (se steg 2.3.5) och med hjälp av en utrotningskoefficient på 29 700 M-1 cm-1, har vi funnit att Massprocenten av TapA var 1,8% ± 0,2%. Mätning av lösningens absorbans efter kristallupplösningen i syra är möjlig när Biopolymererna inte aggregeras vid lågt pH. En nollsignal för lösningens absorbans som innehåller tillsatsen är ett tecken på dess aggregering. I detta fall kan olika analysmetoder, såsom termisk gravitations analys (TGA) användas för att uppskatta massan av tillsatser som finns inuti/på kristallerna.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk beskrivning av den snabba ång diffusions metoden för bildandet av kalciumkarbonatkristaller. Ett kalciuminnehållande lösligt salt (t. ex. kalciumklorid) placeras nära ett ammoniumkarbonatpulver. Här visar vi två brunnar i en 96-borrskiva. Plattan är sedan förseglas, och ammoniumkarbonat bryts ned till ammoniak och koldioxid som diffunderar in i kalcium-innehållande väl, vilket resulterar i utfällning av kalciumkarbonat kristaller (visas här av SEM bilden av en kalcit kristall). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Optiskt mikroskop avbildar av kalciumkarbonatkristaller. En ren kontroll innehåller mestadels kalcit, som kännetecknas av rhombohedral kristaller (a). När kontrollprovet innehåller sfäriska kristaller (t. ex. de som är markerade med en röd cirkel) (B) upprepar du det rengörings protokoll som föreslås i avsnitt 1.1.1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Scanning elektron mikrografer av kalciumkarbonatkristaller bildas i två kontroll experiment. A) en bild av ett prov som innehåller mestadels rhombohedral kristaller (kalcit). (B) en Mikrograf av ett prov med brutna kalcit fasetter och sfäriska kristaller som är mest sannolikt vaterite. I detta fall måste kontroll experiment upprepas. Denna siffra har modifierats från Azulay et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : SEM-bilder av kalcit-kristaller bildas i närvaro av proteinet TapA. Skalstreck representerar 50 μm (A) respektive 10 μm (B). Denna siffra har modifierats från Azulay et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Raman spectra av två polymorphs av kalciumkarbonat. (A) kalcit. Bvaterite. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : UV/VIS absorbansspektra av TapA (grön) och en buffertlösning (100 mm NaCl, 25 mm Tris pH 8,0; svart). Absorbansen användes för att beräkna koncentrationen av TapA i kalciumkarbonatkristaller, efter deras upplösning i syra. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som beskrivs här syftar till att bilda kalciumkarbonat kristaller i närvaro av organiska tillsatser och utvärdera effekten av organiska biopolymerer på Morfologi och struktur av kalciumkarbonat kristaller in vitro-. Metoden baseras på jämförelsen av kristallerna som bildas i närvaron av de organiska tillsatserna till de kalcit kristaller som bildas i kontroll experimentet. Vi har visat hur man använder diffusions metoden för att bilda kalciumkarbonatkristaller, hur man karakteriserar deras morfologi med hjälp av optisk och elektronmikroskopi, hur man karakteriserar deras struktur med hjälp av Raman-spektroskopi, och hur man bestämmer det organiska innehållet (vikt/vikt i procent) av kristallerna.

Vi beskrev det protokoll som vi har använt för att utvärdera effekten av ett bakteriellt extracellulärt protein, TapA, på morfologin och strukturen av kalciumkarbonat, men protokollet kan vara förbrukat till någon annan polymer som är biologiskt renas eller syntetiseras. Förutom effekten av en enda Biopolymer kan denna metod användas med blandningar av biopolymerer för att utvärdera varje ömsesidighet mellan olika polymerer i deras effekt på kalciumkarbonatnederbörd. Vi har begränsat den experimentella uppsättningen till en 96-bra tallrik; varje annan uppsättning där kalciumkarbonatlösningar är placerade och fysiskt åtskilda från ammoniumkarbonatkällan (dvs. lösningarna och pulvret placeras i ett förseglat kärl) är dock möjligt. Typiska fartyg som används är multi-well tallrikar och ett typiskt koncentrationsområde på 10-50 mm används för en experimentell set-up med 96-bra tallrikar10,16,23. En förseglad bägare eller exsickator kan också användas.

Denna metod är enkel att använda och är kompatibel med låga koncentrationer och låga volymer av de Biopolymer tillsatser. Arbeta i en multi-well plattan tillåter screening av flera parametrar samtidigt i en multi-well plattan experiment. Denna metod kan vara känslig för kalciumkarbonatbrunnarnas relativa position med avseende på placeringen av ammoniumkarbonatpulvret. Därför måste försiktighet iakttas för att alltid använda brunnar på samma plats i multi-well plattan och även för att kontrollera att ändra placeringen av brunnarna inte påverkar resultaten. Normalt, med ett tillräckligt stort avstånd mellan de brunnar där experimenten äger rum och ammoniumkarbonatpulvret, säkerställer att resultaten är reproducerbara. Dessutom är det viktigt att justera koncentrationen av CaCl2 lösning så att separata kristaller bildas i kontroll experimentet, som beskrivs i avsnitt 1.1.2. Koncentrationen av tillsatser bör också optimeras för att överskrida en minimal koncentration under vilken ingen effekt observeras. Observera att metoden är mycket känslig för koncentrationen av tillsatser; olika additiva koncentrationer kan framkalla en annan effekt på morfologin och strukturen hos kalciumkarbonatkristaller24.

En stor begränsning av denna metod är att ammoniak och CO2 både diffus i kalciumklorid testlösningar och därför finns det dålig kontroll av pH i hela experimentet. Som ett resultat av spridningen av ammoniak, pH i lösningen ökar (när ammoniak blir ammonium), som visas i jämvikt ekvationer5,6 ((NH4)2Co3 (s) → 2NH3 (g) + Co2 (g) + H 2 O(l), NH3 (AQ) + H2O(l) → NH4+(AQ) + Oh-(AQ), ca2 +(AQ) + Co2 (AQ) + 2OH-(AQ) Image 1 Caco3 (s) + H2O (l)) och det gynnar bildandet av kalciumkarbonat. 

Jämfört med de ytterligare metoder som beskrivs i inledningen, är denna metod tekniskt enkel. På grund av den långsamma nederbördsprocessen kan kristalltillväxten följas i realtid, med hjälp av absorbans eller spridnings tekniker från transparent multi-well teknik. Dessutom, för att följa kinetiken i den kristall tillväxt, kan man också sond kristallen morfologi och struktur vid olika tidpunkter, snarare än efter 20 timmar, som utförs i vår studie. Denna metod kan utökas för att studera utfällning av andra salter av karbonat med en tillräckligt liten KSP, såsom magnesium, barium och kadmium karbonater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna skulle vilja tacka prof. Lia Addadi, Prof. Jonathan Erez, och Dr. Yael Politi för fruktbara diskussioner. Denna forskning har fått stöd av israeliska Science Foundation (ISF), Grant 1150/14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Gadot 64-19-7
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 506-87-6
Calcium chloride dihydrate Merck KGaA 10035-04-8
Ethanol Absolute Gadot 64-17-5
Micro-Raman Renishaw inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope Nikon Eclipse 90i model
Nis elements Br software Nikon For microscope imaging
Scanning Electron Microscope ThermoFisher Scientific FEI Sirion microscope
Spectrophotometer JASCO V-670 model
Sputter coater Polaron SC7640 model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, (4212), 377-379 (1975).
  2. Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306, (5699), 1161-1164 (2004).
  3. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183, (2), 258-269 (2013).
  4. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
  5. Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
  6. Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6, (8), 1915-1920 (2006).
  7. Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11, (3), 301-308 (2013).
  8. Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199, (2), 247-254 (1998).
  9. Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67, (12), 4873-4874 (1962).
  10. Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9, (12), 1171-1177 (2007).
  11. Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5, (4), 1317-1319 (2005).
  12. Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203, (4), 627-635 (2002).
  13. Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
  14. Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54, (1), 151-187 (2003).
  15. Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
  16. Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18, (9), 5582-5591 (2018).
  17. Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. (2018).
  18. Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118, (3), 753-757 (1997).
  19. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. Springer. 571-607 (2005).
  20. Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37, (9), 892-899 (2006).
  21. Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
  22. Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293, (5), 478-491 (2002).
  23. Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
  24. Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20, (30), 4221-4224 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics