Многослойная микрофлюидная платформа для проведения длительного выражения генов без клеток

Bioengineering
 

Summary

Описан процесс изготовления, многослойного, микрофлюидного устройства, позволяющего выполнять в пробирке транскрипцию и перевод (IVTT) в течение длительных периодов времени. Кроме того, предоставляется всеобъемлющий обзор аппаратного и программного обеспечения, необходимого для автоматизации и поддержания этих реакций в течение длительного времени.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ограничения клеточной синтетической биологии становятся все более очевидными по мере того, как исследователи стремятся разработать более крупные и более сложные синтетические генетические регулятивные схемы. Анализ синтетических генетических регуляторных сетей in vivo занимает много времени и страдает от отсутствия экологического контроля, при этом экзогенные синтетические компоненты взаимодействуют с процессами пребывания, что приводит к нежелательному поведению. Чтобы преодолеть эти проблемы, безклеточная характеристика новых схем становится все более распространенным. В пробирке транскрипции и перевода (IVTT) смеси позволяют регулировать экспериментальную среду и могут быть оптимизированы для каждой уникальной системы. Представленные здесь протоколы подробно изготавливают изготовление многослойного микрофлюидного устройства, которое может быть использовано для поддержания реакции IVTT в течение длительного времени. В отличие от пакетных реакций, когда ресурсы истощаются с течением времени и (по-) продукты накапливаются, использование микрофлюидных устройств позволяет пополнить ресурсы, а также удаление реакционных продуктов. Таким образом, клеточная среда эмулируется путем поддержания вне равновесия среды, в которой динамическое поведение генных цепей может быть исследовано в течение длительных периодов времени. Чтобы полностью использовать многослойное микрофлюидное устройство, оборудование и программное обеспечение были интегрированы для автоматизации реакций IVTT. Объединив реакции IVTT с микрофлюидной платформой, представленной здесь, становится возможным всесторонне анализировать комплексное поведение сети, способя наше понимание механизмов, регулирующих клеточные процессы.

Introduction

Клетки способны чувствовать и реагировать на окружающую среду с помощью сложных динамических регуляторныхсетей1,2. Область синтетической биологии использует наши знания о естественных компонентов, входящих в эти сети для инженера биологических систем, которые могут расширить функциональность клеток3,4. И наоборот, можно также продолжить наше понимание природных сетей, регулирующих жизнь, проектируя упрощенные синтетические аналоги существующих схем или передние инженерные биологические системы, которые демонстрируют естественное поведение. Де Ново-инженерия таких биологических систем осуществляется снизу вверх моды, где новые генетические схемы или сигнальные пути инженерии в рациональной манере, используя четко определенные части5,6. Сочетание рационального проектирования сетей с проектированием биологически значимых систем позволяет углубленной характеристики и изучение биологических систем регулирования с различными уровнями абстракции7.

Первопроходцы Elowitz и Leibler8 и Gardner et al.9 первыми продемонстрировали успешное внедрение синтетических генетических сетей в клеточные хосты. В следующем десятилетии, многочисленные исследователи продолжают опираться на эти первоначальные успехи, несмотря на появление ряда ограничений в отношении введения синтетических схем в клетки7,10,11 ,12. В идеале внедрение синтетических схем в сотовые хосты должно происходить модульным способом. К сожалению, сложность клеточной среды делает это особенно сложным, с функцией многих частей и сетей в высокой степени контекст зависит12,13,14. В результате сети часто сталкиваются с нежелательными взаимодействиями с компонентами родного узла, которые могут повлиять на функцию синтетической цепи. Аналогичным образом, компоненты экзогенной сети могут препятствовать принимающим процессам, конкурировать за общие ресурсы внутри хоста и влиять на кинетику роста15,16,17. Следовательно, для того, чтобы рационально проектировать и прогнозировать поведение синтетических сетей в среде in vivo,требуетсякомплексная модель всей динамики, специфичной для хоста и цепи.

Целесообразной альтернативой использованию сотовых хостов для характеристики синтетических сетей является применение технологий транскрипции и перевода (IVTT). Выступая в качестве испытательного дна для синтетических сетей, реакции выполняются в решениях, включающих все компоненты, необходимые для обеспечения экспрессиигенов 19,20,21. Таким образом, создается биологически актуальная, хотя и искусственная среда, в рамках которой синтетические сети могут быть протестированы22,23,24,25,26, 27,28. Основным преимуществом использования решений IVTT является способность выполнять реакции в условиях, определенных пользователем, при этом исследователи способны настроить точный состав каждой реакции2. Кроме того, подход без клеток позволяет проводить высокопроизводительные испытания синтетических сетей, поскольку он устраняет необходимость выполнения трудоемких клеточных шагов клонирования. В результате продолжительность последовательной конструкции - сборки - циклов испытаний значительно сокращается29,30,31,32. Цикл проектирования может быть еще более ускорен за счет использования клеток свободного клонирования методов, таких как сборка Гибсон быстро инженер новых сетей, а также путем построения сетей из линейных шаблонов ДНК, которые - в отличие от плазмиды, необходимые для тестирования in vivo - может быть усилена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)33,34.

Реакция пакета самый простой метод которым реакции IVTT могут быть выполнены, требуя одиночного сосуда реакции wherein все компоненты реакции совмещены35. Такие реакции достаточны для экспрессии белка и базового тестирования цепи, но оказываются недостаточными при попытке изучить долгосрочное динамическое поведение сети. В ходе пакетной реакции реагенты либо истощаются, либо подвергаются деградации, что приводит к постоянному снижению частоты транскрипции и перевода. Кроме того, по мере развития реакций накапливаются побочные продукты, которые могут помешать - или полностью ингибировать - правильное функционирование сети. В конечном счете, использование пакетных реакторов ограничивает динамическое поведение, которое можно наблюдать, с отрицательным регулированием, особенно сложным для реализации5,36.

Универсальность систем IVTT позволяет несколько альтернативных методов, с помощью которых длительные реакции IVTT могут быть выполнены, начиная от непрерывного потока на основе капель методы, а также более простые подходы диализа2,30, 37,38,39,40. Применение микрофлюидных устройств предлагает пользователям повышенный контроль над их реакциями при одновременном увеличении пропускной связи и минимизации затрат35,41,42, с каждым конкретным подходом, имеющим свой собственных преимуществ. Использование непрерывного потока может быть легко оптимизирован для увеличения доходности выражения однако, неспособность эффективно удалить конкретные продукты реакции делает изучение динамического поведения нетривиальным39. В то время как использование капель на основе микрофлюидных систем позволяет высокой пропускной результате скрининга новых сетей, трудность поставки свежих реагентов для реакции приводит к капель, напоминающих небольшой объем пакетных реакций43. Реакторы на основе диализа позволяют вводить свежие реагенты, а также удаление некоторых продуктов реакции, однако, молекулы РНК и более крупные белки накапливаются в реакторе, будучи слишком большим, чтобы рассеиваться через мембранные поры. Кроме того, большие объемы реагентов необходимы для поддержания этих реакций в течение длительных периодов30,44. В 2013 году Maerkl et al. представили многослойное микрофлюидное устройство, разработанное специально для проведения длительных реакций IVTT36,45. Использование многослойных микрофлюидных устройств позволяет прямо контролировать поток жидкости, что позволяет перенаправить поток, а также изоляцию жидкости в определенных областях устройства46,47. Эти изолированные области могут функционировать как независимые нанолитровые камеры реакции, в которых могут быть выполнены реакции IVTT. В ходе одной реакции IVTT периодические инъекции свежих реагентов в реактор используются для пополнения компонентов ИВТт и шаблонов ДНК. Одновременно с ним вытесняется равный объем старого реакционного раствора, удаляя реакционные продукты. Таким образом, вне равновесия сохраняется среда, где базальная транскрипция и скорость перевода остаются в стабильном состоянии, продлевая срок службы ivTT реакций и позволяя происходить богатое динамическое поведение. Применяя этот подход, исследователи могут исследовать кинетические темпы отдельных процессов, происходящих в рамках конкретной цепи, помогая в передовой инженерии новых генетических сетей. Например, Niederholtmeyer et al. внедрили этот подход, чтобы охарактеризовать различные элементы осциллятора генетического кольца, определив кинетические показатели36. В дальнейших исследованиях, Yelleswarapu et al. показали, что кинетическая скорость сигмы фактора 28 (No28),определяемых в условиях партии, была недостаточной для описания поведения осциллятора на основе28евро, и что добавление данных на основе потока улучшенные прогнозы моделей сетевого поведения22.

Целью данной рукописи является представление полного протокола для изготовления многослойных микрофлюидных устройств, способных выполнять долгосрочные реакции IVTT. Кроме того, в данной рукописи будет описано все аппаратное и программное обеспечение, необходимое для выполнения длительных реакций IVTT. Активация микрофлюидного устройства, необходимого для контроля потока жидкостей в ней, достигается с помощью серии пневматических клапанов, которые подключаются непосредственно к микрофлюидным устройствам по длине труб. В свою очередь, пневматические клапаны управляются с помощью специально созданного виртуального интерфейса управления. Поток жидкости в микрофлюидных устройствах достигается с помощью непрерывного давления, которое обеспечивается коммерчески доступной системой регулирования давления. Реакции IVTT обычно выполняются между 29 и 37 градусами По Цельсию, а микроскопийный инкубатор используется для регулирования температуры во время реакций. Тем не менее, функциональность смеси IVTT постепенно ухудшается при хранении выше 4 градусов по Цельсию. Таким образом, эта рукопись будет расширяться на вне чипа системы охлаждения, используемой для охлаждения смеси IVTT до инъекции в микрофлюидное устройство. В заключение, эта рукопись обеспечивает всеобъемлющий обзор процедур, необходимых для успешного выполнения длительных реакций IVTT с использованием микрофлюидного реактора потока, так что другие исследователи смогут воспроизвести эту технологию с относительной Простота.

Protocol

1. Подготовка вафель

ПРИМЕЧАНИЕ: Наши протоколы специфичны для 40 XT положительных фоторезисив и SU8 3050 отрицательных фоторезиста, используемых в ходе этого исследования. Альтернативные photoresists могут быть использованы, однако конкретные скорости спина, температура выпечки, и время выпечки будет меняться. Конструкция микрофлюидного устройства, предоставленная Niederholtmeyer et al.36, связана в таблице материалов.

  1. Поместите две чистые кремниевые пластины (100 мм в диаметре, 1-0-0-0)gt; ориентированные, толщина 525 мкм) в разогретой духовке, установленной до 250 градусов по Цельсию, и оставьте для обезвоживания на ночь (16 ч).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также возможно, чтобы премьер с помощью осаждения паров HMDS; однако, это не является необходимым, если достаточно обезвожены.
  2. Удалите одну кремниевую пластину из духовки и дайте ей остыть до комнатной температуры, прежде чем приступить к спиновому покрытию. Нанесите 3-4 мл из 40 XT фотоустойчивость к центру.
  3. Для получения объекта высотой 25 мкм нанесите следующий протокол вращения: спина на 20 с при 500 об/мин (110 об/мин/с), увеличить скорость вращения до 3100 об/мин (300 об/с) и удерживайте здесь 30 с, и замедляйте до 0 об/мин с при замедлении 200 об/мин/с. микроволокна ткани тщательно удалить любой бисообразной кромки, которые могут иметь место во время спинпокрытия покрытия.
  4. Мягкая выпечка с помощью двух отдельных горячих пластин, установленных до 70 градусов по Цельсию и 120 градусов по Цельсию следующим образом: дайте сидеть при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 30 с. Затем перенесите вафельку на горячую пластину 120 градусов по Цельсию и дайте ей отдохнуть здесь в течение 3,5 мин, прежде чем вернуть вафу на хладнокровие 70 градусов по Цельсию еще на 30 с. Удалите вафу с горячей плиты и - избегая внезапных температурных потрясений - дайте ему остыть до комнатной температуры.
  5. Поместите фотомаску слоя потока (эмульсионную сторону вниз) на фоторезисточенную пленку и разоблачите с помощью ультрафиолетовой лампы до достижения общей экспозиции 200 мДж/см2.
  6. После экспозиции выпекать с помощью двух горячих пластин (70 градусов по Цельсию и 105 градусов по Цельсию) следующим образом: позволяют пластине сидеть при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 20 с, прежде чем перенести вафу на раскалку 105 градусов по Цельсию и оставить ее здесь на 40 с. Наконец, вернуть на 70 градусов по Цельсию hotplate еще на 20 с, чтобы завершить после экспозиции испечь.
  7. Разрешить для охлаждения до комнатной температуры на стопку микроволоконных тканей. Разработайте вафельу, переведя ее в чашку Petri, наполненную разработчиком 726 MIF photoresist, чтобы начать процесс разработки. Разработка ускоряется при выполнении на скамейке шейкера и вся пластина погружается в разработчика.
  8. Промыть вафельу деминерализованной водой и использовать стерео микроскоп, чтобы проверить поверхность вафель для любых фоторезистаных остатков. Если можно увидеть остатки фоторезиста, верните вафельку разработчику.
  9. Reflow положительный photoresist, поместив пластины на горячей пластине, установленной на 110 градусов по Цельсию в течение 25 минут. Этот процесс приведет к округленной функции, а также annealing любые трещины, которые могут появиться в процессе изготовления. Приступить к силанизации, как описано в шаге 1.17.
  10. Удалите вторую кремниевую пластину из духовки, что позволит ей остыть до комнатной температуры, прежде чем приступить к спиновому покрытию. Применить 5 мл SU8 3050 photoresist к центру.
  11. Для получения объекта высотой 30 мкм нанесите следующий протокол вращения: вращайте 20 с при 500 об/мин (110 об/мин/с), увеличив скорость вращения до 4000 об/мин (330 об/мин/с) и удерживайте здесь 42 с, и замедляйте до 0 об/мин при замедлении 200 об/мин/с. микроволокна ткани тщательно удалить любой бисообразной кромки, которые могут иметь место во время спинпокрытия покрытия.
  12. Мягкая выпечка с использованием двух отдельных горячих пластин (65 градусов по Цельсию и 95 градусов по Цельсию) следующим образом: позвольте пластине сидеть при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 30 с. Затем перенесите вафельку на горячую пластину 95 градусов по Цельсию и дайте ей отдохнуть здесь в течение 14 минут, прежде чем вернуть вафу на горячую плиту 65 градусов по Цельсию еще на 30 с. Снимите вафу с горячей плиты и дайте ей остыть до комнатной температуры.
  13. Измерьте интенсивность ультрафиолетовой лампы перед воздействием и используйте ее для определения продолжительности экспозиции, необходимой для достижения общей дозы экспозиции 260 мДж/см2. Поместите фотомаску (эмульсионную сторону вниз) на фоторезисточенную пленку и поместите пластину под ультрафиолетовым источником света. Выставляйте с помощью ультрафиолетовой лампы до достижения общей экспозиции 260 мДж/см2.
  14. После экспозиции выпекать с помощью двух горячих пластин (65 градусов по Цельсию и 95 градусов по Цельсию) следующим образом: позволяют пластине сидеть при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 60 с, прежде чем переносить пластину на горячую плиту 95 градусов по Цельсию и оставить ее здесь на 4,5 мин. Верните в 65 градусов по Цельсию еще на 30 с для завершения послеэкспозиции испечь.
  15. Разрешить для охлаждения до комнатной температуры на стопку микроволоконных тканей. Разработка, передавая его в чашку Петри заполнены mrDev-600 фоторазработчик, чтобы начать процесс разработки. Разработка ускоряется при выполнении на скамейке шейкера и вся пластина погружается в разработчика.
  16. Промыть с изопропанол и использовать стерео микроскоп, чтобы проверить поверхность пластины для любого фоторезиста остатков. Если можно увидеть остатки фоторезиста, верните вафельку разработчику. После полной разработки, жесткий испечь photoresist, поместив пластины на горячей пластине набор на 150 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
  17. Силанизировать обе пластины, чтобы предотвратить сливки PDMS во время мягко-литографии процессов. Для выполнения силанизации, пипетка 2-3 капли (за вафлю) силана в небольшой стеклянный флакон. Поместите этот флакон вместе с вафлями в обезболиватель и потяните вакуум в течение 5-10 мин. Запечатайте осевку и оставьте под вакуумом на срок от 12 до 16 ч.
    ВНИМАНИЕ: Силан токсичен и не должен вдыхаться. Позаботьтесь, чтобы работать в дым капот и носить нитриловые перчатки при обработке silane. Это включает в себя размещение вакуумного насоса в дым капот при потянув вакуум на desiccator.
  18. Освободите вакуум от обезвращилира и удалите иланизированные. Промыть водой и использовать пар N2, чтобы высушить. В этот момент могут быть помещены на хранение до тех пор, пока требуется.

2. Изготовление микрожидкости устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий процесс литографии, используемый для изготовления PDMS на основе многослойных микрофлюидных устройств могут быть разделены на три отдельных шага: 1) PDMS подготовки как потока и управления слоев, 2) выравнивание и склеивание двух слоев PDMS, 3) завершение работы устройства.

  1. Подготовка PDMS
    1. Подготовьте два решения-прекурсор PDMS, объединив базовые и лечебные агенты в пластиковый стакан и используя перемешивание стержня, чтобы перемешать два компонента до полного смешивания. Контрольный слой требует 20 г базового агента и 1 г лечебного средства (соотношение 20:1). Слой потока требует 40 г базового агента и 8 г лечебного средства (соотношение 5:1). Дега решения в desiccator.
    2. Поместите слоя потока в чашку Петри и залить 5:1 соотношение PDMS смеси над вафлей. Дега PDMS в течение 30 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.
    3. Спин пальто контрольный слой пластины (подготовлены с использованием отрицательных SU8 3050photoresist) с 20:1 соотношение PDMS. Налейте 5-10 мл PDMS на центр и запустить следующий протокол спина (сохранить оставшиеся над PDMS для последующего использования): спина при 500 об/мин для 15 s (100rpm/s), увеличить скорость спина до 1450 об/мин (300 об/мин /с) для 45 s , а затем замедлять до 0 об/мин (200 об/мин/с).
    4. Чтобы обеспечить однородную толщину пленки PDMS, поместите с покрытием PDMS на ровную поверхность в закрытой чашке Петри (во избежание загрязнения пыли). Пусть сидеть в течение 30 минут.
    5. Снимите слой потока с дешикатора и поместите как поток, так и контрольные слои в духовку (80 градусов по Цельсию). Лечить оба слоя в течение 28-30 мин и удалить, когда PDMS является достаточно податливым, чтобы манипулировать, оставаясь слегка липким. Немедленно приступайте к процессу выравнивания.
  2. Выравнивание и склеивание
    1. С помощью скальпеля, удалить каждое из четырех устройств из PDMS на слоя потока. После удаления слоя PDMS из кремниевой пластины, немедленно покрыть функцию стороны скотчем, чтобы избежать загрязнения частицами пыли.
    2. Грубо выровняйте блоки слоя потока на контрольном слое глазом, помещая часть элемента устройства в контакт с контрольным слоем PDMS. Впоследствии, внести тонкие коррективы в положение каждого из блоков слоя потока, чтобы выровнять каналы слоя потока с каналами контрольного слоя, используя стерео микроскоп, чтобы помочь в визуализации корректировок.
    3. Применяйте давление, чтобы удалить воздушные карманы между двумя слоями PDMS. Налейте оставшееся соотношение 20:1 PDMS, сохраненное ранее вокруг выровненных блоков слоя потока. Поместите 100 г весов на каждом из устройств, чтобы обеспечить достаточный контакт в процессе склеивания.
    4. Верните выровненные устройства (включая весы) в духовку 80 градусов по Цельсию и оставьте их на связи, по крайней мере 1,5 ч и не более 6 ч.
  3. Завершение устройства
    1. Снимите вафу из духовки и извлеките каждое из отдельных устройств из контрольного слоя, покрывая особенность каждой стороны устройства скотчем.
    2. Итеративно, пробить одно отверстие для каждого из 9 входов слоя потока, 24 канала управления слоем, и выход слоя одного потока каждого устройства. Удар устройства с функцией стороны вверх, используя камеру, чтобы обеспечить отверстия пробиты в пределах предела функции.
    3. Для каждого устройства очистите один микроскоп с изопропанолом и ацетоном и высушите слайды под потоком N2. Впоследствии поместите слайды микроскопа на горячую пластину, установленную до 150 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
    4. Используйте кислородную плазму пепел, чтобы связать устройства PDMS со стеклянными горками, применяя силу пепла 50 Вт в течение 45 с. Убедитесь, что особенность стороны устройства сталкивается вверх, когда пепел. После завершения, поместите устройство особенность стороны вниз на стеклянной слайд, применяя давление, чтобы удалить захваченных газа между поверхностями.
    5. Поместите кабальные устройства на горячую пластину, установленную на 110 градусов по Цельсию на 1 ч. Весы могут быть размещены на верхней части устройств для улучшения сливов устройства.

3. Установка оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения контроля над микрофлюидными чипами, многочисленные части оборудования должны быть установлены и связаны друг с другом. Требуются три различные группы оборудования: 1) Пневматическая система управления для каналов управления, 2) регулятор пневматического давления для контроля потока реагентов реакции внутри устройства и 3) система охлаждения для охлаждения раствора реакции IVTT до инъекции в микрофлюидное устройство. Обзор установки оборудования представлен на рисунке 1. Следует отметить, что представленные здесь протоколы пытаются быть как можно более общими, однако на них ссылаются определенные единицы оборудования, используемые в ходе наших исследований. Все оборудование может быть заменено альтернативами, способными выполнять одну и ту же функцию. В таких случаях протоколы здесь могут быть использованы для наметки общих шагов, необходимых для настройки системы, и требований каждого из компонентов. Альтернативные аппаратные установки представлены Brower et al.48 и White and Streets49.

  1. Пневматическая система управления (см. рисунок 2)
    1. Используя протокол производителей, установите соединение TCP между контроллером fieldbus и рабочей станцией пользователя. Используйте программное обеспечение управления (предоставлено в качестве дополнительных файлов) для составления команд MODBUS, которые отправляются через подключение TCP к контроллеру, и активировать соленоидные клапаны.
    2. Расширьте контроллер fieldbus с восемью 4-канальными цифровыми выходными модулями, по одному для каждого соленоидного клапана, используемого. Каждый соленоидный клапан председательствует над соединительной штырь. Подключите положительный провод к одному из четырех положительных выходов на одном из цифровых выходных модулей при подключении отрицательного провода к одному из наземных портов цифровых выходных модулей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы система работала правильно, соленоиды должны быть подключены систематически, при этом первый соленоид подключен к первому выходу порта, второй соленоид ко второму выходу порта и так далее. В нашей системе используются два клапанных массива с 8 и 22 соленоидными клапанами соответственно. Выходные порты 1-8 подключаются к 8-клапанной решетке, а выходные порты 9-30 подключаются к 22-клапанной решетке.
    3. Подключите обе клапанные массивы к источнику сжатого воздуха с помощью 1/4"трубки. Используйте регуляторы давления, чтобы установить давление 22-клапанного массива до 3 бар, а 8-клапанный массив до 1 бар.
  2. Регулирование давления потока (см. рисунок 3)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для потока жидкостей через слой потока микрофлюидного устройства используется коммерчески доступный регулятор давления 4-портового давления. Выходное давление каждого порта регулируется с помощью программного обеспечения, предоставляемого контроллером давления. Подключите регулятор давления к компьютеру с помощью поставляемого USB-разъема.
    1. Подключите регулятор давления к источнику сжатого воздуха, гарантируя, что поставляемое давление не превысит максимальнодопустимого давления, разрешенного регулятором.
    2. Подключите самца Luer к 3/32 " барб-разъем для каждой из четырех женских Luer блокировки выходных портов регулятора давления. Подключите длину мягких труб (OD: 3 мм, ID: 1 мм, L: 10 см) к колючке.
    3. Подключите второй самец Luer к 3/32 " колючий разъем на открытом конце мягкой трубки и прикрепите это к жидкости водоема разъем портов.
    4. Используйте предоставленное программное обеспечение для установки желаемого давления каждой розетки регулятора потока, прессования реагентов, хранящихся в резервуарах, чтобы привести к потоку реагентов в микрофлюидное устройство. Подключение резервуаров к микрофлюидическому устройству будет обсуждаться в разделе 4.2.
  3. Установка охлаждения Off-Chip (см. Рисунок 4)
    1. Используйте трубки из ПВХ (OD: 10 мм, ID: 6 мм) для подключения системы водяного охлаждения к блоку воды с использованием компрессионной фитинги. Заполните резервуар жидкости системы водяного охлаждения охлаждающей жидкостью и осторожно наклоните устройство, чтобы вытеснить любой захваченный воздух, непрерывно добавляя охлаждающую жидкость в резервуар, чтобы убедиться, что он остается полным. Когда весь газ удаляется из системы, заполните резервуар примерно до 90-95% от его максимального объема.
    2. Катушка PTFE трубки (OD: 0.042 ", ID: 0.022") на холодное лицо элемента Peltier и закрепите это с лентой. Убедитесь, что один конец трубки PTFE подключен к резервуарам системы контроля давления слоя потока (как описано в разделе 4.3). Другой конец трубки PTFE должен выступать не более чем на 1 см от поверхности Пелтиера. Вставьте трубку длиной 5 – 10 см (OD: 0.794 мм, ID: 0.127 мм) в выступающий конец трубки PTFE. Заполнение труб и подключение к микрофлюидного устройства дополнительно объясняется в разделе 4.3.
    3. Поместите горячее лицо элемента Пельтье на холодную пластину водяного блока, применяя достаточное тепловое соединение на два лица. Убедитесь, что труба, элемент Peltier и охлаждающий блок находятся в непосредственном контакте друг с другом во все времена.
    4. Подключите элемент Peltier к контроллеру температуры (через серийный разъем шины), так что напряжение, поставляемое в Peltier, может регулироваться. Надежно поместите термистор на поверхность Пельтье, соединяя выход с температурным контроллером. После включения охладителя воды адаптируйте напряжение, поставляемое в Пельтье, пока температура не станет стабильной на уровне 4 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этой установки, температура Пельтье контролируется вручную путем адаптации поставляемого напряжения, в то время как термистор служит только для мониторинга температуры.

4. Подготовка эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом эксперимента, микрофлюидное устройство должно быть подготовлено, и реакционные реагенты должны быть вставлены в правильную трубку для инъекций в устройство. В этом разделе будут обсуждаться: 1) Подключение труб канала управления к устройству, 2) Подключение неохлажденных реагентов притока к устройству и 3) подключение охлажденных реагентов притока к устройству.

  1. Подключение трубканала канала управления
    1. Для каждого из контрольных каналов микрофлюидного устройства вырежьте длину труб (OD: 0.06", ID: 0.02). С одной стороны вставьте штифт 23 G, 1/2 " Luer заглушки, а на другой вставить нержавеющей стали подключения штифт (OD: 0,65 мм, ID: 0,35 мм, L: 8 мм).
    2. Подключите заглушку Luer к мужскому Луеру до 3/32"колючей нейлоновой разъем. Вставьте колючку разъема в длину полиуретановых труб (OD: 4 мм, ID: 2,5 мм). Вставьте этот полиуретановые трубки непосредственно в один из соленоидных клапанов.
    3. Прикрепите 23 G, 1/2 "Luer заглушки к шприцу и вставьте это в короткий (3-4 см) кусок трубки (OD: 0,06", ID: 0,02"). Поместите открытый конец этой трубки в резервуар ультрачистой воды и заполните шприц ультрачистой водой.
    4. Номер каждого канала управления микрофлюидного устройства, как показано на рисунке 5. Для каждого канала (за исключением каналов управления от 1 до 3, которые не заполнены водой), найти соответствующие трубки (подключены к соленоидных клапанов) и вставить металлический штифт в открытый конец трубки, прикрепленной к шприцу. Вводят воду в трубу канала управления до тех пор, пока половина длины не будет заполнена.
    5. Отключите трубку от шприца и вставьте штифт разъема из нержавеющей стали в соответствующее отверстие микрофлюидного устройства. Повторите для всех каналов управления.
    6. Используйте интерфейс управления, чтобы открыть все соленоидные клапаны. Это будет давление жидкости в трубах канала управления, заставляя его в микрофлюидное устройство и закрытие всех мембранных клапанов внутри устройства. Пример открытых и закрытых мембран внутри устройства приведен на рисунке 6.
  2. Подключение неохлажденных реагентов к устройству
    1. Для каждого из неохлажденных реагентов вырежьте длину труб (OD: 0.06", ID: 0.02) для подключения выхода резервуара к впускам микрожидкости устройства.
    2. Возьмите один конец трубки и вставьте это в резервуар, гарантируя, что трубка достигает основания резервуара. Трубная розетка резервуара должна быть затянута таким образом, чтобы достигается герметичное уплотнение. Вставьте штифт соединения из нержавеющей стали (OD: 0.65 мм, ID: 0.35 мм, L: 8 мм) в открытый конец трубки.
    3. Прикрепите 23 G, 1/2 "Luer заглушки в конце небольшой (1 мл) шприц. Добавьте короткую длину труб (OD: 0.06", ID: 0.02) к заглушке Luer. Разместив конец трубки в нужный раствор реагента, заполните шприц реагентом.
    4. Вставьте штифт разъема из нержавеющей стали в полиуретановые трубки, подключенные к шприцу, и заполните трубку реагентом. При использовании небольших объемов реакции реагент не войдет в резервуар, а сам труба будет выступать в качестве резервуара. Отключите шприц и вставьте штифт разъема в одно из отверстий впускного отверстия впускного слоя микрофлюидного устройства.
    5. Применяйте давление на каждый из резервуаров, используя программное обеспечение регулятора давления, чтобы заставить реагенты в микрофлюидное устройство.
  3. Подключение охлажденных жидкостей к микрофлюидного устройству
    1. Убедитесь, что охладитель воды и элемент Peltier были включены, с температурой поверхности Пельтье установить до 4 градусов по Цельсию. Установите установку охлаждения как можно ближе к микрофлюидного устройства, снижая неохлажденный объем между Пельтье и входе устройства.
    2. Соедините открытый конец трубки PTFE к трубам, соединенным с одним из резервуаров жидкости (как описано в разделе 4.2) с помощью штифта разъема из нержавеющей стали (OD: 0,65 мм, ID: 0,35 мм, L: 8 мм).
    3. Подключите небольшой шприц (1 мл) к заглушке Luer (23 G, 1/2) с короткой длиной труб (OD: 0.06", ID: 0.02") прилагается к концу. Заполните шприц с to-be-охлажденный реагент (здесь, решение реакции IVTT).
    4. Подключите трубку PEEK к шприцу через соединительную трубку и нанесите постоянное давление на шприц, заставляя реагент через трубку PEEK и в трубку PTFE. Отключите трубку PEEK от шприца и вставьте его непосредственно в один из входов канала потока микрофлюидного устройства. При применении давления с помощью программного обеспечения регулятора давления охлажденный реагент будет принудительно в микрофлюидное устройство.

5. Эксперименты

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением экспериментов все аппаратные и трубные соединения, детализированные в протоколах разделов 3 и 4, должны быть завершены, и все реагенты должны быть подключены к устройству. Экспериментальная процедура может быть разделена на четыре отдельные части: 1) Загрузка микрофлюидного устройства, 2) Подготовка микроскопа, 3) Калибровка устройства и 4) Выполнение эксперимента. Пользовательский виртуальный интерфейс управления (см. Рисунок 7),используемый на протяжении всего исследования, предоставляется в качестве дополнительного ресурса через список материалов)

  1. Загрузка микрофлюидного устройства
    1. Поместите микрофлюидное устройство, со всеми трубами управления и слоя потока, прикрепленными к стадии микроскопа, и закройте любые отверстия на инкубаторе. Установите температуру окружающей среды инкубатора до 29 градусов по Цельсию. Убедитесь, что система охлаждения была включена и установлена на 4 градуса Цельсия до начала эксперимента.
    2. Убедитесь, что все каналы потока и управления находятся под давлением. Установите давление контрольных каналов 1-3 на 1 бар, и давление каналов управления 9-29 в 3 бара. Реагенты требуют давления от 20 до 100 мбар для нанесения на резервуары жидкости с помощью программного обеспечения регулятора давления.
    3. Удалить воздух из микрофлюидного устройства с помощью одного из реагентов. Закрыть розетку устройства (надавите на канал управления 29) и одновременно разгерметизировать каналы управления 1-3 и 15-28. Затем выборочно разгерметизируют каналы управления мультиплексером, чтобы выбранный реагент влился в устройство. Используйте микроскоп для мониторинга удаления воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если реагенты не загружаются в устройство правильно, или что пузырьки воздуха не удаляются, давление может быть увеличено до 350 мбар.
    4. Убедитесь, что все реагенты текут правильно, без введения воздуха - с использованием функции флеша в программном обеспечении управления. Мониторинг потока жидкости можно упростить, сначала загрузив фторофор и мониторинг его смещения отдельными реагентами.
  2. Подготовка микроскопа
    1. Используя микроскоп, найдите любые точки интереса (достаточно одной точки в каждом реакторе) в микрофлюидном устройстве и храните его координаты. Эти точки будут изображены во время калибровки и экспериментальных процессов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время калибровки и экспериментальных процедур, включенных в программное обеспечение управления, микроскопу поручено периодически захватывать изображения в ранее хранимых координатах. Для достижения этой цели программное обеспечение для управления общается с программным обеспечением микроскопа, информируя его для записи новых изображений. Эта коммуникация уникальна для каждой установки микроскопа, и как таковая эта функциональность была изменена в рамках предоставленного программного интерфейса. Предоставляется манекен исполняемый, который может быть изменен конечным пользователем для совместимости с их собственной системой микроскопа.
  3. Калибровка микрофлюидного устройства
    1. Определить объем жидкости, вытесненный из каждого реактора во время одного шага притока (последовательность насоса, обеспечиваемая перистальтически актуационными каналами управления 15-17, состоящими из 6 команд MODBUS, выполненных последовательно), путем выполнения протокола калибровки в пакете программного обеспечения.
    2. Установите следующие поля данных в программном обеспечении управления: Elution Buffer Channel, Fluorophore Channel, Количество циклов разбавления (по умолчанию 10 разбавлений), Количество шагов потока (по умолчанию 15 шагов), Количество циклов смешивания (по умолчанию 4 цикла), и время между циклами смешивания (по умолчанию 0 секунд). Инициировать калибровку, нажав Выполните Эксперимент калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе калибровки все реакторы заполнены фторфором и изображения регистрируются. Впоследствии выполняется ряд разбавлений, когда элуент замеривается в реакторах (на основе установленного количества шагов притока), тем самым вытесняя фторофор. После тщательного смешивания, новые изображения принимаются. Этот процесс повторяется для установленного числа циклов разбавления.
    3. После завершения калибровки выполните действия, представленные программным обеспечением управления, завершайте анализ эксперимента по калибровке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ предоставит пользователям коэффициент обновления для каждого реактора на основе снижения флуоресценции, зарегистрированного во время каждого цикла разбавления. Это значение указывает на долю объема реактора, смещенную набором Количество шагов притока. В свою очередь, это значение будет использоваться в ходе экспериментов, чтобы определить, сколько шагов притока требуется для вытеснения конкретного объема реактора.
  4. Выполнение эксперимента
    1. Установите необходимые значения для желаемого эксперимента в виртуальном интерфейсе управления. Критически важным является обновление Фракция «%», которая определяет объем реактора, смещенный за экспериментальный цикл и должен быть установлен между 15 и 40%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретный экспериментальный протокол определит, какие поля интерфейса управления должны быть установлены до начала эксперимента. Для адаптации интерфейса управления для новых экспериментов потребуется некоторое незначительное кодирование.
    2. Инициировать экспериментальный протокол, нажав кнопку Perform Experiment в интерфейсе управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Без изменений, при условии, программное обеспечение инициирует простое выражение белка. Реакторы 1 и 8 используются в качестве элементов управления, в то время как реакторы 2-7 дома идентичных экспериментов. Здесь 75% объема реактора состоит из раствора IVTT, а 25% - либо ультрачистая вода, либо линейное решение ДНК 2,5 нм. Разбавления происходят каждые 15 минут, при этом 30% объема реактора вытесняется на разбавление. Изображения записываются в конце каждого цикла разбавления.

6. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарии были предоставлены для анализа изображений (см. дополнительные файлы или таблицу материалов),использование пакета анализа 'bfopen', который необходим для рассмотрения '.nd2' файлов (предоставленных нашими настройка микроскопа).

  1. Выполнить анализ скрипта 'калибровкиScript.m' и однажды побудило выбрать желаемый '.nd2' файл. Будет показано одно изображение реактора, с помощью которого можно определить правильную интенсивность изображения. Используйте ползунок для оптимизации интенсивности изображения таким образом, чтобы четко видны края микрофлюидного канала.
  2. Будет показано изображение реактора. В рамках этого изображения выберите область внутри реакторного канала, интенсивность которого должна быть определена интенсивностьфлюоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность флуоресценции каждого реактора, для каждого записанного изображения будет определяться с результатами, отображаемыми в простом сюжете, что позволяет визуализировать результаты.

Representative Results

Чтобы продемонстрировать эффективность многослойной микрофлюидной платформы для проведения экспериментов IVTT, описанная установка была использована для выражения белка deGFP. Эксперимент проводился в коммерчески доступной реакционной смеси30 ИВТТ, включающей все необходимые компоненты транскрипции и перевода, дополненную реакционными субстратамами и шаблонами ДНК. Эксперименты проводились при температуре 29 градусов по Цельсию; температура оказалась оптимальной для экспрессии IVTT белков.

Микрофлюидическое устройство обладает девятью уникальными входами, четыре из которых были использованы в ходе этого эксперимента. Первый содержал коммерчески полученную реакционную смесь IVTT. Смесь реакции IVTT вмещает все компоненты, необходимые для успешного выражения белков, однако, очищенная ГамС была добавлена в реакционную смесь - при конечной концентрации 1,3 мкм - до загрузки в микрофлюидное устройство. Добавление белка GamS служит для минимизации деградации линейных видов ДНК при проведении экспериментов. Важно отметить, что смесь IVTT была введена в трубку политетрафторэтилена (ПТФЕ) на элементе Пельтье с температурой поверхности 4 градусов по Цельсию, чтобы охладить раствор перед впрыском его в микрофлюидное устройство; предотвращение деградации реакционного раствора до его использования. Микро-борная политетерная кетон (PEEK) трубка была использована для подключения трубки PTFE, оставляя поверхность элемента Пельтье с микрофлюидным устройством, уменьшая объем реакционной смеси IVTT, не охлаждающейся. Второй раствор, вставленный в устройство, содержал линейный шаблон ДНК кодирования для deGFP - растворенного в ультрачистой воде - в концентрации 10 нм. Третье решение, ультрачистая вода, служило нескольким целям во время экспериментальных процедур. В первую очередь, ультрачистая вода была использована для обеспечения того, чтобы смещенный объем на разбавление был равен для всех реакторов, действуя в качестве замены ДНК в контрольных реакциях. Кроме того, ультрачистая вода также использовалась для разбавления фторофора во время калибровки устройства и для промывки мертвого объема устройства при переключении между реагентами. Окончательным решением, вставленным в устройство, был очищенный раствор FITC-dextran (25 мкм), необходимый для выполнения первоначальной калибровки устройства. Растворы ДНК, воды и фторофора были введены в трубку (0,02 " ID, 0,06" OD), которые впоследствии могут быть вставлены в один из каналов притока микрофлюидного устройства в соответствии с разделом 4.2 протоколов. Таким образом, эти решения хранились при 29 градусах Цельсия для всего эксперимента.

Активация каналов управления микрофлюидным устройством достигается с помощью программного обеспечения для пользовательского управления, где каждый из каналов управления может быть индивидуально настроен. Выполнение длительных реакций IVTT не может быть достигнуто с помощью этого ручного процесса и требует использования автоматизированных протоколов, включенных в программное обеспечение управления. При подготовке микрофлюидного устройства к экспериментам аналогичные автоматизированные протоколы могут быть использованы для выполнения ряда полезных процессов: промывка прибора мертвым объемом с новым реагентом, смешивание реагентов внутри кольцевого реактора и загрузка новый реагент в реактор, вытесняя при этом равный объем текущего решения. Кроме того, доступны два сложных процесса: проведение калибровки устройства и выполнение длительного безклеточного белкового экспрессии. Все вышеупомянутые процессы могут быть легко выполнены из основного интерфейса, наряду с возможностью настройки нескольких параметров для изменения определенных параметров процесса, таких как канал притока, объем притока и продолжительность смешивания.

Из-за колебаний давления и несовершенства при изготовлении микрофлюидных устройств объем жидкости, смещенной в течение одного цикла инъекций, может варьироваться в зависимости от приборов. Таким образом, до проведения экспериментов IVTT, перемещенный объем реактора на цикл инъекций(Освежить Фракция) был определен. Эта калибровка требует заполнения всех восьми реакторов флуоресцентным эталонным раствором. В этом случае был использован очищенный раствор FITC-dextran (25 км.). Впоследствии реакторы разбавляют 10 раз ультрачистой водой. Путем измерения снижения флуоресценции на цикл разбавления для каждого реактора, объем жидкости, смещенной в течение одного цикла инъекций, был определен. В программном обеспечении управления это значение (коэффициент обновления)было записано для использования во время эксперимента IVTT. Важно отметить различия в скорости потока по всему устройству, а также расхождения в отдельных объемах реактора, коэффициент обновления определяется и хранится для каждого отдельного реактора. Последовательность заполнения и разбавления реакторов осуществлялась автоматически с использованием программы «Протекация», которая является частью программного обеспечения для управления. Результаты калибровоза показаны на рисунке 8.

Самый сложный запрограммированный процесс выполняет длительный эксперимент IVTT, позволяя пользователям инициировать эксперимент и впоследствии позволить ему работать без присмотра до завершения. На протяжении всего эксперимента реакторы 1 и 5 использовались в качестве заготовок, при этом во время разбавления в реакторы добавлялись только вода. Реакторы 2 и 6 использовались в качестве отрицательного контроля и содержали только раствор реакции IVTT и ультрачистую воду. Остальные реакторы (3, 4, 7 и 8) содержали решения реакции IVTT и 2,5 нм линейного кодирования ДНК для гена deGFP. Инициализация реакторов достигается за счет полного заполнения всех реакторов (за исключением 1 и 5) раствором реакции IVTT, до того как 25% объема реактора было смещено ультрачистой водой. После этого была начата периодическая инъекция реагентов в реакторы. Эксперимент проводился таким образом, что каждые 14,7 минутвы в реакторы вводились новые реагенты, при этом 30% объема реактора вытеснялось в течение каждого цикла разбавления. Состав каждой инъекции был таков, что 75% впрыскиваемых жидкостей состояло из свежего раствора IVTT, в то время как остальные 25% состояли либо из ДНК, либо из ультрачистой воды. После каждой инъекции новых реагентов реакторы постоянно смешивались, после чего с помощью микроскопа было записано флуоресценционное изображение каждого реактора. Впоследствии реакции было разрешено непрерывно работать в течение 68 циклов, в результате чего экспериментальная продолжительность 16,5 ч. Результаты этого эксперимента приведены на рисунке 9.

При проведении длительных экспериментов IVTT, Есть две основные причины для отказа реакции; введение воздуха в микрофлюидное устройство или деградация раствора реакции IVTT. Возникновение воздуха в микрофлюидном устройстве чаще всего является прямым результатом небольших пузырьков воздуха, существующих в растворах притока, которые впоследствии вводятся в микрофлюидное устройство. При входе в устройство присутствие воздуха тормозит надлежащий поток жидкостей, при этом реакции уже не обновляются, что приводит к образованию пакетных реакций внутри реакторных колец. В некоторых случаях воздух медленно удаляется из устройства путем повторного промывки реагентов, после чего реакция продолжается по назначению (как показано на рисунке 9). В других случаях воздух остается в ловушке и может быть удален только путем прерывания эксперимента и последующего применения непрерывного (высокого) давления к слою потока микрофлюидного устройства, аналогично процессу заполнения, описанному в разделе 5.1 протоколов. Во время наших экспериментов клеточный лисат хранится в трубках PTFE на элементе Пельтье, охлажденный до 4 градусов по Цельсию. Обе меры помогают ограничить деградацию раствора реакции IVTT с течением времени, при этом инертные трубки PTFE обеспечивают ограниченное взаимодействие между трубками и раствором реакции, а также холодными температурами, сохраняющими функциональные (био) молекулярные компоненты, необходимые для выполнения IVTT. Если произойдет деградация реакционного раствора - в результате недостаточного охлаждения или нежелательных взаимодействий между раствором реакции и средой хранения - то это будет проявляться экспериментально как постепенное сокращение белка выражение с течением времени. После деградировать, решение реакции IVTT не может быть восстановлено и новый эксперимент должен быть подготовлен.

Figure 1
Рисунок 1. Установка оборудования, необходимая для выполнения непрерывных реакций IVTT. A) Схема аппаратной установки. B) Фотография установки, используемой во всей этой рукописи. Реализация многослойного микрофлюидного устройства для непрерывной реакции IVTT требует обширной аппаратной установки для регулирования давления потока, активации каналов управления, тепловых и холодных реакций и реагентов, хранения жидкостей и изображения устройства во время Эксперименты. Эксперименты проводятся при температуре 30 градусов По Цельсию, что достигается путем размещения микроскопа в инкубаторе, установленном до такой температуры. Чтобы предотвратить ухудшение раствора реакции IVTT, он хранится в трубках PTFE, сверкающих по холодному лицу элемента Peltier. Температура элемента Peltier установлена до 4 градусов цельсия, при этом для поддержания этой температуры используется охладитель воды и водяной блок. Реагенты, не требующие охлаждения, хранятся в резервуарах жидкости за пределами микроскопа инкубатора. Постоянное давление на эти резервуары применяется компьютерным регулятором давления. Таким образом, жидкости вынуждены через розетовые трубки резервуаров, которые подключаются непосредственно к каналам притока микрофлюидного устройства. Каждый из каналов управления микрофлюидным устройством подключен к пневматическому клапану. Весь клапанный массив находится под постоянным давлением. Открытие клапана позволяет герметичным жидкости в трубах, соединяющих пневматический клапан с каналом управления микрофлюидным устройством, открывая таким образом и закрывая мембраны PDMS, найденные в микрофлюидном устройстве. Пневматические клапаны открываются и закрываются через пользовательский интерфейс, который командует контроллером fieldbus (не показан) для открытия и закрытия конкретных пневматических клапанов. Рисунок адаптированы из Yelleswarapu и др.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2. Обзор установки пневматического клапана и подключения канала управления. 8-клапанный массив показан с тремя соединениями каналов управления, установленными на клапанах 1, 2 и 3. Сжатый воздух может поставляться в клапанный массив через 1/4 "трубки. Для активации каналов управления используются два давления: 1 бар для каналов управления более низким давлением (1, 2 и 3) и 3 бара для каналов контроля более высокого давления (с 9 до 30, не показанных здесь). Трубки могут быть заполнены ультрачистой водой и вставлены в один из входов канала управления с помощью штифта разъема из нержавеющей стали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3. Обзор регулятора давления коммерческого потока и системы резервуаров. Коммерчески доступный регулятор давления используется для впрыска жидкостей в слой потока многослойного микрофлюидного устройства. Подключение контроллера давления к компьютеру позволяет модуляции давления, используемого для выполнения инъекций жидкости. Реагенты могут храниться в резервуаре жидкости, который непосредственно связан с регулятором давления. Применение давления в водохранилище вынуждает жидкость выходить из резервуара через розетовые трубы. Эта розетка трубки могут быть подключены непосредственно к одному из входов жидкости микрофлюидного устройства с помощью штифта разъема из нержавеющей стали. В случае, если объем реагента не может достичь резервуара жидкости, выход трубки выступает в качестве резервуара для реагента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4. Обзор системы охлаждения, используемой для охлаждения реагентов реакции. (Слева) Изолированная установка охлаждения и (справа) Установка охлаждения, помещенная в микроскоп и подключенная к микрофлюидного устройству. Элемент Peltier используется для охлаждения раствора реакции IVTT перед инъекцией в микрофлюидное устройство. Реагент хранится в трубах PTFE, сверкающих над холодным лицом элемента Peltier. Длина труб PEEK используется для передачи охлажденных жидкостей на микрофлюидное устройство, при этом малый внутренний диаметр (0.005) минимизирует объем реагента, который больше не охлаждается. Наряду с свернутыми трубками PTFE, размещается термистор, позволяющий осуществлять мониторинг температуры в режиме реального времени на поверхности элемента Peltier. Напряжение, наносимое на Пельтье, устанавливается таким образом, что температура поверхности Пельтье остается между 0 и 4 градусами Цельсия. Для удаления избыточного тепла, производимого элементом Peltier, горячее лицо Пельтье помещается против охлажденных водой блока, с добавлением силиконовой свободной тепловой топором смазки обеспечения оптимальной передачи тепла между двумя лицами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5. Обзор конструкции микрофлюидного устройства. Микрофлюидный реактор потока для непрерывных реакций IVTT состоит из восьми реакторных колец, каждое из которых имеет объем 10,7 нл. Девять входов обеспечивают приток в устройство девяти уникальных реакционных растворов. 24 контрольных канала регулируют поток жидкостей внутри устройства. Каналы управления с 9 по 14 образуют мультиплекс. Эти каналы управления должны быть под давлением в любое время, чтобы ингибировать поток жидкости в устройство. Разгерметизация двух контрольных каналов одновременно позволяет приток одного реагента. Каналы управления 15, 16 и 17 используются для перистальтно перекачки реагентов в устройство контролируемым образом. Каналы управления от 18 до 25 каждый контролируют впуск одного из восьми реакторов, найденных в устройстве. Канал управления 26 может закрыть канал флеша, тем самым заставляя жидкость в реакторы. Канал управления 27 помогает в однородной заполнении реакторов. Каналы управления 28 и 29 регулируют кольцевые реакторные розетки и единственную розетку устройства соответственно. Наконец, каналы управления 1, 2 и 3 используются для перистальтно перекачки жидкости в кольцевых реакторах, что приводит к смешиванию реагентов. Дизайн этого микрофлюидного устройства и фигура адаптированы из Neiderholtmeyer и др.29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6. Мембрановый клапан в микрофлюидном устройстве. A) Поток канала в микрофлюидном устройстве. На заднем плане видны два канала управления. Эти каналы не находятся под давлением и как таковые клапаны открыты (жидкость может течь). B) Два канала управления, пересекающие каналы слоя потока, были под давлением, закрывая клапаны (т.е. поток жидкости затруднен). При давлении каналов управления тонкая мембрана PDMS, разделяющая каналы потока и контрольного слоя, отклоняется вверх (контрольный слой лежит под слоем потока), что закрывает канал слоя потока. Округление канала слоя потока имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы отклоняемый мембраны полностью закрывает канал потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7. Пользовательский интерфейс, используемый для управления микрофлюидным устройством. На протяжении всего этого исследования, пользовательский интерфейс управления был использован для контроля потока жидкости в микрофлюидных устройств. Интерфейс позволяет пользователям индивидуально активировать каждый из каналов управления (число 1-3 и 9-29), или выполнять сложные протоколы, что приводит к промывке и загрузке реагентов, калибровке микрожидкости и исполнению Эксперименты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8. Результаты калибровоза. Во время калибровоспособного эксперимента реакторы заполняются фторором (25 мкм FITC-Dextran), после чего регистрируется интенсивность флуоресценции. Впоследствии, серия разбавлений следовать, где определенное количество шагов притока (15) используются для введения ультрачистой воды в реакторы. После каждого разбавления реагенты смешиваются и измеряется флуоресценция. Снижение интенсивности флуоресценции на разбавление показывает объем реакторного кольца, смещенного для установленного количества шагов притока; значение, названное Коэффициентом обновления. A) Средняя интенсивность и стандартное отклонение всех восьми реакторов показаны красным цветом, при этом индивидуальные следы интенсивности показаны серым цветом. B) Среднее коэффициент обновления и стандартное отклонение показано для каждого шага разбавления красным цветом. Индивидуальные коэффициенты обновления каждого отдельного реактора показаны серым цветом. Видно, что семь из восьми реакторов показывают очень похожее поведение, однако один реактор показывает колебания в коэффициенте обновления после седьмого цикла разбавления. Это подчеркивает необходимость уникальных коэффициентов обновления для каждого из реакторов, в отличие от использования среднего коэффициента обновления для впрыска реагентов в реакторы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9. Результаты эксперимента IVTT, выражающего белок deGFP. Длительная реакция IVTT была начата таким образом, что 30% объема реактора вытесняется каждые 14,6 минуты. Реакции было разрешено работать в течение более 16 часов, прежде чем быть прекращено. Два реактора микрофлюидного устройства использовались в качестве заготовок, и только ультрачистая вода пролетала через реакторы на протяжении всего эксперимента (реакторы 1 и 5). Все остальные реакторы состояли из 75% раствора реакции IVTT и 25% ультрачистой воды (реакторы 2 и 6) или 2,5 нм линейных шаблонов ДНК кодирования для выражения deGFP (реакторы 3, 4, 7 и 8). Во всех четырех реакторах, где была добавлена ДНК, есть четкое выражение deGFP. Три из четырех реакторов обеспечивают аналогичную интенсивность флуоресценции, при этом один реактор показывает более низкий сигнал флуоресценции. Это может быть вызвано несоответствием в потоке, что приводит к меньшему попаданию ДНК в реактор, или из-за изменений в размерах реактора. Через 14 часов наблюдается резкое увеличение сигнала реакторов, содержащих ДНК. Это вызвано воздушным пузырем, попадающим в слой потока микрофлюидного устройства, предположительно исходящий от одного из растворов притока. Захват воздуха в микрофлюидном устройстве значительно ограничивает поток жидкостей через каналы, в результате чего новые реагенты не могут быть добавлены или удалены из реакторов до тех пор, пока воздух не пройдет. После возобновления потока эксперимент возвращается к прежней интенсивности флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы. 

Discussion

Было представлено многослойное микрофлюидное устройство на базе PDMS, и было продемонстрировано его способность поддерживать реакции IVTT в течение длительных периодов времени. Хотя эта технология хорошо подходит для этого конкретного примера, она может быть использована для многих других приложений. Дополнительный контроль над потоком жидкости - в паре с возможностью непрерывного пополнения реагентов реакции при удалении (по)продукты - идеально подходит для непрерывного синтеза реакций, исследования различных динамических поведения, и одновременное проведение нескольких вариаций одной реакции.

Несмотря на относительно простой процесс изготовления устройств на основе PDMS, их использование требует обширной аппаратной настройки. Состоит из клапанных массивов, регуляторов давления, насосов давления, инкубаторов и холодильных установок, переход от изготовления к использованию не является элементарным и требует значительных первоначальных инвестиций. Кроме того, возможность последовательной настройки и проведения успешных экспериментов с этими устройствами требует значительных временных вложений; точка, которую эта рукопись направлена на адрес. Однако, как только на месте, вся установка может быть изменена для целого ряда целей. Кроме того, аппаратная установка включает в себя многочисленные модульные элементы, каждый из которых может быть расширен, чтобы позволить использовать более сложные микрофлюидные конструкции устройств. Кроме того, модульная конструкция позволяет заменить аппаратные компоненты аналогичным образом функционирующих альтернатив, таким образом, что пользователи не ограничиваются конкретной установки, описанной здесь48,49.

Вариабельность между отдельными устройствами и во внешних условиях (например, колебания давления) может привести к неточностям при проведении экспериментов с использованием этих устройств. Для решения этой проблемы перед каждым экспериментом должна быть проведена калибровка системы, обеспечивающая уникальное коэффициент обновления для каждого из реакторов. В то время как калибровка направлена на изменение устройства к устройству и эксперимент, это трудоемкий процесс, а не безупречный. Жидкости с различной вязкостию не будут течь с той же скоростью при воздействии одинакового давления, и как таковые выполняющие калибровку с несколькими реагентами не могут давать идентичные коэффициенты обновления. Этот эффект смягчается за счет использования трех каналов управления для перистальтно перекачивать реагенты в микрофлюидное устройство, в отличие от регулирования потока путем изменения только поставляемого давления. В крайнем случае в тех случаях, когда разница в вязкости очень велика, для каждого отдельного реагента можно внедрить уникальное коэффициент обновления, выполняя несколько экспериментов по калибровке.

Использование перистальтического насоса для введения реагентов в микрофлюидное устройство смягчает эффекты использования растворов с различной вязкосткой, однако это также создает второстепенную проблему. Использование дискретных шагов для перекачки жидкостей в микрофлюидное устройство означает, что разрешение инъекций в один реактор, ограничено объемом впрыскиваемых при выполнении одного цикла насоса. В рамках наших исследований это значение - определяется в ходе калибровки - примерно равно 1%, что свидетельствует о том, что один цикл насоса вытесняет примерно 1% от объема реактора (около 0,1 нл). Таким образом, вытеснение 30% объема реактора требует выполнения 30 циклов насоса, с 23 циклов насоса решения реакции IVTT добавляются, и только 7 циклов насоса ДНК или ультрачистой воды добавляются. Хотя для наших исследований достаточно, альтернативные экспериментальные протоколы могут столкнуться с проблемами при попытке добавить большее количество уникальных реагентов, использовать более низкий Освежающий фракции, или добавить меньшие объемы одного реагента в реактор. В таких случаях конструкция микрожидкости может быть адаптирована для обеспечения реакторов большим объемом. Пример такого приводится в Нидерхольтмайер и др.36.

Важно отметить, что устройство, описанное в этой рукописи, позволяет поддерживать реакции в течение длительных сроков, что приводит к стабильному состоянию транскрипции и ставок перевода. Периодически впрысывая новые реагенты в реакторы - и удаляя реакцию (по)продукты - реакции устойчивы и сложные динамические поведения могут контролироваться. Таким образом, была создана платформа, которая - в некоторой степени - имитирует клеточную среду. Кроме того, эта платформа позволяет исследовать динамику системы, адаптируя период между инъекциями и специфическим составом инъекций. В результате эти многослойные микрофлюидные устройства являются мощным инструментом для характеристики и оптимизации новых синтетических сетей, которые отображают сложное динамичное поведение.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом, ERC (проект N. 677313 BioCircuit) Грант NWO-VIDI от Нидерландской организации научных исследований (NWO, 723.016.003), финансирование от Министерства образования, культуры и науки (гравитация программы, 024.001.035 и 024.003.013), Программа науки о границах человека Грант RGP0032/2015, Европейский исследовательский совет в рамках научно-исследовательской программы Европейского союза Horizon 2020 Грант 723106, а также Грант Швейцарского национального научного фонда 200021_182019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) - Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials - <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) - Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source -
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation - 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. -
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO - 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific -
Soft tubing Fluigent - Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA - Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Roekel, H. W. H., et al. Programmable chemical reaction networks: emulating regulatory functions in living cells using a bottom-up approach. Chemical Society Reviews. 44, 7465-7483 (2015).
  2. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. (2017).
  3. Del Vecchio, D., Sontag, E. D. Dynamics and control of synthetic bio-molecular networks. Proceedings of the American Control Conference. 1577-1588 (2007).
  4. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 410-422 (2009).
  5. Padirac, A., Fujii, T., Rondelez, Y. Bottom-up construction of in vitro switchable memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3212-E3220 (2012).
  6. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. 439, 856-860 (2006).
  7. Genot, A. J., Fujii, T., Rondelez, Y. In vitro regulatory models for systems biology. Biotechnology Advances. 31, 789-796 (2013).
  8. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  9. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  10. Montagne, K., Plasson, R., Sakai, Y., Fujii, T., Rondelez, Y. Programming an in vitro DNA oscillator using a molecular networking strategy. Molecular Systems Biology. 7, 466-466 (2014).
  11. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics. 11, 367-379 (2010).
  12. Hockenberry, A. J., Jewett, M. C. Synthetic in vitro circuits. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 253-259 (2012).
  13. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33, 111-119 (2015).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology - identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 7, 856-866 (2012).
  15. Venturelli, O. S., et al. Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation. Nature Communications. 8, 1-11 (2017).
  16. Scott, M., Mateescu, E. M., Zhang, Z., Hwa, T. Interdependence of cell growth and gene expression: origins and consequences. Science. 330, 1099-1103 (2010).
  17. Borkowski, O., Ceroni, F., Stan, G. B., Ellis, T. Overloaded and stressed: whole-cell considerations for bacterial synthetic biology. Current Opinion in Microbiology. 33, 123-130 (2016).
  18. Liao, C., Blanchard, A. E., Lu, T. An integrative circuit-host modelling framework for predicting synthetic gene network behaviours. Nature Microbiology. (2017).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, 751-755 (2001).
  21. Oberholzer, T., Nierhaus, K. H., Luisi, P. L. Protein expression in liposomes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 261, 238-241 (1999).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synthetic Biology. 7, (2018).
  23. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40, 3763-3774 (2012).
  24. Dunlop, M. J., et al. Distinct timescales of RNA regulators enable the construction of a genetic pulse generator. Biotechnology and Bioengineering. (2019).
  25. Yoshiyama, T., Ichii, T., Yomo, T., Ichihashi, N. Automated in vitro evolution of a translation-coupled RNA replication system in a droplet flow reactor. Scientific Reports. 8, 1-8 (2018).
  26. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS ONE. 8, 1-12 (2013).
  27. de los Santos, E. L. C., Meyerowitz, J. T., Mayo, S. L., Murray, R. M. Engineering Transcriptional Regulator Effector Specificity Using Computational Design and In vitro Rapid Prototyping: Developing a Vanillin Sensor. ACS Synthetic Biology. 5, 287-295 (2016).
  28. Guo, S., Murray, R. M. Construct functional feedforward loop biological circuits in a cell-free system and in cells. ACS Synthetic Biology. (2019).
  29. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2017).
  30. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, 344-355 (2016).
  31. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  32. Lee, J. W., et al. Creating single-copy genetic circuits. Molecular Cell. 63, 329-336 (2016).
  33. Gibson, D. G., et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  34. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, 387-397 (2014).
  35. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16, 269-281 (2016).
  36. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15985-15990 (2013).
  37. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242, 1162-1164 (1988).
  38. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  39. Timm, A. C., Shankles, P. G., Foster, C. M., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Toward microfluidic reactors for cell-free protein synthesis at the point-of-care. Small. 12, 810-817 (2016).
  40. Doktycz, M. J., Foster, C. M., Retterer, S. T., Timm, A. C., Shankles, P. G. Characterization of extended channel bioreactors for continuous-flow protein production. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 33, 06FM02 (2015).
  41. Khnouf, R., Beebe, D. J., Fan, Z. H. Cell-free protein expression in a microchannel array with passive pumping. Lab on a chip. 9, 56-61 (2009).
  42. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab on a Chip. 11, 3523-3529 (2011).
  43. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16, 2168-2187 (2016).
  44. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synthetic Biology. 1, 29-41 (2012).
  45. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 1-18 (2015).
  46. Galas, J., Haghiri-Gosnet, A. -M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab on a Chip. 13, 415-423 (2013).
  47. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2004).
  48. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  49. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics