Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

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Genetics

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Summary

이 프로토콜의 목표는 인간 질병과 관련된 희귀 유전자 변이체의 기능적 결과를 평가하기 위해 Drosophila melanogaster에서 생체 내 실험의 설계 및 성능을 설명하는 것입니다.

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Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

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Abstract

시퀀싱 기술의 발전으로 전체 게놈 및 전체 엑솜 데이터 세트는 임상 진단 및 최첨단 인간 유전학 연구 모두에 더 쉽게 접근할 수 있게 되었습니다. 이러한 데이터 세트에서 확인된 변이체의 병원성을 예측하기 위해 여러 가지 실리코 알고리즘이 개발되었지만, 기능적 연구는 특정 게놈 변이체가 단백질 기능에 미치는 영향을 결정하는 데 매우 중요합니다. 변종. 진단되지 않은 질병 네트워크 (UDN) 및 기타 희귀 질환 연구 컨소시엄에서, Drosophila, C. elegans,제브라피시 및 마우스를 포함하는 모형 유기체 (MO)는 가치 인간 질병의 기능을 평가하기 위하여 적극적으로 이용됩니다 변종. 이 프로토콜은 UDN의 모델 유기체 스크리닝 센터 초파리 코어에 사용되는 희귀 인간 변이체의 기능적 평가를 위한 방법을 기술한다. 워크플로는 여러 공용 데이터베이스에서 인간 및 MO 정보를 수집하는 것으로 시작하여 MARRVEL 웹 리소스를 사용하여 변형이 환자의 상태에 기여할 가능성이 있는지 여부와 사용 가능한 실험을 기반으로 효과적인 실험을 설계하는 것으로 시작됩니다. 지식과 자원을 활용합니다. 다음으로, 유전 적 도구 (예를 들어, T2A-GAL4 및 UAS-인간 cDNA 라인)는 초파리에서관심있는 변이체의 기능을 평가하기 위해 생성됩니다. 이러한 시약의 개발시, 구조 및 과발현 실험에 기초한 두 갈래 의 기능성 실험이 변형 기능을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 구조 분지에서, 내인성 비행 유전자는 참조 또는 변이체 인간 형질전환유전자로 정형고성 Drosophila 유전자를 대체해서 "인간화"됩니다. 과발현 분지에서, 참조 및 변이체 인간 단백질은 다양한 조직에서 외인성으로 구동된다. 두 경우 모두, 임의의 코랭킹 표현형(예를 들어, 치사성, 눈 형태학, 전기생리학)은 관심 있는 질병에 관계없이 판독값으로 사용될 수 있다. 기준과 변이체 둘레 사이에 관찰된 차이는 변이체 특이적 효과, 따라서 가능성이 있는 병원성을 시사한다. 이 프로토콜은 알려진 및 알려지지 않은 기능을 가진 유전자의 가증한 인간 질병 유발 변이체의 신속하고 생체 내 평가를 허용합니다.

Introduction

희귀 질환 환자는 종종 정확한 진단을 얻기 위해 "진단 오디세이"라고불리는 힘든 여행을 겪습니다 1. 대부분의 희귀 한 질병은 유전 / 게놈 분석 임상 작업의 중요한 요소를 만드는 강한 유전 적 기원을 가지고 생각된다. 염색체 마이크로어레이에 기초한 후보 유전자 패널 염기서열 분석 및 카피 수 변이 분석 이외에, 전체 엑소메(WES) 및 전체 게놈 염기서열 분석(WGS) 기술은 지난 10년 동안 점점 더 가치 있는 도구가 되고 있다2, 3. 현재 WES 및 WGS에서 알려진 병원성 변이체를 확인하기 위한 진단율은 ~25%(소아의 경우 더 높는)4,5. 임상 WES/WGS 후에 진단되지 않는 남아 있는 대부분의 케이스를 위해, 일반적인 문제는 많은 후보 유전자 및 이체가 있다는 것입니다. 차세대 염기서열 분석은 종종 많은 유전자에서 신규또는 매우 드문 변이체를 식별하고, 이러한 변이체가 질병 표현형에 기여하는지 여부를 해석하는 것은 도전적입니다. 예를 들면, 유전자에 있는 대부분의 말도 안되는 또는 프레임 시프트 돌연변이는 인코딩된 전사체의 말도 안되는 중재된 부패 때문에 기능 상실 (LOF) eeles로 생각되더라도, 마지막 exons에서 찾아낸 돌연변이를 잘린 이 프로세스를 탈출하고 같이 기능할 수 있습니다 양성 또는 기능 의 이득 (GOF) 알레일6.

또한, 1930 년대에 허먼 뮬러에 의해 처음 설명 된 바와 같이 다른 유전 시나리오의 숫자 (즉, 변형, 가형, 과모프, 안티 모프, 네오모프, 또는 이소모프) 7 을 초래할 수 있기 때문에, 잘못된 알탐지 알레일의 효과를 예측하는 것은 어려운 작업입니다7 . 수많은 실리코 프로그램 및 방법론은 진화적 보존, 아미노산 변화의 유형, 기능적 영역 내위치, 일반 인구의 대문자 빈도에 기초하여 잘못된 변이체의 병원성을 예측하기 위해 개발되었으며, 및 기타 매개 변수8. 그러나 이러한 프로그램은 변형 해석의 복잡한 문제를 해결하기위한 포괄적 인 솔루션이 아닙니다. 흥미롭게도, 최근 연구는 5 개의 광범위하게 사용되는 변이체 병원성 예측알고리즘 (폴리펜 9, SIFT10,CADD11,PROVEAN12,돌연변이 테이스터)이 병원성 ~80 %에 동의한다는 것을 보여주었습니다8 . 특히, 모든 알고리즘이 동의하더라도, 그들은 시간의 11 %까지 병원성의 잘못된 예측을 반환합니다. 이것은 뿐만 아니라 결함이 있는 임상 해석으로 이끌어 냅니다 그러나 또한 양성으로 그(것)들을 거짓으로 나열하여 새로운 변이체에 후속에서 연구원을 단념할 수 있습니다. 실리코 모델링에서 현재의 한계를 보완하는 한 가지 방법은 시험관 내, 생체 외(예를 들어, 배양된 세포, 오르가노이드) 또는 생체내 변이체 기능의 효과를 입증하는 실험 데이터를 제공하는 것이다.

MO에 있는 희소한 질병 관련이체의 생체 내 기능적인 연구 결과는 13의 유일한 강점이 있고 미국에 있는 진단되지 않은 질병 네트워크 (UDN) 및 희소한을 포함하여 세계에 있는 많은 희소한 질병 연구 이니셔티브에 의해 채택되었습니다 캐나다, 일본, 유럽 및 호주의 질병 모델 및 메커니즘 (RDMM) 네트워크14. MO 연구자를 희귀 질환 진단 및 기계론 적 연구의 워크플로우에 통합하기 위한 이러한 협력적 노력 외에도 임상 및 MO 연구자 간의 다수의 개별 공동 연구결과가 발견으로 이어졌습니다. 및 많은 새로운 인간 질병을 일으키는 유전자및 변이체82,83,84의특성화.

UDN에서, 중앙 집중식 모형 유기체 검열 센터 (MOSC)는 환자의 상태에 대한 설명과 함께 후보 유전자 및 변이체의 제출을 수신하고 이체가 정보학 도구 및 생체 내에서 병원성일 가능성이 있는지 여부를 평가합니다. 실험. UDN의 단계 I (2015-2018)에서, MOSC는 Drosophila 코어 [의학의 베일러 대학 (BCM)] 및 얼룩말 물고기 코어 (오리건 대학)로 구성 사례를 평가하기 위해 협력했다. 정보학 분석 및 Drosophila와 zebrafish에 있는 다른 실험 전략의 수를 사용하여, MOSC는 지금까지 132명의 환자의 진단, 31의 새로운 증후군55의확인, 몇몇 새로운 인간발견의 진단에 기여했습니다 질병 유전자 (예를 들어, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720)및 알려진 질병의 현상치 확장 유전자 (예: CACNA1A21,ACOX122).

UDN 내의 프로젝트 이외에, MOSC Drosophila 코어 연구원은 Mendelian 유전체학 및 그밖 이니셔티브를 위한 센터와 협력하여 새로운 질병 유전자 발견에 기여했습니다 (예를 들면, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29)동일한 정보학 및 유전 적 세트를 사용 UDN을 위해 개발된 전략. 희귀 질환 진단에 대한 MO 연구의 중요성을 감안할 때, MOSC는 UDN의 단계 II (2018-2022)에 대한 C. 예쁜 꼬마 코어와 두 번째 얼룩말 코어 (세인트 루이스의 워싱턴 대학 모두)를 포함하도록 확장되었습니다.

이 원고는 UDN MOSC Drosophila Core에서 활발히 사용되는 생체 내 기능적 연구 프로토콜을 설명하여 잘못된 변형이 인간을 발현하는 형질전환 파리를 사용하여 관심 단백질에 기능적 영향을 미치는지 여부를 결정합니다. 단백질. 이 프로토콜의 목표는 MO 연구원이 임상 연구 그룹과 협력하여 관심 유전자의 후보 변형이 기능적 결과를 가지고 있다는 실험적 증거를 제공하도록 돕고 임상 진단을 용이하게하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 연구원이 관심있는 유전자에 있는 특정 후보 이체를 가진 희소한 질병 환자가 있는 임상 조사체에 의해 접근하는 시나리오에서 가장 유용합니다.

이 프로토콜은 세 가지 요소로 나눌 수 있습니다: (1) 환자 표현형및 Drosophila에서기능적 연구의 타당성에 대한 책임이 있는 관심의 변이체의 가능성을 평가하기 위해 정보를 수집, (2) 수집 기존 유전 도구 및 새로운 도구를 확립하고, (3) 생체 내에서 기능 적 연구를 수행. 세 번째 요소는 관심 있는 변형의 기능을 평가하는 방법(구조 실험 또는 과발현 기반 전략)에 따라 두 개의 하위 요소로 더 세분화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 희귀 한 단일 원성 질환 연구 (예 : 일반적인 질병, 유전자 환경 상호 작용 및 약리학 / 유전 스크린)를 제외한 많은 시나리오에 적응하고 최적화 할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 변이체의 기능과 병원성을 결정하는 능력은 정확한 분자 진단을 제공함으로써 관심있는 환자에게 유익할뿐만 아니라 번역 및 기본 과학 연구 모두에 더 광범위한 영향을 미칠 것입니다.

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Protocol

1. 인간과 MO 정보를 수집하여 평가: 관심의 변형이 질병 표현형 및 초파리 기능 연구의 타당성에 대한 책임이 있는 가능성

  1. 광범위한 데이터베이스 및 문헌 검색을 수행하여 관심 있는 환자의 표현형을 설명하기 에 적합한 후보인지 여부를 결정합니다. 구체적으로 다음 정보를 수집합니다.
    1. 관심 유전자가 이전에 다른 유전 질환 (알려진 질병 유전자의 phenotypic 확장)에 연루되었거나 완전히 새로운 질병 후보 유전자 [불확실한 유의성 (GVUS)의 유전자 변이체]인지 평가하십시오.
    2. 질병 또는 제어 인구 데이터베이스에 대한 관심 의 변이체의 대말 빈도를 평가합니다.
    3. 질병 또는 대조군 데이터베이스에 이 유전자를 포함하는 카피 수 변이(CNV)가 있는지 여부를 평가합니다.
    4. 마우스, 제브라피시, 초파리, C. 예쁜꼬마선충 및 효모를 포함한 다른 MO 종에서 정형신 유전자가 무엇인지 평가한 다음 이러한 정형 고성 유전자의 알려진 기능과 발현 패턴을 추가로 조사합니다.
    5. 관심의 변이체가 단백질의 기능적 영역에 존재하는지, 관심있는 아미노산이 진화적으로 보존되는지 평가한다.
      참고: 이 다섯 가지 질문에 대한 답변(1.1.1-1.1.5 단계)은 여러 인간 및 MO 데이터베이스에 개별적으로 액세스하거나 MARRVEL(희귀 변형 탐색을 위한 모델 유기체 집계 리소스) 웹 리소스(표 참조)를 사용하여 얻을 수 있습니다. 1 온라인 리소스)30,이는 첨부 된 기사31에자세히 설명되어 있습니다. 구체적인 예제는 대표 결과 섹션을 참조하십시오. 군주 이니셔티브 웹 사이트32 및 Gene2Function33도 유용한 정보를 제공합니다.
  2. 추가 정보를 수집하여 이체가 단백질 기능 및 구조 적 관점에서 양호한 질병 후보인지 여부를 추가로 평가합니다.
    1. 관심 의 변형이 실리코 예측 알고리즘에 따라 손상될 것으로 예상되는지 평가합니다.
      참고: 변이체 병원성 알고리즘은 지난 ~ 15 년 동안 많은 연구 그룹에 의해 개발되었으며, 일부는 MARRVEL 검색 결과에 표시됩니다. 아래에 나열된 두 가지를 포함한 최신 프로그램은 여러 변이체 병원성 재생산 알고리즘과 기계 학습 접근법을 결합하여 병원성 점수를 생성합니다. 변형 예측 알고리즘 및 성능에 대한 자세한 내용은 Ghosh,외 8을 참조하십시오. (i) CADD (결합 된 어노미 - 의존적 고갈): 인간 SNV뿐만 아니라 짧은 삽입 및 삭제11에대한 점수를 제공하는 60 개 이상의 게놈 기능으로 구축 된 통합 적 어노미 뮬레이션 . (ii) REVEL (희귀 엑소메 변이체 앙상블 학습자): 여러 변이체 병원성 알고리즘 (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, 돌연변이 평가기, 돌연변이 맛보기, LRT, GERP, SiPhy, phyloP 및 패시콘)을 결합하여 통합 점수를 제공합니다. 가능한 모든 인간의 오해 변형34.
    2. 관심 있는 인간 유전자/단백질 또는 MO 직교가 이전에 유전 질환에 연결된 유전자/단백질과 유전적으로 또는 물리적으로 상호 작용하는 것으로 나타났는지 확인합니다. 그렇다면, 관심 있는 환자가 이러한 장애와 겹치는 표현형을 나타내는지 평가한다.
      참고: 여러 종 화면에서 MO 간행물뿐만 아니라 대규모 단백질 을 기반으로 유전 및 단백질 상호 작용을 분석하기 위해 여러 도구가 개발되었습니다. STRING (이웃 유전자의 반복 인스턴스에 대한 검색 도구)35: 알려진 및 예측 단백질 상호 작용에 대한 데이터베이스. 그것은 다양한 유기체에서 함께 작동 할 수있는 유전자와 단백질을 식별하기 위해 유전자 상호 작용 및 공동 발현 데이터 세트뿐만 아니라 텍스트 마이닝 도구를 통합합니다. MIST (분자 상호 작용 검색 도구)36: 핵심 유전 적 MO (효모, C. elegans, 초파리,얼룩말, 개구리, 쥐, 마우스) 및 인간으로부터의 유전 및 단백질 상호 작용 데이터를 통합하는 데이터베이스. 정형 유전자 /단백질 (인터로그)에서 추론 상호 작용의 예측도 표시됩니다.
    3. 관심 단백질의 3-D 구조가 해결되었는지 또는 모델링되었는지 확인합니다. 그렇다면 관심 있는 변형이 주요 기능 도메인을 기준으로 매핑되는 위치를 결정합니다.
      참고: X선 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 및 극저온 전자 현미경 검사법에 의해 해결 된 단백질 구조는 PDB (단백질 데이터 뱅크) 및 EMDatabank37을포함한 공공 데이터베이스에서 찾을 수 있습니다. 예측/모델링된 단백질 구조에 대한 단일 데이터베이스는 없지만 사용자가 단백질 모델링을 수행할 수 있는 여러 알고리즘(예: SWISS-MODEL38,Modeller39및 Phyre240)을사용할 수 있습니다.
  3. 임상 협력자와 통신하여 섹션 1.1-1.2의 정보학 분석에서 수집된 정보를 논의합니다. 임상 협력자가 또한 관심있는 변이체 및 유전자가 환자에서 보이는 표현형을 설명하기에 좋은 후보라고 느끼는 경우, 섹션 2로 진행하십시오. 환자의 유전자형 및 표현형에 대한 특정 질문이있는 경우, 앞으로 이동하기 전에 임상 협력자와 논의하십시오.
    참고: 관심의 변이체가 관심표현형을 설명할 가능성이 낮다고 생각되면 (예 : 제어 인구의 고주파에서 발견되는 동일한 변형) 변이체가 양호한지 여부를 결정하기 위해 임상 협력자들과 상의하십시오. 임상 표현형을 해석하는 데 적절한 전문 지식이 없을 수 있습니다.

2. 기존 유전 도구를 수집하고 관심의 특정 변종을 연구하기 위해 새로운 시약을 설립

참고: 일단 관심의 변이체가 실험적으로 추구할 좋은 후보가 결정되면, 생체 내 기능 연구를 수행하기 위해 시약을 수집하거나 생성한다. 이 프로토콜에 기술된 기능적 연구를 위해, 몇몇 중요한 Drosophila melanogaster 시약은 필요합니다: 1) 상류 활성화 서열 조절 인간 cDNA 형질전환 균주는 기준 또는 변이체 서열을 운반하는, 2) 기능 상실 관심있는 비행 유전자의 알레, 및 3) 구조 실험에 사용할 수있는 GAL4 라인.

  1. UAS-인간 cDNA 생성 및 형질전환 파리
    1. 적절한 인간 cDNA 구수를 식별하고 구한다. 많은 클론은 MGC (포유류 유전자 수집)43에서 사용할 수 있으며 선택된 판매자로부터 구입할 수 있습니다. 대안적으로 접합되는 유전자의 경우, 어떤 이소폼 cDNA가 Ensembl 또는 RefSeq를 사용하는 것과 일치하는지 확인하십시오.
      참고: 많은 cdNOA는 재조합 매개 복제 시스템 호환 시약44에서사용할 수 있으며, 이는 서브 클론 단계를 단순화합니다. cDNOA는 "열기(정지 코돈 없음)" 또는 "폐쇄(내인성 또는 인공 정지 코돈)" 형식으로 올 수 있습니다. 개방 클론은 생화학적(예를 들어, 웨스턴 블롯) 및 세포 생물학적(예를 들어, 면역 염색) 분석실험에 유용한 단백질의 C'-tagging을 허용하는 반면, 관심 있는 단백질의 발현을 모니터링하는 것은 경우에 따라 단백질 기능을 방해할 수 있다.
    2. 서브-초파리 형질전환 벡터내로 참조 및 변이체 cDNA를 복제한다. φC31 매개 형질 전환 시스템을 사용하면 참조 및 변이체 cDNA가 게놈45에서동일한 위치에 통합 될 수 있습니다. 이 프로젝트의 경우 MOSC 초도핵은 pGW-HA.attB 벡터46을일상적으로 사용합니다.
      참고: 인간 cDNA가 재조합 매개 복제 시스템 호환 벡터 (예 : pDONR221, pENTR221)에 있는 경우, 섹션 2.1.4로 건너 뛰고, 이는 pGW-HA.attB로 cDNA를 서브 클론하는 LR 반응을 설명합니다.
      1. 인간 cDNA가 재조합 매개 복제 시스템 호환 플라스미드에 없는 경우, 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 인간 cDDNA를 게이트웨이 진입 벡터로 서브클론(이러한 프로토콜의 예는 아래에 문서화되어 있음).
        1. 오버행 PCR을 수행하여 attB1attB2 암을 소개합니다. 전방 프라이머는 attB1 서열 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAAAAAAGCAGGCTTCACC-3'를 가지고 표적 cDNA의 제1 22뉴클레오티드를 가져야 한다. 역프라이머는 attB2 서열 5'-GGGGACCACTTTACAAAAGCTGGGTTTA-3'를 가지고 관심 있는 cDNA의 마지막 25개의 뉴클레오티드의 역보보체를 가져야 한다. cDNA의 정지 코돈제외, 복제본을 "열면" C' 태그를 추가하거나 스톱 코동을 추가하여 클론을 "닫아".
        2. 고충실도 PCR 마스터 믹스 50 μL, 증류수 36 μL, 2.1.2.1.1 단계에 나열된 각 순방향 및 역방향 프라이머 5 μL, 10 μM으로 희석된 4 μL의 표적 cDNA(150 ng/μL)로 구성된 100 μL의 고충실도 PCR 믹스를 준비합니다.
        3. 표준 돌연변이 체전 프로토콜을 사용하여 PCR을 수행하여 관심 있는 cDNA에 attB1attB2 무기를 추가합니다. 조건은 관심 있는 구성 및 변형에 따라 달라집니다.
        4. 젤 전기 동동 및 젤 추출을 통해 추가 된 상동성 무기로 대상 cDNA를 분리하십시오. 1% 아가로즈 젤을 만들고 표준 방법을 사용하여 전기 동극을 수행합니다. cDNA의 크기와 상동성 무기의 추가 길이에 해당하는 밴드를 절제합니다. 표준 방법95를통해 겔로부터 DNA를 추출한다. 상용 젤 추출 키트는 여러 회사에서 사용할 수 있습니다.
        5. 사용되는 시스템에 따라 재조합 매개 복제 프로토콜에 기초하여 시험관내 재조합 반응을 수행한다.
        6. BP 반응 혼합물을 화학적으로 유능한 대장균 세포로 변환합니다. 유능한 세포는 사내에서 만들거나 상업 공급 업체에서 구입할 수 있습니다. 식민지 선택을 위한 적절한 항생제를 함유하는 LB 플레이트상에서 하룻밤 동안 형질전환된 세포를 배양하였다. 다음 날, 여러 식민지를 선택하고 하룻밤 독립적 인 액체 문화에서 성장.
        7. 미니프렙을 통해 하룻밤 배양으로부터 DNA를 분리합니다. Sanger 는 양성 클론을 시퀀스하여 cDNA가 올바른 서열96을가지고 있는지 확인합니다. -80°C에서 저장된 25% 글리세롤에서 원하는 서열에 대해 양성인 배양물로부터 세포를 유지한다.
    3. 참조 인간 cDNA97을사용하여 게이트웨이 플라스미드내로 관심의 변이체를 소개하기 위해 사이트 지시 돌연변이 발생을 수행한다. 이 방법에 대한 자세한 프로토콜은 공급업체의 웹 사이트48,49에서찾을 수 있습니다. 전체 개방 판독 프레임(ORF)의 Sanger 시퀀싱을 통해 돌연변이 플라스미드내의 변이체의 존재를 검증하여 이 돌연변이 생성 단계를 통해 추가적인 변이체가 없는지 확인합니다.
    4. LR 클로나제 반응을 통해 기증자 플라스미드(attL1attL2 부위가 있는 게이트웨이 플라스미드)에서 참조 및 변이체 인간 cdNAs를 형질전환 플라스미드(예를 들어, attR1attR2 부위가 있는 pGW-HA.attB)로 서브클론한다.
      참고: 제한 효소 방법을 통해 인간 cDNA를 서브 클론하는 것이 바람직한 경우 기존의 제한 효소 기반 서브 클로닝 (예를 들어, pUAST.attB50)을위해 설계된 UAS φC31 벡터가 있습니다.
    5. UAS-인간 cDNA 트랜스유전자를 통합하는 φC31 도킹 사이트를 선택합니다. 도킹 사이트의 수는 여러 실험실에 의해 생성되었으며 스톡 센터50,52,53에서공개적으로 사용할 수 있습니다.
      참고: 관심 있는 유전자의 플라이 직교를 포함하지 않는 염색체상에 인간 이식유전자를 사용하는 것이 편리하기 때문에, 플라이 직교가 X에 있을 때 두 번째 염색체 도킹 사이트 [VK37(BDSC 스톡 #24872]를 사용하는 것이 좋습니다. , 제3, 또는 제4 염색체는, 제3 염색체 도킹 부위[VK33(BDSC 스톡 #24871]를 사용하여 비행 교정이 제2 염색체상상에 있을 때.
    6. UAS-인간 cDNA 구성을 게르맥라인에서 φC31 인테그라스를 발현하는 파리에 주입합니다(예: vas-φC31, nos-φC31).
      참고: 미세 주입은 사내에서 수행되거나 트랜스제네시스를 위해 핵심 시설 또는 상업 기관으로 전송될 수 있습니다. 형질전환파리생성을 위한 상세한 프로토콜은 인용된 도서장51장에서찾을 수 있다.
    7. 주입된 배아로부터 안정적인 형질전환 균주를 확립한다. 94개 시공당 ~100-200개의 배아를 주입한다. 제2 염색체 도킹 부위(VK37)로의 이식유전자 삽입을 위한 대표적인 교차 방식은 도 1A에도시되어 있다. 기본 초파리 유전학 정보에 대한 인용 책54,55를 참조하십시오.
  2. 구조 기반 기능 성 어세이의 용이성 T2A-GAL4 라인을 얻거나 생성 (그림 2 및 섹션 3.1 참조).
    참고:이 줄은 두 가지 용도로 사용됩니다. 첫째, 대부분의 T2A-GAL4 라인은 유전자 트랩 알레일로서 작용하여 강력한 LOF 대열종으로 작동합니다. 둘째, T2A-GAL4 라인은 관심 있는 유전자의 내인성 조절 요소(그림2A-C)에서UAS 구문(예: UAS-GFP, UAS-인간 cDNAs)의 발현을 허용하는 GAL4 드라이버로서 기능한다.
    1. ~1,000T2A-GAL4 라인이 생성된 Drosophila 유전자 파괴 프로젝트(GDP)58을 포함하여 사용 가능한 T2A-GAL4 라인에 대한 공개 재고 컬렉션을 검색하여59개. 이 균주는 현재 블루밍턴 Drosophila 주식 센터에서 사용할 수 있습니다 (BDSC) GDP와 BDSC 웹 사이트를 통해 검색 할 수 있습니다.
    2. 관심 있는 플라이 유전자를 위한 T2A-GAL4 라인을 사용할 수 없는 경우, 적합한코딩 인트로닉 MiMIC(Minos-mediated 통합 카세트) 라인이 재조합 매개 카세트 교환(RMCE)을 사용하여 T2A-GAL4 라인으로 변환할 수 있는지 확인하십시오. )60 (그림2A).
      참고: RMCE는 기증자 구문의 미세 주입을 통해 T2A-GAL4 라인으로 변환 될 두 코딩 엑온 사이에있는 인트로닉 MiMIC 요소를 허용합니다 (교차 방식의 예는 그림 1B에나와 있습니다) 또는 일련의 십자가, 세부 57,59에설명 된 대로 .
    3. T2A-GAL4 라인을 사용할 수 없고 적절한 코딩 인트로닉 MiMIC가 존재하지 않는 경우, CRIMIC(CRISPR-mediad 통합 카세트)시스템(59)을통해 T2A-GAL4 라인을 생성할 수 있는 가능성을 탐구한다.
      참고: 이 방법론은 CRISPR 매개 DNA 절단 및 상동성 지향 수리 (HDR)를 사용하여 MiMIC와 같은 카세트를 관심있는 유전자의 코딩 인트론에 통합합니다.
    4. 관심 유전자가 큰 인트론(>150 bp)이 없거나 인트론이 없는 경우,설명된 20,61,62와같이 HDR을 사용하여 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 GAL4 이식유전자를 플라이 유전자로 노크하려고 시도한다.
      참고:T2A-GAL4 또는 GAL4 노크-인 우두절의 생성이 어려운 경우, 기재된 92(REF)와 같이 이러한 기존 알레또는 RNAi 라인 및 유비쿼터스 또는 조직 특이적 GAL4 드라이버를 사용하여 구조 실험을 수행하려고 시도한다.

3. 초파리에서 생체에 대한 관심의 인간 변종의 기능 적 분석을 수행

참고: 2절에서 수집되거나 생성된 도구를 사용하여 구조 기반 분석(섹션 3.1)과 과발현 연구(섹션 3.2)를 수행하여 Drosophila에서생체내 의 이체의 결과를 평가합니다. 두 가지 방법이 모두 상호 보완적이기 때문에 두 가지 방법을 모두 사용하는 것이 좋습니다.

  1. 구조 기반 실험을 통한 기능 분석 수행
    참고: 이종 구조 기반 의 실험Drosophila인간 단백질을 사용하여 2개의 orthologous 유전자의 분자 기능이 ~5억 년 이상 진화의 보존되었는지 여부를 결정합니다. 그(것)들은 또한 인간 적인 단백질의 맥락에서 이체의 기능을 평가합니다63. 수백 쌍의 유전자 쌍을 연구하는 체계적인 분석이 보고되지 않았지만, 수십 개의 인간및 포유류(예를 들어, 마우스) 유전자가Drosophila유전자13.
    1. 구조 기반 접근법에서 먼저 변이체의 기능을 평가하기 전에 플라이 직교에서 LOF 돌연변이체에 명백하고, 비결하며, 재현 가능한 표현형이 있는지 여부를 결정합니다.
      참고: 플라이 유전자에 대한 이전 문헌은 먼저 데이터 마이닝에 좋은 장소이며, FlyBase 및 PubMed를 포함한 데이터베이스를 사용하여 찾을 수 있습니다. MARRVEL, 군주 이니셔티브 및 Gene2Funcion과 같은 추가 데이터베이스도 이 정보를 수집하는 데 유용합니다.
    2. 동형접합체 및 헤미지구스(T2A-GAL4 allele)에서 분자적으로 정의된 염색체 결핍 동물에 대한 전 세계적인 조사를 수행하며, 특히 T2A-GAL4 알레르가 특정 유전자를 특징으로 하는 첫 번째 돌연변이인 경우. 치사성, 불임, 장수, 형태학(예: 눈의 크기 및 형태) 및 행동(예: 구애, 비행, 등반 및 뱅 감도 결함)과 같은 표현형을 평가합니다.
      참고: 이 1 차적인 스크린에서 확인된 중요한 표현형이 없는 경우에, 전기 생리학 기록에 의해 측정된 신경학상 결함과 같은 더 미묘한 표현형은 높게 재현가능하고 특정인 경우에 이용될 수 있습니다. 일례로, 전기레티노그램(ERG)을 이용한 기능적 연구는 3.2.3단계에서 설명되어 있다. 어떤 코콜화 표현형을 검출하는 데 실패하는 경우, 섹션 3.2로 이동하고 과발현 기반 기능 연구를 수행한다.
    3. 일단 scorable 표현형이 플라이 LOF 돌연변이체에서 확인되면, 참조 인간 cDNA가 돌연변이 플라이 라인을 구출하기 위해 인간 cDNA를 사용하여 비행 직교의 기능을 대체 할 수 있는지 여부를 테스트합니다. 여기서 수행되는 현상형 분석기는 3.1.2단계로부터의 결과에 따라 달라지며 연구중인 유전자에 특이적일 것이다.
      참고: 비행 유전자의 "인간화"가 성공하면, 이제 기준 대조에 비해 관심의 변이체에 대한 구조의 효율성을 비교할 수있는 플랫폼이 있습니다. 참조 인간의 cDNA로 볼 구조는 완벽 할 필요가 없습니다. 인간 cDNA를 이용한 플라이 돌연변이 표현형의 부분 구조는 여전히 변이체 인간 cDNA 균주를 사용하여 비교 연구를 수행하기 위한 기준점을 제공한다.
    4. 3.1.2단계에서 선택된 분석 시스템을 사용하여, 참조 인간 cDNA로 관찰된 구조를 변형 인간 cDNA로 관찰한 구조와 비교하여 관심 있는 유전자에 대한 결과가 있는지 를 확인한다.
      참고: 변이체 인간 cDNA가 기준 대말보다 더 나쁜 성능을 발휘하는 경우, 이것은 관심의 변이체가 단백질 기능에 해로운 것을 시사한다. 변이체 및 참조가 기능적으로 구별될 수 없는 경우, 1) 알레는 이소모프(단백질 기능에 영향을 미치지 않는 변이체) 또는 2) 분석실험이 미묘한 차이를 검출할 만큼 민감하지 않을 수 있다.
    5. 변이체가 해로운 대문자로 밝혀지면, 다음 추가는 서쪽 얼룩, 면역 형광 염색, 또는 다른 방법을 통해 생체 내에서 관심있는 기준 및 변이체 단백질의 발현 및 세포내 국소화를 평가한다93.
      참고: UAS 인간 cDNA가 pGW-HA.attB 벡터의 개방 클론에서 생성되는 경우, 항 HA 항체를 사용하여 이러한 생화학 및 세포 분석을 수행합니다. 본래 클론이 폐쇄된 클론인 경우, 인간 단백질에 대한 상업적 항체가 이러한 실험에 사용될 수 있는지 여부를 테스트합니다. 발현 수준과 세포내 국소화의 차이는 관심의 변이체가 단백질 기능에 미치는 영향을 밝힐 수 있습니다.
  2. 과발현 연구를 통한 기능 분석 수행
    참고: 그렇지 않으면 야생 형 파리에서 인간 cDNA의 유비쿼터스 또는 조직 별 과발현은 섹션 3.1에서 논의 된 구조 기반 실험에 보완되는 정보를 제공 할 수 있습니다. 구조 기반 세포는 주로 LOF 변이체 (무정형, hypomophic)를 검출하도록 설계되었지만, 과발현 기반 의 학적 인 세포는 평가하기가 더 어려운 기능의 이득 (GOF) 변이체 (과모형, 반모형, 신형태)를 나타낼 수 있습니다.
    1. 관심 있는 인간 cDNA를 과도하게 표현할 GAL4 드라이버 집합을 선택합니다. 유비쿼터스 및 조직/단계별 GAL4 드라이버는 공공 재고 센터(예: BDSC)에서 구할 수 있으며, 그 중 일부는 다른 드라이버보다 더 자주 사용됩니다. 먼저 유비쿼터스 드라이버와 쉽게 코랭킹 표현형 (치사성, 불임, 형태 학적 표현형)에 초점을 맞추고 조직 별 드라이버 및 보다 구체적인 표현형으로 이동합니다.
      참고: 실험에서 사용하기 전에 식 패턴을 확인하려면 리포터 줄(예: UAS-GFP)이 있는 GAL4 드라이버의 식을 확인합니다.
    2. 동일한 조건(예: 온도)에서 동일한 드라이버로 동일한 드라이버를 사용하여 참조 및 변형 인간 cDNA를 발현하여 GAL4 라인에서 3-5 처녀 암컷(예: 눈 의 눈 의 눈 동디스크 발현을 위한 ey-GAL4)을 UAS 라인에서 3-5마리의 수컷 파리로 교차시킴으로써 [예를 들어, UAS-TBX2(+) 또는 UAS-TBX2(p.R305H)는 단면 4.2에 도시된 예로서 단일 바이알에서.
      1. 2-3일마다 십자가를 옮기면 많은 동물들이 한 번의 십자가에서 닫히게 됩니다.
    3. 자손을 검사하고 해부 현미경의 밑에 기준과 변이체 긴장 (예를 들면, 눈 형태)의 어떤 다름든지 검출합니다. 해부 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 파리를 이미지화하여 표현형을 문서화합니다.
      참고: 표현형이 참조에서만 보이지만 변형 선에서는 보이지 않는 경우 변형은 무형 또는 강한 hypomorphic 대일일 수 있습니다. 표현형이 두 유전자형에서 보이지만 기준이 더 강한 결함을 일으키는 경우에, 그 때 이체는 온화한 약한 hypomorphic eele일지도 모릅니다. 기준이 표현형을 나타내지 않거나 약한 표현형을 나타내지만 변이체가 강한 결함을 나타낸다면, 변이체는 GOF 알레일 수 있다.
    4. 표현형이 표준 배양 조건(RT 또는 25°C에서)에서 보이지 않는 경우, UAS/GAL4 시스템은 온도 민감도64,65로알려져 있기 때문에 18-29°C에 이르는 상이한 온도에서 십자가를 설정한다. 전형적으로, UAS 트랜스유전자의 발현은 더 높은 온도에서 더 높다.
  3. 관심 있는 유전자 및 단백질과 관련된 추가적인 기능적 연구를 수행합니다.
    참고: 일반적인 결함을 검사하는 것 외에도 유전자 및 변이체의 분자 기능을 조사하기 위해 분석 시스템을 선택할 수 있습니다. 대표적인 결과에 대해 논의된 한 가지 예에서(TBX2케이스), ERG 기록은 관심의 비행 유전자 이후, 광수용체 기능에 대한 변이체의 효과를 결정하는 데 사용되었다 (bifid)은 시각 시스템 개발의 맥락에서 광범위하게 연구되었다. ERG에 대한 자세한 프로토콜Drosophila이전에 게시된 대로 찾을 수 있습니다.66,67,68.
    1. 시각 시스템의 기능적 결함을 테스트하기 위해 플라이를 생성합니다. Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 라인에서 R1-R6 광수용체에 관심 있는 인간 단백질을 발현하기 위해 참조 또는 변이체 UAS-인간 cDNA 트랜스유전자를 가진 남성으로 크로스 버진 암컷.
      참고: 3-5 처녀 암컷을 3-5 마리의 수컷이 단일 바이알로 날아다니고 2-3일마다 십자가를 옮겨 많은 동물이 한 번의 십자가에서 달아나게 한다. 모든 십자가는 일관된 결과를 얻기 위해 실험 온도에서 설정된 인큐베이터에 보관되어야 합니다.
    2. 일단 파리가 닫히기 시작하면 (초기 십자가를 설정한 후 25 °C에서 ~ 10 일), 자손을 수집(Rh1-GAL4 /+; UAS-인간 cDNA/+)신선한 바이알에 넣고 시각적 시스템이 성숙할 수 있도록 추가로 3일 동안 실험 온도에서 설정된 인큐베이터에 다시 넣습니다.
      참고: ERG는 1-2 일 오래 된 파리에서 수행 할 수 있지만, 새로 닫힌 파리는 ERG 신호에 큰 변동이있을 수 있습니다. 나이에 의존하는 표현형을 검사하는 것이 바람직한 경우에, 이 파리는 젖은 음식에 익사하는 것을 피하기 위하여 새로운 유리병으로 정규로 (예를 들면, 매 5 일) 옮겨지는 한 몇 주 동안 숙성될 수 있습니다.
    3. 먼저 CO2를 사용하여 파리를 마취하거나 얼음에 유리병에 넣어 ERG 기록을 위한 파리를 준비합니다. 유리 현미경 슬라이드에 비행의 한쪽을 부드럽게 붙이면 고정됩니다.
      참고: 여러 참조 및 변형 파리는 하나의 슬라이드에 접착 할 수 있습니다. 모든 파리를 거의 동일한 방향으로 배치하고 한 눈은 기록 전극에 액세스할 수 있습니다. 눈에 접착제를 얻을 하지 않도록 주의 하 고 proboscis 무료 떠나.
    4. 기록 및 참조 전극을 준비합니다. 1.2 mm 유리 모세관을 바늘 풀러에 넣고 활성화하십시오. 두 개의 날카로운 테이퍼 전극을 얻기 위해 모세관을 깰. 생성된 전극은 비어 있어야 하며 최종 직경은 <0.5 mm여야 합니다.
    5. 식염수 용액 (100mM NaCl)으로 모세 혈관을 채우고 기포가 없는지 확인하십시오. 유리 모세혈관을 은선 전극 위로 밀어 (기록 전극과 참조 전극 모두, 그림 4참조) 모세 혈관을 제자리에 고정시다.
    6. 자극기와 앰프를 구성합니다. 자세한 설정은 라우베르스, 외67에서찾을 수있습니다. UDN Drosophila MOSC 셋업은 재료 섹션에 나열된 장비로 구성됩니다.
      1. 앰프를 0.1Hz 하이패스 필터, 300Hz 로우패스 필터 및 100 게인으로 설정합니다.
      2. 자극기를 1s period, 500 ms 펄스 폭, 500 ms 펄스 지연, 실행 모드 및 7 암페어로 설정합니다.
      3. 광원을 준비하여 광원을 자극합니다. 할로겐 광원을 사용하여 플라이 광수용체를 활성화합니다.
      4. ERG 설정에 연결된 컴퓨터에서 레코딩 소프트웨어를 준비합니다. 수집 모델 "고정 길이 이벤트" 및 20s 기간을 사용하여 자극 프로토콜을 만듭니다.
    7. ERG 녹음을 시작하기 전에 어둠을 완료하기 위해 파리에 적응. 실험을 시작하기 전에 파리를 적어도 10분 동안 완전한 어둠 속으로 놓습니다.
      참고: 파리는 적색광을 감지할 수 없으므로 어두운 습관의 기간 동안 적색 광원을 사용합니다.
    8. 파리를 포함하는 슬라이드를 기록 장치에 놓고 기준및 기록 전극을 운반하는 마이크로 조작기를 슬라이드상에서 관심 있는 비행에 가까운 지점으로 이동시다. 전극의 끝을 보고 참조 전극을 플라이의 흉부 (표피 침투)에 조심스럽게 놓습니다. 기준 전극이 안정적으로 삽입되면 기록 전극을 눈 표면에 놓습니다.
      참고: 이 기준 전극의 정확한 위치는 ERG 신호에 큰 영향을 미치지 않습니다. ERG는 세포내 기록이 아닌 필드 전위 기록이기 때문에 기록 전극은 눈의 표면에 배치되어야 합니다. 기록 전극에 가해지는 적절한 양의 압력은 눈을 관통하지 않고 작은 보조개발생한다.
    9. 어두운 환경에 파리를 적응하기 위해 또 다른 3 분 동안 모든 조명을 끕니다.
    10. 레코딩 소프트웨어를 설정하고 신호 녹음을 시작합니다. 수동 셔터가 있는 할로겐 광원을 사용하는 경우 셔터를 닫고 광원을 켭니다. 신호 녹음을 시작합니다.
    11. 한 번의 주행으로 1s마다 셔터를 열고 닫아 플라이 눈을 빛에 노출시면 됩니다.
      참고: 할로겐 광원의 온 / 오프는 수동으로 제어하거나 흰색 LED 광원을 사용하여 자동화되도록 프로그래밍 할 수 있습니다. 백색광 LED에 비해 할로겐 광원을 사용하여 보다 견고하고 신뢰할 수 있는 ERG를 얻을 수 있으며, 이는 할로겐 광원에서 방출되는 광범위한 광 스펙트럼으로 인해 발생할 수 있습니다.
    12. 유리 슬라이드에 장착된 모든 파리의 ERG를 기록합니다. 조건당 유전자형당 15개의 파리로부터 ERG를 수행합니다.
      참고: 참조 와 변형 cDNAs 간의 강력한 차이를 보여주는 조건을 찾기 위해 변경할 수있는 일부 매개 변수에는 온도, 연령 또는 환경 조건 (예 : 밝은 어두운 주기 또는 일정한 빛 / 어둠에서 사육)이 포함될 수 있습니다.
    13. 데이터 분석 수행: 참조, 변형 및 컨트롤의 ERG를 비교하여 차이점이 있는지 확인합니다. ERG 데이터를 사용하여 과도, 탈포, 과도 및 재분극 69(그림 4B)의 변화에 대해 평가합니다.
      참고: 탈분극 및 재분극은 광수용체 내광환전 캐스케이드의 활성화 및 불활성화를 반영하는 반면, 온-및 오프 과도는 시냅스 후 세포의 활동을 측정하는 척도입니다. 광수용체. 광분화의 감소된 진폭 및 변경된 역학은 광수용체 기능 및 건강과 관련된 결함에서 종종 연관되는 반면, 온-오프 과도 의 결함은 결함이 있는 시냅스 개발, 기능 또는 유지 보수가 있는 돌연변이체에서 발견됩니다. 70.
    14. 참조 와 변형 인간 cDNO의 과발현을 가진 ERG 표현형의 다름의 확인시, 이 전기 생리학적 표현형이 광수용체및 그들의 조직학적 분석 및 투과 전자 현미경을 수행하여 시냅스를 시냅스.
      참고: ERG 결함 및 구조 / 초구조 적 분석의 해석에 대한 추가 논의는 이전에설명된 69.

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Representative Results

신경 발달 표현형에 연결된 EBF3에 있는 de novo 오해의 소지가 있는 변이체의 기능적인 연구
근력 저하, 운동 실조, 글로벌 발달 지연 및 표현 성 언어 장애를 포함한 신경 발달 표현형을 가진 7 세 남성에서, 의사와 건강 미진단 질병 프로젝트의 국립 연구소에서 의사와 인간 유전학자 (UDP) EBF3(초기 B-세포 인자3)에서 de novo missense 변이체(p.R163Q)를 확인하되, COE(콜리어/후각-1/초기 B 세포 인자) 가족 전사 인자를 암호화하는 유전자. 이 사례는 기능 연구를 위해 2016년 3월에 UDN MOSC에 제출되었습니다. 이 유전자가 이 케이스를 위한 좋은 후보인지 평가하기 위하여는, MOSC는 OMIM, ClinVar, ExAC (지금 그놈AD로 확장), 제노2MP, DGV 및 해독에서 인간 유전 및 게놈 정보를 수집했습니다. 또한, 주요 MO 종의 정형및 유전자는 DIOPT 도구를 사용하여 확인되었다. 개별 MO 데이터베이스(예를 들어, 웜베이스, 플라이베이스, ZFIN, MGI)로부터유전자 발현 및 표현형 정보를 입수하였다. EBF3 및 UDN MOSC의 다른 선구적인 연구를 위해 수행된 정보학 분석은 MARRVEL 자원30의후기 개발을 위한 기초를 형성했다.

이 방법론을 사용하여 수집된 정보는 EBF3가 분석 시 알려진 인간 유전 질환과 관련이 없다는 것을 나타내었으며, p.R163Q 변이체는 다음 정보를 기반으로 좋은 후보라고 결론을 내렸다. (1) 이 변이체는 이전에 제어 인구 데이터베이스 (ExAC) 및 질병 인구 데이터베이스 (Geno2MP)에서 보고되지 않았으며, 이것은 매우 드문 변이체임을 나타냅니다. (2) ExAC에 기초하여, 이 유전자의 pLI(LOF 편협확률) 점수는 1.00(pLI 점수는 0.00-1.00범위)이다. 이것은 일반 인구에 있는 이 유전자에 있는 LOF 이체에 대하여 선택적인 압력이 있다는 것을 나타내고 이 유전자의 haploinsaa질이 질병을 일으키는 원인이 될 수 있다는 것을 건의합니다. pLI 점수 및 해석에 대한 자세한 내용은 JoVE31 및 관련 논문에 첨부된 MARRVEL 자습서 문서에서 세부 정보30,71을제공합니다.

p.R163Q 변이체는 또한 (3) 이 단백질의 진화적으로 보존된 DNA 결합 도메인에 위치하기 때문에 좋은 후보로 간주되었으며, 이는 DNA 결합 또는 다른 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. (4) p.R163 잔류물은 C. 예쁜꼬마선충과 초파리에서 인간에게 진화적으로 보존되어 종 전반에 걸친 단백질 기능적 기능적에 매우 중요할 수 있음을 시사한다. (5) EBF3 직교는 C. elegans73, 초파리74,제노푸스75,및 마우스76을포함하는 다중 MO72에서 신경 발달에 연루되어 있다. (6) 마우스에서 뇌 발달 중, Ebf3는 여러 간질 및 지적 장애와 관련된 유전자인 Arx (Aristaless관련 홈박스)77의 하류에서 기능하는 것으로 나타났습니다. 인간에 있는 증후군78. 그러므로, 이 데이터는 함께 EBF3가 인간 신경 발달에 매우 중요할 확률이 높고 p.R163Q 이체가 기능적인 결과를 가질 수 있다는 것을 건의합니다.

p.R163Q가 EBF3 기능에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, 매듭(kn;인간 EBF379의플라이 직교)에 대한 T2A-GAL4 라인은 코딩 인트로닉 MiMIC삽입(15)의RMCE를 통해 생성되었다. KnT2A-GAL4 라인은 열성 치사성이며 클래식 kn Allele (kncol-1)의치사성을 보완하지 못했을 뿐만 아니라 kn [Df(2R)BSC429]80을 덮는 분자 정의 결핍을 보완하지 못했습니다. . GAL4의 발현 패턴은 또한 뇌뿐만 아니라 날개 가상 디스크(15)에서이전에 보고된 kn 발현 패턴을 반영했다. UAS 형 질전환 파리는 야생형 플라이 kn cDNA뿐만 아니라 참조 및 변이체 인간 EBF3 cDNA의 발현을 허용하도록 생성되었다. 3개의 단백질 모두 C-말단 3xHA 태그로 태그되었다. 중요한 것은, UAS 야생형 플라이 kn (kn+)또는 참조 인간 EBF3 (EBF3++) 트랜스유전자는 유사한 정도로 Kn T2A-GAL4/Df(2R)의 치사성을 구출( 그림 3C,왼쪽 패널)81.

대조적으로, p.R163Q 변이체(EBF3p.R163Q)를가진 UAS-인간 EBF3 이식유전자는 이 돌연변이체를 구출할 수 없었으며, 이는 p.R163Q 변이체가 생체EBF3 기능에 영향을 미친다는 것을 시사한다 15. 흥미롭게도, 항HA 항체를 사용하여 평가할 때, EBF3p.R163Q 단백질은 비행 조직에서 성공적으로 발현되었고, 그 수준과 세포내 국소화(주로 핵)는 EBF3+와 구별할 수 없었다. Kn+. 이는 변이체가 단백질 불안정성 또는 잘못된 국소화로 인해 LOF 표현형을 유발하지 않는다는 것을 시사한다. p.R163Q 변이체가 EBF3의전사 활성화 기능에 영향을 미쳤는지 여부를 추가로 평가하기 위해, 루시퍼라제 계 리포터 분석기는 HEK293 세포15에서수행되었다. 배양된 인간 세포에서의 이 실험은 EBF3p.R163Q 변이체가 초파리 실험으로부터 얻은 LOF 모델을 지지하여 리포터 구조의 전사를 활성화하지 못했다는 것을 밝혀냈습니다.

실험 적인 연구 결과에 병렬로, BCM에 의사, 인간 유전학자 및 유전 카운슬러와의 협력은 유사한 현상을 가진 2명의 추가 개별의 확인으로 이끌어 냈습니다. 한 환자는 동일한 p.R163Q 변이체를 운반하고, 다른 환자는 동일한 잔류물 (p.R163L)에 영향을 미치는 잘못된 변형을 수행했다. p.R163L 변이체는 또한 플라이 kn 돌연변이체(93)를 구출하는 데 실패하여 이 알레일 역시 EBF3 기능에 영향을 미쳤다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 이 작품은 de novo missense, 넌센스, 프레임 시프트 및 유사한에 연결된 EBF3에 있는 접합 이체를 가진 추가 개별을 보고한 2개의 독립적인 인간 유전학 연구 결과와 백투백 간행되었습니다 신경 발달 표현형82,83. 그 후, 3개의 추가 논문이 de novo EBF3 변이체 및 카피 번호 삭제84,85,86의추가 사례를 보고하는 출판되었다. 이 새로운 신경 발달 증후군은 지금 남자 (OMIM, 인간에 있는 유전자형 표현형 관계를 위한 권위있는 데이타베이스)에 있는 근력 저하, 운동 실조 및 연기한 발달 증후군 (HADDS, MIM #617330)로 알려져 있습니다.

TBX2에서 지배적으로 상속 된 오해 의 변형의 기능 연구는 신드롬 심장 혈관과 골격 발달 장애에 연결
두개안면 이형성증, 심장 이상, 골격 기형, 면역 결핍, 내분비 이상 및 발달 장애의 겹치는 스펙트럼으로 영향을 받은 작은 가족에서 UDN Duke 임상 사이트는 잘못된 변형을 확인했습니다. (p.R20Q) TBX2에서 질병 표현형과분리87. 4명의 가족 중 3명(아들, 딸, 어머니)이 이 병에 걸린 상태이며, 아들은 가장 심한 표현형을 보였다. 임상적으로, 그는 "완전한 DiGeorge 증후군"의 진단을 만났다, TBX1의haploinsaaasasasasasa.kr. 이 가족에 있는 TBX1에서 확인된 아무 돌연변이도 없었지만, 임상의와 인간 유전학자는 생쥐에 있는 이전 연구 결과 때문에 이 유전자가 발달 88 도중 겹치는 기능이 있다는 것을 보여주었기 때문에, TBX2에 있는 이체에 집중했습니다 . TBX1과 TBX2는 모두 맥락에 따라 전사 억제자뿐만 아니라 활성제 역할을 할 수있는 전사 인자의 T 박스 (TBX) 제품군에 속합니다.

이전에는 TBX 가족 유전자의 17명 중 12명이 인간 질병에 연결되었습니다. MOSC는 MARRVEL 및 기타 리소스를 통해 수집된 다음 정보를 기반으로 이 변형을 실험적으로 추구하기로 결정했습니다. (1) 이 변종은 그놈AD에서 ~90,000 "제어"개인의 코호트에서 한 번만 보고되었습니다 (이 변종은 낮은 커버리지 읽기로 인해 기본 보기에서 필터링되었습니다). 어머니의 온화한 표현형 프리젠테이션을 고려할 때, 이것은 아직도 질병 표현형에 책임있을 지도 모르다 희소한 이체로 여겨질 수 있습니다. (2) ExAC/gnomAD에서 TBX2의 pLI 점수는 0.96/0.99이며, 이는 높음입니다(최대 = 1.00). 또한, 그놈AD의 o/e(관찰/예상) LOF 점수는 0.05입니다(1/18.6 예상 LOF 변이체는 그놈AD에서 관찰됩니다). 이 숫자는 이 유전자에 있는 LOF 이체가 일반 인구에서 에 대하여 선택된다는 것을 건의합니다.

추가적으로, (3) p.R20는 C. 예쁜꼬마선충및초초로부터 인간에게 진화적으로 보존되어, 이것이 TBX2 기능에 대한 중요한 잔류물이 될 수 있음을 시사한다. (4) 여러 프로그램은 변형이 손상 될 가능성이 있음을 예측 (폴리픈 : 가능 / 아마 손상, SIFT : 해로운, CADD 점수 : 24.4, REVEL 점수 : 0.5). (5) MO 돌연변이체는 환자에서 영향을 받는 조직에 결함을 나타낸다 (예를 들어, 심장 혈관 시스템, 소화 / 영양 시스템, 두개안면, 사지 / 숫자에 결함을 나타내는 녹아웃 마우스). 따라서, TBX1과 TBX2 사이의 생물학적 링크와 함께 이러한 환자와 DiGeorge 증후군 사이의 자형질 링크와 함께, Drosophila를사용하여이 유전자의 변이체의 기능적 연구를 수행하는 것이 최적이었다.

p.R20Q 변이체가 TBX2 기능에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해,Bifid(bi; 인간 TBX2의 초파리 직조)에서 T2A-GAL4 라인은 코딩 인트로닉 MiMIC의 RMCE를 통해 생성되었다(도2)87. 이러한 대열판, biT2A-GAL4는열성 푸팔 치사하고 강한 LOF 돌연변이체로서 행동하였고, 이전에 보고된 bi LOF 연합체(예를 들어, biD2, biD4; 그림 2 E). 이러한 고전적이고 새로 생성된 바이 알레일의 치사성은 전체 바이궤적을 운반하는 ~80 kb 의 게놈 구조 구조에 의해 구출되었고, 이들 시약은 실제로 깨끗한 LOF 알레임임을 나타낸다. BIT2A-GAL4 라인에서 GAL4의 발현 패턴은 또한 날개 가상 디스크를 포함하는 여러 조직에서 이전에 보고된 바이 발현 패턴과 잘 일치하였다(도2D).

이와 병행하여, 기준 또는 변이체(p.R20Q) 서열을 운반하는 TBX2에 대한 UAS-트랜스제닉 라인이 생성되었다. 불행히도, 어느 이식유전자도 바이T2A-GAL4 라인의 치사성을 구출할 수 없었다. 중요한 것은, 야생형 플라이 UAS-bi 이식유전자는 또한 이 유전자의 투여 감수성 때문에 biT2A-GAL4 알레이를 구출하는 데 실패했다. 실제로, UAS-bi+ UAS-TBX2+의 과발현은 야생형 동물에서 과발현될 때 어느 정도의 치사성을 일으켰다. 이러한 이중/TBX2 과발현의 독성 효과는 p.R20Q 변이체가 TBX2 기능에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하기 위한 기능적 분석술로서 활용되었다. Drosophila bi 유전자는 시각 시스템의 맥락에서 광범위하게 연구되었기 때문에 [유전자는 또한 optomotor blind (omb)]로 알려져 있습니다, 시각 시스템과 관련된 표현형은 광범위하게 조사되었다. 참조 TBX2가 시각 시스템과 관련된 뇌의 눈과 부분에서 UAS-트랜스유전자를 발현하는 ey-GAL4 드라이버를 사용하여 발현되었을 때, ~85% 치사율(도3C, 우측 패널) 및 유의한 눈 크기의 감소(도4B)가 관찰되었다. 이러한 표현형은 야생형 플라이 UAS-bi 이식유전자가 발현되었을 때 관찰된 표현형보다 강했으며, 이는 인간 TBX2가 과발현시 파리에 더 해롭다는 것을 시사한다.

흥미롭게도, p.R20Q TBX2는 치사(도3C, 오른쪽 패널)를 유발하고 동일한 조건하에서 동일한 드라이버를 사용하여 작은 눈 표현형(도4B)을 유도하는 데 덜 강력했다는 것을 시사한다87, 이 변이체가 단백질 기능에 영향을 미칩니다. 더욱이, R1-R6 광수용체에서 UAS 트랜스게전지를 특이적으로 발현하는 다른 GAL4 드라이버를 이용한 광수용체 및 변이체 TBX2의 기능은, 변이체 TBX2가 이를 나타내었다는 것을 밝혀내고, 참조 TBX2에 비해 훨씬 온화한 ERG 표현형 (그림4B)87. 흥미롭게도, 대부분의 p.R20Q TBX2 단백질은 기준 단백질과 유사한 핵에서 여전히 발견되었으며, 이는 변이체가 핵 국소화에 영향을 미치지 않았음을 시사한다. HEK293T 세포에서 루시퍼라제 기반 전사 억제 분석결과, p.R20Q는 팔린드로믹 T-박스 사이트(87)를 사용하여 리포터 구조의전사를 효과적으로 억압할 수 없었다. 추가로, TBX2p.R20Q의 단백질 수준에 있는 감소는TBX2 +에 비해 관찰되었습니다, 이체가 차례차례로 세포 내의 그것의 풍부에 영향을 미치는 TBX2의 번역 또는 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 건의합니다.

TBX2에 있는 희소한 이체를 가진 추가 환자는 이 실험적인 연구 결과와 병행하여 UDN 듀크 임상 사이트에 임상의에 의해 확인되었습니다.  관련이없는 가족에서 de novo missense (p.R305H) 변형을 가진 8 세 소년은 첫 번째 가족87에서발견 된 많은 기능을 전시했습니다. Drosophila와 인간 세포주에서 추가 기능적인 연구 결과는 p.R305H 이체가 또한 TBX2 기능 및 단백질 수준에 영향을 미친다는 것을 밝혔습니다, 강하게 이 유전자에 있는 결점은 가능성이 2개의 가족에서 찾아낸 많은 표현형의 밑에 있다는 것을 건의합니다. 이 장애는 최근 오마이에 "척추 이상 및 가변 내분비 및 T 세포 기능 장애"(VETD, MIM #618223)로 선별되었다. 중첩된 표현형을 가진 TBX2에 있는 손상이체를 가진 추가 개별의 확인은 인간적인 질병에 있는 이 유전자를 위한 유전자형 표현형 관계의 전체 스펙트럼을 이해하는 것이 중요합니다.

Figure 1
그림 1 : UAS-인간 cDNA 및 T2A-GAL4 라인을 생성하는 주입 및 교차 계획. (A) 미세 주사및 십자가를 통한 UAS-인간 cDNA 트랜스유전자 생성. 1세대 및 2세대에서 수컷 파리를 이용한 제2 염색체 도킹 사이트(VK37)로 트랜스게네지를 통합하는 교차 방식이 예시로 나타났다. 인간 cDNA φC31 형질전환 구조(pGW-HA.attB)를 φC31 인테그라제(3xP3-GFP 및 3xP3-RFP로 표시)의 생식선 공급원을 포함하는 초기 배아에 주입하고 VK37 도킹 부위[노란색 + ++로 표시)] ) 마커], 형질전환 이벤트는 형질전환 벡터에 존재하는 백색 +(w+) 미니유전자로 이어질 수 있다. GFP 및 RFP를 사용하여 파리를 선택하여 φC31 인테그라를 교차하는 것이 좋습니다. 염색체가 두 번째 부위 치사/멸균 히트 돌연변이를 운반하는 경우 최종 안정 재고는 동형접합체 또는 균형 잡힌 주식으로 보관될 수 있습니다. 이러한 트랜스유전자가 이형이 후진상태에서 사용되는 한, 형질전환 구조에 대한 두 번째 부위의 치명적/멸균 돌연변이의 존재는 일반적으로 기능적 연구의 결과에 영향을 미치지 않는다(그림 3). (B) 미세 주입 및 십자가를 통해 T2A-GAL4 라인을 생성합니다. 제2 염색체 MiMIC 삽입을 T2A-GAL4 요소로 변환하는 교차 방식이 예로 도시된다. T2A-GAL4(pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70)에 대한 φC31 인테그라제 및 RMCE 벡터에 대한 발현 벡터를 마이크로주입함으로써 관심 있는 MiMIC에 적합한 판독 프레임이 선택된다. 관심 유전자의 코딩 인트론에서 MiMIC를 운반하는 배아로의 세부 사항57,59는, 하나는 T2A-GAL4 라인으로 원래의 MiMIC를 변환할 수 있다. 그림 2 A는 RMCE 변환의 회로도다이어를 보여 주다. 변환 이벤트는 원래 MiMIC 카세트(60)에서 y+ 마커에 대해 스크리닝하여 선택할 수 있다. RMCE는 두 방향으로 발생할 수 있기 때문에 성공적인 변환 이벤트의 50%만이 GAL4의 성공적인 생산으로 이어지며, 이는 차세대 UAS-GFP 리포터 트랜스유전자에 의해 검출될 수 있습니다. 최종 안정 재고는 유전자의 LOF가 치명적 / 멸균 인 경우 동형 접합체 또는 균형 잡힌 주식으로 보관 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : RMCE를 통해 MiMIC 엘리먼트를 T2A-GAL4 라인으로 변환합니다. (a) φC31 인테그라제는 원형 벡터(아래쪽)로 나타난 T2A-GAL4 카세트 측면의 플라이(top)와 2개의 attB 부위에서 두 개의 attP 사이트 간의 재결합을 용이하게 한다. (B) 성공적인 RMCE 이벤트는 관심 있는 유전자의 동일한 배향에서 선택 가능한 마커(yellow+) 및 T2A-GAL4 카세트의 삽입의 손실로 이어진다. RMCE 이벤트는 두 방향으로 발생할 수 있기 때문에 RMCE 반응의 50%만이 원하는 제품을 생성합니다. 반대 방향으로 삽입된 RMCE 제품은 유전자 트랩 알레일 또는 발현 GAL4로 기능하지 않습니다. 시구의 방향성은 Sanger 시퀀싱을 통해 확인되어야 합니다. (C) 관심 있는 유전자의 전사(top) 및 번역(아래)은 T2A-GAL4 카세트의 3' 말단에 존재하는 폴리아 신호로 인해 잘린 mRNA 및 단백질의 생성을 유도한다. T2A는 리보솜 건너뛰기 신호로 리보솜이 이 신호 후에 번역을 중단하고 다시 시작할 수 있습니다. 이는 관심 있는 잘린 유전자 생성물과 공유적으로 부착되지 않은 GAL4 원소를 생성하는데 사용된다. GAL4는 핵에 진입하고 UAS 원소의 통제하에 있는 전이유전자의 전사를 촉진할 것이다. UAS-GFP는 유전자 발현 리포터로서 사용될 수 있으며, UAS-인간 cDNA는 유전자 "인간화"를 통한 구조 실험에 사용될 수 있다. (D) UAS-GFP(top)의 바이 드라이빙 발현에서 T2A-GAL4 요소의 예이다. 이러한 발현 패턴은 동일한 유전자(biomb-GAL4;bottom)에 대해 이전에 생성된 인핸서 트랩 라인과 유사하다. (E) 이전에 보고된 LOF 바이 알레와 T2A-GAL4 알레의 비교. 이 수치는 이전 간행물57,87에서채택및 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : 구조 기반(왼쪽) 및 과발현 기반(오른쪽) 연구를 사용하여 인간 변이체에대한 기능 분석. (A) (왼쪽 패널): EBF3 변이체의 기능은 치사성/생존가능성에 초점을 맞춘 플라이 매듭(kn) LOF 알레일의 구조 기반 분석으로 평가되었다; (오른쪽 패널): TBX2의 변이체의 기능은 야생 형 파리에서 인간 TBX2 트랜스유전자의 과발현을 수행하여 치사성/생존가능성, 눈 형태학 및 전기생리학 표현형에 중점을 두어 평가하였다(그림4) . (B) 기능성 연구에서 시험되는 파리를 얻기 위한 교차 방식. 항상 중성 UAS 요소(예: UAS-lacZ, UAS-GFP)를대조군 실험으로 사용하는 것이 좋습니다. (C) 대표적인 결과 결과를 해석하는 데 필요한 적절한 대조군 실험과 함께 EBF3p.R163Q TBX2p.R20Q 변이체에 대한 기능적 연구결과가 각각 나타났다. 구조 기반 분석 과다 발현 연구는 변이체가 무정형 또는 비형성 대두로 행동한다는 것을 보여줍니다. 여기에 표시된 치사/생존성 데이터는 이전 간행물15,87에제시된 실험 데이터를 기반으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : 초파리에서눈 형태와 전기 레티노그램을 기반으로 인간 TBX2에서 드문 오센스 변이체의 기능분석. (A) 4대 성분(온-과도, 탈분극, 과도) 및 대표적인 전기레티노그램 기록과 함께, 즉석에서 기록 및 기준 전극의 전형적인 배치를 보여주는 회로도 이미지 재분극)을 참조하십시오. (B) TBX2 변이체(p.R20Q)는 시각 시스템(ey-GAL4 및 Rh1-GAL4)에특이적인 GAL4 드라이버를 사용하여 플라이 아이에서과발현 연구에 기초한 부분 LOF 알레일로 기능한다. 이는 기준 TBX2가 변이체 단백질에 비해 강한 형태학적 및 전기생리학적 표현형을 유발한다는 것을 보여주었다. (상단 패널): 눈 크기의 심각한 감소는 Ey-GAL4와 UAS-TBX2+ 과다 표현시 볼 수 있습니다. UAS-TBX2p.R20Q. ey-GAL4로 구동되는 것은 또한 더 작은 눈을 일으키는 원인이 됩니다, 그러나 표현형은 훨씬 온화합니다. (하단 패널): UAS-TBX2 +가 Rh1-GAL4를 사용하여 코어 R1-R6 광수용체에서 표현될 때, 온-및 오프 과도, 감소된 탈분극 및 전위 후 의 큰 비정상적인 장편성(PDA) 표현형, 제어 파리에서 볼 수 없습니다. 이러한 표현형은 UAS-TBX2p.R20Q가 동일한 Rh1-GAL4를사용하여 발현될 때만큼 심각하지 않다. 이 수치는 이전 간행물69,87에서채택및 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

Drosophila melanogaster를 이용한 실험 적인 연구 결과는 질병 관련 인간 이체의 결과를 평가하기 위하여 강력한 분석 시스템을 제공합니다. 이것은 지난 세기89년 동안 비행 필드에 있는 많은 연구원에 의해 생성된 지식 그리고 다양한 유전 공구의 큰 바디 때문이. 그러나 다른 실험 시스템과 마찬가지로 존재하는 주의 사항과 한계를 인정하는 것이 중요합니다.

데이터 마이닝과 관련된 주의 사항
이 프로토콜의 첫 번째 단계는 관심 있는 유전자와 관련된 정보를 위해 데이터베이스를 채굴하는 것이지만 시작점으로만 사용하는 것이 중요합니다. 예를 들어 변형 함수의 silico 예측에서 중요한 통찰력을 제공하지만 이러한 데이터는 항상 신중하게 해석되어야 합니다. 모든 주요 알고리즘이 인간 변이체가 양성이라고 예측하는 몇 가지 경우가 있지만, Drosophila에서의 기능적 연구는 그러한 변이체24의손상 특성을 명확하게 입증했습니다. 유사하게, 단백질-단백질 상호 작용, 공동 발현 및 구조 모델링 데이터는 모두 통찰력 있는 정보이지만, 이러한 대규모-omics 데이터 세트에 존재하는 의사 양성 및 의사 음성 정보가 있을 수 있다. 예를 들어, 이전에 확인된 또는 예측된 단백질-단백질 상호작용중 일부는 인위적이거나 특정 세포 및 조직 유형에서만 볼 수 있다.

또한, 특정 단백질-단백질 상호작용이 일시적이기 때문에 이러한 데이터 세트에서 포착되지 않은 많은 거짓 음성 상호작용이 있을 수 있다(예를 들어, 효소-기질 상호작용). 실험적 검증은 특정 유전자 또는 단백질이 관심의 생물학적 맥락에서 생체 내에서 유전적으로 또는 물리적으로 상호 작용한다는 것을 입증하는 데 중요합니다. 마찬가지로 상동성 모델링을 기반으로 예측된 구조는 해결된 구조가 아니라 모델로 취급되어야 합니다. 이 정보는 관심 있는 아미노산이 단백질의 구조적으로 중요한 부분에 존재한다는 것을 발견되는 경우에 유용할 수 있더라도, 부정적인 데이터는 변이체가 손상될 수 있다는 가능성을 배제하지 않습니다. 마지막으로, 이전에 보고된 유전자형 표현형 정보 중 일부는 공용 데이터베이스에 보관된 일부 정보가 정확하지 않을 수 있기 때문에 신중하게 다루어야 합니다. 예를 들어 MO 데이터베이스의 일부 정보는 엄격하게 제어되고 엄격하게 수행된 실험을 기반으로 하는 반면, 다른 정보는 추가 후속 연구와 엄격한 제어없이 대형 스크린 페이퍼에서 나올 수 있습니다.

T2A-GAL4 전략을 사용한 "인간화" 실험이 항상 성공적이지는 않습니다.
인간 cDDNA를 이용한 구조 및 과발현 기반 기능 연구는 인간 단백질의 맥락에서 변이체의 평가를 허용하지만, 이 접근법이 항상 성공하는 것은 아닙니다. 참조 인간 cDNA가 비행 돌연변이 표현형을 구출 할 수없는 경우, 두 가지 가능한 설명이 있습니다. 첫번째 가능성은 인간 단백질이 비기능적이거나 플라이 세포의 맥락에서 활동을 현저하게 감소시켰다는 것이다. 이는 1) 단백질 발현 감소, 안정성, 활성 및/또는 국소화 또는 2) 다중 단백질 복합체에서 작동하는 플라이 단백질과의 호환성 부족 때문일 수 있다. UAS/GAL4 시스템은 온도에 민감하기 때문에 파리를 비교적 높은 온도(예: 29°C)에서 올려이 조건에서 구조할 가능성을 볼 수 있습니다. 또한, UAS-fly cDNA 컨스트럭트 및 이식유전자를 양성 대조군으로서 생성할 수 있다. 관심의 변이체가 보존된 아미노산에 영향을 미치는 경우, 유사한 변이체는 플라이 직교의 맥락에서 변이체의 기능적 연구를 위해 플라이 cDNA내로 도입될 수 있다. 이것은 필요하지 않더라도, 인간 cDNA 형질전환 선을 사용하여 부정적 또는 결정적인 결과를 주는 경우에연구 결과를 크게 돕습니다 (그림 3).

두 번째 가능성은 인간 단백질의 발현이 일부 세포- 또는 유기체 수준의 독성을 유발한다는 것이다. 이는 항모질(예를 들어, 지배적인 음성 단백질로 작용하는), 과모질(예를 들어, 너무 많은 활성) 또는 신형태(예를 들어, 단백질 응집와 같은 신규한 독성 기능의 이득)에 기인할 수 있으며, 이는 항상 유전자의 내인성 기능과 항상 관련되지 는 않을 수 있다. 이펙트를 제외합니다. 이 경우, 파리를 저온(예를 들어, 18°C)에 유지하면 이러한 문제 중 일부를 완화시킬 수 있다. 마지막으로, 플라이 cDNA의 과발현이 TBX2 예에서 볼 수 있듯이 플라이 T2A-GAL4 라인을 구출하지 못할 수 있는 몇 가지 시나리오가 있는데, 이는 유전자 생성물의 트리트 투여 의존성 때문일 가능성이 있다. 관심 있는 단백질의 과발현을 피하기 위해, 관심 있는 플라이 유전자는 CRISPR을 통해 직접 변형될 수 있고, 게놈 구조 구조 는 관심있는 변이체를 포함하는 설계될 수 있거나, 또는 LOF 알레르21을사용하여 구조 실험을 수행할 수 있다. 작은 유전자의 경우, 플라이 게놈 구조 구이던스를 "인간화"하는 것은 보존되지 않은아미노산(24)에 영향을 미치는 인간 변이체를 테스트하는 것으로 간주될 수 있다. 요약하자면, 인간화 실험이 관심 의 변형의 기능적 평가를 허용하지 않을 때 대체 전략을 고려해야 한다.

음수 및 양수 결과 해석
1) 참조 및 변이체 인간 cDNO가 플라이 돌연변이 표현형을 유사한 정도로 구출하고 2) 테스트된 모든 조건에서 관찰된 차이가 없다면, 그 변이체가 Drosophila에서 기능적으로 구별할 수 없다고 가정할 수 있습니다. Vivo. 그러나 이 정보는 관심 있는 변형이 비병원성이라는 것을 배제하기에 충분하지 않다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 인간과 관련이 있습니다. 반면에 긍정적인 데이터는 변이체가 단백질 기능에 해로운 결과를 초래한다는 강력한 징후이지만, 이 데이터만으로는 병원성을 주장하기에 충분하지 않습니다. 의학 유전학 및 유전체학의 미국 대학 (ACMG)는 "양성", "가능성이 양성", "알 수없는 중요성의 변종 (VUS)", "가능성이 병원성", 및 인간 질병 관련 유전자의 변종을 분류하는 표준 및 지침의 세트를 발표했다 "병원성"90. 이 분류는 확립된 질병 관련 유전자에만 적용되며 "불확실한 의미의 유전자"(GUS)의 변이체에 직접 적용되지는 않지만, 인간 변이체 기능 연구에 관련된 모든 개인은 변형 함수를 보고할 때 이 지침을 준수해야 합니다.

MO 표현형이 인간 질병 상태를 모델링하지 않을 때 유용한 생물학적 정보 추출
과발현 기반 기능성 검사에는 한계가 있으며, 특히 득점되는 표현형 중 일부는 관심 있는 질병 상태와 거의 관련이 없을 수 있기 때문에 유의해야 합니다. 유사하게, 구조 실험을 통해 평가되고 있는 표현형은 관심 있는 질병에 어떤 직접적인 관련성이 없을 지도 모릅니다. 이러한 실험은 무척추 동물 시스템에서 내인성 컨텍스트 외부에서 수행되기 때문에, 그들은 질병 모델로 간주되지 말고 오히려 "살아있는 시험관"으로 Drosophila를 사용하여 유전자 기능 테스트로 간주되어서는 안됩니다.

모델 유기체가 인간의 질병 상태를 모방하지 않더라도 구조 실험에 사용되는 처할 수 있는 표현형은 종종 질병 상태에 대한 유용한 생물학적 통찰력을 제공할 수 있습니다. "표현체(명백한 상동 표현형)"91의 개념은 Drosophila와 인간 표현형 사이 근본적인 분자 연결을 추가로 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 플라이 윙, 흉부, 다리 및 눈의 형태학적 표현형은 노치 신호 통로의 결함에 대한 우수한 표현형 판독이며, 심혈관 결함을 포함한 많은 선천성 질환과 연결된 진화적으로 보존된 통로입니다. 인간 에서62. Drosophila에있는 특정 표현형의 뒤에 분자 논리를 이해해서, 아직 이해되지 않는 인간에 있는 유전자와 표현형 사이 숨겨진 생물학 링크를 확인하는 것이 가능합니다.

임상 협력자들과의 지속적인 커뮤니케이션
환자에서 발견되는 희귀 한 변종의 기능을 연구하기 위해 임상의와 협력 할 때 강력한 협력 관계를 확립하는 것이 중요합니다. 임상 및 기본 생물 의학 연구원은 동일한 유전자 / 유전 경로에 대한 관심사를 공유 할 수 있지만, 임상 및 과학 분야 사이의 큰 문화적 및 언어적 (예 : 의료 전문 용어, 모델 유기체 특정 명명법) 격차가 있습니다. 두 당사자 간의 강력한 신뢰 기반 관계는 광범위한 의사 소통을 통해 구축 될 수 있습니다. 또한 양방향 통신은 이러한 관계를 수립하고 유지하는 데 매우 중요합니다. 예를 들어, 대표적인 결과 섹션에 기재된 두 가지 사례에서, 유사한 유전자형 및 표현형을 가진 추가 환자의 식별뿐만 아니라 후속 기능적 연구는 관심 있는 변이체의 병원성을 증명하는 데 중요했다. 강력한 기능적 데이터로도 연구자와 임상의는 종종 "n = 1"사례에서 확인된 변이체가 질병의 진정한 원인이라는 인간 유전학자를 설득하는 데 어려움을 겪고 있습니다.

MO 연구원은 관심의 변이체가 손상된다는 것을 일단 확인하면, 그밖 임상의 및 인간 유전학자와 네트워킹해서 일치하는 케이스를 적극적으로 확인하기 위하여 시도할 수 있다 그래서 가능한 한 빨리 임상 협력자에 다시 통신하는 것이 중요합니다. 제노2MP [멘델리안 표현형에 유전형: 멘델리안 유전체학 연구41에등록된 9,650명의 개별의 비식별 데이터베이스; 의심되는 환자와 가족 구성원을 포함합니다 유전 질환을 갖는] 동일한 장애가있을 수있는 개인을 평가하기 위해 검색 할 수 있습니다. 그런 다음, 수석 임상의는 메시징 기능을 사용하여 연락할 수 있다.

또는, GeneMatcher는 임상의, 기본 연구원 및 희귀 한 변종을 운반하는 추가 환자를 식별하기 위해 동일한 유전자에 대한 관심사를 공유하는 환자를위한 중매 웹 사이트인 GeneMatcher를 사용할 수 있습니다. GeneMatcher는 매치메이커 Exchange42라는매치메이킹 웹 사이트의 더 큰 통합 네트워크의 일부이기 때문에 호주 유전체학 건강 얼라이언스 환자 아카이브, 브로드 매치박스를 포함하여 전 세계의 추가 데이터베이스를 검색 할 수 있습니다. , 해독, MyGene2, 및 페놈 센트럴 단일 GeneMatcher 유전자 제출. GeneMatcher에 참여하는 것은 "연구자"로 가능하지만, 기본 과학자들은 경기 후 다른 임상의와의 의사 소통이 특정 수준의 의료를 필요로하기 때문에, 자신의 임상 협력과이 웹 사이트를 활용하는 것이 좋습니다 전문성.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

호세 살라자르, 줄리아 왕, 카렌 슐제 박사에게 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 우리는 여기에 논의 된 TBX2 변종의 기능적 특성에 대해 닝 리우 박사와 Xi Luo 박사를 인정합니다. 진단되지 않은 질병 네트워크 모형 유기체 검열 센터는 건강의 국가 학회 (NIH) 공동 기금 (U54 NS093793)를 통해 지원되었습니다. H. T. C. NIH [CNCDP-K12 및 NINDS (1K12 NS098482)], 미국 신경학 아카데미 (신경 과학 연구 보조금), 버로우스 웰컴 기금 (의료 과학자를위한 경력 상), 아동 신경학회 및 아동 신경학 재단 ( PERF 엘터만 교부금), NIH 이사 조기 독립상 (DP5 OD026426). M. F. W. 사이먼스 재단 (SFARI 상: 368479)에 의해 추가 지원되었다. S. Y.는 NIH (R01 DC014932), 사이먼스 재단 (SFARI 상 : 368479), 알츠하이머 협회 (새로운 조사자 연구 보조금 : 15-364099), 기초 연구를위한 나만 가족 기금 및 캐롤라인 비스 법률 기금에 의해 추가지원되었습니다. 분자 의학. BCM의 공초점 현미경 검사법은 NIH Grant U54HD083092에 의해 부분적으로 지적 발달 장애 연구 센터 (IDDRC) 신경 시각화 코어에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

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