गुर्दे की सबकैप्सुलर ट्रांसप्लांटेशन 2'-Deoxyguanosine-treated Murine भ्रूण थाइमस में नग्न चूहे

Immunology and Infection

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Summary

हम एक नग्न माउस के गुर्दे कैप्सूल में 2'deoxyguanosine इलाज E18.5 थाइमस प्रत्यारोपण करने के लिए एक सरल और कुशल विधि प्रदान करते हैं. इस विधि दोनों थाइमिक उपकला कोशिकाओं समारोह और टी कोशिकाओं परिपक्वता के अध्ययन में सहयोगी होना चाहिए.

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Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).

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Abstract

थाइमस एक महत्वपूर्ण केंद्रीय प्रतिरक्षा अंग है, जो टी कोशिकाओं के विकास और भेदभाव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। थाइमस प्रत्यारोपण थाइमिक उपकला कोशिका समारोह और वीवो में टी कोशिकाओं परिपक्वता की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। यहाँ हम प्रत्यारोपण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला के भीतर इस्तेमाल प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन करेंगे 2'-deoxyguanosine (दाता के लिम्फोसाइटों को कम करने के लिए) एक athymic नग्न माउस के गुर्दे कैप्सूल में भ्रूण थाइमस इलाज किया. इस विधि दोनों सरल और कुशल है और विशेष कौशल या उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। इस सरल विधि के माध्यम से प्राप्त परिणामों से पता चला कि प्रत्यारोपित थाइमस प्रभावी रूप से प्राप्तकर्ता की टी कोशिकाओं के उत्पादन का समर्थन कर सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल के संबंध में कई महत्वपूर्ण बिंदुओं को आगे स्पष्ट किया जाएगा।

Introduction

थाइमस केंद्रीय प्रतिरक्षा अंग है, थाइमस थाइमोसाइट्स के भीतर सकारात्मक और नकारात्मक चयन से गुजरना, और परिपक्व टी कोशिकाओं1,2हो जाते हैं। असामान्य सकारात्मक या नकारात्मक चयन का परिणाम प्रतिरक्षा कमी या ऑटोम्यून्यून पैथोलॉजीज में क्रमशः3,4. इसलिए, थाइमस अंग प्रत्यारोपण दाता के थाइमस में टी कोशिकाओं के चयन की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है। जीन उत्परिवर्तनों द्वारा मध्यस्थता किए गए थाइमिक उपकला फलन का विश्लेषण करते समययह विधि विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो 5 उत्परिवर्तित होने पर भ्रूणीय घातक फीनोटाइप का कारण बनती है .

प्रतिरोपित थाइमस में प्राप्तकर्ता की टी कोशिकाओं की परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए, थाइमस के भीतर दाता के लिम्फोसाइटों की कमी आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए भ्रूण 14, 15 या 16 दिन (E14, E15, E16) थाइमस का चयन आमतौर पर6,7किया जाता है। अधिक परिपक्व चरणों से थाइमस भी सफलतापूर्वक 2'-deoxyguanosine के साथ इलाज के द्वारा दाता के लिम्फोसाइटों के समाप्त किया जा सकता है. तथापि, लिम्फोसाइटों को कम करने और पुराने थाइमस संस्कृति के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन पहले8,9नहीं किया गया है। जबकि प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल कई अध्ययनों से शुरू किया गया है10,11, आगे संशोधन और इन प्रोटोकॉल के सुधार आवश्यक है.

हमारे प्रोटोकॉल को दो भागों में विभाजित किया गया है: (i) देर से विकास के चरण E18.5 थाइमस से टी लिम्फोसाइटों की कमी 2'-deoxyguanosine युक्त मीडिया में संस्कृति द्वारा। (ii) प्राप्तकर्ताओं में सुसंस्कृत थाइमस का प्रत्यारोपण। इस प्रक्रिया में, हम गुर्दे की चोट के कम मौका के साथ गुर्दे कैप्सूल में बड़े ऊतक (E18.5 थाइमस) देने के लिए एक सरल तरीका विकसित की है। बाद के चरण थाइमस पर ध्यान केंद्रित करते समय, हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग सीधे या विभिन्न विकासात्मक चरणों या अन्य समान आकार के ऊतकों में थाइमस के प्रत्यारोपण के लिए संशोधनों के साथ भी किया जा सकता है।

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Protocol

प्रस्तुत प्रोटोकॉल पशु देखभाल के बारे में जिनान विश्वविद्यालय की आचार समिति के दिशा निर्देशों का पालन करता है।

नोट: प्रयुक्त सामग्री सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं.

1. भ्रूण थाइमस का अलगाव

  1. प्रयोग से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें, और 70% इथेनॉल के साथ बेंच/हुड को बाँझ करें।
  2. कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करना, एनेस्थेटाइज़ और गर्भवती मादा माउस (18.5 दिन सफल संभोग के बाद) इच्छामृत्यु. फिर 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र पोंछ.
    नोट: यहाँ हम Insm1+/lac] महिलाओं और Insm1+/lac] पुरुषों से मेल लगाया। गर्भाशय से भ्रूण के अलगाव से पहले पेंटोबार्बिटल का इंट्राप्लेसेंटल इंजेक्शन किया गया था और प्रत्येक भ्रूण के लिए decapitation प्रदर्शन किया गया था।
  3. कैंची का उपयोग करना, मूत्राशय से शुरू होने वाले पेट पर एक "वी" आकार का कट बनाएं और गर्भाशय के प्रत्येक सींग तक चल रहे हैं।
  4. कैंची का उपयोग करके, मेसोट्रियम और गर्भाशय ग्रीवा/योनि में कटौती करें, और गर्भाशय को एकत्र करें। गर्भाशय को एक पेट्री डिश में रखें जिसमें बर्फ पर कोल्ड फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) होता है। इसके बाद, एक गर्भाशय सींग से दूसरे करने के लिए पूर्वकाल गर्भाशय की दीवार को काटने से, लिफाफे decidua में हैं जो भ्रूण का पर्दाफाश। ठीक चम्मियों का उपयोग करके, लिफाफे वाले डेसीडुआ ऊतकों को वापस छीलें और भ्रूणों को छोड़ने के लिए गर्भनाल को काट लें। थाइमस के अलगाव तक बर्फ पर एक नया पेट्री डिश में सभी भ्रूण रखें।
  5. 70% शराब के साथ एक भ्रूण को साफ करें और इसे एक नए पेट्री डिश में रखें। इस कदम से, सुनिश्चित करें कि बाँझ शर्तों को बनाए रखा जाता है।
  6. कैंची के साथ निचले जबड़े के करीब काटने से, भ्रूण के सिर को हटाने और एक कागज तौलिया के साथ रक्त नाली. इसके बाद, भ्रूण को उसी पेट्री डिश पर सुपाच्य स्थिति में ठीक करें।
    नोट: हम Insm1 और लाख के लिए प्रत्येक भ्रूण की पूंछ का एक टुकड़ा काट दिया- जीनोटाइपिंग.
  7. कैंची का उपयोग करना, कक्षीय सामने के साथ क्षैतिज पार्श्व छाती की दीवार में कटौती, और फिर छाती को खोलने के लिए डायाफ्राम काट दिया। थाइमस अब श्वासनली के सामने और दिल के निकट स्थित दो सफेद खण्डों के रूप में दिखाई देना चाहिए।
  8. थाइमस के पीछे तुला-टिप संदंश रखें और फिर थाइमस को धीरे से खींच लें। यह पुष्टि करने के लिए थाइमस की अखंडता की जांच करना सुनिश्चित करें कि इसमें दो संयुक्त पालियों हैं।
  9. 1x पीबीएस के साथ थाइमस धो लें और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत संयोजी ऊतकों और रक्त वाहिकाओं को ट्रिम करें।

2. पृथक भ्रूण थाइमस की संस्कृति

  1. एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम (RPMI1640 + 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + 100 U/mL पेनिसिलिन और 100 डिग्री सेल्सियस / साफ थाइमी को कुएँ में एक थाइमस प्रति कुएं में डाल दो। चित्र 1 संस्कृति मीडिया में पृथक थाइमस प्रदर्शित करता है।
  2. प्रत्येक थाइमस युक्त अच्छी तरह से 1.25 मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2'-deoxygranosine जोड़ें.
  3. संस्कृति आठ दिनों के लिए अलग थाइमस, दोनों संस्कृति मीडिया और 2'-deoxygranosine हर दो दिन ताज़ा.

3. गुर्दे कैप्सूल में subcapsular अंतरिक्ष की स्थापना

  1. सुई और काप ्डअर्क ट्यूब तैयार करने के लिए (चित्र 2), कैंची का उपयोग करके 45 डिग्री कोण पर ट्यूब भाग पर खोपड़ी की नस की सुई को काट दिया।
  2. नग्न माउस वजन और फिर यह एक pentobarbital के साथ anesthetize (1.5%) इंजेक्शन (75 ग्राम/जी शरीर वजन)।
  3. जब कोई प्रतिवर्त निम्नलिखित प्रतिवर्त मनाया जाता है, ऑपरेटिंग टेबल पर एक सही पार्श्व स्थिति में माउस रखें.
  4. एक 0.5% povidone आयोडीन झाड़ू के साथ, शरीर के बाहर करने के लिए अंदर से शल्य चिकित्सा क्षेत्र में दो बार त्वचा कीटाणुरहित.
  5. कैंची का उपयोग करना, बाएं गुर्दे क्षेत्र में रीढ़ की हड्डी के समानांतर एक 5-9 मिमी त्वचा चीरा बनाने (अंतिम रिब और iliac शिखर के बीच). इसके बाद, उपत्वचा ऊतक और मांसपेशियों के माध्यम से काटने और गुर्दे का पर्दाफाश करके पेट की गुहा खोलें।
  6. गुर्दे के उजागर के साथ, रीढ़ की हड्डी के किनारे चीरा किनारे से मांसपेशियों और वसा ऊतक लिफ्ट करने के लिए एक हाथ में चने की एक जोड़ी का उपयोग करें। दूसरे हाथ से, धीरे से गुर्दे बाहर निचोड़ (वैकल्पिक रूप से, गुर्दे दोनों हाथों की उंगलियों का उपयोग कर बाहर निचोड़ा जा सकता है).
  7. यह सुनिश्चित करने के लिए कि गुर्दे के कैप्सूल सर्जरी के दौरान नम है, नमकीन के साथ गुर्दे की सतह गीला (0.9% NaCl).
  8. गुर्दे कैप्सूल में एक निक बनाएँ, और धीरे कदम 3.1 में तैयार सुई टिप का उपयोग कर निचले सही पक्ष पर गुर्दे कैप्सूल खरोंच. निक का आकार गुर्दे की 1/2-2/3 चौड़ाई होना चाहिए; गुर्दे पर खरोंच नहीं है.
  9. गुर्दे के कैप्सूल पर निक में कदम 3.1 में तैयार जलसेक ट्यूब स्लाइड. गुर्दे की लंबी ओर के साथ गुर्दे के साथ गुर्दे कैप्सूल को धीरे से अलग करें जब तक कि गुर्दे के कैप्सूल के अंदर 3-4 मिमी तक नहीं पहुंच जाता। जलसेक ट्यूब वापस ड्रा; गुर्दे subcapsular अंतरिक्ष की स्थापना की है.

4. भ्रूण ीय मरिन थाइमस का प्रत्यारोपण

  1. संस्कृति मीडिया को कम करने के लिए नमकीन में चरण 2.3 में दो बार थाइमस सुसंस्कृत धोएं।
  2. अपने सिरिंज-कनेक्टिंग इंटरफ़ेस पर एक सिरिंज के लिए चरण 3.1 में तैयार क्लिप्ड जलसेक ट्यूब कनेक्ट करें। तैयार थाइमस को जलसेक ट्यूब में धीरे-धीरे प्रेरित करें।
  3. गुर्दे के कैप्सूल में क्लिप्ड इन्फ्यूजन ट्यूब को धीरे से डालें और बेहतर पोल तक पहुंचें। गुर्दे के कैप्सूल में थाइमस उद्धार; धीरे-धीरे ट्यूब को वापस लेना, साथ ही सीरिंज के प्लंजर को धीरे से धकेलते हुए।
  4. एक शराब दीपक का उपयोग करना, थोड़ा गर्मी सुई चरण 3.1 में तैयार की. यह सुनिश्चित करने के बाद कि पूरे थाइमस subcapsular अंतरिक्ष के अंदर है, गर्म सुई का उपयोग करने के लिए निक cauterize.
  5. cauterization के बाद, पेट की गुहा में गुर्दे को बहाल. पर्युदवणता और पेशी को सीवन.
  6. एक संशोधित बाधित ऊर्ध्वाधर गद्दे सीवन का उपयोग करना, त्वचा चीरा बंद (कम से कम तीन समुद्री मील टाई और दूर किसी भी अतिरिक्त धागा काट).
  7. एक povidone आयोडीन झाड़ू का उपयोग करना, चीरा कीटाणुरहित. दर्द से छुटकारा पाने के लिए, सर्जरी के दौरान और फिर सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए फ्लुनिक्सिन (2 ग्राम/जी) का नीचे का इंजेक्शन किया गया।
  8. जब तक पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद, अवरक्त दीपक के नीचे माउस गर्म रखें.
  9. ट्रांसप्लांट किए गए थाइमस को विभाजित करने से पहले प्राप्तकर्ता के गुर्दे के कैप्सूल में थाइमस को 8 सप्ताह के लिए रखें और पहले वर्णित5,8,9के रूप में फीनोटाइपिक विश्लेषण का आयोजन करें .

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Representative Results

यहाँ हम पृथक E18.5 थाइमस को दर्शाते हैं जिसमें दो पूर्ण खण्ड होते हैं (चित्र 1)। इसके अतिरिक्त, हम खोपड़ी नस सुई है कि जलसेक ट्यूब पर एक बेवल बनाने के लिए काटा गया था दिखाने के लिए (चित्र 2) . इसके बाद, हम उस थाइमस की स्थिति की एक प्रतिनिधि छवि भी दिखाते हैं जिसे गुर्दे के कैप्सूल में प्रत्यारोपित किया गया था (चित्र 3क) और प्राप्तकर्ता चूहों के भीतर 8 सप्ताह के विकास के बाद थाइमस (चित्र 3ख) । यह निर्धारित करने के लिए कि क्या टी कोशिकाओं का उत्पादन नग्न चूहों में किया गया थाइमस के साथ प्रतिरोपित किया गया थाइमस, दोनों प्रत्यारोपित थाइमस और परिधीय रक्त में, हमने सीडी 4 और सीडी 8 एंटीबॉडी धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके कोशिका ओंपीय ोंगादों का पता लगाया। परिधीय रक्त रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस सेएकत्र किया गया था जैसा कि पहले 12 वर्णित किया गया था। हमने पाया कि टी कोशिकाओं दोनों प्रत्यारोपित थाइमस और नग्न चूहों के परिधीय रक्त एक थाइमस के साथ प्रतिरोपित में उत्पादित किया गया. तथापि, गैर-प्रतिरोपित नग्न चूहों के परिधीय रक्त में कोई टी कोशिकाओं का पता नहीं चला (चित्र 4)। टी कोशिकाओं के स्रोत का निर्धारण करने के लिए हमने परिधीय सफेद रक्त कोशिकाओं में इन्सम1 और लैक जीनों की जांच की, जिनमें नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किए जाने वाले जीनोटाइपिंग विधियों का प्रयोग किया गया और पहले13,14का वर्णन किया गया था। चूंकि दाता भ्रूण Insm1 जीन एक या दोनों alleles में लाख जीन द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, जब टी कोशिकाओं को दाता से थाइमस के साथ सह-प्रतिरोपित किया गया था, हम परिधीय से एकत्र टी कोशिकाओं के जीनोम में लाख जीन का पता लगा सकता है प्राप्तकर्ता का रक्त, जो इंगित करता है कि वे दाता थाइमस द्वारा उत्पादित किए गए थे। इसके अतिरिक्त, के रूप में कोई लाख जीन मौजूद था, लाख का पता नहीं लगाया जाएगा जब टी कोशिकाओं प्राप्तकर्ता के hematopoietic कोशिकाओं से उत्पन्न किया गया. हमने परिधीय टी कोशिकाओं में लाख जीन का पता नहीं लगाया जो यह दर्शाता है कि टी कोशिकाएं प्राप्तकर्ता से उत्पन्न हुई थीं (चित्र 5)।

Figure 1
चित्र 1: थाइमस E18.5 भ्रूणों से अलग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: थाइमस खोपड़ी नस सुई से बने उपकरण देने. एक बेवल बनाने के लिए 45 डिग्री के कोण पर सुई के करीब जलसेक ट्यूब भाग में खोपड़ी नस सुई काट दिया गया था। प्रक्रिया में सुई और जलसेक ट्यूब दोनों का उपयोग किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: थाइमस गुर्दे के कैप्सूल में प्रत्यारोपित किया गया। (क) वृक्क कैप्सूल में पुन: प्रतिरोपित ई18.5 थाइमस। (बी) प्राप्तकर्ता में 8 सप्ताह की वृद्धि के बाद गुर्दे के कैप्सूल में थाइमस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसप्लांट किए गए थाइमस से अलग टी कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण, थाइमस-ट्रांसप्लांट किया गया और गैर-प्रतिरोपित नग्न चूहों का रक्त। टी कोशिकाओं के दाग के लिए सीडी 4 और सीडी 8 एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। CD4+CD8+ डबल सकारात्मक कोशिकाओं, CD4+ एकल सकारात्मक, CD8+ एकल सकारात्मक और CD4 - CD8-डबल नकारात्मक कोशिकाओं के रूप में संकेत दिया प्रत्येक uadrants में दिखाए जाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: थाइमस में परिधीय रक्त टी कोशिकाओं के स्रोत की पहचान नग्न चूहों प्रत्यारोपित. परिधीय रक्त श्वेत कोशिकाओं में लैक जीन और इन्सम1 जीन का जीनटाइपिंग दिखाया गया है। सीढ़ी: डीएनए मार्कर, + : सकारात्मक नियंत्रण डीएनए, -: नकारात्मक नियंत्रण डीएनए, Anim1: नग्न माउस के परिधीय सफेद रक्त कोशिकाओं से डीएनए Insm1लाख के साथ प्रत्यारोपित किया गया / Insm1+/lac] थाइमस के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

भ्रूणीय थाइमस का वृक्क उपकैप्सुलर प्रतिरोपण थाइमिक उपकला कोशिकाओं के कार्य और विवो में टी कोशिकाओं की परिपक्वता की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। हालांकि भ्रूण थाइमस अंग संस्कृति और प्रत्यारोपण6 ,7पर कई प्रयोगात्मक अध्ययन कर रहे हैं,हमारे प्रोटोकॉल murine भ्रूण थाइमस संस्कृति और गुर्दे subcapsular पर एक सरल वैकल्पिक प्रक्रिया प्रदान करता है पुराने थाइमस ऊतक के लिए प्रत्यारोपण.

हमारे प्रोटोकॉल में पिछले प्रोटोकॉल में कई अलग - अलग संशोधनों को शामिल करके सुधार किया गया है 6,7,10,11. सबसे पहले, E14-E16 थाइमस के बजाय, हम प्रत्यारोपण के लिए E18.5 से अलग थाइमस का उपयोग किया। लाभ यह है कि इस बाद के विकास के चरण में थाइमस में अपेक्षाकृत परिपक्व थाइमिक संरचनाएं और उपकला कोशिका आबादी होती है। हालांकि नवजात या वयस्क चूहों परिपक्व थाइमस का एक वैकल्पिक स्रोत हैं, यदि प्रसवकालीन घातक phenotype जीन हेरफेर का एक परिणाम के रूप में होता है, इस तरह के Jmd6 या Insm1 जीन में उत्परिवर्तन के रूप में5,13,इस विधि परिपक्व थाइमस के अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है। एक दूसरा संशोधन प्रत्यारोपण से पहले E18 थाइमस की संस्कृति विधि का पूर्वदर्शन है। इसके अतिरिक्त, एक तीसरा संशोधन प्रत्यारोपण प्रक्रिया में होता है, जिसमें हम सुई टिप का इस्तेमाल करने के बजाय उठा और tweezers और कैंची के साथ गुर्दे कैप्सूल काटने के गुर्दे कैप्सूल पर एक निक बनाने के लिए. इस संशोधन दोनों गुर्दे कैप्सूल क्षति और गुर्दे की चोट कम. एक अंतिम संशोधन सीवन चरण में है. संशोधित बाधित ऊर्ध्वाधर गद्दे सीवन त्वचा पर बाहर सीवन लाइन को समाप्त करता है और इसलिए काटने के कारण चीरा के उद्घाटन को रोकता है।

हालांकि इस प्रोटोकॉल गुर्दे कैप्सूल में E18.5 थाइमस प्रत्यारोपण के लिए प्रयोग किया जाता है, यह अन्य विकासात्मक चरणों में थाइमस के प्रत्यारोपण के लिए या इसी तरह के आकार के साथ अन्य ऊतकों के लिए संशोधित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस्तेमाल सामग्री विशेष रूप से संज्ञाहरण अभिकर्मकों जो स्थानीय कानूनों द्वारा प्रतिबंधित किया जा सकता है के संबंध में विभिन्न क्षेत्रों से विभिन्न उपयोगकर्ताओं द्वारा तदनुसार संशोधित किया जा सकता है. हमारे प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए पेंटोबार्बिटल की खुराक 75 ग्राम/जी शरीर के वजन है। हालांकि, एनेस्थेटाइज्ड जानवरों की मौत को रोकने के लिए अधिकतम खुराक 100 ग्राम/जी शरीर के वजन से अधिक नहीं होनी चाहिए। हालांकि गुर्दे कैप्सूल में थाइमस का प्रत्यारोपण विवो में थाइमस के कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक कुशल तरीका है, ऊपर प्रस्तुत विधि में कुछ सीमाएं मौजूद हैं। इन सीमाओं में विवो वृद्धि अवधि में 8 सप्ताह के दौरान गुर्दे के कैप्सूल से बाहर निकलने का खतरा शामिल है (1 में 12).। दूसरे एक और सीमा सर्जरी के बाद चूहों की मौत है (6 में 30). हालांकि, यह मौत मुख्य रूप से पेंटोबार्बिटल की अधिक मात्रा के कारण होती है। इस प्रकार, संज्ञाहरण के अन्य अनुमत विधियों को नियोजित किया जा सकता है।

सारांश में, हम अलग और संस्कृति E18.5 थाइमस के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और फिर बाद में गुर्दे के कैप्सूल में थाइमस प्रत्यारोपण. यह तो थाइमिक उपकला कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है समारोह और टी कोशिकाओं परिपक्वता की प्रक्रिया.

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Disclosures

ब्याज का कोई संघर्ष घोषित नहीं किया गया।

Acknowledgments

यह काम S.J. के लिए जिनान विश्वविद्यालय के प्रारंभ पैकेज द्वारा और ग्वांग्झू चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (ग्रेट नंबर 201704020209 S.J.). हम पांडुलिपि के proofreading और संपादन के लिए एमी Botta (जीव विज्ञान विभाग, न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय, टोरंटो, पर M3J 1P3, कनाडा) धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Povidone iodine Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd 20171113
0.9% Sodium Chloride Injection Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd 2C17112101
1 mL Sterile syringe Solarbio YA1090
2’-Deoxyguanosine MEC HY-17563 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate Corning Incorporated Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish Corning Incorporated 430166
70% ETOH LIRCON 20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies Biolegend 100711 1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1060 To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd 17062111 079 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JC2303 To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS? GIBCO 10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1050 To sterilize before use
Flow cytometry BD FACSCanto II
Flunixin meglumine MACLIN F810147 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5 World Precision Instruments 14098 To sterilize before use
Infrared lamp OTLAN MT-810
Needle holder, JZ 14 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J32010 To sterilize before use
PE anti-mouse CD4 Biolegend 100511 1:100
Penicillin-Streptomycin mixture GIBCO 15140122 1:100
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium GIBCO C14-11875-093
Scalp vein needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd XC001
Spring scissors VANNAS S11014-12 To sterilize before use
stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sterile 15cm cotton swab Guangzhou Haozheng 20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P Guangzhou Haozheng 20172640868
Sterile PBS (1x) GENOM GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J41010 To sterilize before use

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References

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