장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼

Bioengineering
 

Summary

PDMS 기반의 제조 과정, 다층, 체외 전사 및 번역(IVTT) 반응이 장기간 수행될 수 있도록 하는 미세유체 장치. 또한 장기간 이러한 반응을 자동화하고 유지하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어에 대한 포괄적인 개요가 제공됩니다.

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van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).

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Abstract

세포 기지를 둔 합성 생물학의 한계는 연구원이 더 크고 더 복잡한 합성 유전 통제 회로를 개발하는 것을 목표로 함에 따라 점점 더 명백해지고 있습니다. 생체 내에서 합성 유전 조절 네트워크의 분석은 시간이 많이 걸리고 환경 제어의 부족으로 고통받고 있으며, 외인성 합성 성분이 호스트 프로세스와 상호 작용하여 원치 않는 행동을 초래합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 새로운 회로의 무세포 특성화가 더욱 널리 퍼지고 있습니다. 시험관 내 전사 및 번역(IVTT) 혼합물은 실험 환경의 조절을 허용하고 각각의 고유 시스템에 최적화될 수 있다. 여기에 제시된 프로토콜은 장기간 IVTT 반응을 유지하는 데 사용할 수 있는 다층 미세 유체 장치의 제조를 자세히 설명합니다. 시간이 지남에 따라 자원이 고갈되고 (바이-) 제품이 축적되는 배치 반응과는 달리, 미세 유체 장치를 사용하면 자원의 보충뿐만 아니라 반응 제품의 제거가 가능합니다. 이러한 방식으로, 세포 환경은 유전자 회로의 동적 거동이 장기간에 걸쳐 조사될 수 있는 평형 이외 환경을 유지함으로써 에뮬레이트된다. 다층 미세 유체 장치를 완전히 활용하기 위해 하드웨어와 소프트웨어가 통합되어 IVTT 반응을 자동화합니다. IVTT 반응을 여기에 제시된 미세 유체 플랫폼과 결합함으로써 복잡한 네트워크 동작을 포괄적으로 분석하여 세포 프로세스를 조절하는 메커니즘에 대한 이해를 촉진할 수 있습니다.

Introduction

셀은 복잡한 동적 규제 네트워크1,2를사용하여 환경을 감지하고 대응할 수 있습니다. 합성 생물학 분야는 세포3,4의기능을 확장 할 수있는 생물학적 시스템을 설계하기 위해 이러한 네트워크를 포함하는 자연 발생 구성 요소에 대한 우리의 지식을 활용합니다. 반대로, 기존 회로의 단순화된 합성 유사체를 설계하거나 자연적으로 발생하는 행동을 나타내는 전방 공학 생물 시스템을 설계하여 생명을 지배하는 자연 네트워크에 대한 이해를 증진할 수도 있습니다. 이러한 생물학적 시스템의 de novo 엔지니어링은 새로운 유전 회로 또는 신호 경로가 잘 정의 된5,6부분을 사용하여 합리적인 방식으로 설계되는 상향식 방식으로 수행됩니다. 네트워크의 합리적인 설계와 생물학적 관련 시스템의 설계를 결합하면 다양한 수준의 추상화 7과 함께 생물학적 규제 시스템의 심층적 특성화 및 연구를 할 수있습니다.

Elowitz와 Leibler8 및 Gardner et al.9의 선구적인 작품은 세포 호스트에 합성 유전 네트워크의 성공적인 도입을 입증하는 첫번째이었습니다. 다음 10 년 에서, 수많은 연구원은세포7,10,11에 합성 회로의 도입에 관한 몇 가지 제한의 출현에도 불구하고 이러한 초기 성공에 구축을 계속하고있다 ,12. 이상적으로, 셀룰러 호스트에 합성 회로의 도입은 모듈 식으로 발생해야합니다. 불행하게도, 셀룰러 환경의 복잡성은 많은 부분과 네트워크의 기능이 매우 문맥의존되는 12,13,14,특히 도전하게한다 . 결과적으로 네트워크는 종종 합성 회로의 기능에 영향을 줄 수 있는 네이티브 호스트 구성 요소와 원치 않는 상호 작용을 경험합니다. 유사하게, 외인성 네트워크의 구성 요소는 숙주 과정을 억제하고, 호스트 내의 공유 자원을 위해 경쟁하고, 성장역학15,16,17에영향을 미칠 수 있다. 따라서 생체 내 환경에서 합성 네트워크의 동작을 합리적으로 설계하고 예측하기 위해서는 모든 호스트 및 회로 별 역학의 포괄적인 모델이필요합니다 18.

합성 네트워크의 특성화를 위한 셀룰러 호스트의 사용에 대한 실행 가능한 대안은 시험관 내 전사 및 번역(IVTT) 기술의 적용이다. 합성 망에 대한 테스트베드로서 작용하여, 반응은 유전자 발현을 가능하게 하는 데 필요한 모든 성분을 포함하는 용액에서수행된다(19,20,21). 이러한 방식으로, 생물학적으로 관련, 이기는하지만 인공, 환경은 합성 네트워크를 테스트 할 수있는 내에서 생성된다22,23,24,25, 26, 27,28. IVTT 솔루션을 사용하는 주요 장점은 사용자가 지정한 조건하에서 반응을 수행할 수 있는 능력이며, 연구자들은 각 반응의 정확한 조성을 조정할 수 있습니다2. 또한 셀 프리 접근 방식은 시간이 많이 소요되는 셀룰러 복제 단계를 수행할 필요가 없으므로 합성 네트워크의 높은 처리량 테스트를 가능하게 합니다. 그 결과, 연속적인 설계 -build-test 사이클의 지속 기간은29,30,31,32로현저히 감소된다. Gibson 어셈블리와 같은 무세포 복제 기술을 활용하여 새로운 네트워크를 신속하게 엔지니어링하고 생체 내 테스트에 필요한 플라스미드와 달리 선형 DNA 템플릿에서 네트워크를 구축함으로써 설계 주기를 더욱 가속화할 수 있습니다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)33,34를통해 증폭 될 수있다.

배치 반응은 IVTT 반응이 수행 될 수있는 가장 간단한 방법이며, 모든 반응 성분이 결합되는 것을 특징으로하는 단일 반응 용기가필요합니다 35. 이러한 반응은 단백질 발현 및 기본 회로 테스트에 충분하지만 네트워크의 장기적인 동적 거동을 연구하려고 할 때 불충분하다는 것을 증명합니다. 배치 반응의 과정을 통해, 시약은 고갈되거나 전사 및 번역 속도의 지속적인 감소의 결과로 저하를 겪습니다. 또한 반응이 진행됨에 따라 네트워크의 올바른 기능을 방해하거나 완전히 억제할 수 있는 부산물이 축적됩니다. 궁극적으로, 배치 반응기의 사용은 관찰 할 수있는 동적 동작을 제한, 부정적인 규제는5,36을구현하는 특히 도전되고.

IVTT 시스템의 다양성은 연속 흐름에서 액적 기반 방법뿐만 아니라 간단한 투석 접근법 2,30에이르기까지 장기간 IVTT 반응을 수행 할 수있는 여러 가지 대체 방법을 가능하게합니다. 37,38,39,40. 미세 유체 장치의 응용 프로그램은 처리량을 증가시키고 비용을 최소화하는 동안 사용자가 자신의 반응에 대한 제어를 증가 제공35,41,42,각 특정 접근 방식은 자신의 장점. 연속 흐름의 사용은 발현 수율을 증가시키기 위해 용이하게 최적화될 수 있지만, 특정 반응 생성물을 효과적으로 제거할 수 없다는 것은 동적 거동에 대한 연구를 사소한39로만든다. 액적 기반 미세유체 시스템을 채용하는 동안 신규 네트워크의 고처리량 스크리닝이 가능하지만, 반응에 신선한 시약을 공급하는 어려움은 소량의 배치반응(43)과유사한 액적의 결과를 초래한다. 투석 기지를 둔 반응기는 신선한 시약의 소개를 허용할 뿐만 아니라 몇몇 반응 제품의 제거, RNA 분자 및 더 큰 단백질은 막 기공을 통해서 확산하기에 는 너무 크고, 반응기 내축적입니다. 또한, 시약의 많은 볼륨은 장기간 이러한 반응을 유지하기 위해 필요합니다30,44. 2013년, Maerkl 등은 장기간 IVTT 반응을 수행하기 위해 특별히 설계된 다층 미세 유체 장치를36,45로제시하였다. 다층 미세 유체 장치의 사용은 유체 흐름을 직접 제어 할 수 있게하여 장치46,47의특정 영역에서 유체의 리디렉션및 유체 의 절연을 허용합니다. 이러한 단리된 영역은 IVTT 반응이 수행될 수 있는 독립적인 나노리터 규모의 반응 챔버로서 기능할 수 있다. 단일 IVTT 반응 의 과정을 통해, 반응기에 신선한 시약의 주기적인 주사는 IVTT 분대 및 DNA 템플릿을 보충하기 위하여 이용됩니다. 동시에, 이전 반응 용액의 동일한 부피가 변위되어 반응 제품을 제거합니다. 이러한 방식으로, 기초 전사 및 번역 속도가 일정한 상태로 유지되는 평형 환경이 유지되어 IVTT 반응의 수명을 연장하고 풍부한 동적 동작이 발생할 수 있습니다. 이 접근을 적용함으로써, 연구원은 새로운 유전 네트워크의 전진 공학에 있는 원조, 특정 회로 내의 일어나는 개별적인 프로세스의 운동 비율을 조사할 수 있습니다. 예를 들어, Niederholtmeyer 외. 유전 링 발진기의 다양한 요소를 특성화하기 위해 이 접근법을 구현하고, 이의 운동 속도를결정한다 36. 추가 연구에서 Yelleswarapu 외. 배치 조건하에서 결정된 시그마 인자 28(σ28)의운동 속도가 σ28기반 발진기의 거동을 설명하기에 충분하지 않았으며, 유동 기반 데이터의 첨가가 불충분하다는 것을 보여주었다. 네트워크 동작의 향상된 모델 예측22.

이 원고의 목적은 장기 IVTT 반응을 수행 할 수있는 다층 미세 유체 장치의 제조를위한 완전한 프로토콜을 제시하는 것입니다. 또한 이 원고는 장기간 IVTT 반응을 수행하는 데 필요한 모든 하드웨어 및 소프트웨어를 설명합니다. 그 안에 유체의 흐름을 제어하는 데 필요한 미세 유체 장치의 작동은 튜브 길이를 통해 미세 유체 장치에 직접 연결되는 일련의 공압 밸브를 사용하여 달성됩니다. 또한 공압 밸브는 맞춤형 가상 제어 인터페이스를 통해 제어됩니다. 미세 유체 장치 내의 유체 흐름은 시판되는 압력 조절 시스템에서 제공하는 연속 압력을 사용하여 달성됩니다. IVTT 반응은 전형적으로 29°C와 37°C 사이에서 수행되며 현미경 인큐베이터는 반응 동안 온도를 조절하는데 사용된다. 그러나 IVTT 혼합물의 기능은 4°C 이상으로 저장될 때 점차 저하된다. 따라서, 이 원고는 미세 유체 장치에 주입하기 전에 IVTT 혼합물을 냉각하는 데 사용되는 오프 칩 냉각 시스템에서 확장됩니다. 결론적으로,이 원고는 다른 연구자들이 상대적으로이 기술을 복제 할 수 있도록 미세 유체 흐름 반응기를 사용하여 장기간 IVTT 반응을 성공적으로 수행하는 데 필요한 절차에 대한 포괄적 인 개요를 제공합니다. 용이성.

Protocol

1. 웨이퍼 준비

참고: 당사의 프로토콜은 이 연구에서 사용되는 40 XT 포지티브 포토레지스트 및 SU8 3050 네거티브 포토레지스트에 특화되어 있습니다. 대체 포토레지스트를 사용할 수 있지만 특정 스핀 속도, 베이킹 온도 및 베이킹 시간은 다양합니다. Niederholtmeyer 외36에서 제공하는 미세 유체 장치 디자인은 재료 표에연결되어 있습니다.

  1. 250 °C로 설정된 예열된 오븐에 깨끗한 실리콘 웨이퍼 2개(직경 100mm, lt;1-0-0> 525 μm 두께)를 놓고 웨이퍼를 밤새 탈수(~16시간)로 둡니다.
    참고 : HMDS 증착을 사용하여 웨이퍼를 프라이밍 할 수도 있습니다. 그러나 웨이퍼가 충분히 탈수된 경우에는 필요하지 않습니다.
  2. 오븐에서 실리콘 웨이퍼 1개를 제거하고 스핀 코팅을 진행하기 전에 실온으로 식힙니다. 웨이퍼 중앙에 40XT 포토레지스트의 3-4mL를 적용합니다.
  3. 25 μm의 특징 높이를 얻으려면 다음과 같은 스핀 프로토콜을 적용하십시오 : 500 rpm (110 rpm / s)에서 20 s회전을 높이고 스핀 속도를 3100 rpm (300 rpm / s)로 늘리고 30 초에 유지한 다음 웨이퍼를 200 rpm /s의 감속으로 0 rpm으로 감속하십시오. 마이크로 화이버 조직은 조심스럽게 스핀 코팅 중에 발생할 수있는 가장자리 구이제거.
  4. 다음과 같은 방식으로 70°C 및 120°C로 설정된 두 개의 분리된 핫 플레이트를 사용하여 소프트 베이킹: 웨이퍼가 30s에 대해 70°C에 앉을 수 있도록 한다. 그런 다음 웨이퍼를 120 °C 핫플레이트로 옮기고 웨이퍼를 70°C 핫플레이트로 되돌려 놓기 전에 3.5분 동안 이곳에 놓이게 합니다.
  5. 유동층 포토마스크(에멀젼 측면)를 포토레지스트 필름 에놓고 총 200 mJ/cm2의 노출이 이루어질 때까지 UV 램프를 사용하여 웨이퍼를 노출시다.
  6. 다음과 같은 방식으로 두 개의 핫 플레이트(70°C 및 105°C)를 사용하여 노광 후 베이킹: 웨이퍼를 105°C 핫플레이트로 옮기고 40s동안 여기 두기 전에 웨이퍼가 20초 동안 70°C에 앉도록 한다. 마지막으로 웨이퍼를 70°C 핫플레이트로 되돌려 20s를 더 하여 후노출 베이킹을 완료한다.
  7. 웨이퍼가 극세사 조직 스택의 실온으로 냉각되도록 합니다. 웨이퍼를 726 MIF 포토레지스트 개발자로 채워진 페트리 접시로 이송하여 웨이퍼를 개발하여 개발 과정을 시작한다. 벤치탑 셰이커에서 수행하면 개발이 가속화되고 전체 웨이퍼가 개발자에 잠기게 됩니다.
  8. 탈염수로 웨이퍼를 헹구고 스테레오 현미경을 사용하여 웨이퍼 표면에 포토레지스트 잔류물이 있는지 확인합니다. 포토레지스트 잔류물이 보일 수 있는 경우 웨이퍼를 개발자에게 반환합니다.
  9. 웨이퍼를 110°C로 설정된 핫 플레이트 상에 25분 동안 배치하여 포지티브 포토레지스트를 리플로우한다. 이 프로세스는 반올림 된 기능뿐만 아니라 제조 과정에서 나타났을 수있는 균열을 어닐링합니다. 1.17단계에서 기재된 바와 같이 웨이퍼를 실라니화하는 것을 진행한다.
  10. 오븐에서 두 번째 실리콘 웨이퍼를 제거하여 스핀 코팅을 진행하기 전에 실온으로 냉각시됩니다. 웨이퍼 중앙에 SU8 3050 포토레지스트 5mL를 적용합니다.
  11. 30 μm의 특징 높이를 얻으려면 다음과 같은 스핀 프로토콜을 적용하십시오 : 500 rpm (110 rpm / s)에서 20 s회전을 높이고 스핀 속도를 4,000 rpm (330 rpm / s)로 늘리고 42 s동안 여기에 유지하고 웨이퍼를 200 rpm /s의 감속으로 0 rpm으로 감속하십시오. 마이크로 화이버 조직은 조심스럽게 스핀 코팅 중에 발생할 수있는 가장자리 구이제거.
  12. 다음과 같은 방식으로 두 개의 분리된 핫 플레이트(65°C 및 95°C)를 사용하여 소프트 베이킹: 웨이퍼가 30초에 65°C에 앉을 수 있도록 한다. 그런 다음 웨이퍼를 95°C 핫플레이트로 옮기고 14분 동안 이곳에 쉬게 한 다음 웨이퍼를 65°C 핫플레이트로 되돌려 나머지 30초 동안 핫플레이트에서 웨이퍼를 제거하고 실온으로 냉각시도록 합니다.
  13. 노출 전에 UV 램프의 강도를 측정하고 이를 사용하여 260 mJ/cm2의총 노출 량을 달성하는 데 필요한 노출 기간을 결정합니다. 포토마스크(에멀젼 측면)를 포토레지스트 필름에 놓고 웨이퍼를 UV 광원 아래에 놓습니다. 총 260 mJ/cm2의 노출이 달성될 때까지 UV 램프를 사용하여 웨이퍼를 노출합니다.
  14. 다음과 같은 방식으로 두 개의 핫 플레이트(65°C 및 95°C)를 사용하여 노광 후 베이킹: 웨이퍼를 95°C 핫플레이트로 옮기고 4.5분 동안 이곳으로 떠나기 전에 웨이퍼가 65°C에서 65°C에 앉도록 허용합니다. 을 사용하여 노출 후 베이킹을 완료합니다.
  15. 웨이퍼가 극세사 조직 스택의 실온으로 냉각되도록 합니다. 개발 프로세스를 시작하기 위해 mrDev-600 포토 개발자로 채워진 페트리 접시로 전송하여 웨이퍼를 개발하십시오. 벤치탑 셰이커에서 수행하면 개발이 가속화되고 전체 웨이퍼가 개발자에 잠기게 됩니다.
  16. 이소프로판올로 웨이퍼를 헹구고 스테레오 현미경을 사용하여 웨이퍼 표면에 포토레지스트 잔류물이 있는지 확인합니다. 포토레지스트 잔류물이 보일 수 있는 경우 웨이퍼를 개발자에게 반환합니다. 일단 완전히 개발되면, 1시간 동안 150°C로 설정된 핫 플레이트에 웨이퍼를 놓음으로써 포토레지스트를 단단하게 구워줍니다.
  17. 연리소그래피 공정 동안 PDMS의 부착을 방지하기 위해 두 웨이퍼를 실라제화합니다. 실란화를 수행하기 위해, 실란의 파이펫 2-3 방울(웨이퍼당)을 작은 유리 바이알내로 한다. 이 바이알을 웨이퍼와 함께 건조기에 넣고 5-10 분 동안 진공을 당깁니다.
    주의: 일란은 독성이 있으며 흡입해서는 안 됩니다. 실란을 다룰 때는 연기 후드에서 작업하고 니트릴 장갑을 착용할 때 주의하십시오. 여기에는 건조기에서 진공을 당길 때 진공 펌프를 연기 후드에 넣는 것이 포함됩니다.
  18. 건조기에서 진공을 방출하고 실란화 웨이퍼를 제거합니다. 물로 헹구고N2의 증기를 사용하여 웨이퍼를 건조시십시오. 이 시점에서 웨이퍼는 필요할 때까지 저장에 배치할 수 있습니다.

2. 미세 유체 장치 제조

참고 : PDMS 기반 의 다층 미세 유체 장치를 제조하는 데 사용되는 연질 석판 화 과정은 세 가지 단계로 분리 될 수있다 : 1) 흐름 및 제어 층 모두의 PDMS 준비, 2) 두 PDMS 층의 정렬 및 접합, 3) 장치의 완료.

  1. PDMS 준비
    1. 플라스틱 비커에 베이스와 경화제를 결합하고 혼합 봉을 사용하여 완전히 혼합될 때까지 두 성분을 저어두 개의 PDMS 전구체 용액을 준비합니다. 대조군층에는 20 g의 염기제와 1 g의 경화제(20:1 비율)가 필요합니다. 유동층은 염기제 40 g및 경화제 8 g(5:1 비율)을 필요로 한다. 건조기에서 솔루션을 탈기.
    2. 유동층 웨이퍼를 페트리 접시에 넣고 5:1 비율의 PDMS 혼합물을 웨이퍼 위에 붓습니다. 기포를 제거하기 위해 30 분 동안 PDMS를 탈기하십시오.
    3. 20:1 비율 PDMS로 제어 층 웨이퍼(음극 SU8 3050photoresist를 사용하여 제조)를 스핀 코팅합니다. PDMS의 5-10 mL을 웨이퍼의 중앙에 붓고 다음 스핀 프로토콜을 실행 (나중에 사용하기 위해 PDMS 위에 왼쪽을 유지): 15 s (100rpm / s)에 대한 500 rpm에서 스핀, 45 s에 대한 1450 rpm (300 rpm / s)로 스핀 속도를 증가 , 웨이퍼를 0 rpm (200 rpm / s)로 감속합니다.
    4. 균일한 PDMS 필름 두께를 보장하려면 PDMS 코팅 웨이퍼를 밀폐된 페트리 접시에 평평한 표면에 놓습니다(먼지 오염을 방지하기 위해). 웨이퍼를 30분 동안 앉게 합니다.
    5. 건조기에서 유동층을 제거하고 유동층과 대조군층을 오븐(80°C)에 놓습니다. 두 층을 28-30 분 동안 치료하고 PDMS가 조작 할 수있을만큼 가단 할 때 제거하고 약간 끈적 거리게합니다. 즉시 정렬 프로세스를 진행합니다.
  2. 정렬 및 접합
    1. 메스를 사용하여, 유동층 웨이퍼 상에서 PDMS로부터 4개의 디바이스각각을 제거한다. 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 층을 제거하면 즉시 스카치 테이프로 기능 면을 덮어 먼지 입자 오염을 방지하십시오.
    2. 제어 레이어의 흐름 레이어 블록을 눈으로 대략 정렬하여 장치의 피처 면을 제어 레이어 PDMS와 접촉합니다. 이어서, 각 유동층 블록의 위치를 미세하게 조정하여 유동층의 채널을 제어층 채널과 정렬하고, 스테레오 현미경을 사용하여 조정의 시각화를 돕는다.
    3. 압력을 가하여 두 PDMS 레이어 사이의 에어 포켓을 제거합니다. 정렬된 유동 층 블록 주위에 이전에 저장된 나머지 20:1 비율 PDMS를 붓습니다. 접합 공정 중에 충분한 접촉을 보장하기 위해 각 장치에 100g의 분동을 놓습니다.
    4. 정렬된 장치(가중치 포함)를 80°C 오븐에 반납하고 1.5시간 이상 6시간 이상 접합하도록 둡니다.
  3. 장치 완성
    1. 오븐에서 웨이퍼를 제거하고 제어 층 웨이퍼에서 각 개별 장치를 추출하여 각 장치의 특징 면을 스카치 테이프로 덮습니다.
    2. 반복적으로, 각 디바이스의 9개의 유동층 입구, 24개의 제어층 채널 입구 및 단일 유동층 출구에 대해 단일 구멍을 펀치한다. 카메라를 사용하여 피처 면이 위를 향하도록 장치를 펀치하여 피처 경계 내에서 구멍이 뚫리도록 합니다.
    3. 각 장치에 대해 이소프로판올과 아세톤으로 단일 현미경 슬라이드를 청소하고 N2스트림 에서 슬라이드를 건조시면 됩니다. 이어서, 현미경 슬라이드를 150°C로 설정된 핫 플레이트위에 15분 동안 놓는다.
    4. 산소 플라즈마 재를 사용하여 PDMS 장치를 유리 슬라이드에 접합하고 45s에 대해 50W의 회분 전력을 적용하십시오. 완료되면 장치 피처측면을 유리 슬라이드에 내려놓고 압력을 가하여 표면 사이에 갇힌 가스를 제거합니다.
    5. 접합 된 장치를 110 °C로 설정된 핫 플레이트에 놓고 1 시간 동안 가중치를 장치의 접착력을 향상시키기 위해 장치 위에 배치 할 수 있습니다.

3. 하드웨어 설정

참고: 미세 유체 칩을 제어하려면 수많은 하드웨어를 설치하고 서로 연결해야 합니다. 하드웨어의 세 가지 별개의 그룹이 필요합니다 : 1) 제어 채널에 대한 공압 제어 시스템, 2) 장치 내의 반응 시약의 흐름을 제어하는 공압 압력 레귤레이터, 3) 이전에 IVTT 반응 용액을 냉각하는 냉각 시스템 미세 유체 장치에 주입. 하드웨어 설정에 대한 개요는 그림 1에제공됩니다. 여기에 제공된 프로토콜은 가능한 한 일반적이지만 연구 전반에 걸쳐 사용되는 특정 장비가 참조된다는 점에 유의해야 합니다. 모든 하드웨어는 동일한 기능을 수행할 수 있는 대안으로 대체될 수 있습니다. 이러한 경우 여기에 있는 프로토콜을 사용하여 시스템을 설정하는 데 필요한 일반적인 단계와 각 구성 요소의 요구 사항을 간략하게 설명할 수 있습니다. 대체 하드웨어 설정은 브라우어외 48 및 화이트 및 스트리트49에의해 제공됩니다.

  1. 공압 제어 시스템(그림 2참조)
    1. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 필드버스 컨트롤러와 사용자 워크스테이션 간에 TCP 연결을 설정합니다. 제어 소프트웨어(보조 파일로 제공)를 사용하여 컨트롤러에 대한 TCP 연결을 통해 전송되는 MODBUS 명령을 작성하고 솔레노이드 밸브를 작동시려면
    2. 8개의 4채널 디지털 출력 모듈로 필드버스 컨트롤러를 확장할 수 있으며, 각 솔레노이드 밸브에 대해 하나씩 사용할 수 있습니다. 각 솔레노이드 밸브는 연결 핀을 주재합니다. 네거티브 와이어를 디지털 출력 모듈의 접지 포트 중 하나에 연결하는 동안 디지털 출력 모듈 중 하나에 있는 4개의 양수 출력 중 하나에 양수 와이어를 연결합니다.
      참고 : 시스템이 올바르게 작동하려면 솔레로이드가 첫 번째 출력 포트에 연결되고 두 번째 솔레로이드가 두 번째 출력 포트에 연결되는 등 체계적으로 연결되어야합니다. 당사 시스템에서는 각각 8개와 22개의 솔레노이드 밸브와 함께 두 개의 밸브 어레이가 사용됩니다. 출력 포트 1-8은 8밸브 어레이에 연결되고 출력 포트 9-30은 22밸브 어레이에 연결됩니다.
    3. 1/4" 튜브를 사용하여 두 밸브 어레이를 압축 공기 소스에 연결합니다. 압력 레귤레이터를 사용하여 22밸브 어레이의 압력을 3bar로 설정하고 8밸브 어레이를 1bar로 설정합니다.
  2. 유압 조절(그림 3참조)
    참고: 미세 유체 장치의 유동층을 통해 유체를 흐름하기 위해 시판되는 4포트 압력 조절장치가 사용됩니다. 각 포트의 출력 압력은 압력 컨트롤러와 함께 제공되는 소프트웨어를 통해 조절됩니다. 제공된 USB 커넥터를 사용하여 압력 조절기를 컴퓨터에 연결합니다.
    1. 압력 레귤레이터를 압축 공기 소스에 연결하여 공급된 압력이 레귤레이터가 허용하는 최대 압력을 초과하지 않도록 합니다.
    2. 수컷 루어를 압력 조절기의 4개의 암 루어 잠금 출력 포트각각에 3/32" 바브 커넥터에 연결합니다. 부드러운 튜브의 길이를 연결 (OD : 3mm, ID : 1mm, L : 10cm) 바브에.
    3. 두 번째 수인 루어를 3/32" 바브 커넥터에 연결하여 부드러운 튜브의 열린 끝에 연결하고 이를 유체 저장소 커넥터 포트에 부착합니다.
    4. 제공된 소프트웨어를 사용하여 유량 조절기의 각 출구의 원하는 압력을 설정하고, 저장소 내에 저장된 시약을 가압하여 시약이 미세 유체 장치로 유입됩니다. 저수지와 미세유체 장치의 연결은 섹션 4.2에서 논의될 것이다.
  3. 오프 칩 냉각 설정(그림 4참조)
    1. PVC 튜브(OD: 10mm, ID: 6mm)를 사용하여 수냉 시스템을 압축 피팅을 사용하여 냉판 물 블록에 연결합니다. 수냉 시스템의 유체 저장소를 냉각수로 채우고 장치를 부드럽게 기울여 갇힌 공기를 대체하고 지속적으로 냉각수를 저장소에 추가하여 가득 차도록 합니다. 모든 가스가 시스템에서 제거되면 저장소를 최대 부피의 약 90-95%로 채웁니다.
    2. 코일 PTFE 튜브 (OD : 0.042", ID : 0.022") 펠티에 요소의 차가운 면에 테이프로 이것을 고정합니다. PTFE 튜브의 한쪽 끝이 유동층 압력 제어 시스템의 저장소에 연결되어 있는지 확인합니다(섹션 4.3에 설명된 대로). PTFE 튜브의 다른 쪽 끝은 펠티에 표면에서 1cm 이하로 돌출되어야합니다. PTFE 튜브의 돌출 끝에 5 - 10cm 길이의 PEEK 튜브 (OD : 0.794 mm, ID : 0.127 mm)를 삽입하십시오. 튜브의 충전 및 미세 유체 장치에 대한 연결은 섹션 4.3에서 더 설명되어 있습니다.
    3. 펠티에 원소의 핫 면을 물 블록의 콜드 플레이트에 놓고 두 면에 충분한 열 화합물을 적용합니다. 튜브, 펠티에 소자 및 냉각 블록이 항상 서로 직접 접촉하고 있는지 확인하십시오.
    4. 펠티에 소요소를 직렬 버스 커넥터를 통해 온도 컨트롤러에 연결하여 펠티에에 공급되는 전압을 조절할 수 있습니다. 펠티에 표면에 서미스터를 단단히 놓고 출력을 온도 컨트롤러에 연결합니다. 물 냉각기를 켠 후 온도가 4 °C에서 안정될 때까지 펠티에에 공급되는 전압을 조정합니다.
      참고: 이 설정을 사용하면 펠티에 온도가 제공된 전압을 조정하여 수동으로 제어되며, 서미스터는 온도를 모니터링하는 역할만 수행합니다.

4. 실험 준비

참고: 실험을 시작하기 전에 미세 유체 장치를 준비해야 하며 반응 시약을 장치에 주입하기 위해 올바른 튜브에 삽입해야 합니다. 이 섹션에서는 1) 제어 채널 튜브를 장치에 연결, 2) 장치에 대한 냉각되지 않은 유입 시약의 연결 및 3) 냉각된 유입 시약의 장치에 대한 연결에 대해 설명합니다.

  1. 제어 채널 튜브 연결
    1. 미세 유체 장치의 각 제어 채널에 대해, 튜브의 길이를 잘라 (OD : 0.06", ID : 0.02"). 한쪽 끝에 23G, 1/2" Luer 스텁의 핀을 삽입하고 다른 쪽 끝에스테인리스 스틸 연결 핀을 삽입합니다(OD: 0.65 mm, ID: 0.35mm, L: 8mm).
    2. 루어 스텁을 수컷 루어에 3/32" 바브 나일론 커넥터에 연결합니다. 폴리우레탄 튜브 길이에 커넥터의 바브를 삽입합니다(OD: 4mm, ID: 2.5mm). 솔레노이드 밸브 중 하나에 직접이 폴리 우레탄 튜브를 삽입합니다.
    3. 23G, 1/2" 루어 스텁을 주사기에 부착하고 짧은(3-4cm) 튜브 조각(OD: 0.06", ID: 0.02")에 넣습니다. 이 튜브의 열린 끝을 초순수 의 저장소에 넣고 주사기를 초순수로 채웁니다.
    4. 도 5에나타낸 바와 같이 미세유체 장치의 각 제어 채널번호를 번호로 표시합니다. 각 채널(물로 채워지지 않은 제어 채널 1~3개 제외)에 대해 해당 튜브(솔레노이드 밸브에 연결됨)를 찾아 주사기에 부착된 튜브의 열린 끝에 금속 핀을 삽입합니다. 길이의 절반이 채워질 때까지 제어 채널 튜브에 물을 주입합니다.
    5. 주사기에서 튜브를 분리하고 스테인리스 스틸 커넥터 핀을 미세 유체 장치의 해당 구멍에 삽입합니다. 모든 제어 채널에 대해 반복합니다.
    6. 제어 인터페이스를 사용하여 모든 솔레노이드 밸브를 엽니다. 이것은 제어 채널 튜브 내의 유체를 가압하여 미세 유체 장치로 강제하고 장치 내의 모든 멤브레인 기반 밸브를 닫습니다. 장치 내의 개방 및 폐쇄 멤브레인의 예는 그림 6에있습니다.
  2. 냉각되지 않은 시약을 장치에 연결
    1. 냉각되지 않은 각 시약에 대해, 튜브의 길이를 잘라 (OD : 0.06", ID : 0.02") 미세 유체 장치 입구에 저수지 출구를 연결합니다.
    2. 튜브의 한쪽 끝을 가지고 튜브가 저수지의 베이스에 도달할 수 있도록 저장소에 삽입합니다. 저수지 튜브 콘센트는 공기 꽉 밀봉이 달성되도록 조여야한다. 스테인리스 스틸 연결 핀(OD: 0.65mm, ID: 0.35 mm, L: 8mm)을 튜브의 열린 끝에 삽입합니다.
    3. 작은(1mL) 주사기 끝에 23G, 1/2" 루어 스텁을 부착합니다. Luer 스텁에 짧은 길이의 튜빙(OD: 0.06", ID: 0.02")을 추가합니다. 튜브의 끝을 원하는 시약 용액에 넣고 주사기를 시약으로 채웁니다.
    4. 스테인리스 스틸 커넥터 핀을 주사기에 연결된 폴리우레탄 튜브에 넣고 튜브를 시약으로 채웁니다. 작은 반응 량을 사용하는 경우 시약은 저장소에 들어가지 않으며 튜브 자체는 저장소 역할을합니다. 주사기를 분리하고 커넥터 핀을 미세 유체 장치의 흐름 층 입구 구멍 중 하나에 삽입합니다.
    5. 압력 조절기 소프트웨어를 사용하여 각 저장소에 압력을 가하여 시약을 미세 유체 장치로 강제로 넣습니다.
  3. 냉각된 유체를 미세 유체 장치에 연결
    1. 펠티에의 표면 온도를 4°C로 설정하여 물 냉각기와 펠티에 소소가 켜져 있는지 확인합니다. 냉각 설정을 가능한 한 미세 유체 장치에 가깝게 장착하여 Peltier와 장치 입구 사이의 냉각되지 않은 부피를 최소화합니다.
    2. 스테인리스 스틸 커넥터 핀(OD: 0.65mm, ID: 0.35mm, L: 8mm)을 사용하여 PTFE 튜브의 개방 단부를 유체 저장소 중 하나에 연결된 튜브에 연결합니다(섹션 4.2에 설명된 대로).
    3. 작은 주사기(1mL)를 짧은 튜브 길이(OD: 0.06", ID: 0.02")로 Luer 스텁(23G, 1/2")에 연결합니다. 주사기를 냉각되는 시약(여기, IVTT 반응 용액)으로 채웁니다.
    4. 결합 튜브를 통해 주사기에 PEEK 튜브를 연결하고 PEEK 튜브를 통해 PTFE 튜브에 시약을 강제로 주사기에 일정한 압력을 가한다. 주사기에서 PEEK 튜브를 분리하고 미세 유체 장치의 흐름 채널 입구 중 하나에 직접 삽입합니다. 압력 레귤레이터 소프트웨어를 통해 압력이 가해지면 냉각된 시약이 미세 유체 장치로 강제로 유입됩니다.

5화 실험

참고: 실험을 수행하기 전에 프로토콜 섹션 3과 4에 자세히 설명된 모든 하드웨어 및 튜브 연결이 완료되어야 하며 모든 시약을 장치에 연결해야 합니다. 실험 절차는 다음 네 개의 별개의 부분으로 나눌 수 있습니다: 1) 미세 유체 장치의 로딩, 2) 현미경 을 준비, 3) 장치의 교정, 4) 실험을 수행. 이 연구 전반에 걸쳐 사용되는 사용자 지정 가상 제어 인터페이스(그림 7참조)는 재료 목록을 통해 보충 리소스로 제공됩니다.

  1. 미세 유체 장치 로딩
    1. 현미경 단계에 부착 된 모든 제어 및 흐름 층 튜브와 미세 유체 장치를 배치하고 인큐베이터에 있는 모든 개구부를 닫습니다. 인큐베이터의 주변 온도를 29°C로 설정합니다. 실험을 시작하기 전에 냉각 시스템이 켜져 있고 4°C로 설정되어 있는지 확인합니다.
    2. 모든 흐름 및 제어 채널이 가압되어 있는지 확인합니다. 제어 채널의 압력을 1 bar에서 1-3으로 설정하고 3 bar에서 제어 채널 9-29를 가압합니다. 시약은 압력 조절기 소프트웨어를 사용하여 유체 저장소에 적용하기 위해 20mbar에서 100mbar 사이의 압력을 필요로 합니다.
    3. 시약 중 하나를 사용하여 미세 유체 장치에서 공기를 제거합니다. 장치의 출구를 닫고 (제어 채널 29가 가압) 동시에 제어 채널 1-3 및 15-28을 감압. 그런 다음 선택적으로 멀티플렉서의 제어 채널을 압압하여 선택된 시약이 장치 내로 흐르도록 합니다. 현미경을 사용하여 공기 제거를 모니터링합니다.
      참고: 시약이 장치에 올바르게 로드되지 않거나 기포가 제거되지 않는 경우 압력을 최대 350mbar까지 늘릴 수 있습니다.
    4. 제어 소프트웨어에서 Flush 함수를 사용하여 공기를 유입하지 않고 모든 시약이 올바르게 흐르도록 하십시오. 먼저 플루오로포어를 로딩하고 개별 시약에 의한 변위를 모니터링하여 유체 흐름모니터링을 단순화할 수 있습니다.
  2. 현미경 준비
    1. 현미경을 사용하여, 미세 유체 장치 내에서 관심 있는 모든 지점(각 반응기 내의 단일 지점이 충분하다)을 찾아, 이의 좌표를 저장한다. 이러한 점은 교정 및 실험 프로세스 중에 이미지화됩니다.
      참고: 제어 소프트웨어에 포함된 교정 및 실험 절차 중에 현미경은 이전에 저장된 좌표에서 이미지를 주기적으로 캡처하도록 지시됩니다. 이를 달성하기 위해 제어 소프트웨어는 현미경 소프트웨어와 통신하여 새로운 이미지를 기록하도록 알려줍니다. 이 통신은 각 현미경 설정에 고유하므로 제공된 소프트웨어 인터페이스 내에서 이 기능이 수정되었습니다. 제공된 더미 실행 형은 자신의 현미경 시스템과의 호환성을 위해 최종 사용자가 수정 할 수 있습니다.
  3. 미세 유체 장치 교정
    1. 캘리브레이션 프로토콜을 실행하여 단일 유입 단계(연동 적으로 작동 제어 채널 15-17에 의해 제공되는 펌프 서열, 6개의 MODBUS 명령을 순차적으로 포함하는 펌프 서열) 동안 각 반응기로부터 변위된 유체 부피를 결정합니다. 소프트웨어 패키지에 제공됩니다.
    2. 제어 소프트웨어 내에서 다음 데이터 필드 설정: 용출 버퍼 채널, 플루오로폴레 채널, 희석 주기 수(기본값은 10희석), 유입 단계 수(기본값은 15단계), 혼합 주기 (기본값은 4사이클) 및 혼합 주기 사이의 시간(기본값은 0초)입니다. 캘리브레이션 실험 수행을 눌러 교정을 시작합니다.
      참고: 교정 과정에서 모든 반응기는 형광로 채워지고 이미지가 기록됩니다. 그 후, 용리액이 반응기(설정된 유입 단계 수에 따라)로 계량되어 형광포를 대체하는 일련의 희석이 수행됩니다. 철저하게 혼합 한 후, 새로운 이미지가 촬영됩니다. 이 프로세스는 희석 주기 의 집합 수에 대해 반복됩니다.
    3. 교정이 완료되면 제어 소프트웨어에서 제시한 단계를 수행하여 교정 실험분석을 완료합니다.
      참고: 분석은 각 희석 주기동안 기록된 형광 감소에 따라 각 반응기에 대한 새로 고침 비율을 사용자에게 제공합니다. 이 값은 설정된 유입 단계 수에 의해 변위된 반응기 체적의 분율을 나타냅니다. 차례로 이 값은 실험 중에 특정 반응기 체적을 대체하는 데 필요한 유입 단계 수를 결정하는 데 사용됩니다.
  4. 실험 수행
    1. 가상 제어 인터페이스 내에서 원하는 실험에 필요한 값을 설정합니다. 중요는 재생률 [%]로, 실험 주기당 변위된 반응기 부피를 결정하며 15~40%로 설정해야 합니다.
      참고: 특정 실험 프로토콜은 실험을 시작하기 전에 제어 인터페이스의 어떤 필드를 설정해야 하는지 결정합니다. 새로운 실험을 위해 제어 인터페이스를 조정하려면 일부 사소한 코딩이 필요합니다.
    2. 제어 인터페이스에서 실험 수행 버튼을 눌러 실험 프로토콜을 시작합니다.
      참고: 변경되지 않은 제공된 소프트웨어는 간단한 단백질 발현을 개시합니다. 원자로 1과 8은 제어로 활용되며, 원자로 2-7은 동일한 실험을 수용합니다. 여기서, 반응기 부피의 75%는 IVTT 용액을 포함하고, 25%는 초순수 또는 2.5 nM 선형 DNA 용액이다. 희석은 15분마다 발생하며, 희석당 반응기 부피의 30%가 변위됩니다. 이미지는 각 희석 주기의 끝에 기록됩니다.

6. 데이터 분석

참고 : 스크립트는 이미지의 분석을 위해 제공되었습니다 (보충 파일 또는 재료 의 테이블참조),'.nd2'파일의검토에 필요한 'bfopen'분석 패키지를 사용 (우리의 제공) 현미경 설정).

  1. 분석 스크립트'교정Script.m'을실행하고 한 번 원하는'.nd2'파일을선택하라는 메시지가 표시됩니다. 올바른 이미지 강도를 결정할 수 있는 단일 반응기 이미지가 표시됩니다. 슬라이더를 사용하여 미세 유체 채널의 가장자리가 선명하게 보이도록 이미지 강도를 최적화합니다.
  2. 반응기의 이미지가 표시됩니다. 이 이미지 내에서 형광 강도를 결정해야 하는 반응기 채널 내부영역을 선택합니다.
    참고: 각 반응기의 형광 강도는 각 반응기의 형광 강도를 간단한 플롯에 표시된 결과로 결정하여 결과를 시각화할 수 있도록 합니다.

Representative Results

IVTT 실험의 전도에 대한 다층 미세유체 플랫폼의 효과를 입증하기 위해, 기재된 설정은 deGFP 단백질을 발현하기 위해 사용되었다. 실험은 시판되는30IVTT 반응 혼합물-반응 기질 및 DNA 템플릿으로 보충된 모든 필요한 전사 및 번역 성분을 포함하는 것으로 진행되었다. 실험은 29°C의 온도에서 실시하였다; 단백질의 IVTT 발현에 최적인 것으로 밝혀진 온도.

미세 유체 장치는 9 개의 독특한 입구를 가지고 있으며, 그 중 4 개는이 실험 중에 활용되었습니다. 제1 은 상업적으로 수득된 IVTT 반응 혼합물을 함유하였다. IVTT 반응 혼합물은 단백질을 성공적으로 발현하는 데 필요한 모든 성분을 수용하지만, 정제된 GamS는 미세 유체 장치로 로딩하기 전에 1.3 μM의 최종 농도에서 반응 혼합물에 첨가하였다. GamS 단백질의 첨가는 실험을 수행할 때 선형 DNA 종의 분해를 최소화하는 역할을 한다. 결정적으로, IVTT 혼합물을 4°C의 표면 온도를 가진 펠티에 원소 상에 코일링된 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브에 주입하여 이의 용액을 미세유체 장치로 주입하기 전에 냉각시키는 단계; 사용 전에 반응 용액의 분해를 방지합니다. 마이크로 보어 폴리에테르 케톤(PEEK) 튜브를 사용하여 펠티에 소자 표면을 미세유체 장치와 상태로 두고 PTFE 튜브를 연결하여 냉각되지 않는 IVTT 반응 혼합물의 부피를 감소시켰습니다. 장치에 삽입된 두 번째 용액은 10 nM의 농도에서 - 초순수에 용해된 deGFP에 대한 선형 DNA 템플릿 코딩을 포함했다. 세 번째 용액인 초순수는 실험 절차 중에 여러 가지 목적으로 사용되었습니다. 주로, 초순수는 희석당 변위된 부피가 모든 반응체에 대해 동일하도록 하기 위해 사용되었으며, 제어 반응에서 DNA를 대체한다. 또한, 초순수는 또한 장치 교정 중에 형광포를 희석시키고 시약 사이를 전환할 때 장치의 죽은 부피를 플러시하는 데 사용되었습니다. 장치에 삽입된 최종 용액은 초기 장치 캘리브레이션을 수행하는 데 필요한 정제된 FITC-dextran 용액(25 μM)이었다. DNA, 물 및 형광포액을 튜브(0.02" ID, 0.06" OD)에 주입하였고, 이는 프로토콜의 섹션 4.2에 따라 미세유체 장치의 유입 채널 중 하나에 삽입될 수 있었다. 이와 같이, 이들 용액은 실험의 전체에 대해 29°C에서 저장되었다.

미세 유체 장치의 제어 채널의 작동은 각각의 제어 채널을 개별적으로 작동시킬 수 있는 사용자 지정 제어 소프트웨어를 통해 달성됩니다. 이 수동 프로세스를 통해 장기간 IVTT 반응을 실행할 수 없으며 제어 소프트웨어 내에 통합된 자동화된 프로토콜을 사용해야 합니다. 실험을 위해 미세 유체 장치를 준비할 때, 유사한 자동화 된 프로토콜을 사용하여 새로운 시약으로 장치 죽은 볼륨의 플러싱, 링 반응기 내 시약의 혼합 및 로딩과 같은 여러 가지 유용한 프로세스를 실행할 수 있습니다. 반응기에 새로운 시약을 넣는 동시에 전류 용액의 동일한 부피를 대체합니다. 또한 장치 교정의 전도 및 장기간 무세포 단백질 발현의 실행이라는 두 가지 복잡한 공정을 사용할 수 있습니다. 앞서 언급한 모든 프로세스는 인플로우 채널, 유입 볼륨 및 혼합 기간과 같은 특정 프로세스 설정을 다양하게 구성하도록 여러 매개 변수를 구성하는 기능과 함께 메인 인터페이스에서 쉽게 실행할 수 있습니다.

미세 유체 장치 제조 중 압력 및 결함의 변동으로 인해 단일 주입 주기 동안 변위된 유체의 부피는 장치마다 다를 수 있습니다. 이와 같이, IVTT 실험을 수행하기 전에, 주사 사이클당 변위된 반응기 부피(RefreshFraction)를결정하였다. 이 교정을 위해서는 8개의 반응기 모두를 형광 기준 용액으로 충진해야 합니다. 이 경우, 정제된 FITC-dextran 용액(25 μM)을 사용하였다. 이어서, 반응기는 초순수로 10 회 희석된다. 각 반응기에 대한 희석 주기당 형광의 감소를 측정함으로써, 단일 주입 주기 동안 변위된 유체의 부피를 측정했다. 대조군 소프트웨어 내에서, IVTT 실험 동안 사용하기 위해 이 값(새로 고침 비율)이기록되었다. 결정적으로, 장치 전체의 유량 변동과 개별 반응기 부피의 불일치를 고려하여 새로 고침 비율이 각 개별 반응기에 대해 결정되고 저장됩니다. 반응기를 충전하고 희석하는 순서는 제어 소프트웨어의 일부를 구성하는 교정 수행 프로그램을 사용하여 자동으로 수행되었습니다. 교정 실험의 결과는 도 8에나와 있다.

가장 복잡한 사전 프로그래밍된 프로세스는 장기간 IVTT 실험을 실행하여 사용자가 실험을 시작하고 완료될 때까지 무인으로 작동할 수 있도록 합니다. 실험 전반에 걸쳐, 원자로 1과 5는 희석 중에 원자로에 물만 첨가하는 빈 칸으로 사용되었다. 반응기 2 및 6은 음성 대조군으로 활용되었고 IVTT 반응 용액 및 초순수만을 함유했다. 나머지 반응기(3, 4, 7 및 8)에는 deGFP 유전자에 대한 IVTT 반응 용액 및 2.5 nM의 선형 DNA 코딩이 포함되어 있었다. 반응기의 초기화는 모든 반응기(1 및 5 제외)를 IVTT 반응 용액으로 완전히 충진함으로써 달성되며, 반응기 부피의 25%가 초순수로 변위되기 전에 달성된다. 이에 따라, 반응기에 시약의 주기적인 주입이 개시되었다. 실험은 매 14.7분마다 새로운 시약을 반응기에 주입하고, 각 희석 주기 동안 반응기 부피의 30%가 변위되도록 하였다. 각 주사의 조성물은 주입된 유체의 75%가 신선한 IVTT 용액을 구성하고 나머지 25%는 DNA 또는 초순수로 구성되도록 하였다. 새로운 시약의 각 주입에 따라 반응기를 연속하여 혼합한 다음, 그 후 각 반응기의 형광 이미지를 현미경을 사용하여 기록했습니다. 반응은 이후에 68 사이클 동안 연속하여 실행되도록 허용되었고, 그 결과 16.5 h의 실험 기간이 있었습니다. 이 실험의 결과는 그림 9에있습니다.

장기간 IVTT 실험을 수행 할 때, 반응의 실패에 대한 두 가지 주요 원인이 있다; 미세 유체 장치 내의 공기 의 도입 또는 IVTT 반응 용액의 분해. 미세 유체 장치 내에서 공기의 발생은 유입 액에 존재하는 작은 기포의 직접적인 결과이며, 이는 이후에 미세 유체 장치에 주입됩니다. 장치를 입력하면 공기의 존재는 유체의 적절한 흐름을 억제하여 반응이 더 이상 주기적으로 새로 고쳐지므로 반응기 링 내에서 배치 반응이 형성됩니다. 일부 경우에, 공기는 시약의 반복적인 플러싱에 의해 장치에서 서서히 제거되고, 그 후 반응은 의도한 대로 계속된다(도 9에도시된 바와 같이). 다른 경우에는 공기가 갇혀 있고, 실험을 중단하고 이어서 미세 유체 장치의 유동층에 연속(high) 압력을 가하여 제거될 수 있으며, 이는 프로토콜의 섹션 5.1에 기재된 충진 공정과 유사합니다. 실험 동안 세포 포세이트는 4°C로 냉각된 펠티에 원소 상에서 PTFE 튜브에 저장된다. 두 측정 모두 시간이 지남에 따라 IVTT 반응 용액의 분해를 제한하는 데 도움이되며, 불활성 PTFE 튜브는 튜브와 반응 용액 및 기능성 (바이오) 분자를 보존하는 차가운 온도 사이의 제한된 상호 작용을 보장합니다. 구성 요소는 IVTT를 수행하는 데 필요합니다. 반응 용액의 분해가 발생해야 - 반응 용액과 저장 환경 사이의 불충분한 냉각 또는 원치 않는 상호 작용의 결과로 - 다음이 단백질의 점진적 감소로 실험적으로 자신을 나타낼 것이다 시간이 지남에 따라 표현식을 표현할 수 있습니다. 일단 분해되면, IVTT 반응 용액은 복구될 수 없고 새로운 실험이 준비되어야 합니다.

Figure 1
그림 1. 지속적인 IVTT 반응을 수행하는 데 필요한 하드웨어 설정입니다. A)하드웨어 설정의 회로도. B)이 원고 전체에 사용된 설정 사진. 연속 IVTT 반응을 위한 다층 미세 유체 장치를 구현하려면 유압, 작동 제어 채널, 열 및 냉각 반응 및 시약, 유체 저장 및 이미지 장치를 조절하는 광범위한 하드웨어 설정이 필요합니다. 실험. 실험은 30 °C의 온도에서 수행되며, 이는 이 온도로 설정된 인큐베이터 내에 현미경을 배치함으로써 달성된다. IVTT 반응 용액의 열화를 방지하기 위해, 펠티에 원소의 차가운 면 위에 코일 된 PTFE 튜브 내에 저장됩니다. 펠티에 원소의 온도는 4°C로 설정되어 있으며, 이 온도를 유지하기 위해 물 냉각기와 물 블록이 사용됩니다. 냉각이 필요하지 않은 시약은 현미경 인큐베이터 외부의 유체 저장소에 저장됩니다. 컴퓨터 제어 압력 레귤레이터에 의해 이러한 저장소에 일정한 압력이 가해지다. 이러한 방식으로 유체는 미세 유체 장치의 유입 채널에 직접 연결되는 저장소의 출구 튜브를 통해 강제로 연결됩니다. 미세 유체 장치의 각 제어 채널은 공압 밸브에 연결됩니다. 전체 밸브 어레이는 일정한 압력을 받고 있습니다. 밸브를 열면 공압 밸브를 미세 유체 장치의 제어 채널에 연결하는 튜브 내의 유체의 가압을 허용하므로 미세 유체 장치 내에서 발견되는 PDMS 멤브레인을 열고 닫습니다. 공압 밸브는 특정 공압 밸브를 열고 닫도록 필드버스 컨트롤러(도시되지 않음)를 명령하는 사용자 인터페이스를 통해 열리고 닫힙니다. 옐레스와라푸 외22에서적응 그림 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. 공압 밸브 설정 및 제어 채널 연결 개요. 8밸브 어레이에는 밸브 1, 2 및 3에 장착된 3개의 제어 채널 연결이 표시됩니다. 압축 공기는 1/4" 튜브를 통해 밸브 어레이에 공급될 수 있습니다. 제어 채널의 작동을 위해 두 개의 압력이 사용됩니다 : 낮은 압력 제어 채널 (1, 2 및 3)에 대한 1 바 및 더 높은 압력 제어 채널 (9 ~ 30, 여기에 표시되지 않음)에 대한 3 바. 튜브는 초순수로 채워지고 스테인리스 스틸 커넥터 핀을 사용하여 제어 채널 입구 중 하나에 삽입할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 상업용 유압 조절기 및 저수지 시스템의 개요. 시판되는 압력 조절기는 다층 미세 유체 장치의 유동층에 유체를 주입하는 데 사용됩니다. 압력 컨트롤러를 컴퓨터에 연결하면 유체 주입을 수행하는 데 사용되는 압력을 변조할 수 있습니다. 시약은 압력 조절기와 직접 연결되는 유체 저장소에 보관할 수 있습니다. 저장소에 압력을 가할 때 출구 튜브를 통해 유체가 저수지 밖으로 나오게 됩니다. 이 출구 튜브는 스테인레스 스틸 커넥터 핀을 사용하여 미세 유체 장치의 유체 입구 중 하나에 직접 연결할 수 있습니다. 시약 부피가 유체 저장소에 도달할 수 없는 경우, 출구 튜브는 시약의 저장소 역할을 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4. 반응 시약을 냉각하는 데 사용되는 냉각 시스템의 개요. (왼쪽)분리된 냉각 설정 및 (오른쪽) 냉각 설정이 현미경 내에 배치되고 미세 유체 장치에 연결됩니다. 펠티에 소소는 미세 유체 장치에 주입하기 전에 IVTT 반응 용액을 냉각하는 데 사용됩니다. 시약은 펠티에 원소의 차가운 면 위에 코일된 PTFE 튜브 내에 저장됩니다. PEEK 튜브의 길이는 시약 부피가 더 이상 냉각되지 않도록 작은 내부 직경 (0.005")으로 냉각 된 유체를 미세 유체 장치로 전달하는 데 사용됩니다. 코일 형 PTFE 튜브와 함께 서미스터가 배치되어 펠티에 원소 표면에서 실시간 온도 모니터링이 가능합니다. 펠티에에 가해지는 전압은 펠티에의 표면 온도가 0°C에서 4°C 사이로 유지되도록 설정된다. 펠티에 소자에서 발생하는 과도한 열을 제거하기 위해 펠티에의 핫 페이스는 실리콘 프리 히트 싱크 그리스를 추가하여 두 면 사이의 최적의 열 전달을 보장하는 수냉 식 블록에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5. 미세 유체 장치 설계 개요. 연속 IVTT 반응을 위한 미세 유체 유동 반응기는 각각 10.7 nL의 부피를 가진 8개의 반응기 고리로 구성됩니다. 9개의 입구를 통해 9개의 고유한 반응 용액이 장치에 유입될 수 있습니다. 24개의 제어 채널은 장치 내의 유체 흐름을 조절합니다. 제어 채널 9~14는 멀티플렉서를 형성한다. 이러한 제어 채널은 장치에 유체 흐름을 억제하기 위해 항상 가압되어야합니다. 두 개의 제어 채널의 감압은 동시에 단일 시약의 유입을 허용합니다. 제어 채널 15, 16 및 17은 제어된 방식으로 시약을 장치에 연수적으로 펌핑하는 데 사용됩니다. 제어 채널(18~25)은 각각 장치 내에서 발견되는 8개의 반응기 중 하나의 입구를 제어한다. 제어 채널(26)은 플러시 채널을 닫아 유체를 반응기 내로 강제할 수 있습니다. 제어 채널(27)은 반응기의 균일한 충진을 돕는다. 제어 채널(28) 및 29는 각각 링 반응기 출구와 유일한 장치 출구를 조절한다. 마지막으로, 제어 채널 1, 2 및 3은 순환 반응기 내의 유체를 연동하여 시약의 혼합을 초래하는 데 사용됩니다. 이 미세 유체 장치와 그림의 디자인은 모두 Neiderholtmeyer 외29에서적응됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6. 미세 유체 장치 내의 멤브레인 기반 밸브. A)미세 유체 장치 내의 흐름 채널. 두 개의 제어 채널을 백그라운드에서 볼 수 있습니다. 이러한 채널은 가압되지 않고 밸브가 열려 있습니다 (유체가 흐를 수 있음). B)유동층 채널을 교차하는 두 개의 제어 채널이 가압되어 밸브를 닫습니다(즉, 유체 흐름이 방해됩니다). 제어 채널의 가압시, 흐름 및 제어 층 채널을 분리하는 얇은 PDMS 멤브레인은 유동층 채널을 닫는 위쪽(제어 층이 유동층 아래에 있음)으로 편향됩니다. 유동층 채널의 반올림은 편향된 멤브레인이 유채널을 완전히 닫도록 하는 데 중요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7. 미세 유체 장치를 제어하는 데 사용되는 사용자 인터페이스. 이 연구를 통해, 사용자 정의 제어 인터페이스는 미세 유체 장치 내에서 유체의 흐름을 제어하는 데 사용되었습니다. 인터페이스를 통해 사용자는 각 제어 채널(번호 1-3 및 9-29)을 개별적으로 작동하거나 시약의 플러싱 및 로딩, 미세 유체 장치의 교정 및 실행을 초래하는 정교한 프로토콜을 실행할 수 있습니다. 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8. 교정 실험의 결과. 교정 실험 동안 반응기는 형광 강도가 기록된 후 형광공 (25 μM FITC-Dextran)으로 채워집니다. 그 후, 일련의 희석이 뒤따르며, 여기서 설정된 수의 유입 단계(15)가 반응기내로 초순수를 주입하는데 사용된다. 각 희석 후, 시약이 혼합되고 형광이 측정된다. 희석당 형광 강도의 감소는 설정된 유입 단계 수에 대해 변위된 반응기 고리의 부피를 드러내고; 새로 고침 비율이라고하는 값. A)8개 반응기의 평균 강도 및 표준 편차는 빨간색으로 표시되며 개별 강도 추적은 회색으로 표시됩니다. B)각 희석 단계에 대해 평균 새로 고침 비율 및 표준 편차가 빨간색으로 표시됩니다. 각 개별 반응기의 개별 새로 고침 비율은 회색으로 표시됩니다. 8개의 반응기 중 7개가 매우 유사한 동작을 보이는 것을 볼 수 있지만, 한 반응기는 7번째 희석 주기 후 새로 고침 비율의 변동을 나타낸다. 이는 반응기로 시약을 주입하기 위해 평균 새로 고침 비율을 사용하는 것과 는 달리 각 반응기마다 고유한 새로 고침 비율의 필요성을 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9. deGFP 단백질을 발현하는 IVTT 실험의 결과. 연장된 IVTT 반응은 반응기 부피의 30%가 14.6분마다 변위되도록 시작되었다. 반응은 종료되기 전에 16 시간 이상 실행하도록 허용되었다. 미세 유체 장치의 두 개의 반응기를 공백으로 사용했으며, 실험 전반에 걸쳐 초순수만 이 반응기를 통해 날아갔다(반응기 1 및 5). 다른 모든 반응기는 75% IVTT 반응 용액과 25%의 초순수(반응기 2 및 6) 또는 deGFP(반응기 3, 4, 7 및 8)의 발현을 코딩하는 2.5 nM 선형 DNA 템플릿으로 구성되었다. DNA가 추가된 4개의 반응기 모두에, 명확한 deGFP 발현이 있다. 4개의 반응기 중 3개는 유사한 형광 강도를 제공하며, 한 반응기에서는 더 낮은 형광 신호를 표시합니다. 이는 반응기로 들어가는 DNA가 적거나 반응기 치수의 변화로 인해 유동이 불균형하여 발생할 수 있습니다. 14 시간 후, DNA를 포함하는 반응기의 신호에서 급격한 증가가 보입니다. 이는 유입 액중 하나에서 비롯된 미세 유체 장치의 유동층에 유입되는 기포에 의해 발생합니다. 미세 유체 장치의 공기 트랩은 채널을 통한 유체의 흐름을 크게 제한하므로 공기가 통과할 때까지 반응기에서 신선한 시약을 추가하거나 제거할 수 없습니다. 흐름을 재개하면 실험은 이전의 형광 강도로 돌아갑니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

PDMS 기반 다층 미세 유체 장치가 제시되었으며, 오랜 시간 동안 IVTT 반응을 유지하는 능력이 입증되었습니다. 이 특정 예제에 적합하지만 이 기술은 다른 수많은 응용 프로그램에 사용될 수 있습니다. 유체 흐름에 대한 추가 제어 - (by) 제품을 제거하는 동안 지속적으로 반응 시약을 보충할 수있는 능력과 결합 - 연속 합성 반응, 다양한 동적 행동의 조사 및 동시 단일 반응의 여러 변형의 전도.

PDMS 기반 장치의 비교적 간단한 제작 과정에도 불구하고, 이의 사용은 광범위한 하드웨어 설정이 필요합니다. 밸브 어레이, 압력 조절기, 압력 펌프, 인큐베이터 및 냉각 장치로 구성된 제작에서 사용으로의 전환은 기본이 아니며 상당한 초기 투자가 필요합니다. 또한 이러한 장치로 성공적인 실험을 일관되게 설정하고 수행할 수 있는 능력은 상당한 시간 투자가 필요합니다. 이 원고가 해결하는 것을 목표로하는 지점입니다. 그러나 일단 제자리에 있으면 전체 설정을 다양한 용도로 수정할 수 있습니다. 또한 하드웨어 설정은 수많은 모듈식 요소로 구성되며, 각 요소는 보다 복잡한 미세 유체 장치 설계를 사용할 수 있도록 확장할 수 있습니다. 또한, 모듈식 설계를 통해 하드웨어 구성요소를 유사하게 작동하는 대안으로 교체할 수 있으며, 이러한 대안은 사용자가 여기에 설명된 특정 설정에 한정되지 않도록하는 48,49.

개별 장치 간의 가변성 및 외부 조건(예: 압력 변동)에서는 이러한 장치를 사용하여 실험을 수행할 때 부정확성이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 각 실험 전에 시스템 교정을 수행하여 각 반응기마다 고유한 새로 고침 비율을 제공해야 합니다. 교정은 장치 간 및 실험 간 변형을 해결하는 반면, 시간이 많이 소요되는 프로세스이며 완벽하지 않습니다. 점도가 다른 유체는 동일한 압력에 노출될 때 동일한 속도로 흐르지 않으며, 다중 시약으로 교정을 수행하므로 동일한 새로 고침 비율을생성하지 않을 수있습니다. 이 효과는 공급된 압력만 을 변화시켜 흐름을 조절하는 것과 는 달리 세 가지 제어 채널을 사용하여 시약을 미세 유체 장치로 연동 펌프하여 감쇠됩니다. 점도의 차이가 매우 큰 경우 마지막 수단으로, 여러 교정 실험을 수행하여 각 개별 시약에 대해 고유한 새로 고침 비율을 구현할 수 있습니다.

연동 펌프를 사용하여 미세 유체 장치에 시약을 주입하면 점도가 다른 솔루션을 사용하는 효과가 약해지지만 이차적인 문제도 발생합니다. 유체를 미세 유체 장치로 펌핑하기 위해 개별 단계를 사용하면 단일 반응기로 의 주입 해상도가 제한되고 단일 펌프 사이클을 수행할 때 주입된 부피에 의해 제한됩니다. 우리의 연구 내에서 이 값은 보정 중에 결정되며, 단일 펌프 사이클이 반응기 부피(약 0.1 nL)의 약 1%를 대체한다는 것을 나타냅니다. 따라서 반응기 부피의 30%를 대체하려면 30개의 펌프 사이클을 실행해야 하며, IVTT 반응 용액의 23개의 펌프 사이클이 추가되고 DNA 또는 초순수의 펌프 사이클만 7회가 추가됩니다. 연구에 충분하지만 대체 실험 프로토콜은 더 많은 수의 고유 시약을 추가하거나, 더 낮은 새로 고침 분획을사용하거나, 반응기에 단일 시약의 더 작은 볼륨을 추가하려고 할 때 문제가 발생할 수 있습니다. 이러한 경우, 미세 유체 장치 설계는 더 큰 부피의 반응기를 제공하도록 조정할 수 있다. 이러한 예는 니더홀트마이어 외36에보고됩니다.

결정적으로, 이 원고에 설명된 장치는 장기간 반응을 지속하여 정상 상태 전사 및 번역 속도를 가능하게 합니다. 주기적으로 반응기에 새로운 시약을 주입하고 반응(byby)제품을 제거함으로써 반응이 지속되고 복잡한 동적 거동을 모니터링할 수 있습니다. 이런 식으로 어느 정도는 셀룰러 환경을 모방하는 플랫폼이 만들어졌습니다. 또한,이 플랫폼은 주사와 주사의 특정 구성 사이의 기간을 조정하여 시스템 역학의 탐구를 가능하게한다. 그 결과, 이러한 다층 미세 유체 장치는 복잡한 동적 동작을 표시하는 새로운 합성 네트워크의 특성화 및 최적화를 위한 강력한 도구입니다.

Disclosures

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 유럽 연구위원회에 의해 지원되었다, ERC (프로젝트 n. 677313 BioCircuit) 과학 연구를위한 네덜란드 기구에서 NWO-VIDI 교부금 (NWO, 723.016.003), 교육부에서 자금 지원, 문화 및 과학 (중력) 프로그램, 024.001.035 & 024.003.013), 인간 프론티어 과학 프로그램 그랜트 RGP0032/2015, 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 그랜트 723106, 스위스 국립 과학 재단 보조금 200021_182019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) - Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials - <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) - Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source -
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation - 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. -
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO - 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific -
Soft tubing Fluigent - Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA - Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove

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