長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

Bioengineering
 

Summary

PDMSベースの多層、マイクロ流体デバイスの製造プロセスは、インビトロ転写および翻訳(IVTT)反応を長期間にわたって行うことを可能にする。さらに、これらの反応を長期間自動化および維持するために必要なハードウェアとソフトウェアの包括的な概要を提供します。

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van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).

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Abstract

細胞ベースの合成生物学の限界は、研究者がより大きく、より複雑な合成遺伝子調節回路の開発を目指すにつれて、ますます明らかになってきています。生体内の合成遺伝子調節ネットワークの分析は時間がかかり、環境制御の欠如に苦しんでおり、外因性合成成分が宿主プロセスと相互作用して望ましくない挙動を引き起こします。これらの問題を克服するために、新しい回路の無細胞特性化がより一般的になりつつある。インビトロ転写および翻訳(IVTT)混合物は実験環境の調節を可能にし、各独特なシステムのために最大限に活用することができる。ここで提示されるプロトコルは、長期間にわたってIVTT反応を維持するために利用できる多層マイクロ流体デバイスの製造について詳述する。時間の経過と共に資源が枯渇し(バイ)製品が蓄積するバッチ反応とは対照的に、マイクロ流体デバイスを使用することで、資源の補充と反応産物の除去が可能になります。このように、細胞環境は、遺伝子回路の動的挙動を長期間にわたって調べることができる非平衡環境を維持することによってエミュレートされる。多層マイクロ流体デバイスを十分に活用するために、ハードウェアとソフトウェアが統合され、IVTT反応を自動化しました。IVTT反応をここで紹介するマイクロ流体プラットフォームと組み合わせることで、複雑なネットワーク挙動を総合的に解析することが可能となり、細胞プロセスを調節するメカニズムの理解を深めることが可能になります。

Introduction

細胞は、複雑な動的調節ネットワーク1、2を使用して環境を感知し、応答することができます。合成生物学の分野は、これらのネットワークを含む天然成分に関する我々の知識を利用して、細胞3、4の機能を拡張できる生物学的システムを設計する。逆に、既存回路の簡略化された合成アナログを設計したり、自然発生する行動を示すフォワードエンジニアリング生物学的システムを設計したりすることで、生命を支配する自然ネットワークの理解を深めることも可能です。このような生物学的システムのde novo工学は、新しい遺伝回路またはシグナル伝達経路が、明確に定義された部分5、6を使用して合理的な方法で設計されるボトムアップ方方法で行われる。ネットワークの合理的な設計と生物学的に関連するシステムの設計を組み合わせることで、様々な抽象化7の様々なレベルを持つ生物学的調節システムの詳細な特性と研究が可能になります。

ElowitzとLeibler8およびGardner et al. al. 9の先駆的な研究は、細胞宿主への合成遺伝ネットワークの導入に成功した最初の作品でした。次の10年間で、多くの研究者は、細胞7、10、11への合成回路の導入に関するいくつかの制限の出現にもかかわらず、これらの初期の成功に基づいて構築し続けています 、12.理想的には、細胞ホストへの合成回路の導入は、モジュラー方式で行われるべきです。残念ながら、セルラー環境の複雑さは、多くの部分とネットワークの機能が高度にコンテキスト依存している12、13、14で、これを特に困難にします。その結果、ネットワークは、多くの場合、合成回路の機能に影響を与える可能性のあるネイティブホストコンポーネントとの望ましくない相互作用を経験します。同様に、外因性ネットワークの構成要素は、宿主プロセスを阻害し、宿主内の共有リソースを競い合い、成長運動学15、16、17に影響を与えることができる。したがって、インビボ環境における合成ネットワークの挙動を合理的に設計および予測するためには、すべてのホストおよび回路固有のダイナミクスの包括的なモデルが必要である18.

合成ネットワークの特性を示すためにセルラーホストを使用する実行可能な代替手段は、インビトロ転写および翻訳(IVTT)技術の適用である。合成ネットワークのテストベッドとして機能し、反応は、遺伝子発現19、20、21を可能にするために必要なすべての成分を含む溶液で行われる。このように、生物学的に関連する、人工的であるが、合成ネットワークをテストすることができる環境が22、23、24、25、26、 27、28.IVTTソリューションを使用する主な利点は、研究者が各反応2の正確な組成を調整することができ、ユーザー指定の条件下で反応を実行する能力です。さらに、セルフリーアプローチは、時間のかかるセルラークローン作成手順を実行する必要がないので、合成ネットワークのハイスループットテストを可能にします。その結果、連続した設計の持続時間 - ビルド - テストサイクルは大幅に29、30、31、32を減少させました。ギブソンアセンブリなどの無細胞クローニング技術を駆使して新しいネットワークを迅速に設計し、生体内試験に必要なプラスミドとは異なる線形DNAテンプレートからネットワークを構築することで、設計サイクルをさらに加速することができます。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)33、34を介して増幅することができる。

バッチ反応は、IVTT反応を行うことができる最も簡単な方法であり、すべての反応成分が35を組み合わせた単一の反応容器を必要とする。このような反応は、タンパク質発現および基本的な回路試験には十分でありながら、ネットワークの長期的な動的挙動を研究する際には不十分であることが証明される。バッチ反応の過程で、試薬は枯渇するか、または転写および翻訳速度の連続的な減少をもたらす劣化を受ける。さらに、反応が進行するにつれて、ネットワークの正しい機能を妨害する(または完全に阻害する)副産物が蓄積する。最終的に、バッチリアクターの使用は観察可能な動的挙動を制限し、否定的な規制は5、36を実装することが特に困難である。

IVTTシステムの汎用性は、連続的な流れから液滴ベースの方法、およびより簡単な透析アプローチ2、30まで、長時間のIVTT反応を行うことができる複数の代替方法を可能にします。37、383940.マイクロ流体デバイスのアプリケーションは、スループットを向上させ、コストを最小化しながら、ユーザーが反応を制御し、コストを35、41、42にし、それぞれの特定のアプローチを持つことを提供します独自の利点。連続的な流れの使用は、発現収量を増加させるために容易に最適化することができるが、特定の反応産物を効果的に除去することができないため、動的挙動の研究は非些細な39になる。液滴ベースのマイクロ流体システムを採用すると、新規ネットワークのハイスループットスクリーニングが可能になりますが、反応に新鮮な試薬を供給することの難しさは、小体積バッチ反応に似た液滴をもたらします43。透析ベースの反応器は、新鮮な試薬の導入だけでなく、いくつかの反応産物の除去を可能にしますが、RNA分子と大きなタンパク質は、膜の細孔を通して拡散するには大きすぎて、反応器内に蓄積します。さらに、これらの反応を長期にわたって持続させるためには、大量の試薬が必要とされ、30、44.2013年、Maerklらは、長期IVTT反応36、45を導行するために特別に設計された多層マイクロ流体デバイスを発表した。多層マイクロ流体装置の使用は、流体の流れを直接制御することを可能にし、流れのリダイレクトだけでなく、デバイス46、47の特定の領域における流体の分離を可能にする。これらの単離された領域は、IVTT反応を行うことができる独立したナノリットルスケール反応室として機能することができる。単一のIVTT反応の過程で、反応器への新鮮な試薬の定期的な注入はIVTT成分およびDNAテンプレートを補充するために使用される。同時に、古い反応溶液の等しい体積が変位し、反応産物を除去する。このようにして、基礎転写および翻訳速度が安定した状態にとどまり、IVTT反応の寿命を延ばし、豊かな動的挙動が起こる場合、平衡状態が維持されます。このアプローチを適用することにより、研究者は、特定の回路内で発生する個々のプロセスの運動速度を調べることができ、新しい遺伝的ネットワークのフォワードエンジニアリングを支援することができます。例えば、ニーダーホルトマイヤーらは、遺伝的リング発振器の様々な要素を特徴付けるこのアプローチを実施し、その運動速度を36に決定した。さらなる研究では、Yelleswarapuらは、バッチ条件下で決定されたシグマ因子28(σ28)の運動速度がσ28ベースの発振器の挙動を記述するのに不十分であり、フローベースのデータを追加したことを示した。ネットワーク動作のモデル予測の改善22.

この原稿の目的は、長期IVTT反応を行うことができる多層マイクロ流体デバイスの製造のための完全なプロトコルを提示することです。さらに、この原稿では、長時間のIVTT反応を実行するために必要なすべてのハードウェアとソフトウェアについて説明します。マイクロ流体装置の作動は、その中の流体の流れを制御するために必要であり、チューブの長さを介してマイクロ流体デバイスに直接接続する一連の空気弁を使用して達成される。次に、空気弁はカスタム造られた仮想制御インターフェイスによって制御される。マイクロ流体装置内の流体の流れは、市販の圧力調節システムによって提供される連続的な圧力を使用して達成される。IVTT反応は、典型的には29°Cと37°Cの間で行われ、顕微鏡インキュベーターは、反応中の温度を調節するために使用されます。しかし、IVTT混合物の機能性は、4°Cを超えて保存すると徐々に劣化する。したがって、この原稿は、マイクロ流体装置に注入する前にIVTT混合物を冷却するために使用されるオフチップ冷却システム上で拡大されます。結論として、この原稿は、他の研究者が相対的にこの技術を複製することができるように、マイクロ流体流動反応器を使用して長時間のIVTT反応を正常に実行するために必要な手順の包括的な概要を提供します。容易。

Protocol

1. ウェーハの準備

注:私たちのプロトコルは、この研究中に使用される40 XT陽性フォトレジストとSU8 3050陰性フォトレジストに固有です。代替フォトレジストを使用できますが、特定のスピン速度、ベーキング温度、およびベーキング時間は異なります。ニーダーホルトマイヤーら36が提供するマイクロ流体デバイス設計は、材料の表にリンクされています。

  1. 2つのきれいなシリコンウェーハ(直径100mm、<1-0-0>指向、525μmの厚さ)を250°Cに設定した予熱オーブンに入れ、ウェーハを一晩(〜16時間)脱水します。
    注:HMDS蒸着を使用してウエハをプライミングすることも可能です。ただし、ウェーハが十分に脱水されている場合は、これは必要ありません。
  2. オーブンからシリコンウェーハを1つ取り出し、スピンコーティングを進める前に室温まで冷まします。ウエハの中心に40 XTフォトレジストの3-4 mLを適用します。
  3. 25 μm のフィーチャの高さを得るためには、次のスピン プロトコルを適用します: 500 rpm (110 rpm/s) で 20 s のスピンを行い、スピン速度を 3100 rpm (300 rpm/s) に上げ、ここで 30 rpm を保持し、200 rpm/s の減速でウェーダーを 0 rpm に減速します。マイクロファイバー組織は、スピンコーティング中に発生した可能性のあるエッジビーズを慎重に除去します。
  4. 次の方法で70 °Cと120 °Cに設定された2つの別々のホットプレートを使用して柔らかいベーク:ウエハが30sのために70 °Cに座ることができます。その後、ウエハを120°Cのホットプレートに移し、ウエハを70°Cホットプレートに戻す前に3.5分間休ませ、ウエハをホットプレートから取り外し、急激な温度衝撃を避け、室温まで冷却します。
  5. フロー層フォトマスク(エマルションサイドダウン)をフォトレジストフィルム上に置き、200mJ/cm2の総露出が達成されるまでUVランプを使用してウエハを露出させる。
  6. 次の方法で2つのホットプレート(70°Cおよび105°C)を使用して露光後焼き:ウエハを105°Cホットプレートに移す前に、20°Cで70°Cに座り、40sのためにここに残します。最後に、ウエハを70°Cのホットプレートに戻し、さらに20sの露出後のベークを完了します。
  7. マイクロファイバー組織のスタック上で、ウェーハを室温まで冷却します。開発プロセスを開始するために726 MIFフォトレジスト開発者で満たされたペトリ皿にそれを転送することにより、ウエハを開発します。ベンチトップシェーカーで行うと開発が加速され、ウエハ全体が開発者に水没します。
  8. 脱塩水でウエハをすすいで、ステレオ顕微鏡を使用してウエハ表面にフォトレジスト残渣がないか確認します。フォトレジスト残渣が見られる場合は、ウエハを開発者に返します。
  9. ウエハを110°Cにセットしたホットプレートに25分間置いて、陽性フォトレジストをリフローします。このプロセスは、丸みを帯びた特徴だけでなく、製造プロセス中に現れた可能性のある亀裂をアニーリングします。手順 1.17 に記載されているように、ウェーハをサイラ化します。
  10. オーブンから2番目のシリコンウェーハを取り出し、スピンコーティングを進める前に室温まで冷却します。ウエハの中心にSU8 3050フォトレジストの5 mLを適用します。
  11. 30 μm のフィーチャの高さを得るためには、次のスピン プロトコルを適用します: 500 rpm (110 rpm/s) で 20 s のスピンを行い、スピン速度を 4,000 rpm (330 rpm/s) に上げ、ここで 42 s を保持し、200 rpm/s の減速でウェーダーを 0 rpm に減速します。マイクロファイバー組織は、スピンコーティング中に発生した可能性のあるエッジビーズを慎重に除去します。
  12. 2つの別々のホットプレート(65°Cおよび95°C)を使用して柔らかく焼く:ウエハが30sのために65 °Cに座ることを可能にする。その後、ウェーハを95°Cのホットプレートに移し、ウエハを65°Cホットプレートに戻す前に14分間休ませ、さらに30sの間ウエハを取り出し、室温まで冷却します。
  13. 露出前のUVランプの強度を測定し、これを使用して、260 mJ/cm2の総暴露量を達成するために必要な露光持続時間を決定します。フォトマスク(エマルションサイドダウン)をフォトレジストフィルムの上に置き、UV光源の下にウエハを置きます。260 mJ/cm2の総露出が達成されるまでUVランプを使用してウエハを露出させる。
  14. 次の方法で2つのホットプレート(65°Cおよび95°C)を使用して露光後焼き:ウェーハを95°Cホットプレートに移す前に65°Cで65°Cに座り、4.5分間ここに残します。ポスト露出ベイクを完了します。
  15. マイクロファイバー組織のスタック上で、ウェーハを室温まで冷却します。開発プロセスを開始するためにmrDev-600フォトデベロッパーで満たされたペトリ皿にそれを転送することにより、ウエハを開発します。ベンチトップシェーカーで行うと開発が加速され、ウエハ全体が開発者に水没します。
  16. イソプロパノールでウエハをすすいで、ステレオ顕微鏡を使用してウエハ表面にフォトレジスト残渣がないか確認します。フォトレジスト残渣が見られる場合は、ウエハを開発者に返します。完全に開発されたら、1時間150°Cに設定されたホットプレートにウエハを置くことによって、フォトレジストを強く焼きます。
  17. 両方のウェーハをシラ化して、ソフトリソグラフィプロセス中のPDMSの接着を防ぎます。サイラ化を行うために、シランのピペ状2〜3液滴(ウエハ当たり)を小さなガラスバイアルに入れる。このバイアルを、ウェハと一緒にデシケータに入れ、5~10分間真空を引っ張り、デシケータをシールし、12~16時間真空の下にウェーハを残します。
    注意:シランは有毒であり、吸入すべきではありません。煙のフードで作業し、シランを扱うときにニトリル手袋を着用するように注意してください。これには、デシケータに真空を引っ張る際に、真空ポンプをヒュームフードに入れることが含まれます。
  18. デシケータから真空を解放し、シラン化されたウエハを取り除きます。水で洗い流し、N2の蒸気を使用してウエハを乾燥させます。この時点で、ウェーハは必要になるまで貯蔵に置くことができる。

2. マイクロ流体デバイス製造

注:PDMSベースの多層マイクロ流体デバイスを製造するために使用されるソフトリソグラフィプロセスは、3つの異なるステップに分けることができます:1)流れと制御層の両方のPDMS調製、2)2つのPDMS層のアライメントと接着、3)デバイスが完了します。

  1. PDMS の準備
    1. ベースと硬化剤をプラスチックビーカーに組み合わせ、混合棒を使用して2つの成分を完全に混合するまで撹拌することにより、2つのPDMS前駆体溶液を調製します。対照層には、20gの塩基剤と1gの硬化剤(20:1比)が必要です。流層には、ベース剤の40gと硬化剤の8g(5:1比)が必要です。デシケータでソリューションをドガします。
    2. 流層ウエハをペトリ皿に入れ、5:1比のPDMS混合物をウエハの上に注ぎます。気泡を取り除くために30分間PDMSをドガ。
    3. スピンコートは、コントロール層ウエハ(負のSU8 3050フォトレジストを使用して調製)を20:1比PDMSでコーティングします。PDMSの5-10 mLをウェーハの中心に注ぎ、次のスピンプロトコルを実行します(後で使用するために左のPDMSを保持):15秒(100rpm/s)500 rpmでスピンし、45秒でスピン速度を1450rpm(300 rpm/s)に上げます。を使用し、ウェーハを 0 rpm (200 rpm/s) に減速します。
    4. 均質なPDMSフィルムの厚さを確保するために、PDMSコーティングされたウエハを閉じたペトリ皿の水面に置きます(ほこり汚染を避けるために)。ウエハを30分間座らせておきましょう。
    5. デシケータから流れ層を取り出し、流れ層と制御層の両方をオーブン(80°C)に入れます。両方の層を28〜30分間硬化させ、PDMSが操作可能な場合は取り除き、わずかに粘着性を残します。直ちに位置合わせプロセスを進めます。
  2. アライメントとボンディング
    1. メスを使用して、フロー層ウエハ上のPDMSから4つのデバイスのそれぞれを取り外します。シリコンウエハからPDMS層を取り外すには、ほこり粒子汚染を避けるために、すぐにスコッチテープで特徴側を覆います。
    2. 制御層上のフロー層ブロックを目で大まかに位置合わせし、デバイスの特徴側をコントロール層PDMSと接触させます。その後、各フロー層ブロックの位置を微調整して、フロー層のチャンネルを制御層チャネルに合わせ、ステレオ顕微鏡を使用して調整の可視化を支援します。
    3. 2 つの PDMS 層間のエア ポケットを取り外すには、圧力をかけます。アライメントされたフロー層ブロックの周りに先に保存された残りの20:1比PDMSを注ぎます。接合プロセス中に十分な接触を確保するために、各デバイスに100gの重みを置きます。
    4. 整列したデバイス(重量を含む)を80°Cオーブンに戻し、少なくとも1.5hと6hを超えなく結合するようにしておきます。
  3. デバイスの仕上げ
    1. オーブンからウェーハを取り出し、各デバイスの特徴側をスコッチテープで覆い、制御層ウエハから個々のデバイスを抽出します。
    2. 反復的に、9つのフロー層入口、24の制御層チャネル入口、および各デバイスの単一流層出口のそれぞれに対して単一の穴をパンチする。フィーチャー側を上向きにしてデバイスをパンチし、カメラを使用して、フィーチャ境界内で穴が開いていることを確認します。
    3. 各デバイスについて、イソプロパノールとアセトンで単一の顕微鏡スライドをきれいにし、N2の流れの下でスライドを乾燥させます。その後、150°Cに設定されたホットプレート上に顕微鏡スライドを15分間置きます。
    4. 酸素プラズマアッシングを使用してPDMSデバイスをガラススライドに接着し、50 Wのアッシングパワーを45秒で適用します。完了したら、デバイスフィーチャーサイドをガラススライドの下に置き、表面間に閉じ込められたガスを除去する圧力を加えます。
    5. 1時間110°Cに設定されたホットプレートに接着されたデバイスを置く重量は、デバイスの接着性を向上させるために、デバイスの上に置くことができます。

3. ハードウェアのセットアップ

注:マイクロ流体チップの制御を実現するには、多数のハードウェアを取り付け、相互に接続する必要があります。ハードウェアの3つの異なるグループが必要です:1)制御チャネルのための空気制御システム、2)デバイス内の反応試薬の流れを制御する空気圧レギュレータ、および3)前にIVTT反応溶液を冷却する冷却システムマイクロ流体デバイスへの注入。ハードウェアセットアップの概要を図 1に記載しています。ここで提供されるプロトコルは、可能な限り一般的にしようとしますが、私たちの研究全体で使用される特定の機器が参照されることに注意してください。すべてのハードウェアは、同じ機能を実行できる代替品に置き換えることができます。このような場合、ここでのプロトコルを使用して、システムのセットアップに必要な一般的な手順と各コンポーネントの要件の概要を説明できます。代替ハードウェアのセットアップは、Browerら48とホワイトとストリート49によって提示されます。

  1. 空気圧制御システム(図2参照)
    1. 製造元のプロトコルを使用して、フィールドバス・コントローラーとユーザー・ワークステーション間の TCP 接続を確立します。制御ソフトウェア (補足ファイルとして提供) を使用して、コントローラーへの TCP 接続を介して送信される MODBUS コマンドを作成し、ソレノイドバルブを作動させる。
    2. 8つの4チャンネルデジタル出力モジュール(使用されているソレノイドバルブごとに1つずつ)を備えたフィールドバスコントローラを拡張します。各ソレノイドバルブは、接続ピンを主宰します。正のワイヤをデジタル出力モジュールの 1 つの正の出力のいずれかに接続しながら、負のワイヤをデジタル出力モジュールのアース ポートの 1 つに接続します。
      注: システムを正しく動作させるには、ソレノイドを体系的に接続し、最初のソレノイドを最初の出力ポートに接続し、2 番目のソレノイドを 2 番目の出力ポートに接続する必要があります。私達のシステムでは、2つの弁の配列はそれぞれ8および22のソレノイド弁と使用される。出力ポート 1 から 8 は 8 バルブ アレイに接続し、出力ポート 9~30 は 22 バルブ アレイに接続します。
    3. 1/4インチチューブを使用して、両方のバルブアレイを圧縮空気源に接続します。圧力レギュレータを使用して、22バルブアレイの圧力を3棒に、8バルブアレイを1棒に設定します。
  2. 流圧調節(図3参照)
    注:マイクロ流体デバイスの流れ層を通って流体を流すために、市販の4ポート圧力レギュレータが使用されます。各ポートの出力圧力は、圧力コントローラに付属のソフトウェアを介して調整されます。付属のUSBコネクタを使用して、圧力レギュレータをコンピュータに接続します。
    1. 圧力レギュレータを圧縮空気源に接続し、供給された圧力がレギュレータで許容される最大圧力を超えないことを確認します。
    2. 圧力レギュレータの 4 つのメス Luer ロック出力ポートのそれぞれに、オスの Luer を 3/32 インチバーブ コネクタに接続します。柔らかい管の長さ(OD:3 mm、ID:1 mm、L:10 cm)をバーブに接続します。
    3. 2番目のオスのLuerを3/32"バーブコネクタをソフトチューブの開き端に接続し、これを流体貯蔵管コネクタポートに取り付けます。
    4. 提供されたソフトウェアを使用して、フローレギュレータの各出口の所望の圧力を設定し、リザーバ内に格納された試薬を加圧して、試薬をマイクロ流体デバイスに流します。マイクロ流体デバイスへのリザーバの接続については、セクション4.2で説明します。
  3. オフチップ冷却セットアップ(図4参照)
    1. PVCチューブ(OD:10 mm、ID:6 mm)を使用して、圧縮継手を使用して水冷システムをコールドプレートウォーターブロックに接続します。冷却システムの流体貯蔵所を冷却剤で満たし、ユニットを穏やかに傾けて閉じ込められた空気を置き換え、冷却管に冷却剤を継続的に追加して、完全な状態を保ちます。すべてのガスがシステムから取り除かれたら、その最大容積の約90-95%に貯蔵所を満たします。
    2. コイルPTFEチューブ(OD:0.042"、ID:0.022")をペルチェ素子の冷たい面に取り付け、テープで固定します。PTFE チューブの一方の端がフロー層圧力制御システムのリザーバに接続されていることを確認します(セクション 4.3 で説明します)。PTFE チューブのもう一方の端は、ペルチェ面から 1 cm 以下で突出する必要があります。PTFE チューブの突出端に PEEK チューブの長さ 5 ~ 10 cm (OD: 0.794 mm、ID: 0.127 mm) を挿入します。チューブの充填およびマイクロ流体装置への接続については、セクション4.3でさらに説明する。
    3. ペルチェ素子の熱い面をウォーターブロックのコールドプレート上に置き、2つの面に十分な熱化合物を適用します。チューブ、ペルチェ要素、および冷却ブロックが常に互いに直接接触していることを確認します。
    4. ペルチェ素子を温度コントローラ(シリアルバスコネクタ経由)に接続し、ペルチェに供給される電圧を調整できるようにします。ペルチェ面にサーミスタをしっかりと置き、出力を温度コントローラに接続します。水クーラーをオンにした後、温度が4°Cで安定するまでペルチェに供給される電圧を調整します。
      注:この設定では、ペルチェ温度は供給された電圧を調整することによって手動で制御され、サーミスタは温度を監視するだけの役割を果たします。

4. 実験の準備

注:実験を開始する前に、マイクロ流体デバイスを準備する必要があり、反応試薬は、デバイスに注入するための正しいチューブに挿入する必要があります。このセクションでは、1) 制御チャネルチューブのデバイスへの接続、2) 冷却されていない流入試薬のデバイスへの接続、および 3) 冷却された流入試薬のデバイスへの接続について説明します。

  1. 制御チャネルチューブの接続
    1. マイクロ流体デバイスの各制御チャネルについて、チューブの長さを切ります(OD:0.06"、ID:0.02")。一方の端に、23 G、1/2"ルアースタブのピンを挿入し、もう一方の挿入ステンレス鋼接続ピン(OD:0.65 mm、ID:0.35ミリメートル、L:8ミリメートル)。
    2. LuerスタブをオスのLuerに3/32"バーブナイロンコネクタに接続します。コネクタのバーブをポリウレタンチューブの長さに挿入します(OD:4 mm、ID:2.5 mm)。このポリウレタンチューブをソレノイドバルブの1つに直接挿入します。
    3. 23 G,1/2"ルアースタブをシリンジに取り付け、これを短い(3~4cm)チューブに挿入します(OD:0.06インチ、ID:0.02インチ)。このチューブの開いている端を超純水の貯蔵所に入れ、注射器を超純水で満たします。
    4. 図 5 に示すように、マイクロ流体デバイスの各制御チャネルに番号を付けます。各チャネル(水で満たされていない制御チャネル1~3を除く)について、対応するチューブ(ソレノイドバルブに接続)を見つけ、シリンジに取り付けられたチューブの開いた端に金属ピンを挿入します。長さの半分が満たされるまで、コントロールチャネルチューブに水を注入します。
    5. チューブをシリンジから取り外し、ステンレススチールコネクタピンをマイクロ流体装置の対応する穴に挿入します。すべての制御チャネルに対して同じ手順を繰り返します。
    6. コントロールインターフェイスを使用して、すべてのソレノイドバルブを開きます。これは、制御チャネルチューブ内の流体を加圧し、マイクロ流体デバイスにそれを強制し、デバイス内のすべての膜ベースのバルブを閉じます。装置内の開閉膜および閉じた膜の例を図 6 に示します。
  2. 冷却されていない試薬をデバイスに接続する
    1. 冷却されていない試薬のそれぞれについて、チューブの長さを切り取り(OD:0.06"、ID:0.02")、リザーバの出口をマイクロ流体デバイスの入口に接続します。
    2. チューブの一方の端を取り、これを貯水池に挿入し、チューブが貯水池の底部に達することを確認します。貯留管の出口は気密シールが達成されるような締め付けされるべきである。ステンレススチール製の接続ピン(OD:0.65 mm、ID:0.35 mm、L:8 mm)をチューブの開き端に挿入します。
    3. 小さい(1 mL)シリンジの端に23 G、1/2"ルアースタブを取り付けます。Luer スタブに短い長さのチューブ (OD: 0.06"、ID: 0.02") を追加します。チューブの端部を所望の試薬溶液に入れ、注射器を試薬で充填する。
    4. 注射器に接続されているポリウレタンチューブにステンレススチールコネクタピンを挿入し、チューブを試薬で充填します。小さな反応量を使用する場合、試薬はリザーバに入らず、チューブ自体がリザーバとして機能します。シリンジを取り外し、マイクロ流体装置のフロー層入り込み穴の 1 つにコネクタ ピンを挿入します。
    5. 圧力レギュレータソフトウェアを使用して各リザーバに圧力を加え、試薬をマイクロ流体デバイスに強制的に入れることができます。
  3. 冷却された流体をマイクロ流体装置に接続する
    1. ペルチェの表面温度を4°Cに設定して、水クーラーとペルチェ素子がオンになっていることを確認します。冷却セットアップを可能な限りマイクロ流体デバイスの近くに取り付け、ペルチェとデバイスの入り込みとの間の冷却されていないボリュームを最小限に抑えます。
    2. PTFE チューブの開いた端を、ステンレススチール製コネクタ ピン (OD: 0.65 mm、ID: 0.35 mm、L: 8 mm) を使用して、流体リザーバの 1 つに接続されたチューブ (セクション 4.2 に記載) に接続します。
    3. 小さなシリンジ(1 mL)をLuerスタブ(23G、1/2インチ)に接続し、チューブの短い長さ(OD:0.06"、ID:0.02")を端に取り付けて接続します。シリンジに冷却試薬(ここでは、IVTT反応溶液)を充填します。
    4. 接続チューブを介してPEEKチューブをシリンジに接続し、注射器に一定の圧力を加え、PEEKチューブを通してPTFEチューブに試薬を強制します。PEEKチューブを注射器から取り外し、マイクロ流体装置のフローチャネル入り江の1つに直接挿入します。圧力レギュレータソフトウェアを介して圧力が加わると、冷却された試薬はマイクロ流体装置に強制されます。

5. 実験

注:実験を行う前に、プロトコルセクション3と4で詳述されているすべてのハードウェアおよびチューブ接続を完了し、すべての試薬をデバイスに接続する必要があります。実験手順は、1)マイクロ流体装置の負荷、2)顕微鏡の準備、3)装置のキャリブレーション、および4)実験を行う4つの異なる部分に分けることができます。この研究全体で使用されるカスタム仮想制御インターフェイス(図7を参照)は、材料リストを介して補足リソースとして提供されます)

  1. マイクロ流体装置の積み込み
    1. 顕微鏡ステージにすべての制御および流れ層チューブを取り付け、インキュベーターの開口部を閉じて、マイクロ流体装置を配置します。インキュベーターの周囲温度を29°Cに設定します。実験を始める前に、冷却システムの電源が入っていて、4°Cに設定されていることを確認します。
    2. すべてのフローおよび制御チャネルが加圧されていることを確認します。制御チャネル1~3の圧力を1バールに設定し、3バールで制御チャンネル9~29を加圧します。試薬は圧力調整装置ソフトウェアを使用して液体の貯蔵所に適用される20から100 mbarの間の圧力を要求する。
    3. 試薬の1つを使用して、マイクロ流体装置から空気を取り除きます。装置の出口を閉じる(制御チャネル29を加圧)、同時に制御チャネル1-3、および15-28を減圧する。次に、選択した試薬がデバイスに流れ込むことを可能にするために、マルチプレクサの制御チャネルを選択的に減圧します。顕微鏡を使用して空気の除去を監視します。
      注:試薬がデバイスに正しくロードされていない場合、または気泡が除去されていない場合、圧力は350 mbarまで増加することができます。
    4. 制御ソフトウェアのFlush関数を使用して、空気を導入せずにすべての試薬が正しく流れるようにします。流体の流れの監視は、まずフッ素をロードし、個々の試薬による変位を監視することによって簡素化できます。
  2. 顕微鏡の準備
    1. 顕微鏡を使用して、マイクロ流体装置内の任意の対象点(各反応器内の単一点で十分である)を見つけ、その座標を保存する。これらの点は、キャリブレーションおよび実験プロセス中に画像化されます。
      注:制御ソフトウェアに含まれるキャリブレーションおよび実験手順の間に、顕微鏡は以前に保存された座標で定期的にイメージを捕獲するように指示される。これを達成するために、制御ソフトウェアは顕微鏡ソフトウェアと通信し、新しい画像を記録するように通知します。この通信は、各顕微鏡のセットアップに固有であり、この機能は提供されたソフトウェア インターフェイス内で変更されています。提供されるダミー実行可能ファイルは、エンドユーザーが独自の顕微鏡システムとの互換性のために変更することができる。
  3. マイクロ流体デバイスの校正
    1. キャリブレーションプロトコルを実行することにより、単一の流入ステップ(操作チャネル15-17を順次作動させる制御チャネル15-17によって提供されるポンプ配列、順次実行される6つのMODBUSコマンドを含む)の間に各反応器から変位する流体体積を決定する。ソフトウェア パッケージで提供されます。
    2. 制御ソフトウェア内の次のデータフィールドを設定する:溶出バッファチャネル、蛍油チャネル、希釈サイクル数(デフォルトは10希釈)、流入ステップ数(デフォルトは15ステップ)、混合サイクル数(デフォルトは 4 サイクル)、混合サイクル間の時間(デフォルトは 0 秒)。キャリブレーション実験の実行を押してキャリブレーションを開始します。
      注:キャリブレーションプロセス中に、すべての反応器は蛍煙管で満たされ、画像が記録されます。その後、溶出剤が(流入ステップの設定数に基づいて)原子炉内に計量される一連の希釈が行われ、したがって、蛍光素を置き換える。徹底的に混合した後、新しい画像が撮影されます。このプロセスは、設定された希釈サイクル数に対して繰り返されます。
    3. キャリブレーションが完了すると、制御ソフトウェアによって提示された手順に従い、キャリブレーション実験の分析を完了します。
      注:分析は、各希釈サイクル中に記録された蛍光減少に基づいて、各反応器のリフレッシュをユーザーに提供します。この値は、設定された流入ステップによって置き換えられた反応器体積割合を示します。次に、この値は、特定の反応器の容積を置き換えるために必要な流入ステップの数を決定するために実験中に使用されます。
  4. 実験の実行
    1. 仮想制御インターフェイス内で目的の実験に必要な値を設定します。重要なのは、実験サイクルごとに変位した反応器の体積を決定するリフレッシュ率[%]であり、15~40%の間で設定する必要があります。
      注: 特定の実験プロトコルは、実験を始める前にコントロールインターフェイスのどのフィールドを設定するかを決定します。いくつかのマイナーなコーディングは、新しい実験のために制御インターフェイスを適応させるために必要になります。
    2. コントロール インターフェイスの [実験の実行] ボタンを押して、実験プロトコルを開始します。
      注:変更されていない、提供されたソフトウェアは、単純なタンパク質発現を開始します。原子炉1と8は制御として利用され、原子炉2~7は同一実験を行う。ここで、反応器容積の75%はIVTT溶液を含み、25%は超純水または2.5nM線形DNA溶液のいずれかである。希釈は15分ごとに起こり、反応器体積の30%は希釈ごとに変位する。画像は、各希釈サイクルの終了時に記録されます。

6. データ分析

注:画像の分析用のスクリプトが提供されています(補足ファイルまたは材料の表を参照)。 顕微鏡セットアップ)。

  1. 分析スクリプト'calibrationScript.m'を実行し、プロンプトが表示されたら、目的の '.nd2' ファイルを選択します。正しい画像強度を決定できる単一の反応器画像が表示されます。スライダを使用して、マイクロ流体チャネルのエッジがはっきりと見えるように画像強度を最適化します。
  2. 原子炉の画像を表示します。この画像の中で、蛍光強度を決定する反応器チャネル内の領域を選択する。
    注:各反応器の蛍光強度は、記録された画像ごとに、単純なプロットに表示された結果で決定され、結果の可視化を可能にする。

Representative Results

IVTT実験の伝導に対する多層マイクロ流体プラットフォームの有効性を実証するために、記載されたセットアップを使用してdeGFPタンパク質を発現した。実験は、市販の30 IVTT反応混合物(必要な転写および翻訳成分をすべて含む)で行い、反応基質およびDNAテンプレートを補完した。実験は29°Cの温度で行った。タンパク質のIVTT発現に最適であることが判明した温度。

マイクロ流体装置は9つのユニークな入り入り入り物を有し、そのうち4つがこの実験中に利用された。第1は市販のIVTT反応混合物を含有する。IVTT反応混合物は、タンパク質を正常に発現するために必要なすべての成分を収容しますが、精製されたGamSは、マイクロ流体デバイスにロードする前に、反応混合物に1.3 μMの最終濃度で添加されました。GamSタンパク質の添加は、実験を行う際の線形DNA種の分解を最小限に抑えるのに役立つ。重要なことに、IVTT混合物をポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブに注入し、表面温度4°Cのペルチェ素子に入れ、マイクロ流体装置への注入前に溶液を冷却した。使用前に反応溶液の劣化を防ぎます。マイクロボアポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブを用いて、ペルチェ素子表面を残してPTFEチューブをマイクロ流体装置に接続し、IVTT反応混合物の体積を低下させ、冷却されない。デバイスに挿入された第2の溶液は、10 nMの濃度で、超純水に溶解したdeGFP用の線形DNAテンプレートコーディングを含んでいた。第3の溶液、超純水は、実験手順中に複数の目的を果たした。主に、超純水を使用して、希釈当たりの変位体積がすべての反応器に対して等しいことを保証し、対照反応におけるDNAの代替として機能しました。さらに、超純水は、デバイスのキャリブレーション中に蛍光色素を希釈し、試薬を切り替えるときにデバイスの死んだ体積をフラッシュするためにも使用されました。デバイスに挿入された最終的な解決策は、初期デバイスのキャリブレーションを実行するために必要な精製FITC-dextran溶液(25 μM)でした。DNA、水、および蛍煙素溶液をチューブ(0.02"ID、0.06"OD)に注入し、その後、プロトコルのセクション4.2に従ってマイクロ流体デバイスの流入チャネルの1つに挿入することができました。したがって、これらの溶液は、実験全体について29°Cで保存した。

マイクロ流体デバイスの制御チャネルの作動は、各制御チャネルを個別に作動させることができるカスタム制御ソフトウェアを介して達成される。長時間のIVTT反応の実行は、この手動プロセスでは達成できず、制御ソフトウェア内に組み込まれた自動化プロトコルの使用が必要です。実験用のマイクロ流体デバイスを準備する場合、同様の自動化されたプロトコルを使用して、新しい試薬でデバイスデッドボリュームをフラッシュすること、リング反応器内の試薬の混合、および負荷の多くの有用なプロセスを実行することができます。現在の溶液の等しい容積を置き換えながら、原子炉に新しい試薬。さらに、デバイスキャリブレーションの伝導と、長期の無細胞タンパク質発現の実行という2つの複雑なプロセスが利用可能です。前述のすべてのプロセスは、メインインターフェイスから簡単に実行でき、流入チャネル、流入量、混合時間などの特定のプロセス設定を変更するように複数のパラメータを設定できます。

マイクロ流体デバイス製造中の圧力と欠陥の変動により、単一の注入サイクル中に変位する流体の体積は、デバイス間で変化する可能性があります。そのため、IVTT実験を行う前に、注入サイクル当たりの変位反応器容積(リフレッシュ画分)が決定された。このキャリブレーションは、蛍光参照溶液を用いた8つの反応器すべてを充填する必要があります。この場合、精製FITC-デキストラン溶液(25μM)を用いた。その後、反応器は超純水で10回希釈される。各反応器の希釈サイクル当たりの蛍光の減少を測定することにより、単回注入サイクル中に変位した流体の体積を決定した。制御ソフトウェア内では、IVTT実験中に使用するためにこの値(リフレッシュ比)が記録された。重要なのは、デバイス間の流量の変動、および個々の反応器体の不一致を考慮するために、リフレッシュが個々の反応器ごとに決定され、保存されます。原子炉の充填と希釈のシーケンスは、制御ソフトウェアの一部を形成するキャリブレーションプログラムを使用して自動的に行われました。キャリブレーション実験の結果を図8に示す。

最も複雑な事前プログラムされたプロセスは、長期間のIVTT実験を実行し、ユーザーが実験を開始し、その後、それが完了するまで無人で動作することを可能にします。実験を通して、原子炉1と5はブランクとして使用され、希釈時には原子炉に水だけを加えた。反応器2,6は陰性対照として利用され、IVTT反応溶液と超純水のみを含有した。残りの反応器(3、4、7、8)には、deGFP遺伝子に対するIVTT反応溶液と2.5nMの線形DNAコードが含まれていた。反応器の初期化は、IVTT反応溶液ですべての反応器(1および5を除く)を完全に充填することによって達成され、反応器体積の25%が超純水で変位した。その後、反応器への試薬の定期的な注入が開始された。実験は、14.7分ごとに新しい試薬を原子炉に注入し、各希釈サイクル中に反応器体の30%が変位する実験を行った。各注射の組成物は、注入された流体の75%が新鮮なIVTT溶液を含み、残りの25%はDNAまたは超純水から成り立っていた。新しい試薬を注入するたびに反応器を連続的に混合し、その後、各反応器の蛍光画像を顕微鏡を用いて記録した。その後、反応を68サイクル連続的に実行し、16.5時間の実験持続時間を得た。この実験の結果は図9に挙げています。

長期のIVTT実験を行う場合、反応の失敗の主な原因は2つあります。マイクロ流体装置への空気の導入またはIVTT反応溶液の劣化。マイクロ流体装置内の空気の発生は、ほとんどの場合、流入溶液中に存在する小さな気泡の直接的な結果であり、その後マイクロ流体装置に注入されます。装置に入ると、空気の存在は液体の適切な流れを阻害し、それによって反応はもはや定期的にリフレッシュされなくなり、反応リング内のバッチ反応の形成につながる。場合によっては、試薬の繰り返しフラッシュによって空気がデバイスからゆっくりと除去され、その後反応は意図どおりに続きます(図9に示すように)。他のケースでは、空気は閉じ込められたままであり、実験を中止し、その後、プロトコルのセクション5.1に記載されている充填プロセスに類似したマイクロ流体デバイスの流れ層に連続的な(高い)圧力を加えることによってのみ除去することができる。我々の実験の間、細胞リサートは4°Cに冷却されたペルチェ要素のPTFE管に貯えられる。いずれも、不活性PTFEチューブにより、機能的(生体)分子を維持するチューブと反応溶液と低温との間の限られた相互作用を確保し、時間の経過とともにIVTT反応溶液の分解を制限する助けを与える。IVTTを実行するために必要なコンポーネント。反応溶液の劣化が起こった場合(反応溶液と貯蔵環境との間の冷却が不十分または望ましくない相互作用の結果として)、タンパク質の段階的な減少として実験的に現れる。時間の経過と一致する表現。いったん分解すると、IVTT反応溶液は回収できず、新たな実験を準備する必要があります。

Figure 1
図 1.連続的な IVTT 反応を実行するために必要なハードウェアセットアップ。A)ハードウェアセットアップの回路図。B)この原稿全体で使用される設定の写真。連続的なIVTT反応のための多層マイクロ流体装置の実装は、流れ圧力を調節し、制御チャネルを作動させ、熱および冷却反応および試薬、貯蔵液および間に装置をイメージさせる広範なハードウェアのセットアップを要求する。実験。実験は30°Cの温度で行われ、この温度に設定されたインキュベーター内に顕微鏡を置くことによって達成される。IVTT反応溶液の劣化を防ぐため、ペルチェ素子の冷たい面上に巻かれたPTFEチューブ内に貯蔵される。ペルチェ素子の温度は4°Cに設定され、この温度を維持するために水クーラーと水ブロックが使用されています。冷却を必要としない試薬は、顕微鏡インキュベーターの外の流体貯留槽に貯蔵される。一定の圧力は、コンピュータ制御圧力レギュレータによってこれらの貯留槽に適用されます。このようにして、流体は、マイクロ流体装置の流入チャネルに直接接続するリザーバの出口チューブを介して強制されます。マイクロ流体装置の各制御チャネルは、空気弁に接続されている。弁の配列全体が一定の圧力の下にある。弁を開くと、空気弁をマイクロ流体装置の制御チャネルに接続するチューブ内の流体の加圧を可能にし、マイクロ流体装置内で見つかったPDMS膜を開閉する。空気弁は特定の空気弁を開くそして閉じるためにフィールドバスのコントローラー(図示されない)を命令するユーザーインターフェイスを通して開閉される。イェレスワラプら22.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.空気弁のセットアップおよび制御チャネルの関係の概要。8バルブアレイは、バルブ1、2、および3に取り付けられた3つの制御チャネル接続で示されています。圧縮空気は1/4"の管を通して弁の配列に供給することができる。制御チャネルの作動には、下圧制御チャネル用の1棒(1、2、3)と高圧制御チャネル用の3棒(9~30、ここには示しません)の2つの圧力が使用されます。チューブは、超純水で充填し、ステンレス鋼コネクタピンを使用して制御チャネル入り入り入り入り入り入り入り入り入り入り入り入り入り込みで挿入することができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.商業流圧レギュレータおよび貯留槽システムの概要。市販の圧力レギュレータは、多層マイクロ流体装置の流層に流体を注入するために使用されます。圧力コントローラをコンピュータに接続すると、流体注入を実行するために使用される圧力の変調が可能になります。試薬は圧力調整器に直接接続される液体貯蔵所で貯えることができる。貯留槽への圧力の適用は出口管を通して貯留所から液体を強制する。この出口の管はステンレス鋼のコネクターピンを使用してマイクロ流体装置の流動の入口の1つに直接接続することができる。試薬の容積が流体貯留部に到達できない場合、出口管は試薬の貯蔵所として機能する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4.反応試薬を冷却するために使用される冷却システムの概要。(左)絶縁冷却セットアップと(右)冷却セットアップを顕微鏡内に置き、マイクロ流体装置に接続します。ペルチェ素子は、マイクロ流体装置に注入する前にIVTT反応溶液を冷却するために使用されます。試薬はペルチェ要素の冷たい面の上に巻かれたPTFEの管内に貯えられる。PEEKチューブの長さは、冷却された流体をマイクロ流体デバイスに転送するために使用され、小さな内径(0.005")で試薬の容積が冷却されなくなりました。コイル状のPTFEチューブと並んでサーミスタを配置し、ペルチェ素子の表面でリアルタイムの温度監視を可能にします。ペルチェに印加される電圧は、ペルチェの表面温度が0°C~4°Cの間に残るように設定されます。ペルチェ素子によって生成される余分な熱を除去するために、ペルチェの熱面は、シリコーンフリーヒートシンクグリースを追加して、2つの面間の最適な熱伝達を保証して、水冷却ブロックに対して配置されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5.マイクロ流体デバイス設計の概要。連続IVTT反応のためのマイクロ流体流動反応器は8つの反応器リングから成り、それぞれ10.7 nLの容積を持つ。9つの入り入り入りは装置への9つの独特な反応解決の注入を可能にする。24の制御チャネルは装置内の液体の流れを調節する。制御チャネル9~14はマルチプレクサを形成する。これらの制御チャネルは、デバイスへの流体の流れを抑制するために常に加圧する必要があります。2つの制御チャネルの減圧は同時に単一の試薬の流入を可能にする。制御チャネル15、16、および17は、制御された方法で試薬を装置に注ぎ込むために使用される。制御チャネル18から25は、それぞれ装置内で見つかった8つの反応器のうちの1つの入り込みを制御する。制御チャネル26は、フラッシュチャネルを閉じることができ、従って反応器に流体を強制する。制御チャネル27は、反応器の均質な充填を助ける。制御チャネル28および29は、リング反応器出口と唯一の装置出口をそれぞれ調整する。最後に、制御チャネル1、2、および3は、リング反応器内の流体を蠕動的にポンプに使用し、試薬を混合する。このマイクロ流体装置の設計および図は両方ともネイダーホルトマイヤーら29から適応される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6.マイクロ流体装置内の膜ベースのバルブ。 A)マイクロ流体装置内の流れチャネル。バックグラウンドで 2 つのコントロール チャネルが見られます。これらのチャネルは加圧されていないので弁は開いている(液体は流すことができる)。B)流層チャネルと交差する2つの制御チャネルが加圧され、バルブを閉じている(すなわち、流体の流れが妨げられる)。制御チャネルの加圧時に、流れと制御層チャネルを分離する薄いPDMS膜は、フロー層チャネルを閉じる上向きに偏向する(制御層は流れ層の下にある)。流層チャネルの丸めは、偏向膜がフローチャネルを完全に閉じられるようにする上で重要です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図 7.マイクロ流体デバイスを制御するために使用されるユーザーインターフェイス。この研究を通じて、カスタム制御インターフェイスは、マイクロ流体デバイス内の流体の流れを制御するために使用されてきました。インターフェイスは、ユーザーが個々に制御チャネル(番号1-3と9-29)を作動させるか、試薬のフラッシュとローディング、マイクロ流体デバイスのキャリブレーション、および実行をもたらす精巧なプロトコルを実行することができます。実験。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図 8.キャリブレーション実験の結果。キャリブレーション実験中、反応器は蛍光強度が記録された蛍光素子(25μM FITC-Dextran)で満たされます。続いて、一連の希釈が続き、一定数の流入ステップ(15)が反応器に超純水を注入するために使用される。各希釈の後、試薬が混合され、蛍光が測定されます。希釈当たりの蛍光強度の低下は、一定数の流入ステップに対して変位した反応器リングの体積を明らかにする。リフレッシュ比と呼な値A) 8 つの反応器の平均強度と標準偏差は赤色で表示され、個々の強度トレースは灰色で示されます。B)希釈ステップごとに平均リフレッシュ比と標準偏差が赤色で表示されます。個々の反応器の個々のリフレッシュ比は灰色で表示されます。8基のうち7基が非常に類似した挙動を示しているのが分かりますが、1つの原子炉は7回目の希釈サイクル後のリフレッシュ比の変動を示しています。これは、試薬を反応器に注入するための平均リフレッシュ比を使用するのではなく、各反応器に固有のリフレッシュ比の必要性を強調しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図 9.deGFPタンパク質を発現するIVTT実験の結果。長時間のIVTT反応が開始され、反応器体積の30%が14.6分ごとに変位する。反応は終了する前に16時間以上実行することができました。マイクロ流体装置の2つの反応器をブランクとして使用し、実験中に超純水のみが原子炉を通して飛行した(反応器1および5)。他のすべての反応器は、75%のIVTT反応溶液と、deGFPの発現をコードする2.5nM線形DNAテンプレート(反応器3、4、7、8)のいずれかの25%の超純水(反応器2および6)または2.5nM線形DNAテンプレートで構成されています。DNAを添加した4つの反応器すべてにおいて、明確なdeGFP発現がある。4つの反応器のうち3つは同様の蛍光強度を提供し、1つの反応器は低い蛍光シグナルを示す。これは、流れの不一致によって、反応器に入るDNAが少なくなるか、または反応器の寸法の変動が原因である可能性があります。14時間後、DNAを含む反応器のシグナルに急激な増加が見られる。これは、マイクロ流体デバイスの流層に入る気泡によって引き起こされ、おそらく流入溶液の1つに由来していると考えられています。マイクロ流体装置の空気の捕捉はチャネルを通る液体の流れを著しく制限し、それによって空気が通過するまで反応器に新しい試薬を加えたり取り除いたりすることはできません。流れの再開時に、実験は以前の蛍光強度に戻ります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル。 これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

PDMSベースの多層マイクロ流体デバイスが発表され、IVTT反応を長期間持続する能力が実証されています。この特定の例に適していますが、このテクノロジは他の多くのアプリケーションに使用できます。流体の流れに対する追加の制御 - (によって)製品を除去しながら、継続的に反応試薬を補充する能力と組み合わせることで、連続的な合成反応、様々な動的挙動の調査、および同時に最適です。単一の反応の複数のバリエーションの伝導。

PDMSベースのデバイスの比較的簡単な製造プロセスにもかかわらず、その使用には広範なハードウェアセットアップが必要です。バルブアレイ、圧力レギュレータ、圧力ポンプ、インキュベーター、冷却ユニットを含む、製造から使用への移行は初歩的ではなく、多大な初期投資を必要とします。さらに、これらのデバイスを一貫してセットアップして成功した実験を実行するには、かなりの時間投資が必要です。この原稿が取り組むポイント。ただし、いったん設定すると、さまざまな目的でセットアップ全体を変更できます。さらに、ハードウェアセットアップは多数のモジュラー要素で構成され、それぞれがより複雑なマイクロ流体デバイス設計を採用できるように拡張できます。さらに、モジュラー設計により、同様に機能する代替手段によってハードウェアコンポーネントを置き換えることができます。

個々のデバイス間の変動性、および外部条件(圧力変動など)では、これらのデバイスを使用して実験を行う際に不正確な結果が生じる可能性があります。この問題に対処するには、各実験の前にシステムのキャリブレーションを実行し、各反応器に固有のリフレッシュ比を提供する必要があります。キャリブレーションは、デバイス間および実験から実験へのバリエーションに対応しますが、時間のかかるプロセスであり、完璧ではありません。粘度が異なる流体は、同一の圧力にさらされた場合と同じ速度で流れ、複数の試薬でキャリブレーションを行うように、同一のリフレッシュ比を得ない場合があります。この効果は、3つの制御チャネルを利用して試薬を微小流体装置に注ぎ込むことで減衰し、供給圧力のみを変化させることによって流れを調節するのとは対照的である。粘度の格差が非常に大きい場合の最後の手段として、複数の校正実験を行うことで、個々の試薬ごとに独自のリフレッシュを実装することができます。

微小流体装置に試薬を注入する蠕動ポンプの使用は、さまざまな粘度を持つ溶液を使用する効果を減衰させるが、それはまた二次的な問題を作成する。マイクロ流体装置に流体を送り込む離散ステップを使用すると、単一の反応器への注入の分解能が、単一のポンプサイクルを実行する際に注入される体積によって制限される。我々の研究では、キャリブレーション中に決定されたこの値は、1つのポンプサイクルが反応器体の約1%(約0.1 nL)を置き換えるであることを示す、ほぼ1%です。したがって、原子炉体積の30%を置き換えるには、IVTT反応溶液の23ポンプサイクルが追加され、DNAまたは超純水のポンプサイクルが7つしか加えられており、30ポンプサイクルの実行が必要です。私たちの研究には十分ですが、代替実験プロトコルは、より多くのユニークな試薬を追加したり、より低いリフレッシュ画分を使用したり、単一の試薬の量を減らしたりする場合に問題が発生する可能性があります。このような場合、マイクロ流体デバイスの設計は、より大きな容積を持つ反応器を提供するように適合させることができる。そのような例はニーダーホルトマイヤーら36で報告されている。

重要なことに、この原稿の中で概説された装置は安定した状態の転写および翻訳率の結果として長期間反応を持続することを可能にする。定期的に新しい試薬を反応器に注入し、反応を除去することによって、反応は持続し、複雑な動的挙動を監視することができます。このようにして、ある程度は細胞環境を模倣するプラットフォームが作成されました。さらに、このプラットフォームは、注射と注射の特定の組成との間の期間を適応させることによって、システムダイナミクスの探索を可能にする。その結果、これらの多層マイクロ流体デバイスは、複雑な動的挙動を表示する新しい合成ネットワークの特性と最適化のための強力なツールです。

Disclosures

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

Acknowledgments

この研究は、欧州研究評議会、ERC(プロジェクトn.677313バイオサーキット)がオランダ科学研究機構(NWO、723.016.003)からのNWO-VIDI助成金、文部科学省(重力)からの資金提供によって支援されました。プログラム, 024.001.035 & 024.003.013), ヒューマンフロンティア科学プログラムグラントRGP0032/2015, 欧州連合のホライズン2020研究革新プログラム助成金723106, スイス国立科学財団助成金200021_182019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) - Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials - <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) - Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source -
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation - 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. -
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO - 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific -
Soft tubing Fluigent - Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA - Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove

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References

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