In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De vooruitgang in de sequentie technologie heeft het hele genoom en het geheel-exome datasets toegankelijker gemaakt voor zowel klinische diagnose als het geavanceerde onderzoek naar menselijke genetica. Hoewel een aantal silico-algoritmen zijn ontwikkeld om de pathogeniteit van de in deze gegevenssets geïdentificeerde varianten te voorspellen, zijn functionele studies van cruciaal belang om te bepalen hoe specifieke genomische varianten de eiwit functie beïnvloeden, vooral voor missense Varianten. In het netwerk van niet-gediagnosticeerde ziekten (UDN) en andere onderzoeksconsortia met een zeldzame ziekte worden model organismen (MO), waaronder Drosophila, C. elegans, zebravis en muizen, actief gebruikt om de functie van vermoedelijke humane ziekteveroorzakende Varianten. Dit protocol beschrijft een methode voor de functionele beoordeling van zeldzame menselijke varianten die worden gebruikt in de model organismen screening centrum Drosophila kern van het UDN. De workflow begint met het verzamelen van menselijke en MO-informatie uit meerdere openbare databases, waarbij de WebResource MARRVEL wordt gebruikt om te beoordelen of de variant waarschijnlijk bijdraagt aan de toestand van een patiënt en effectieve experimenten ontwerpt op basis van beschikbare kennis en middelen. Vervolgens worden genetische hulpmiddelen (bijv. T2A-GAL4 en UAS-Human cDNA-lijnen) gegenereerd om de functies van de interesse varianten in Drosophilate beoordelen. Bij de ontwikkeling van deze reagentia kunnen twee-pronged Functionele assays op basis van reddings-en overexpressie-experimenten worden uitgevoerd om de variant functie te beoordelen. In de reddingstak worden de endogene vlieg genen "gehumaniseerd" door het orthologeuze Drosophila gen te vervangen door referentie-of variant menselijke transgenen. In de overexpressie tak, de referentie en variant menselijke eiwitten zijn exogenously gedreven in een verscheidenheid van weefsels. In beide gevallen kan elke scoor bare fenotype (bijvoorbeeld letaliteit, oogmorfologie, elektrofysiologie) als uitlezen worden gebruikt, ongeacht de ziekte van belang. Verschillen waargenomen tussen referentie en variant allelen suggereren een variant-specifiek effect, en dus waarschijnlijk pathogeniteit. Dit protocol maakt snelle, in vivo evaluaties mogelijk van putatieve humane ziekteveroorzakende varianten van genen met bekende en onbekende functies.

Introduction

Patiënten met zeldzame ziekten ondergaan vaak een moeizame reis die wordt aangeduid als de "diagnostische Odyssee" om een accurate diagnose1te verkrijgen. De meeste zeldzame ziekten worden verondersteld te hebben een sterke genetische oorsprong, het maken van genetische/genomic analyseert kritische elementen van de klinische werk. In aanvulling op de kandidaat-genpanel sequencing en de Copy Number variatie-analyse op basis van chromosomale micro arrays, zijn whole-exome (WES) en Whole-genoom sequencing (WGS)-technologieën steeds meer waardevolle hulpmiddelen geworden in de afgelopen tien jaar2, 3. Momenteel is de diagnostische snelheid voor het identificeren van een bekende pathogene variant in Wes en WGS ~ 25% (hoger in pediatrische gevallen)4,5. Voor de meeste gevallen die niet gediagnosticeerd blijven na klinische WES/WGS, is een veelvoorkomend probleem dat er veel kandidaatgenen en varianten zijn. Volgende-generatie sequencing identificeert vaak nieuwe of ultra-zeldzame varianten in veel genen, en het interpreteren of deze varianten bijdragen aan de ziekte fenotypes is uitdagend. Hoewel de meeste onzin-of frame Shift-mutaties in genen worden beschouwd als verlies van functie (LOF) allelen als gevolg van nonsens-gemedieerde verval van de gecodeerde transcriptie, kunnen afslankende mutaties die in de laatste exonen zijn gevonden, aan dit proces ontsnappen en functioneren als goedaardig of gain-of-function (GoF) allelen6.

Bovendien, het voorspellen van de effecten van een missense allel is een lastige taak, omdat het kan resulteren in een aantal verschillende genetische scenario's zoals voor het eerst beschreven door Herman Muller in de jaren 1930 (dat wil zeggen, amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, Neomorph, of Isomorph)7 . Talrijke in silico-Programma's en methodologieën zijn ontwikkeld om de pathogeniteit van missense-varianten te voorspellen op basis van evolutionaire instandhouding, type aminozuur verandering, positie binnen een functioneel domein, allel-frequentie in de algemene populatie, en andere parameters8. Deze Programma's zijn echter geen allesomvattende oplossing voor het oplossen van het gecompliceerde probleem van de interpretatie van varianten. Interessant is dat een recente studie heeft aangetoond dat vijf algemeen gebruikte voorspellend voorspelling van varianten (Polyphen9, SIFT10, Cadd11, Provean12, mutatie taster) overeenkomen met pathogeniteit ~ 80% van de tijd8 . Met name, zelfs wanneer alle algoritmen het erover eens zijn, geven ze een onjuiste voorspelling van pathogeniteit tot 11% van de tijd. Dit leidt niet alleen tot gebrekkige klinische interpretatie, maar kan ook onderzoekers ontmoedigen om nieuwe varianten op te volgen door ze onterecht als goedaardig te vermelden. Een manier om de huidige beperking van in silico-modellering aan te vullen, is om experimentele gegevens te leveren die het effect van de variant functie in vitro, ex vivo (bijv. gekweekte cellen, organoïden) of in vivo aantonen.

In vivo functionele studies van zeldzame ziekten geassocieerde varianten in MO hebben unieke sterktes13 en zijn goedgekeurd door vele zeldzame ziekte onderzoek initiatieven over de hele wereld, met inbegrip van de niet-gediagnosticeerde ziekten netwerk (UDN) in de Verenigde Staten en zeldzame Ziekten modellen & mechanismen (RDMM) netwerken in Canada, Japan, Europa en Australië14. Naast deze gecoördineerde inspanningen om MO-onderzoekers te integreren in de workflow voor diagnose van zeldzame ziekten en mechanistische studies op nationale schaal, hebben een aantal individuele samenwerkings onderzoeken tussen klinische en MO-onderzoekers geleid tot de ontdekking en karakterisering van vele nieuwe genen en varianten van de menselijke ziekte,82,83,84.

In het UDN ontvangt een gecentraliseerd model organismen screening Center (MOSC) inzendingen van kandidaatgenen en varianten met een beschrijving van de toestand van de patiënt en beoordeelt zij of de variant waarschijnlijk pathogeen is met informatica-instrumenten en in vivo Experimenten. In fase I (2015-2018) van het UDN bestond de MOSC uit een Drosophila kern [Baylor College of Medicine (BCM)] en Zebrafish core (University of Oregon) die samen werkten om gevallen te beoordelen. Met behulp van informatica analyse en een aantal verschillende experimentele strategieën in Drosophila en zebravis heeft de MOSC tot nu toe bijgedragen aan de diagnose van 132 patiënten, identificatie van 31 nieuwe syndromen55, ontdekking van verschillende nieuwe menselijke ziekte genen (bijv. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) en fenotypische expansie van bekende ziekten genen (bijv. CACNA1A21, ACOX122).

Naast projecten binnen het UDN hebben de kern onderzoekers van MOSC Drosophila bijgedragen aan nieuwe ziekteverwekkende genen in samenwerking met de centra voor Mendelian Genomics en andere initiatieven (bijv. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) met dezelfde verzameling van informatica en genetische strategieën ontwikkeld voor het UDN. Gezien het belang van MO-studies over de diagnose van zeldzame ziekten, werd de MOSC uitgebreid met een C. elegans core en Second Zebrafish core (beide aan de Washington University in St. Louis) voor fase II (2018-2022) van het UDN.

Dit manuscript beschrijft een in vivo functioneel studie protocol dat actief wordt gebruikt in de UDN MOSC Drosophila core om te bepalen of missense varianten functionele gevolgen hebben voor het proteïne van belang met behulp van transgene vliegen die menselijke Eiwitten. Het doel van dit protocol is om MO-onderzoekers te helpen samen te werken met klinische onderzoeksgroepen om experimenteel bewijs te leveren dat een kandidaatvariant in een gen van belang functionele gevolgen heeft, waardoor de klinische diagnose wordt vergemakkelijkt. Dit protocol is vooral nuttig in een scenario waarin een onderzoeker van Drosophila wordt benaderd door een klinisch onderzoeker die een patiënt met een zeldzame ziekte heeft met een specifieke kandidaatvariant in een gen van belang.

Dit protocol kan worden onderverdeeld in drie elementen: (1) het verzamelen van informatie om de waarschijnlijkheid te beoordelen van de variant van de rente die verantwoordelijk is voor het fenotype van de patiënt en de haalbaarheid van een functioneel onderzoek in Drosophila, (2) het verzamelen bestaande genetische hulpmiddelen en het oprichten van nieuwe, en (3) het uitvoeren van functionele studies in vivo. Het derde element kan verder worden onderverdeeld in twee sub-elementen, gebaseerd op hoe de functie van een variant van belang kan worden beoordeeld (reddingsexperiment of overexpressie gebaseerde strategieën). Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan worden aangepast en geoptimaliseerd voor vele scenario's buiten zeldzame monogene ziekte onderzoek (bijvoorbeeld, gemeenschappelijke ziekten, gen-omgeving interacties, en farmacologische/genetische schermen om therapeutische doelen te identificeren). De mogelijkheid om de functionaliteit en pathogeniteit van varianten te bepalen zal niet alleen de patiënt van belang ten goede komen door een accurate moleculaire diagnose te geven, maar zal ook bredere effecten hebben op zowel translationeel als fundamenteel wetenschappelijk onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. het verzamelen van menselijke en MO-informatie om te beoordelen: waarschijnlijkheid van een variant van belang die verantwoordelijk is voor de fenotypes van de ziekte en de haalbaarheid van functionele studies in Drosophila

  1. Voer uitgebreide database en literatuur zoekopdrachten uit om te bepalen of de specifieke genen en varianten van belang zijn goede kandidaten om uit te leggen van het fenotype van de patiënt van belang. Specifiek, verzamelen van de volgende informatie.
    1. Beoordelen of het gen van belang eerder is betrokken bij andere genetische aandoeningen (fenotypische expansie van bekend ziekte-gen) of dit is een geheel nieuw ziekte kandidaatgen [genvariant van onzekere significantie (GVUS)].
    2. Evalueer de allel frequentie van de variant van de belangstelling voor ziekte of controlepopulatie databases.
    3. Beoordelen of er Copy Number variaties (Cnv's) die dit gen in ziekte of controlepopulatie databases bevatten.
    4. Bepaal wat de orthologeuze genen zijn in verschillende MO-soorten, waaronder muis, zebravis, Drosophila, C. elegans en gist, en onderzoek vervolgens de bekende functies en expressie patronen van deze orthologeuze genen.
    5. Beoordelen of de variant van de rente aanwezig is in een functioneel domein van het eiwit en of het aminozuur van belang evolutionair wordt bewaard.
      Opmerking: antwoorden op deze vijf vragen (stappen 1.1.1-1.1.5) kunnen worden verkregen door de toegang tot een aantal menselijke en mo-databases afzonderlijk of met behulp van de MARRVEL (model organisme geaggregeerde bronnen voor zeldzame variant exploratie) WebResource (Zie tabel 1 voor online-informatiebronnen)30, die diepgaand wordt beschreven in een begeleidend artikel31. Zie de sectie representatieve resultaten voor specifieke voorbeelden. De Monarch Initiative website32 en Gene2Function33 bieden ook nuttige informatie.
  2. Verzamel aanvullende informatie om verder te beoordelen of de variant een goede ziekte kandidaat is uit een eiwit functie en structuur oogpunt.
    1. Beoordelen of de variant van de rente schadelijk is op basis van silico-Voorspellings algoritmen.
      Opmerking: variant pathogeniciteitsalgoritmen zijn ontwikkeld door vele onderzoeksgroepen in de afgelopen ~ 15 jaar, en sommige worden ook weergegeven in de MARRVEL zoekresultaten. Meer recente Programma's, waaronder de twee hieronder genoemde, combineren meerdere variant pathogeniteit herdictie algoritmes en machine learning benaderingen om een pathogeniteits score te genereren. Raadpleeg Ghosh, et al.8voor meer informatie over algoritmen voor het voorspellen van varianten en hun prestaties. (i) CADD (gecombineerde annotatie afhankelijke depletie): integratieve annotatie tool die is opgebouwd uit meer dan 60 genomische functies, die scores biedt voor menselijke Snv's en korte inserties en verwijderingen11. (II) REVEL (zeldzame exoomsequencing variant ensemble learner): combineert meerdere variant pathogeniciteitsalgoritmen (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP en phastCons) om een geïntegreerde score te bieden voor alle mogelijke menselijke missense varianten34.
    2. Bepalen of het menselijk gen/eiwit van belang of de MO orthologs zijn aangetoond aan genetisch of fysiek interactie met genen/eiwitten eerder gekoppeld aan genetische ziekten. Als dat zo is, beoordelen of de patiënt van belang vertoont overlappende fenotypes met deze aandoeningen.
      Opmerking: erzijn verschillende tools ontwikkeld om genetische en eiwit-eiwit interacties te analyseren op basis van mo-publicaties en grootschalige proteomica van meerdere soorten schermen. STRING (zoekhulpmiddel voor terugkerende instanties van naburige genen)35: een database voor bekende en voorspelde eiwit-eiwit interacties. Het integreert genetische interactie en co-expressie datasets, evenals tekstmijnbouw hulpmiddelen om genen en eiwitten te identificeren die samen in verschillende organismen kunnen functioneren. MIST (moleculaire interactie zoeken tool)36: een database die genetische en eiwit-eiwit interactiegegevens van de belangrijkste genetische MOs integreert (gist, C. elegans, Drosophila, zebravis, kikker, rat, muis) en mensen. Voorspelling van interacties afgeleid van orthologeuze genen/eiwitten (interlogs) worden ook weergegeven.
    3. Bepaal of de 3D-structuur van het eiwit van belang is opgelost of gemodelleerd. Zo ja, bepaal waar de variant van de interesse toewijzing ten opzichte van de belangrijkste functionele domeinen.
      Opmerking: eiwit structuren opgelost door Röntgen kristallografie, nucleaire magnetische resonantie (NMR), en Cryo-elektronenmicroscopie kunnen worden gevonden in openbare databases, waaronder het VOB (Protein databank) en emdata Base37. Hoewel er geen individuele database is voor voorspelde/gemodelleerde eiwit structuren, zijn een aantal algoritmen (d.w.z. SWISS-MODEL38, modeller39en Phyre240) beschikbaar voor gebruikers om eiwit modellering uit te voeren.
  3. Communiceer met klinische medewerkers om informatie te bespreken die is verzameld uit de informatica analyses in de paragrafen 1.1-1.2. Als klinische medewerkers ook het gevoel hebben dat de variant en het gen van belang goede kandidaten zijn om de fenotypes die bij de patiënt worden gezien uit te leggen, ga dan naar sectie 2. Als er specifieke vragen zijn over het genotype en fenotype van de patiënt, bespreek deze dan met de klinische medewerkers voordat u verder gaat.
    Opmerking: als wordt gevoeld dat de variant van de rente waarschijnlijk niet het fenotype van belang verklaart (bijv. identieke variant gevonden in hoge frequentie in de controlepopulatie), bespreek dit dan met klinische medewerkers om te bepalen of de variant een goede van de kandidaat, aangezien er mogelijk niet de juiste deskundigheid is om klinische fenotypes te interpreteren.

2. het verzamelen van bestaande genetische hulpmiddelen en het opzetten van nieuwe reagentia voor het bestuderen van een specifieke

Opmerking: zodra de variant van belang is bepaald een goede kandidaat om experimenteel te volgen, verzamelen of genereren van reagentia om uit te voeren in vivo functionele studies. Voor functionele studies die in dit protocol worden beschreven, zijn enkele belangrijke reagentia van Drosophila melanogaster nodig: 1) upstream activerings sequentie-gereguleerde humane cDNA-transgene stammen die de referentie-of variant sequentie dragen, 2) een verlies van functie allel van een fly gen van belang, en 3) een GAL4 lijn die kan worden gebruikt voor reddingsexperimenten.

  1. Generatie van UAS-menselijke cDNA constructies en transgene vliegen
    1. Identificeer en verkrijg de juiste menselijke cDNA-constructies. Veel klonen zijn verkrijgbaar bij de MGC (Mammalian Gene Collection)43 en kunnen worden gekocht bij geselecteerde venders. Voor genen die ook kunnen worden gesplitst, moet u controleren welke isovorm cDNA overeenkomt met het gebruik van ENSEMBL of refseq.
      Opmerking: veel cdna's zijn beschikbaar in of-gemedieerde kloon systeem compatibele reagentia44, die de subkloon stap vereenvoudigt. Cdna's kunnen komen in een "open (geen stop codon)" of "gesloten (met endogene of kunstmatige stop codon)" formaat. Terwijl open klonen toestaan dat C'-tagging van eiwitten die nuttig zijn voor biochemische (bijvoorbeeld Western Blot) en cel biologisch (bijvoorbeeld, immunokleuring) assays om te controleren van de uitdrukking van het eiwit van belang, het kan interfereren met de eiwit functie in sommige gevallen.
    2. Onderkloon de referentie en variant cDNA in de transgene vector van Drosophila . Gebruik het φc31-gemedieerde Transgenese-systeem, omdat hierdoor de referentie en variant cDNAs kunnen worden geïntegreerd in dezelfde locatie in het genoom45. Voor dit project gebruikt de MOSC Drosophila core routinematig de PGW-ha. attb Vector46.
      Opmerking: als de Human cDNA is in of-gemedieerde klonen systeem compatibele vectoren (bijvoorbeeld PDONR221, pENTR221), ga dan naar sectie 2.1.4, waarin wordt uitgelegd LR reacties op subclone de cDNAs in PGW-ha. attb.
      1. Als het menselijke cDNA niet in een of-gemedieerd kloon systeem compatibel plasmide is, subkloon de menselijke cDNAs in een gateway entry vector met behulp van standaard moleculaire biologische technieken (een voorbeeld van een dergelijk protocol wordt hieronder beschreven).
        1. Voer een overhangende PCR uit om attB1 en attB2 armen te introduceren. De voorwaartse primer moet de attB1 sequentie 5 '-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-3 ' hebben gevolgd door de eerste 22 nucleotiden van de doel-cDNA. De omgekeerde primer moet de attB2 sequentie 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3 ' hebben gevolgd door het omgekeerde complement van de laatste 25 nucleotiden van de cDNA van belang. Sluit de stop codon van de cDNA, voeg vervolgens een C ' tag als het is gewenst om te "openen" een kloon, of Voeg een stop codon aan "Close" een kloon.
        2. Maak een 100 μL High-Fidelity PCR-mix, bestaande uit 50 μL High-Fidelity PCR-Master Mix, 36 μL gedistilleerd water, 5 μL van elke voorwaartse en omgekeerde primers, vermeld in stap 2.1.2.1.1 verdund tot 10 μM, en 4 μL doel-cDNA (150 ng/μL).
        3. Voer PCR uit met behulp van het standaard mutagenese protocol om attB1 en attB2 armen toe te voegen aan de cDNA van belang. Voorwaarden zullen variëren afhankelijk van de constructie en de varianten van belang.
        4. Isoleer het doel cDNA met toegevoegde homologie armen via gel elektroforese en gel-extractie. Maak 1% agarose gel en voer elektroforese uit met behulp van standaardmethodes. Accijnzen de band die overeenkomt met de grootte van de cDNA plus de extra lengte van de homologie armen. Extract DNA uit de gel door middel van standaardmethoden95. Commerciële gel-extractie kits zijn verkrijgbaar bij verschillende bedrijven.
        5. Voer een in vitro of reactie uit op basis van het door of gemedieerde kloon protocol volgens het systeem dat wordt gebruikt.
        6. Transformeer de BP-reactie mix in chemisch competente E. coli -cellen. Bevoegde cellen kunnen worden gemaakt in eigen huis of gekocht bij commerciële leveranciers. Cultuur de getransformeerde cellen 's nachts op een LB plaat met passende antibiotica voor kolonie selectie. De volgende dag, Selecteer verschillende kolonies en groeien ze in onafhankelijke vloeibare culturen 's nachts.
        7. Isoleer DNA uit de nachtelijke culturen via miniprep. Sanger Volg de positieve klonen om ervoor te zorgen dat de cDNA de juiste volgorde96heeft. Behoud cellen uit de culturen die positief zijn voor de gewenste volgorde in 25% glycerol opgeslagen bij-80 °C.
    3. Voer op de site gerichte mutagenese uit om de variant van de interesse in de toegangspoort plasmide te introduceren met de referentie Human cDNA97. Een gedetailleerd protocol voor deze methode u vinden op de website van de leverancier48,49. Valideer de aanwezigheid van de variant in het gemuleerde plasmide via Sanger-sequencing van het volledige Open Lees frame (ORF) om ervoor te zorgen dat er geen extra varianten worden geïntroduceerd via deze mutagenese stap.
    4. Subkloon de referentie en variant Human cDNAs in het donor plasmide (gateway plasmiden met attL1 en attL2 sites) in het transgene plasmide (bijv. PGW-ha. attb met attR1 en attR2 sites) via een LR clonase-reactie.
      Opmerking: er zijn UAS φC31 vectoren ontworpen voor conventionele restrictie enzym-gebaseerde subklonen (bijvoorbeeld Puast. attb50) als het de voorkeur heeft om te subclone Human cDNAs via restrictie enzym methoden.
    5. Selecteer φC31 docking sites om de UAS-Human cDNA transgenes te integreren. Een aantal docking sites zijn gegenereerd door verschillende laboratoria en zijn openbaar beschikbaar vanuit de Stock Centers50,52,53.
      Letop: omdat het handig is om het menselijk transgen op een chromosoom te hebben dat niet de Fly ortholog van het gen van belang bevat, wordt het aanbevolen om een tweede chromosoom docking site te gebruiken [VK37 (bdsc Stock #24872] wanneer de Fly ortholog op de X staat , derde of vierde chromosomen, en gebruik een derde chromosoom docking site [VK33 (BDSC Stock #24871] wanneer de Fly ortholog is op het tweede chromosoom.
    6. Injecteren van UAS-menselijke cDNA constructies in vliegen uitdrukken φc31 integrase in hun kiembaan (bv., vas-φc31, NOS-φc31).
      Opmerking: micro-injectie kan in eigen huis worden uitgevoerd of worden verzonden naar kern faciliteiten of commerciële entiteiten voor Transgenese. Gedetailleerd protocol voor het genereren van transgene vliegen is te vinden in het geciteerde boek hoofdstuk51.
    7. Stabiele transgene stammen van de geïnjecteerde embryo's vast te stellen. Injecteer ~ 100-200 embryo's per construct94. Een representatieve oversteek regeling voor een transgen insertie in een tweede chromosoom docking plaats (VK37) is afgebeeld in Figuur 1a. Zie de geciteerde boeken54,55 voor elementaire Drosophila genetica informatie.
  2. Verkrijg of Genereer een T2a-GAL4-lijn die op Rescue gebaseerde functionele testen faciliteert (Zie afbeelding 2 en punt 3,1).
    Opmerking: deze regel zal twee doeleinden dienen. Eerste, de meeste T2A-GAL4 lijnen getest gedragen zich als sterke LOF allelen door te functioneren als een Genval allel. Ten tweede fungeren T2a-GAL4-lijnen als GAL4-stuurprogramma dat expressie van UAS-constructies mogelijk maakt (bijv. UAS-GFP, UAS-Human cDNAs) onder de endogene regulatie elementen van het gen van belang56,57 (Figuur 2a-C).
    1. Doorzoek openbare voorraad verzamelingen voor beschikbare T2A-GAL4 lijnen, waaronder het Drosophila -Gendisruptie project (bbp)58 , waarin ~ 1.000 T2a-GAL4-regels zijn gegenereerd59. Deze stammen zijn momenteel beschikbaar vanuit het Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc) en zijn doorzoekbaar via zowel het BBP als de bdsc-websites.
    2. Als er geen T2A-GAL4-lijn voor het Fly-gen beschikbaar is, controleer dan of een geschikte Codeer-intronic-lijn (Minos-gemedieerde integratie cassette) beschikbaar is voor omzetting in een T2a-GAL4 lijn met behulp van of-gemedieerde cassette Exchange (rmce )60 (Figuur 2A).
      Opmerking: rmce maakt het mogelijk intronic-nabootsen van elementen die zich tussen twee Codeer exonen bevinden, om te zetten in een T2a-GAL4 lijn door middel van micro injectie van een donor constructie (een voorbeeld van een kruisings regeling wordt weergegeven in Figuur 1B) of een reeks kruisen, zoals beschreven in detail57,59.
    3. Als een T2A-GAL4-lijn niet beschikbaar is en er geen geschikte Codeer intronic-nabootsen bestaat, u de mogelijkheid verkennen om een T2A-GAL4 lijn te genereren via het CRIMIC-systeem (CRISPR-gemedieerde Integration cassette)59.
      Opmerking: deze methodologie maakt gebruik van crispr-gemedieerde DNA-decolleté en homologie gerichte reparatie (HDR) om een nabootsen achtige cassette te integreren in een codeer-intron in een gen van belang.
    4. Als het gen van belang een grote intron mist (> 150 BP) of geen introns heeft, probeer dan een GAL4 transgen in het Fly-gen te kloppen met het crispr/Cas9-systeem met behulp van HDR, zoals beschreven20,61,62.
      Opmerking: als het genereren van een T2a-GAL4 of GAL4 knock-in allel moeilijk is, probeert u Rescue-experimenten uit te voeren met behulp van deze reeds bestaande allelen of RNAi-lijnen en alomtegenwoordige of Weefselspecifieke GAL4-Stuurprogramma's zoals beschreven92 (ref).

3. uitvoeren van de functionele analyse van de menselijke variant van de interesse in vivo in Drosophila

Opmerking: Voer een op Rescue gebaseerde analyse uit (paragraaf 3,1) en overexpressie studies (paragraaf 3,2) met behulp van de in sectie 2 verzamelde of gegenereerde hulpmiddelen om de gevolgen van de variant van de rente in vivo in Drosophilate beoordelen. Overweeg het gebruik van beide benaderingen, omdat de twee complementair zijn.

  1. Functionaalanalyse uitvoeren via op Rescue gebaseerde experimenten
    Opmerking: Heterologous Rescue-gebaseerde experimenten inDrosophilahet gebruik van menselijke eiwitten bepalen of de moleculaire functie van de twee orthologeuze genen is bewaard gedurende ~ 500.000.000 jaar evolutie. Ze beoordelen ook de functie van de variant in de context van het menselijke eiwit63. Hoewel een systematische analyse van honderden genen paren niet is gemeld, kunnen enkele tientallen mensen en zoogdieren (bijvoorbeeld muis) genen de functie vanDrosophilaGenen13.
    1. Bepaal in de op redding gebaseerde aanpak eerst of er duidelijke, scorable en reproduceerbare fenotypes zijn in LOF mutanten in de Fly ortholog voor het beoordelen van de functies van de varianten.
      Opmerking: eerdere literatuur over het Fly-gen is een goede plek voor data Mine eerst, en het kan worden gevonden met behulp van databases met inbegrip van flybase en PubMed. Extra databases zoals MARRVEL, Monarch Initiative en Gene2Funcion zijn ook nuttig bij het verzamelen van deze informatie.
    2. Voer een globaal onderzoek uit van scoor bare fenotypes in homozygoot en hemizygoot (T2a-GAL4 allel over een moleculair gedefinieerde chromosomale deficiëntie dieren, vooral als het T2a-GAL4 allel de eerste mutatie is die wordt gekarakteriseerd voor een specifiek gen. Het beoordelen van fenotypes zoals letaliteit, steriliteit, levensduur, morfologische (bv. grootte en morfologie van het oog) en gedrag (bijv. verkering, vlucht, klimmen en knal gevoeligheids defecten).
      Opmerking: als er geen belangrijke fenotypes van dit primaire scherm worden geïdentificeerd, kunnen subtielere fenotypes zoals neurologische defecten gemeten door elektrofysiologische opnames worden gebruikt als ze zeer reproduceerbaar en specifiek zijn. Als voorbeeld, functionele studies met electroretinogram (ERG) worden beschreven in stap 3.2.3. Als er geen scorbaar fenotype kan worden gedetecteerd, gaat u naar sectie 3,2 en voert u de op overexpressie gebaseerde functionele studie uit.
    3. Zodra een verschscorbaar fenotype in de Fly LOF mutant is geïdentificeerd, test of de referentie Human cDNA de functie van de Fly ortholog kan vervangen door een poging om humaan cDNA te gebruiken om de Mutant Fly line te redden. De fenotypische assay die hier moet worden uitgevoerd, is afhankelijk van de resultaten van stap 3.1.2 en zal specifiek zijn voor het onderzochte gen.
      Opmerking: als "humanisatie" van het Fly-gen succesvol is, is er nu een platform om de efficiëntie van redding te vergelijken met de variant van belang in vergelijking met de referentie-tegenhanger. De redding gezien met Reference Human cDNA hoeft niet perfect te zijn. Gedeeltelijke redding van de Fly Mutant fenotype met behulp van een humaan cDNA biedt nog steeds een referentiepunt voor het uitvoeren van vergelijkende studies met behulp van de variant menselijke cDNA stam.
    4. Vergelijk met behulp van het in stap 3.1.2 geselecteerde testsysteem de redding met het referentie humaan cDNA naar de redding waargenomen bij de variant Human cDNA om te bepalen of de variant van de rente gevolgen heeft voor het gen van belang.
      Opmerking: als de variant Human cDNA slechter presteert dan het referentie-allel, suggereert dit dat de variant van de interesse schadelijk is voor de eiwit functie. Als de variant en referentie niet functioneel kunnen worden onderscheiden, dan 1) het allel kan een isomorf zijn (een variant die geen invloed heeft op de eiwit functie) of 2) de assay is niet gevoelig genoeg om subtiele verschillen te detecteren.
    5. Als de variant een schadelijk allel is, evalueer dan verder de expressie en de intracellulaire lokalisatie van de referentie-en variant-eiwitten van belang in vivo via Western Blot, immunofluorescentie kleuring of andere methoden93.
      Opmerking: als de UAS-Human cDNA wordt gegenereerd op basis van een open kloon in een PGW-ha. attb vector, gebruik een anti-ha-antilichaam om deze biochemische en cellulaire testen uit te voeren. Als de originele kloon een gesloten kloon is, test dan of commerciële antilichamen tegen de menselijke eiwitten kunnen worden gebruikt voor deze testen. Een verschil in uitdrukkings niveaus en intracellulaire lokalisatie kan onthullen hoe de variant van de rente de eiwit functie beïnvloedt.
  2. Uitvoeren van functionele analyses via overexpressie studies
    Opmerking: alomtegenwoordige of Weefselspecifieke overexpressie van menselijke cdna's in anderszins wild-type vliegen kan informatie verschaffen die complementair is aan de op redding gebaseerde experimenten die worden besproken in paragraaf 3,1. Hoewel reddingsoperaties voornamelijk zijn ontworpen om LOF-varianten (amorfe, hypomophic) te detecteren, kunnen overexpressie-gebaseerde assays ook de gain-of-function (GOF)-varianten onthullen die moeilijker te beoordelen zijn (hypermorfe, antimorf, neomorf).
    1. Selecteer een set GAL4 drivers om de Human cDNAs van belang te overdrukken. Een aantal alomtegenwoordige en weefsel-/stage-specifieke GAL4-Stuurprogramma's zijn verkrijgbaar bij openbare voorraad centra (bijv. BDSC), waarvan sommige vaker worden gebruikt dan andere. Eerste focus op alomtegenwoordige bestuurders en gemakkelijk scoor bare fenotypes (letaliteit, steriliteit, morfologische fenotypes), ga dan naar weefsel-specifieke drivers en meer specifieke fenotypes.
      Opmerking: Valideer de expressie van GAL4-Stuurprogramma's met een reporter regel (bijvoorbeeld UAS-GFP) om te bevestigen van de expressie patronen vóór gebruik in de experimenten.
    2. Express de referentie en variant Human cDNAs met dezelfde bestuurder onder dezelfde voorwaarde (bijv. temperatuur) door kruising 3-5 Virgin vrouwtjes uit de GAL4-lijn (bv. EY-GAL4 voor Eye imaginal disc Expression) met 3-5 mannelijke vliegen van de UAS-lijnen [bijv. UAS-TBX2 (+) of UAS-TBX2 (p. R305H) voor het voorbeeld in punt 4,2] in een enkele injectieflacon.
      1. Overdracht van de kruisen elke 2-3 dagen te hebben veel dieren ecverliezen van een enkel kruis.
    3. Onderzoek de nakomelingen en Detecteer eventuele verschillen tussen de referentie-en variant stammen (bv. oogmorfologie) onder een dissectie Microscoop. Beeld de vliegen met behulp van een camera bevestigd aan een dissectie Microscoop te documenteren fenotype.
      Opmerking: als een fenotype alleen wordt gezien in de referentie, maar niet in de variant lijn, dan kan de variant een amorfe of een sterk hypomorfe allel zijn. Als het fenotype in beide genotypen wordt gezien, maar de referentie een sterker defect veroorzaakt, dan kan de variant een mild tot zwak hypomorf allel zijn. Als de verwijzing geen fenotype vertoont of slechts een zwak fenotype bevat, maar de variant een sterk defect vertoont, kan de variant een GOF-allel zijn.
    4. Als een fenotype niet wordt gezien in de standaard kweekomstandigheden (RT of bij 25 °c, stel dan de kruisingen in bij verschillende temperaturen variërend van 18-29 °c, aangezien het UAS/GAL4-systeem bekend staat als temperatuurgevoelig64,65). Meestal is de expressie van UAS-transgenen hoger bij hogere temperaturen.
  3. Uitvoeren van aanvullende functionele studies met betrekking tot de genen en het eiwit van belang.
    Opmerking: Naast het onderzoeken van algemene defecten kan een testsysteem worden geselecteerd om de moleculaire functies van het gen en de variant te testen. In een voorbeeld dat wordt besproken in de representatieve resultaten (TBX2geval) werden erg-opnames gebruikt om de effecten van de variant op de functie fotoreceptor te bepalen, omdat het gen van de fly van belang (bifid) uitvoerig bestudeerd in het kader van de ontwikkeling van het visuele systeem. Gedetailleerde protocollen voor ERG inDrosophilakan worden gevonden als eerder gepubliceerd66,67,68.
    1. Genereer vliegen om te testen op functionele defecten in het visuele systeem. Kruis Virgin vrouwtjes van de Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 lijn aan mannetjes met referentie of variant UAS-Human cDNA transgenes om de menselijke eiwitten van belang te uiten in de R1-R6 photoreceptors.
      Opmerking: Kruis 3-5 Virgin vrouwtjes naar 3-5 man vliegt in een enkele injectieflacon en overdracht van de kruisen elke 2-3 dagen te hebben veel dieren ecverliezen van een enkel kruis. Alle kruisen moeten worden bewaard in een incubator die bij de proef temperatuur is ingesteld om consistente resultaten te verkrijgen.
    2. Zodra vliegen begint te Eclose (bij 25 ° c, ~ 10 dagen na het instellen van het eerste Kruis), verzamelen van de nakomelingen (Rh1-GAL4/+; UAS-humaan cDNA/+) in verse flesjes en plaats ze terug in de incubator ingesteld op de experimentele temperatuur voor nog 3 dagen voor het visuele systeem te rijpen.
      Opmerking: Hoewel erg kan worden uitgevoerd op 1-2 dag oude vliegen, nieuwe eclosed vliegen kunnen grote schommelingen in hun erg signaal hebben. Als het wenselijk is om een leeftijdsgebonden fenotype te onderzoeken, kunnen deze vliegen enkele weken worden gerijpt, zolang ze regelmatig (bijv. elke ~ 5 dagen) naar een nieuwe injectieflacon worden overgebracht om verdrinking in nat voedsel te voorkomen.
    3. Bereid de vliegen voor het opnemen van de ERG door eerste anesthetiserende de vliegen met behulp van CO2 of het plaatsen van hen in een flacon op ijs. Lijm de ene kant van de vlieg zachtjes op een glazen Microscoop glijbaan om ze te immobiliseren.
      Opmerking: meerdere referentie-en variant vliegen kunnen worden gelijmd op een enkele dia. Plaats alle vliegen in ongeveer dezelfde oriëntatie met één oog toegankelijk voor de opname-elektrode. Zorg ervoor dat u geen lijm op het oog krijgt en dat u de Proboscis gratis verlaat.
    4. Bereid de opname-en referentie-elektroden. Plaats een 1,2 mm Glazen capillair in een naald trekker en activeer. Breek het capillaire buisje om twee scherpe taps toelopende elektroden te verkrijgen. De resulterende elektroden moeten hol zijn en hebben een uiteindelijke diameter van < 0,5 mm.
    5. Vul de capillairen met zoutoplossing (100 mM NaCl), ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen. Schuif de glazen capillairen over de zilver draad elektroden (zowel de opname-elektrode en referentie-elektrode, Zie Figuur 4) en bevestig de capillairen op zijn plaats.
    6. Configureer de stimulator en versterker. Een gedetailleerde opstelling vind je in Lauwers, et al.67. De installatie van de UDN Drosophila MOSC bestaat uit apparatuur die wordt vermeld in de sectie materialen.
      1. Stel de versterker in op 0,1 Hz high-pass filter, 300 Hz low-pass filter en 100 Gain.
      2. Stel de stimulator in op 1 s-periode, 500 MS pulsbreedte, 500 MS Pulse delay, run mode en 7 amp.
      3. Maak de lichtbron klaar voor foto stimulatie. Gebruik een halogeen lichtbron om de Fly photoreceptors te activeren.
      4. Bereid de opname software voor op een computer die is aangesloten op de ERG-opstelling. Maak een stimulatie protocol met acquisitie model "vaste lengte gebeurtenissen" en 20 s duur.
    7. Acclimatiëren de vliegen om duisternis te voltooien voor het initiëren van ERG opnames. Plaats de vliegen in volledige duisternis voor ten minste 10 minuten voordat u begint met het experiment.
      Let op: omdat vliegen geen rood licht kan detecteren, gebruik dan een rode lichtbron tijdens de periode van donkere gegegegegegegegeis.
    8. Plaats de dia met de vliegen op het opnameapparaat en verplaats de micro manipulatoren die de referentie-en opname-elektroden dragen naar een punt dat dicht bij de rente op de dia ligt. Bekijk de punt van de elektrode en plaats de referentie-elektrode voorzichtig in de thorax van de vlieg (doordringen in de cuticula). Zodra de referentie-elektrode stabiel is ingebracht, plaatst u de opname-elektrode op het oppervlak van het oog.
      Opmerking: de exacte positie van deze referentie-elektrode heeft geen grote invloed op het erg-signaal. De opname-elektrode moet aan het oppervlak van het oog worden geplaatst, omdat ERG een veld potentiaal opname is in plaats van een intracellulaire opname. De juiste hoeveelheid druk op de opname-elektrode veroorzaakt een kleine Dimple zonder het oog in te dringen.
    9. Schakel alle lichten uit voor nog eens 3 minuten om de vliegen naar de donkere omgeving te acclimeren.
    10. Stel de opname software in en begin met het opnemen van het signaal. Als u een halogeen lichtbron gebruikt met handmatige sluiter, zet dan de lichtbron aan met de sluiter gesloten. Begin met het opnemen van het signaal.
    11. Bloot de vlieg ogen aan het licht door de sluiter elke 1 s te openen en te sluiten voor de 20 s duur van een enkele hardloopsessie.
      Opmerking: de aan/uit van de halogeen lichtbron kan handmatig worden bediend of geprogrammeerd om te worden geautomatiseerd met behulp van een witte LED-lichtbron. Robuustere en betrouwbaardere ERG kan worden verkregen door een halogeen lichtbron te gebruiken in vergelijking met een witte licht-LED, waarschijnlijk als gevolg van het bredere Lichtspectrum uitgezonden door de halogeen lichtbron.
    12. Registreer ERGs van alle vliegen die op de glazen glijbaan zijn gemonteerd. Voer ERGs uit vanaf 15 vliegen per genotype per aandoening.
      Opmerking: sommige parameters die kunnen worden gewijzigd om een voorwaarde te vinden die robuuste verschillen vertoont tussen referentie-en variant-cdna's kunnen temperatuur, leeftijd of omgevingscondities omvatten (bijv., gehouden in licht-donkere cyclus of constant licht/duisternis).
    13. Gegevensanalyse uitvoeren: Vergelijk de ERGs van de verwijzing, variant en besturingselementen om te bepalen of er verschillen zijn. Evalueer de ERG-gegevens voor veranderingen in transiënten, ontpolsatie, off-Transiënten en repolarisatie69 (Figuur 4B).
      Opmerking: depolarisatie en repolarisatie weerspiegelen de activering en inactivatie van de fototransductie Cascade binnen fotoreceptoren, terwijl on-en off-transiënten maatregelen zijn van de activiteiten van post synaptische cellen die signalen ontvangen van de photoreceptors. Een verminderde amplitude en veranderde kinetiek van repolarisatie worden vaak geassocieerd in defecten met de functie van de fotoreceptor en de gezondheid, terwijl defecten in on-en off-transiënten worden aangetroffen in mutanten met defecte Synapse ontwikkeling, functie of onderhoud 70.
    14. Na identificatie van verschillen in ERG fenotypes met overexpressie van referentie versus variant Human Cdna's, Bepaal of dit elektrofysiologische fenotype geassocieerd is met structurele en ultrastructurele defecten in fotoreceptoren en hun synapsen door het uitvoeren van histologische analyse en transmissie elektronenmicroscopie.
      Opmerking: verdere bespreking van de interpretatie van erg gebreken en structurele/ultrastructurele analyse is eerder beschreven69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Functionele studie van de Novo missense variant in EBF3 gekoppeld aan neurodevelopmental fenotypes
In een 7-jarige man met neurodevelopmental fenotypes met inbegrip van hypotonie, ataxie, wereldwijde ontwikkelingsachterstand, en expressieve spraakstoornis, artsen en menselijke genetici bij de National Institutes of Health Ungediagnosticeerde ziekten project (UDP) identificeerde een de Novo missense variant (p. R163Q) in EBF3 (Early b-Cell factor 3)15, een gen dat een Coe (Collier/Olfactory-1/Early B-cell factor) familie transcriptiefactor codeert. Deze zaak werd ingediend bij de UDN MOSC in maart 2016 voor functionele studies. Om te beoordelen of dit gen een goede kandidaat voor deze zaak was, verzamelde de MOSC menselijke genetische en genomische informatie van OMIM, ClinVar, ExAC (nu uitgebreid tot gnomAD), geno2MP, DGV en Decipher. Daarnaast werden de orthologeuze genen in belangrijke MO-soorten geïdentificeerd met behulp van het DIOPT-gereedschap. Genexpressie en fenotypische informatie uit individuele MO-databases (bijv. worm Base, FlyBase, ZFIN, MGI) werden vervolgens verkregen. De informatica analyses die werden uitgevoerd voor EBF3 en andere baanbrekende studies in het UDN MOSC vormden de basis voor de latere ontwikkeling van de MARRVEL resource30.

De informatie die met behulp van deze methodologie is verzameld EBF3 was niet geassocieerd met enige bekende menselijke genetische aandoening op het moment van analyse, en er werd geconcludeerd dat de p. R163Q variant een goede kandidaat was op basis van de volgende informatie. (1) deze variant was niet eerder gerapporteerd in de controlepopulatie databases (ExAC) en de database van de ziekte populatie (geno2MP), wat aangeeft dat dit een zeer zeldzame variant is. (2) op basis van ExAC is de pLI (waarschijnlijkheid van LOF intolerantie) Score van dit gen 1,00 (pLI scores bereik van 0.00-1.00). Dit geeft aan dat er selectieve druk is tegen LOF-varianten in dit gen in de algemene populatie en suggereert dat haploinsufficiëntie van dit gen ziekte kan veroorzaken. Voor meer informatie over pli Score en de interpretatie ervan, een begeleidende marrvel tutorial artikel in jove31 en gerelateerde papers geven Details30,71.

De p. R163Q variant werd ook beschouwd als een goede kandidaat omdat (3) het is gelegen in het evolutionair bewaard DNA bindend domein van dit eiwit, suggereren dat het kan invloed hebben op DNA-binding of andere eiwit functies. (4) het residu van p. R163 wordt evolutionair bewaard van C. elegans en Drosophila naar de mens, wat suggereert dat het kritisch kan zijn voor eiwit dat functioneel is voor verschillende soorten. (5) EBF3 orthologs zijn betrokken bij neuronale ontwikkeling in meerdere mo72 inclusief C. elegans73, Drosophila74, Xenopus75en muizen76. (6) tijdens de ontwikkeling van de hersenen bij muizen is aangetoond dat Ebf3 stroomafwaarts van ARX (aristaless-gerelateerde homebox)77werkt, een gen geassocieerd met verschillende epilepsie en verstandelijke handicap syndromen bij de mens78. Vandaar, deze gegevens samen suggereren dat EBF3 is zeer waarschijnlijk cruciaal voor menselijke neuro ontwikkeling en dat de p. R163Q variant functionele gevolgen kan hebben.

Om te beoordelen of p. R163Q invloed heeft op EBF3 functie, is een T2A-GAL4 lijn voor knoop (kn; de Fly ortholog van human EBF379) gegenereerd via rmce van een codering intronic nabootsen inbrengen15. De knT2a-GAL4 lijn is recessieve letale en niet aan te vullen de letaliteit van een klassieke kn allel (knCol-1), evenals moleculair gedefinieerde DEFICIËNTIE die bedekt kn [DF (2R) BSC429]80 . Expressie patronen van de GAL4 ook weerspiegelen eerder gerapporteerde patronen van kn expressie in de hersenen, alsmede in de vleugel imaginal schijf15. UAS transgene vliegen werden vervolgens gegenereerd om de uitdrukking van referentie en variant Human EBF3 cDNA evenals wild-type vliegen kn cDNA. Alle drie de eiwitten werden getagd met een C-Terminal 3xHA tag. Belangrijk, UAS wild-type Fly kn (kn+) of Reference Human EBF3 (EBF3+) transgenes gered de letaliteit van knT2a-GAL4/DF (2R) BSC429 in een vergelijkbare mate ( Afbeelding 3C, linker paneel)81.

UAS-Human EBF3 transgen met de p. R163Q variant (EBF3p. R163Q) was echter niet in staat om deze Mutant te redden, wat suggereert dat de p. R163Q variant invloed heeft op EBF3 functie in vivo15. Interessant is dat, wanneer beoordeeld met behulp van een anti-HA-antilichaam, het EBF3p. R163Q eiwit met succes werd uitgedrukt in de vlieg weefsels, en de niveaus en subcellulaire lokalisatie (voornamelijk nucleaire) waren niet te onderscheiden van die van EBF3+ en KN+. Dit suggereert dat de variant geen LOF fenotype veroorzaakt als gevolg van eiwit instabiliteit of verkeerd lokalisatie. Om verder te beoordelen of de p. R163Q variant de transcriptionele activeringsfunctie van EBF3beïnvloede, werd een op Luciferase gebaseerde reporter assay uitgevoerd in HEK293 cellen15. Dit experiment in gekweekte menselijke cellen onthulde dat de EBF3p. R163Q variant niet in staat was om de transcriptie van de reporter constructies te activeren, ter ondersteuning van het lof model verkregen uit Drosophila experimenten.

Parallel aan de experimentele studies leidden samenwerkingen met artsen, menselijke genetici en genetische raadgevers bij BCM tot de identificatie van twee extra personen met soortgelijke symptomen. Eén patiënt droeg de identieke p. R163Q variant, en een andere droeg een missense variant die hetzelfde residu beïnvloede (p. R163L). De p. R163L variant ook niet te redden van de Fly kn Mutant93 suggereren dat dit ALLEL ook beïnvloed EBF3 functie. Interessant is dat dit werk werd gepubliceerd back-to-back met twee onafhankelijke menselijke genetica studies die gemeld extra individuen met de Novo missense, onzin, frame Shift, en splicing varianten in EBF3 gekoppeld aan soortgelijke neurodevelopmental fenotypes82,83. Vervolgens werden er drie aanvullende documenten gepubliceerd waarin aanvullende gevallen van de Novo EBF3 -varianten en afschriftnummer verwijdering84,85,86werden bekendgemaakt. Dit nieuwe neuroontwikkelingssyndroom is nu bekend als de hypotonie, ataxie en vertraagde ontwikkelings syndroom (HADDS, MIM #617330) in de online Mendeliaanse erfenis in de mens (OMIM, een gezaghebbende database voor genotype-fenotype verhoudingen bij de mens).

Functionele studie van dominant erfelijke missense-variant in TBX2 gekoppeld aan een Syndromische cardiovasculaire en skelet ontwikkelingsstoornis
In een kleine familie die wordt getroffen door overlappende spectrums van craniofaciale dysmorfie, cardiale anomalieën, skeletafwijkingen, immuundeficiëntie, endocriene afwijkingen en ontwikkelingsstoornissen, heeft de klinische site van de UDN-hertog een missense-variant geïdentificeerd (p. R20Q) in TBX2 die scheidt met de ziekte fenotypes87. Drie (zoon, dochter, moeder) van de vier familieleden worden beïnvloed door deze aandoening, en de zoon tentoongesteld de meest ernstige fenotype. Klinisch, hij ontmoette een diagnose van "volledige DiGeorge syndroom", een aandoening die vaak veroorzaakt door haploinsufficiëntie van TBX1. Hoewel er in deze familie geen mutaties waren geïdentificeerd in TBX1 , richtten de clinici en menselijke genetici zich op een variant in TBX2, aangezien eerdere studies bij muizen toonden dat deze genen overlappende functies hebben tijdens de ontwikkeling88 . TBX1 en TBX2 beide behoren tot T-box (TBX) familie van transcriptiefactoren die kunnen fungeren als transcriptionele onderdrukkers, evenals Activators afhankelijk van de context.

Voorheen waren varianten in 12 van de 17 leden van de Tbx familie genen gekoppeld aan menselijke ziektes. De MOSC besloot om experimenteel deze variant voort te zetten op basis van de volgende informatie verzameld via MARRVEL en andere bronnen. (1) deze variant werd slechts eenmaal gerapporteerd in een cohort van ~ 90.000 "controle" individuen in gnomAD (deze variant werd uitgefilterd in een standaardweergave, waarschijnlijk als gevolg van lage dekking leesbewerkingen). Gezien de mildere fenotypische presentatie van de moeder, kan dit nog steeds worden beschouwd als een zeldzame variant die verantwoordelijk kan zijn voor de fenotypes van de ziekte. (2) de pLI-scores van TBX2 in exac/gnomAD zijn 0,96/0,99, wat hoog is (maximum = 1,00). Daarnaast is de o/e (waargenomen/verwacht) LOF Score in gnomAD is 0,05 (slechts 1/18.6 verwacht LOF variant wordt waargenomen in gnomAD). Deze getallen suggereren dat LOF varianten in dit gen worden gekozen tegen in de algemene populatie.

Bovendien, (3) de p. R20 is evolutionair bewaard van C. elegans en Drosophila aan de mens, wat suggereert dat dit een belangrijk residu voor TBX2 functie kan zijn. (4) meerdere Programma's voorspellen dat de variant waarschijnlijk schadelijk is (polyphen: mogelijk/waarschijnlijk schadelijk, SIFT: deleterious, CADD Score: 24,4, REVEL Score: 0,5). (5) MO-mutanten vertonen defecten in weefsels die zijn aangetast bij patiënten (bijv. knock-outmuizen die defecten vertonen in het cardiovasculaire systeem, spijsverterings-/alimentaire systemen, craniofaciale, ledematen/Digit). Daarom was het, samen met de biologische verbanden tussen TBX1 en TBX2 en fenotypische verbanden tussen deze patiënten en DiGeorge syndroom, optimaal om functionele studies van varianten in dit gen uit te voeren met Drosophila.

Om te beoordelen of de p. R20Q variant invloed heeft op TBX2 functie, is een T2a-GAL4 lijn in bifid (bi; het Drosophila ORTHOLOG van humane TBX2) gegenereerd via Rmce van een codering intronic nabootsen (Figuur 2)87. Dit allel, biT2a-GAL4, was recessieve exuviae dodelijk en gedroeg als een sterke lof Mutant, vergelijkbaar met eerder gerapporteerde bi lof allelen (bijv., biD2, biD4; Figuur 2 E). de letaliteit van deze klassieke en nieuw gegenereerde bi -allelen werd gered door een ~ 80 KB genomische reddingsconstructie met de gehele bi -Locus, wat erop duidt dat deze reagentia inderdaad schoon lof allelen zijn. Het expressie patroon van GAL4 in de biT2a-GAL4 lijn kwam ook goed overeen met eerder gerapporteerde patronen van bi -expressie in meerdere weefsels, waaronder in de vleugel imaginale schijf (Figuur 2D).

Parallel, UAS-transgene lijnen voor TBX2 met de referentie of variant (p. R20Q) sequenties werden gegenereerd. Helaas, geen van beide transgen was in staat om letaliteit van de biT2a-GAL4 lijn te redden. Belangrijk is dat een wild-type Fly UAS-bi transgen ook faalde om de biT2a-GAL4 allel te redden, waarschijnlijk als gevolg van de doserings gevoeligheid van dit gen. Sterker nog, overexpressie van UAS-bi+ en UAS-TBX2+ veroorzaakte een zekere mate van letaliteit wanneer deze overuitgedrukt werd in een wild-type dier. Dit toxische effect van bi/TBX2 overexpressie werd gebruikt als een functionele assay om te beoordelen of de p. R20Q variant van invloed kan zijn op TBX2 functie. Aangezien het Drosophila bi -gen uitvoerig is bestudeerd in de context van het visuele systeem [gen is ook bekend als optomotor blind (OMB)], werden fenotypes gerelateerd aan het visuele systeem uitvoerig onderzocht. Wanneer de referentie TBX2 werd uitgedrukt met behulp van een EY-GAL4 -driver die UAS-transgenes uitdrukt in het oog en delen van de hersenen die relevant zijn voor het visuele systeem, ~ 85% letaliteit (Figuur 3C, rechter paneel) en significante vermindering van de ooggrootte (Figuur 4B) werd waargenomen. Dit fenotype was sterker dan het fenotype dat werd waargenomen wanneer een wild-type Fly UAS-bi- transgen werd uitgedrukt, wat suggereert dat de menselijke TBX2 meer schadelijk is voor de vlieg wanneer deze overexpressie is.

Belangwekkend, de p. R20Q TBX2 was minder potent in het veroorzaken van letaliteit (Figuur 3C, rechter paneel) en bij het induceren van een klein oog fenotype (Figuur 4B) met behulp van dezelfde bestuurder onder de identieke voorwaarde87, suggereren dat de variant de eiwit functie beïnvloedt. Bovendien is de functie van fotoreceptoren die de referentie-en variant TBX2 met behulp van een andere GAL4 driver, (Rh1-GAL4) die specifiek UAS-transgenen in R1-R6-fotoreceptoren uitdrukt, onthuld dat de variant TBX2 een veel mildere ERG fenotype vergeleken met referentie TBX2 (Figuur 4B)87. Interessant is dat de meeste van de p. R20Q TBX2 eiwit nog steeds gevonden in de Nucleus, vergelijkbaar met het referentie-eiwit, wat suggereert dat de variant niet van invloed op nucleaire lokalisatie. Een op Luciferase gebaseerde transcriptionele repressie test in HEK293T cellen toonde aan dat de p. R20Q niet in staat was om de transcriptie van een reporter constructie met palindroom T-Box sites87effectief te onderdrukken. Bovendien, dalingen van de eiwit niveaus van TBX2p. R20Q werden waargenomen in vergelijking met TBX2+, wat suggereert dat de variant kan invloed hebben op de vertaling of eiwit stabiliteit van TBX2, die op zijn beurt beïnvloedt zijn overvloed in een cel.

Aanvullende patiënten met zeldzame varianten in TBX2 werden in parallel met deze experimentele studies geïdentificeerd door clinici op de klinische site van UDN Duke.  Een 8-jarige jongen met een de Novo missense (p. R305H) variant van een niet-verwante familie tentoongesteld veel van de functies gevonden in de eerste familie87. Aanvullende functionele studies in Drosophila en Human cellijnen toonden aan dat de p. R305H variant ook TBX2 functie en eiwit niveaus beïnvloedt, wat sterk suggereert dat defecten in dit gen waarschijnlijk ten grondslag liggen aan veel fenotypes gevonden in de twee families. Deze aandoening werd onlangs samengesteld als "Vertebrale anomalieën en variabele endocriene en T-cel dysfunctie" (VETD, MIM #618223) in OMIM. Identificatie van extra personen met schadelijke varianten in TBX2 met overlappende fenotypes is essentieel om het volledige spectrum van genotype-fenotype-relaties voor dit gen in de menselijke ziekte te begrijpen.

Figure 1
Figuur 1 : Injectie-en oversteek schema voor het genereren van UAS-menselijke cDNA-en T2a-GAL4-lijnen. A) opwekking van UAS-humane cDNA-transgenen door middel van micro injecties en kruisingen. De kruising van de transgenen in een tweede chromosoom docking site (VK37) met behulp van mannelijke vliegen in de eerste en tweede generatie worden getoond als een voorbeeld. Na injectie van de humane cDNA φc31 transgene constructie (PGW-ha. attb) in vroege embryo's die een kiembaan bron van φc31 integrase bevatten (gelabeld met 3xp3-GFP en 3xp3-RFP) en VK37 docking site [gelabeld met een geel+ (y+ ), kunnen transgene gebeurtenissen worden gevolgd met de witte+ (w+) minigene die aanwezig is in de transgene vector. Het wordt aanbevolen om het oversteken van de φC31 integrase door te selecteren tegen vliegen met GFP en RFP. De uiteindelijke stabiele kolf kan worden bewaard als homo zygoten of als een gebalanceerde kolf als het chromosoom een tweede site dodelijke/steriele treffer mutatie draagt. De aanwezigheid van tweede site letale/steriele mutaties op een transgene constructie heeft gewoonlijk geen invloed op de uitkomst van functionele studies zolang deze transgenen in heterozygoot worden gebruikt (Figuur 3). B) genereren van T2a-GAL4 lijnen door middel van Microinjection en kruisen. Oversteek schema voor het omzetten van een tweede chromosoom nabootsen invoegen in een T2A-GAL4 element wordt weergegeven als een voorbeeld. Door microinjecteren van een expressie vector voor φC31 integrase en RMCE vector voor T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70, een geschikte lees frame voor het nabootsen van belang is geselecteerd. Zie de volgende papers voor Details57,59 in embryo's die een nabootsen in een codering intron in gen van belang, kan men het originele nabootsen omzetten in een T2a-GAL4 lijn. Figuur 2 A toont een schematisch diagram van de rmce-conversie. De conversiegebeurtenis kan worden geselecteerd door te screenen op de y+ marker in de originele nabootsen cassette60. Aangezien rmce in twee richtingen kan voorkomen, leidt slechts 50% van de succesvolle conversiegebeurtenis tot een succesvolle productie van GAL4, die kan worden gedetecteerd door een UAS-GFP reporter transgen in de volgende generatie. De uiteindelijke stabiele kolf kan worden bewaard als homo zygoeten of als een gebalanceerde kolf als het LOF van het gen dodelijk/steriel is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Omzetting van Nabootsings elementen in T2a-GAL4 lijnen via RMCE. (A) φc31 integrase vergemakkelijkt de recombinatie tussen de twee attp -sites in de vlieg (boven) en twee ATTB -locaties die een T2a-GAL4 cassette flaneren die wordt weergegeven als een cirkelvormige vector (onder). B) succesvolle rmce-gebeurtenissen leiden tot verlies van een selecteerbaar markeerteken (geel +) en het inbrengen van de T2a-GAL4 cassette in dezelfde richting van het gen van belang. Aangezien de RMCE-gebeurtenis in twee richtingen kan gebeuren, levert slechts 50% van de RMCE-reactie een gewenst product op. Een RMCE-product dat in de tegenovergestelde richting wordt geplaatst, functioneert niet als een Genval-allel of Express-GAL4. De directionaliteit van de constructie moet worden bevestigd via Sanger-sequencing. (C) transcriptie (boven) en translatie (onder) van het gen van belang leidt tot het genereren van een afgeknotte mRNA en eiwit als gevolg van het Polya-signaal dat aanwezig is op het 3 ' uiteinde van de T2a-GAL4 cassette. De T2a is een ribosoom overslaan signaal, waardoor het ribosoom te stoppen en opnieuw initiëren van de vertaling na dit signaal. Dit wordt gebruikt om een GAL4 element te genereren dat niet covalent is gehecht aan het afgeknotte genproduct van belang. De GAL4 zal de Nucleus betreden en zal de transcriptie van transgenen die onder controle van UAS-elementen staan, vergemakkelijken. UAS-GFP kan worden gebruikt als een genexpressie Reporter, en UAS-Human cDNA kan worden gebruikt voor reddingsexperimenten via gen "humanisatie". (D) getoond is een voorbeeld van een T2a-GAL4 element in bi -Driving expressie van UAS-GFP (top). Deze expressie patroon lijkt op een eerder gegenereerde Enhancer trap-lijn voor hetzelfde gen (biOMB-GAL4; onder). E) vergelijking van T2a-GAL4 allel van bi met eerder gerapporteerde lof bi allelen. Dit cijfer is overgenomen en gewijzigd uit eerdere publicaties57,87. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Functionele analyse van menselijke varianten met behulp van op redding gebaseerde (linker) en overexpressie gebaseerde (rechts) studies. (A) (linker paneel): de functie van EBF3 varianten werd beoordeeld met een Rescue-based analyse van de Fly- Knot (kN) lof allel gericht op letaliteit/levensvatbaarheid; (rechter paneel): de functie van varianten in TBX2 werd beoordeeld door het uitvoeren van overexpressie van menselijke TBX2 transgenen in wild-type vliegen, gericht op letaliteit/levensvatbaarheid, oogmorfologie en elektrofysiologie fenotypes (Figuur 4) . B) de oversteek schema's om de vliegen te verkrijgen die in de functionele studies moeten worden getest. Het wordt geadviseerd om altijd een neutraal UAS-element (bijv. UAS-lacZ, UAS-GFP) als controle-experiment te gebruiken. C) representatieve resultaten van functionele studies van respectievelijk EBF3p. R163Q en TBX2p. R20Q varianten, samen met passende controle experimenten die nodig zijn om de resultaten te interpreteren. Zowel op redding gebaseerde analyse als overexpressie studies blijkt dat de varianten zich gedragen als amorfe of hypomorfe allelen. De hier getoonde letaliteit/levensvatbaarheid gegevens zijn gebaseerd op experimentele gegevens die zijn gepresenteerd in eerdere publicaties15,87. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : Functionele analyse van een zeldzame missense-variant in Human TBX2 op basis van oogmorfologie en electroretinogram in Drosophila. A) eenschematisch beeld van de typische plaatsing van de opname-en referentie-elektroden op het vlieg oog, samen met een representatieve electroretinogramopname met vier belangrijke componenten (on-Transient, depolarisatie, off-Transient, repolarisatie). B) TBX2 variant (p. R20Q) functioneert als een gedeeltelijke lof allel op basis van overexpressie studies in de Fly Eye met behulp van GAL4 drivers specifiek voor het visuele systeem (EY-GAL4 en Rh1-GAL4). Hieruit bleek dat de referentie TBX2 een sterk morfologisch en elektrofysiologisch fenotype veroorzaakte in vergelijking met het variant eiwit. (Bovenste panelen): een ernstige afname van de ooggrootte wordt gezien bij overexpressie van UAS-TBX2+ met EY-GAL4. UAS-TBX2p. R20Q. Gedreven met EY-GAL4 veroorzaakt ook een kleiner oog, maar het fenotype is veel milder. (Onderste panelen): wanneer UAS-TBX2+ wordt uitgedrukt in de core R1-R6 fotoreceptoren met behulp van Rh1-GAL4, is er een verlies van on-en off-transiënten, verminderde depolarisatie, en grote abnormale verlengde depolarisatie na potentiele (PDA) fenotype, die niet wordt gezien in de controle vliegt. Deze fenotypes zijn niet zo ernstig als wanneer UAS-TBX2p. R20Q wordt uitgedrukt met behulp van dezelfde Rh1-GAL4. Dit cijfer is overgenomen en gewijzigd uit eerdere publicaties69,87. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Purpose Tool Url
Variant functie
Voorspellings algoritmen
PolyPhen-2
Sift
CADD
PROVEAN
MutationTaster
Revel
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
Zeldzame en niet-gediagnosticeerde
ziekte onderzoek
Consortia
Udn
RDMM
IRUD
SOLVE-RD
AFGN
https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
Integratieve database voor
mens en model
Informatie over organismen
MARRVEL
Monarch Initiative
Gene2Function
Fenologs
http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
Menselijke genetische en
Genomics-databases
OMIM
ClinVar
ExAC
gnomAD
GenoMP
DGV
Ontcijferen
https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
Ortholog-identificatie tool DIOPT https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Model organisme
Databanken en biomedische
Literatuur zoeken
Worm base (C elegans)
FlyBase (Drosophila)
ZFIN (zebravis)
MGI (muis)
Pubmed
https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Genetische en eiwit
interactie databases
Tekenreeks
MIST
https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Eiwitstructuur
databases en
hulpprogramma's voor modellering
WWPBD
SWISS-MODEL
Modeller
Phyre2
http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Patiënt matchmaking
platforms
Matchmaker Exchange
GeneMatcher
AGHA archief
Matchbox
Ontcijferen
MyGene2
Phenome Central
http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
Menselijke transcriptie
aantekening en cDNA
gegevens klonen
Zoogdieren genen collectie
Ensembl
Refseq
https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tabel 1: online bronnen met betrekking tot dit protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Experimentele studies met Drosophila melanogaster bieden een robuust assay-systeem om de gevolgen van met de ziekte geassocieerde menselijke varianten te beoordelen. Dit is te wijten aan de grote hoeveelheid kennis en diverse genetische hulpmiddelen die zijn gegenereerd door veel onderzoekers in het veld vliegen over de afgelopen eeuw89. Net als elk ander experimenteel systeem is het echter belangrijk om de voorbehoud en beperkingen te erkennen die bestaan.

Voorbehoud in verband met datamining
Hoewel de eerste stap in dit protocol is om databases te mijnen voor informatie met betrekking tot een gen van belang, is het belangrijk om het alleen als uitgangspunt te gebruiken. Bijvoorbeeld, hoewel in silico voorspelling van de functie variant waardevolle inzichten verschaft, moeten deze gegevens altijd met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Er zijn enkele gevallen waarin alle belangrijke algoritmen voorspellen dat een menselijke variant is goedaardig, maar functionele studies in Drosophila duidelijk aangetoond de schadelijke aard van dergelijke variant24. Evenzo, hoewel eiwit-eiwit interacties, co-expressie, en structurele modellering van gegevens zijn allemaal inzichtelijke stukjes informatie, kunnen er pseudo-positieve en pseudo-negatieve informatie aanwezig zijn in deze grote-omics gegevenssets. Bijvoorbeeld, sommige van de eerder geïdentificeerde of voorspelde eiwit-eiwit interacties kunnen kunstmatig of alleen gezien in bepaalde cel en weefsel soorten.

Bovendien kunnen er veel valse negatieve interacties zijn die niet in deze gegevenssets zijn opgenomen, omdat bepaalde eiwit-eiwit interacties van voorbijgaande aard zijn (bijv. interacties van enzym-substraat). Experimentele validering is essentieel om aan te tonen dat bepaalde genen of eiwitten genetisch of fysiek in vivo in de biologische context van belang zijn. Op dezelfde manier, structuren voorspeld op basis van homologie modellering moet worden behandeld als een model in plaats van opgelost structuur. Hoewel deze informatie nuttig kan zijn als wordt geconstateerd dat een aminozuur van belang in een structureel belangrijk deel van het eiwit aanwezig is, uitsluit negatieve gegevens niet de mogelijkheid dat de variant schadelijk kan zijn. Ten slotte moet een deel van de eerder gemelde genotype-fenotype informatie ook met voorzichtigheid worden behandeld, aangezien sommige informatie die in openbare databases is gearchiveerd, mogelijk niet nauwkeurig is. Sommige informatie in MO-databases is bijvoorbeeld gebaseerd op experimenten die goed zijn gecontroleerd en rigoureus zijn uitgevoerd, terwijl anderen mogelijk afkomstig zijn van een groot scherm papier zonder verdere vervolgstudies en strenge controles.

"Humanisatie" experimenten met behulp van T2A-GAL4 strategie niet altijd succesvol
Hoewel functionele studies op basis van redding en overexpressie met behulp van menselijke Cdna's een evaluatie van varianten in de context van het menselijke eiwit mogelijk maken, is deze aanpak niet altijd succesvol. Als een referentie humaan cDNA de Fly Mutant fenotype niet kan redden, zijn er twee waarschijnlijke verklaringen. De eerste mogelijkheid is dat het menselijke eiwit niet-functioneel is of de activiteit in de context van een vliegcel significant heeft verminderd. Dit kan te wijten zijn aan 1) verminderde eiwit expressie, stabiliteit, activiteit en/of lokalisatie of 2) een gebrek aan compatibiliteit met vlieg eiwitten die in een multi-eiwit complex werken. Omdat het UAS/GAL4-systeemtemperatuur gevoelig is, kunnen de vliegen op een relatief hoge temperatuur worden verhoogd (bijv. 29 °C) om de mogelijkheid van redding in deze toestand te zien. Daarnaast kan een UAS-Fly cDNA Construct en transgen als positieve controle worden gegenereerd. Als de variant van belang beïnvloedt een geconconeerd aminozuur, de analoge variant kan worden geïntroduceerd in de Fly cDNA voor functionele studie van de variant in de context van de Fly ortholog. Hoewel dit niet nodig is, het helpt sterk de studie in gevallen dat het gebruik van menselijke cDNA transgene lijnen geven negatieve of onduidelijk resultaten (Figuur 3).

De tweede mogelijkheid is dat de expressie van het menselijk eiwit veroorzaakt sommige toxiciteit op cellulair of organisme niveau. Dit kan te wijten zijn aan antimorfe (bijvoorbeeld als een dominant negatief eiwit), hypermorfe (bijv. te veel activiteit) of neomorf (bijv. een toename van een nieuwe toxische functie, zoals eiwit aggregatie die niet altijd gerelateerd is aan de endogene functie van het gen van interest) effecten. In dit geval kan het houden van de vliegen op een lage temperatuur (bijvoorbeeld 18 °C) sommige van deze problemen verlichten. Tot slot, er zijn enkele scenario's waarin overexpressie van een vlieg cDNA mag niet redden de Fly T2A-GAL4 lijn zoals te zien in het TBX2 voorbeeld, waarschijnlijk te wijten aan trict dosering afhankelijkheid van het genproduct. Om overexpressie van een eiwit van belang te voorkomen, kan het Fly gen van belang direct worden aangepast via crispr, een genomische reddingsconstructie kan worden ontwikkeld die de variant van de interesse bevat, of reddingsexperimenten kunnen worden uitgevoerd met een lof allel21. Voor kleine genen, "humaniseren" de Fly genomische Rescue construct kan worden beschouwd als test menselijke varianten die invloed hebben op niet-geconcongeerde aminozuren24. Samenvattend moeten alternatieve strategieën worden overwogen wanneer het humanisatieexperiment geen functionele beoordeling van de belangen variant toestaat.

Negatieve en positieve resultaten interpreteren
Als 1) zowel de referentie als de variant van de menselijke cDNAs de Fly Mutant fenotypes in een vergelijkbare mate redden en 2) er is geen verschil waargenomen in alle geteste omstandigheden, dan kan worden aangenomen dat de variant functioneel niet te onderscheiden is in Drosophila in Vivo. Het is echter belangrijk om op te merken dat deze informatie niet volstaat om uit te maken dat de variant van de rente niet-pathogene is, aangezien de Drosophila assay mogelijk niet gevoelig genoeg is of alle mogelijke functies van het gen/eiwit van belang kan opvangen relevant voor de mens. Positieve gegevens, daarentegen, is een sterke indicatie dat de variant schadelijke gevolgen heeft voor de eiwit functie, maar deze gegevens alleen is nog steeds niet voldoende om de pathogeniteit te claimen. De American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) heeft een reeks normen en richtlijnen gepubliceerd om varianten in de menselijke ziekte geassocieerde genen te classificeren in "goedaardige", "waarschijnlijk goedaardig", "variant van onbekende significantie (VUS)", "waarschijnlijk pathogeen", en "pathogene"90. Hoewel deze classificatie alleen van toepassing is op vastgestelde ziekteverwekkende genen en niet rechtstreeks toepasbaar is op varianten in "genen van onzekere betekenis" (GUS), worden alle personen die betrokken zijn bij functionele studies in de menselijke variant sterk aangemoedigd om Houd u aan deze richtlijn bij het rapporteren van de functie variant.

Nuttige biologische informatie extraheren wanneer MO-fenotypes geen aandoening van de menselijke ziekte model leren
Het is belangrijk om in gedachten te houden dat overexpressie gebaseerde Functionele assays beperkingen hebben, vooral omdat sommige van de fenotypes die worden gescoord, weinig relevantie kunnen hebben voor de aandoening van de ziekte van belang. Evenzo kunnen fenotypes die worden beoordeeld door middel van reddingsexperimenten, geen directe relevantie hebben voor de ziekte van belang. Aangezien deze experimenten buiten de endogene contexten in een ongewervelde systeem worden uitgevoerd, dienen ze niet als ziekte modellen te worden beschouwd, maar eerder als een gen-functietest met Drosophila als een "levende reageerbuis".

Zelfs als het modelorganisme een aandoening van de menselijke ziekte niet nabootsen, kunnen scoor bare fenotypes die in reddingsexperimenten worden gebruikt vaak nuttige biologische inzichten in ziekte omstandigheden bieden. Het concept "fenologs (niet-duidelijke homologe fenotypes)"91 kan worden gebruikt om de onderliggende moleculaire verbindingen tussen Drosophila en menselijke fenotypes verder te bepalen. Bijvoorbeeld, morfologische fenotypes in de Fly Wing, thorax, benen en ogen zijn uitstekende fenotypische uitlezingen voor defecten in Inkeping signalering traject, een evolutionair bewaard traject gekoppeld aan vele aangeboren aandoeningen, met inbegrip van cardiovasculaire defecten bij de mens62. Door de moleculaire logica achter bepaalde fenotypes in Drosophilate begrijpen, is het mogelijk om verborgen biologische verbanden te identificeren tussen genen en fenotypes bij mensen die nog niet begrepen zijn.

Voortdurende communicatie met klinische medewerkers
Bij het werken met clinici om de functie van een zeldzame variant gevonden bij de patiënt te bestuderen, is het belangrijk om een sterke samenwerkingsrelatie te creëren. Hoewel klinische en elementaire biomedische onderzoekers belangen kunnen delen in dezelfde genen/genetische trajecten, is er een groot cultureel en taalkundig (bijv. medisch jargon, modelorganisme-specifieke nomenclatuur) tussen de klinische en wetenschappelijke velden. Een sterke, op vertrouwen gebaseerde relatie tussen de twee partijen kan worden opgebouwd door middel van uitgebreide communicatie. Bovendien is bidirectionele communicatie van cruciaal belang voor het tot stand brengen en onderhouden van deze relatie. Zo waren in de twee gevallen zoals beschreven in de sectie representatieve resultaten, de identificatie van extra patiënten met soortgelijke genotypen en fenotypes, evenals latere functionele studie, van cruciaal belang om de pathogeniteit van de varianten van belang te bewijzen. Zelfs met sterke functionele gegevens hebben onderzoekers en clinici vaak moeilijkheden om menselijke genetici te overtuigen dat een variant die in "n = 1" gevallen wordt geïdentificeerd, de ware oorzaak van de ziekte is.

Zodra de MO-onderzoeker vaststelt dat een variant van belang schadelijk is, is het van cruciaal belang om zo snel mogelijk terug te communiceren naar klinische medewerkers, zodat ze actief kunnen proberen om overeenkomende gevallen te identificeren door te netwerken met andere clinici en menselijke genetici. Instrumenten zoals geno2MP [genotypes to Mendelian fenotypes: een geanonimiseerde database van 9.650 personen ingeschreven in het centrum van de Universiteit van Washington voor Mendelian Genomics studie41; inclusief patiënten en familieleden die verdacht worden van met genetische aandoeningen] kan worden gezocht om individuen te beoordelen die dezelfde stoornis kunnen hebben. Vervolgens kan de lead clinicus gecontacteerd worden met behulp van een Messaging-functie.

Als alternatief kan GeneMatcher worden gebruikt, wat een matchmaking-website is voor clinici, basis onderzoekers en patiënten die interesses delen in dezelfde genen om extra patiënten te identificeren die zeldzame varianten dragen. Aangezien GeneMatcher deel uitmaakt van een groter integratief netwerk van matchmaking websites genaamd matchmaker Exchange42, kunnen extra databases over de hele wereld worden doorzocht, waaronder het patiëntenarchief van de Australische Genomics Health Alliance, Broad matchbox , DECIPHER, MyGene2, en PhenomeCentral in een enkele inzending van GeneMatcher gen. Hoewel deelname aan GeneMatcher mogelijk is als "onderzoeker", wordt het aanbevolen dat basis wetenschappers deze website gebruiken met hun klinische medewerkers, omdat communicatie met andere clinici na een wedstrijd vereist bepaalde niveaus van medische Expertise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken Jose Salazar, Julia Wang en Dr. Karen Schulze voor de kritische lezing van het manuscript. We erkennen drs. ning Liu en XI Luo voor de functionele karakterisering van de TBX2 varianten die hier worden besproken. Niet-gediagnosticeerde ziekten Network model organismen screening Center werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Gemeenschappelijk Fonds (U54 NS093793). H. T. C. werd verder ondersteund door de NIH [CNCDP-K12 en NINDS (1K12 NS098482)], de American Academy of Neurology (neuro Science Research Grant), het Burroughs Wellcome Fund (loopbaan prijs voor medische wetenschappers), de Child neurologie Society en de Child neurologie Foundation ( (DP5 OD026426) en de eerste onafhankelijkheids prijs van NIH Director. M. F. W. werd verder ondersteund door Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. werd verder ondersteund door de NIH (R01 DC014932), de Simons Foundation (SFARI Award: 368479), de Alzheimer's Association (nieuwe onderzoeker Research Grant: 15-364099), naman familie fonds voor fundamenteel onderzoek, en Caroline Wiess Law Fonds voor onderzoek in Moleculaire geneeskunde. Confocale microscopie bij BCM wordt deels ondersteund door NIH Grant U54HD083092 aan de intellectuele en ontwikkelings handicap Research Center (IDDRC) neuro Visualization core.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100, (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362, (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14, (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312, (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312, (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103, (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18, (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7, (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11, (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7, (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207, (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19, (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100, (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102, (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27, (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103, (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103, (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13, (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12, (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93, (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99, (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45, (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27, (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103, (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100, (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7, (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99, (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46, (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44, (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45, (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10, (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158, (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19, (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2, (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314, (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140, (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9, (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314, (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190, (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10, (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188, (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8, (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199, (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34, (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5, (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4, (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536, (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22, (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125, (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56, (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233, (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131, (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17, (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16, (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108, (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13, (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100, (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100, (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100, (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3, (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3, (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27, (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21, (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17, (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281, (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77, (1), 51-59 (1989).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics