In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Formålet med denne protokol er at skitsere design og udførelse af in vivo eksperimenter i Drosophila melanogaster for at vurdere de funktionelle konsekvenser af sjældne genvarianter forbundet med sygdomme hos mennesker.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fremskridt i sekvensering teknologi har gjort helgenom og hel-exome datasæt mere tilgængelige for både klinisk diagnose og banebrydende humangenetik forskning. Selv om der er udviklet en række in silico-algoritmer til at forudsige patogeniciteten af varianter, der er identificeret i disse datasæt, er funktionelle undersøgelser afgørende for at bestemme, hvordan specifikke genomvarianter påvirker protein funktionen, især for missense Varianter. I netværket af udiagnosticerede sygdomme (UDN) og andre forskningskonsortier for sjældne sygdomme, anvendes modelorganismer (MO), herunder Drosophila, C. elegans, zebrafish og mus, til at vurdere funktionen af formodede humane sygdomsfremkaldende Varianter. Denne protokol beskriver en metode til funktionel vurdering af sjældne humane varianter, der anvendes i modellen organismer screening Center Drosophila kernen af udn. Arbejdsprocessen begynder med indsamling af menneskelige og MO-oplysninger fra flere offentlige databaser ved hjælp af MARRVEL-webressourcen for at vurdere, om varianten sandsynligvis vil bidrage til en patients tilstand, samt udforme effektive eksperimenter baseret på tilgængelige viden og ressourcer. Dernæst genereres genetiske værktøjer (f. eks. T2A-GAL4 og UAS-humane cDNA-linjer) for at vurdere funktionerne af varianter af interesse i Drosophila. Ved udvikling af disse reagenser, to-strenget funktionelle assays baseret på redning og overekspression eksperimenter kan udføres for at vurdere variant funktion. I rednings grenen er de endogene flue gener "humaniseret" ved at erstatte det ortoloøse Drosophila -gen med reference eller variant humane transgener. I overekspression gren, er reference og variant humane proteiner eksogent drevet i en række forskellige væv. I begge tilfælde kan enhver brændende fænotype (f. eks. dødelighed, øjen morfologi, Elektrofysiologi) anvendes som en udlæsning, uanset hvilken sygdom der er af interesse. Forskelle observeret mellem reference og variant alleler tyder på en variant-specifik effekt, og dermed sandsynligvis patogenicitet. Denne protokol giver mulighed for hurtige, in vivo vurderinger af formodede menneskelige sygdomsfremkaldende varianter af gener med kendte og ukendte funktioner.

Introduction

Patienter med sjældne sygdomme gennemgår ofte en besværlig rejse benævnt "diagnostisk Odyssey" for at opnå en nøjagtig diagnose1. De fleste sjældne sygdomme menes at have en stærk genetisk oprindelse, hvilket gør genetisk/genomisk analyse af kritiske elementer i det kliniske arbejdsforhold. Ud over kandidat genpanel sekvensering og kopi nummer variation analyse baseret på kromosomale mikroarrays, hele exome (Wes) og hel-Genome sekventering (WGS) teknologier er blevet stadig mere værdifulde værktøjer i løbet af de sidste årti2, 3. I øjeblikket, den diagnostiske sats for at identificere en kendt patogene variant i Wes og WGS er ~ 25% (højere i pædiatriske tilfælde)4,5. For de fleste tilfælde, der forbliver udiagnosticeret efter kliniske WES/WGS, et almindeligt problem er, at der er mange kandidat gener og varianter. Næste generations sekvensering identificerer ofte nye eller ultra-sjældne varianter i mange gener og fortolker, om disse varianter bidrager til sygdoms fænotyper, er udfordrende. For eksempel, selv om de fleste nonsens eller frameshift mutationer i gener menes at være tab-of-funktion (LOF) alleler på grund af nonsens-medieret henfald af den kodede afskrift, afkortning mutationer fundet i de sidste exons undslippe denne proces og kan fungere som godartet eller forstærknings funktion (GOF) alleler6.

Desuden, forudsige virkningerne af en missense allel er en skræmmende opgave, da det kan resultere i en række forskellige genetiske scenarier som første beskrevet af Herman Muller i 1930 ' erne (dvs., Amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph, eller isomorph)7 . Talrige i silico programmer og metoder er blevet udviklet til at forudsige patogenicitet af missense varianter baseret på evolutionære bevaring, type af aminosyre ændring, position inden for et funktionelt domæne, allel hyppighed i den almindelige befolkning, og andre parametre8. Men disse programmer er ikke en omfattende løsning til at løse det komplicerede problem med variant fortolkning. Interessant, en nylig undersøgelse viste, at fem bredt anvendte varianten patogenicitet forudsigelse algoritmer (Polyphen9, SIFT10, cadd11, Provean12, mutation smagsprøve) enige om patogenicitet ~ 80% af tiden8 . Især, selv når alle algoritmer er enige, de returnerer en ukorrekt forudsigelse af patogenicitet op til 11% af tiden. Dette fører ikke kun til fejlagtig klinisk fortolkning, men kan også afskrække forskere fra at følge op på nye varianter ved fejlagtigt at opføre dem som godartede. En måde at supplere den nuværende begrænsning af i silico modellering er at tilvejebringe eksperimentelle data, der viser effekten af variant funktionen in vitro, ex vivo (f. eks. dyrkede celler, organoider) eller in vivo.

In vivo funktionelle undersøgelser af sjældne sygdomme associerede varianter i MO har unikke styrker13 og er blevet vedtaget af mange sjældne sygdoms forskning initiativer rundt om i verden, herunder de udiagnosticerede sygdomme netværk (udn) i USA og sjældne Sygdomme modeller & mekanismer (RDMM) netværk i Canada, Japan, Europa og Australien14. Ud over disse koordinerede bestræbelser på at integrere MO-forskere i arbejdsgangen for diagnosticering af sjældne sygdomme og Mekanistiske undersøgelser på nationalt plan har en række individuelle samarbejds undersøgelser mellem kliniske og MO-forskere ført til opdagelsen og karakterisering af mange nye menneskelige sygdomsfremkaldende gener og varianter82,83,84.

I UDN modtager en centraliseret model organismer screening Center (MOSC) indsendelse af kandidat gener og varianter med en beskrivelse af patientens tilstand og vurderer, om varianten sandsynligvis vil være sygdomsfremkaldende ved hjælp af edb-værktøjer og in vivo Eksperimenter. I fase i (2015-2018) af UDN bestod MOSC af en Drosophila Core [Baylor College of MEDICINE (bcm)] og Zebrafish Core (University of Oregon), der arbejdede sammen om at vurdere sagerne. Ved hjælp af informatik analyse og en række forskellige eksperimentelle strategier i Drosophila og zebrafish, har mosc hidtil bidraget til diagnosticering af 132 patienter, identifikation af 31 nye syndromer55, opdagelse af flere nye menneskelige sygdomsgener (f. eks. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) og fænotypiske ekspansion af kendt sygdom gener (f. eks. CACNA1A21, ACOX122).

Ud over projekter inden for UDN har MOSC Drosophila kerne forskere bidraget til nye sygdoms genopdagelser i samarbejde med centrene for Mendelian Genomics og andre initiativer (f. eks. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) ved hjælp af samme sæt af informatik og genetiske strategier udviklet til UDN. I betragtning af betydningen af MO undersøgelser om sjældne sygdomme diagnose, MOSC blev udvidet til at omfatte en C. elegans kerne og anden Zebrafish kerne (både på Washington University ved St. Louis) for fase II (2018-2022) af udn.

Dette manuskript beskriver en in vivo funktionel studie protokol, der bruges aktivt i UDN MOSC Drosophila kerne til at afgøre, om missense varianter har funktionelle konsekvenser på det protein af interesse ved hjælp af transgene fluer, der udtrykker menneskelig Proteiner. Målet med denne protokol er at hjælpe MO forskere med at arbejde sammen med kliniske forskningsgrupper for at tilvejebringe eksperimentelle beviser for, at en kandidat variant i et gen af interesse har funktionelle konsekvenser, hvilket letter den kliniske diagnose. Denne protokol er mest nyttig i et scenarie, hvor en Drosophila forsker kontaktes af en klinisk investigator, der har en sjælden sygdom patient med en specifik kandidat variant i et gen af interesse.

Denne protokol kan opdeles i tre elementer: (1) indsamling af oplysninger for at vurdere sandsynligheden for, at varianten af interesse er ansvarlig for patientens fænotype og gennemførligheden af en funktionel undersøgelse i Drosophila, (2) indsamling eksisterende genetiske værktøjer og etablering af nye, og (3) udførelse af funktionelle undersøgelser in vivo. Det tredje element kan yderligere opdeles i to underelementer baseret på, hvordan funktionen af en variant af interesse kan vurderes (redningsforsøg eller overekspressions baserede strategier). Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol kan tilpasses og optimeres til mange scenarier uden for sjældne monogen sygdoms forskning (f. eks. almindeligt forekommende sygdomme, interaktioner mellem gener og miljø og farmakologiske/genetiske skærme for at identificere terapeutiske mål). Evnen til at bestemme variabilitet og patogenicitet af varianter vil ikke kun gavne patienten af interesse ved at give præcise molekylære diagnose, men vil også have en bredere indvirkning på både translationel og grundlæggende videnskabelig forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. indsamling af menneskelige og MO oplysninger til at vurdere: sandsynligheden for en variant af interesse er ansvarlig for sygdom fænotyper og gennemførlighed af funktionelle undersøgelser i Drosophila

  1. Udføre omfattende database og litteratursøgninger for at afgøre, om de specifikke gener og varianter af interesse er gode kandidater til at forklare fænotype af patienten af interesse. Indsaml specifikt følgende oplysninger.
    1. Vurdere, om genet af interesse tidligere har været impliceret i andre genetiske lidelser (fænotypisk ekspansion af kendt sygdoms gen) eller dette er en helt ny sygdoms kandidat gen [genvariant af usikker betydning (GVUS)].
    2. Vurder allel hyppigheden af varianten af interesse i sygdoms-eller kontrol populations databaser.
    3. Vurder, om der er kopier af nummer variationer (Cnv's), der omfatter dette gen i sygdoms-eller kontrol populations databaser.
    4. Vurdere, hvad de orthologøse gener er i forskellige MO arter, herunder mus, zebrafish, Drosophila, C. elegans, og gær, derefter yderligere undersøge de kendte funktioner og udtryks mønstre af disse ortologøse gener.
    5. Vurdere, om den variant af interesse er til stede i et funktionelt domæne af proteinet, og hvis aminosyre af interesse er evolutionært bevaret.
      Bemærk: svarene på disse fem spørgsmål (trin 1.1.1-1.1.5) kan fås ved at få adgang til en række humane og mo databaser enkeltvis eller ved at bruge Marrvel (model organisme aggregerede ressourcer til sjælden variant udforskning) webressource (Se tabel 1 for online ressourcer)30, som er beskrevet indgående i en ledsagende artikel31. Se afsnittet om repræsentative resultater for specifikke eksempler. Monarch Initiative hjemmeside32 og Gene2Function33 giver også nyttige oplysninger.
  2. Saml yderligere oplysninger for yderligere at vurdere, om varianten er en god sygdoms kandidat fra en protein funktion og struktur point-of-View.
    1. Vurder, om varianten af interessen forventes at være skadelig baseret på i silico-forudsigelses algoritmer.
      Bemærk: variant patogenicitetsalgoritmer er blevet udviklet af mange forskergrupper i løbet af de seneste ~ 15 år, og nogle vises også i marrvel søgeresultaterne. Nyere programmer, herunder de to, der er anført nedenfor, kombinerer flere forskellige varianitetsalgoritmer for patogenicitet og maskinel læringstilgange for at generere en patogenicitetsscore. For mere information om variant forudsigelse algoritmer og deres præstationer, henvises til Ghosh, et al.8. (i) CADD (kombineret annotation-afhængig nedbrydning): Integrativ annotation værktøj bygget fra mere end 60 genomiske funktioner, som giver resultater for menneskelige SNVs samt korte indsættelser og sletninger11. (II) REVEL (sjælden exome variant ensemble eleven): kombinerer multiple varians patogenicitetsalgoritmer (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP og phastCons) for at give en integreret score for alle mulige menneskelige missense varianter34.
    2. Afgøre, om det menneskelige gen/protein af interesse eller dens MO orthologs har vist sig at genetisk eller fysisk interagere med gener/proteiner tidligere knyttet til genetiske sygdomme. Hvis ja, vurdere, om patienten af interesse udviser overlappende fænotyper med disse lidelser.
      Bemærk: flere værktøjer er blevet udviklet til at analysere genetiske og protein-protein interaktioner baseret på mo publikationer samt storstilet proteomics fra flere arter skærme. STRING (søgeværktøj til tilbagevendende forekomster af tilstødende gener)35: en database for kendte og forventede protein-protein interaktioner. Det integrerer genetiske interaktion og co-Expression datasæt samt tekst-mining værktøjer til at identificere gener og proteiner, der kan fungere sammen i en række organismer. TÅGE (molekyle interaktions søgeværktøj)36: en database, der integrerer genetiske og protein-protein interaktionsdata fra kerne genetiske mos (gær, C. elegans, Drosophila, zebrafish, Frog, rat, mus) og mennesker. Forudsigelse af interaktioner udledt fra ortologøse gener/proteiner (interlogs) vises også.
    3. Bestem, om 3-D-strukturen af det protein af interesse er blevet løst eller modelleret. Hvis det er tilfældet, skal du afgøre, hvor varianten af rente tilknytningen er i forhold til de vigtigste funktionelle domæner.
      Bemærk: proteinstrukturer løst ved røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) og Cryo-elektronmikroskopi kan findes i offentlige databaser, herunder FBF (protein databank) og EMDatabank37. Selv om der ikke er nogen enkelt database for forudsagte/modelleret proteinstrukturer, en række algoritmer (dvs., SWISS-MODEL38, modeller39, og Phyre240) er tilgængelige for brugerne at udføre protein modellering.
  3. Kommuniker med kliniske samarbejdspartnere for at drøfte oplysninger indsamlet fra Informatik analyserne i afsnit 1.1-1.2. Hvis kliniske samarbejdspartnere også mener, at varianten og genet af interesse er gode kandidater til at forklare de fænotyper, der ses hos patienten, skal du fortsætte til afsnit 2. Hvis der er specifikke spørgsmål om patientens genotype og fænotype, Diskuter dem med de kliniske samarbejdspartnere, før de bevæger sig fremad.
    Bemærk: Hvis det er opfattelsen, at den variant af interesse er usandsynligt at forklare fænotype af interesse (f. eks identisk variant findes i høj frekvens i kontrol population), diskutere dette med kliniske samarbejdspartnere til at afgøre, om varianten er en god kandidat, da der måske ikke er tilstrækkelig ekspertise til at fortolke kliniske fænotyper.

2. indsamling af eksisterende genetiske værktøjer og oprettelse af nye reagenser til undersøgelse af en specifik variant af interesse

Bemærk: når varianten af interesse er blevet bestemt en god kandidat til at forfølge eksperimentelt, indsamle eller generere reagenser til at udføre in vivo funktionelle undersøgelser. For funktionelle undersøgelser beskrevet i denne protokol, nogle vigtige Drosophila melanogaster reagenser er nødvendige: 1) upstream aktivering sekvens-regulerede Human cDNA transgene stammer, der bærer reference eller variant sekvens, 2) en tab-of-funktion allel af en flue gen af interesse, og 3) en GAL4 linje, der kan bruges til redning eksperimenter.

  1. Generation af UAS-humane cDNA-konstruktioner og transgene fluer
    1. Identificere og opnå de relevante humane cDNA-konstruktioner. Mange kloner er tilgængelige fra MGC (mammalian gen Collection)43 og kan købes fra udvalgte venders. For gener, der Alternativt er splejret, skal du kontrollere, hvilken isoform cDNA der svarer til at bruge Ensembl eller RefSeq.
      Bemærk: mange cdnas er tilgængelige i rekombinase-mediated kloning system kompatible reagenser44, hvilket forenkler subklonings trinnet. cDNAs kan komme i en "åben (no stop codon)" eller "lukket (med endogene eller kunstige stop codon)" format. Mens åbne kloner tillade C'-mærkning af proteiner, der er nyttige for biokemiske (f. eks, Western blot) og celle biologisk (f. eks, immunofarvning) assays at overvåge ekspression af det protein af interesse, det kan forstyrre protein funktion i nogle tilfælde.
    2. Sub-klon reference og variant cDNA i Drosophila transgene vektor. Brug φc31-mediated Trans Genesis system, da dette gør det muligt for reference og variant cdnas at blive integreret i samme sted i genom45. Til dette projekt bruger MOSC Drosophila Core rutinemæssigt PGW-ha. attb-vektoren46.
      Bemærk: Hvis det humane cDNA er i rekombinase-medieret klonings system kompatible vektorer (f. eks. PDONR221, pENTR221), skal du springe til afsnit 2.1.4, som forklarer LR-reaktioner for at under klone Cdnas i PGW-ha. attb.
      1. Hvis det humane cDNA ikke er i et rekombinant medieret klonings system, der er kompatibelt med plasmid, under klone den humane cDNAs ind i en gateway indgangs vektor ved hjælp af standard molekylære biologiske teknikker (et eksempel på en sådan protokol er dokumenteret nedenfor).
        1. Udfør en udhæng PCR for at introducere attB1 og attB2 arme. Den fremadgående primer skal have attB1 sekvens 5 '-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-3 ' efterfulgt af de første 22 nukleotider af målet cDNA. Den omvendte primer skal have attB2 sekvens 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3 ' efterfulgt af det omvendte supplement af de sidste 25 nukleotider af cDNA af interesse. Ekskluder stop codon af cDNA, derefter tilføje en C ' tag, hvis det ønskes at "åbne" en klon, eller tilføje et stop codon at "lukke" en klon.
        2. Forbered en 100 μL high-fidelity PCR mix bestående af 50 μL high-fidelity PCR Master Mix, 36 μL destilleret vand, 5 μL af hver fremad og reverse primere anført i trin 2.1.2.1.1 fortyndet til 10 μM, og 4 μL af Target cDNA (150 ng/μL).
        3. Udføre PCR ved hjælp af standard mutagenese protokol for at tilføje attB1 og AttB2 arme på cDNA af interesse. Betingelserne vil variere afhængigt af den konstruktion og varianter af interesse.
        4. Isoler målet cDNA med tilsat homologi arme via gel elektroforese og gel ekstraktion. Opret 1% agopstået gel og Udfør elektroforese ved hjælp af standardmetoder. Punktafgiftspligtige det bånd, der svarer til størrelsen af cDNA plus den ekstra længde af de homologiske arme. Uddrag DNA fra gelen gennem standardmetoder95. Kommerciel gel ekstraktions kits er tilgængelige fra flere virksomheder.
        5. Udfør en in vitro-rekombinasereaktion baseret på den rekombinasemedierede klonings protokol i henhold til det anvendte system.
        6. BP-reaktionsblandingen omdannes til kemisk kompetente E. coli -celler. Kompetente celler kan laves in-House eller købes fra kommercielle leverandører. Kultur de transformerede celler natten over på en LB plade indeholdende passende antibiotika til koloni udvælgelse. Næste dag skal du vælge flere kolonier og dyrke dem i uafhængige flydende kulturer natten over.
        7. Isoler DNA fra overnight kulturer gennem miniprep. Sanger sekvens de positive kloner at sikre, at cDNA har den korrekte sekvens96. Vedligehold celler fra de kulturer, der er positive for den ønskede sekvens i 25% glycerol opbevares ved-80 °C.
    3. Udfør site-instrueret mutagenese at introducere den variant af interesse i Gateway plasmid med referencen Human cDNA97. En detaljeret protokol for denne metode kan findes på leverandørens hjemmeside48,49. Valider tilstedeværelsen af varianten i det muterede plasmid via sanger sekvensering af hele den åbne læse ramme (ORF) for at sikre, at ingen yderligere varianter introduceres gennem dette mutagenose trin.
    4. Subclone reference og variant Human cdnas i donor plasmid (gateway plasmider med attL1 og attL2 sites) i den transgene plasmid (f. eks PGW-ha. attb med attR1 og attR2 sites) via en LR clonase reaktion.
      Bemærk: der er UAS φc31 vektorer designet til konventionel restriktion enzym-baserede subkloning (f. eks puast. attb50), hvis det foretrækkes at subklon Human cdnas via restriktionsenzym metoder.
    5. Vælg φC31 docking-steder, hvor de UAS-humane cDNA-transgener skal integreres. En række af docking-sites er blevet genereret af flere laboratorier og er offentligt tilgængelige fra lager Centre50,52,53.
      Bemærk: da det er praktisk at have det menneskelige transgen på et kromosom, der ikke indeholder flueortholog af det pågældende gen, anbefales det at anvende et andet kromosom docking-sted [VK37 (bdsc Stock #24872], når flue ortholog er på X , tredje eller fjerde kromosomer, og brug et tredje kromosom docking-sted [VK33 (BDSC Stock #24871], når flue ortholog er på det andet kromosom.
    6. Injicer UAS-humane cDNA-konstruktioner i fluer, som udtrykker φc31 integrasehæmmer i deres kimcelle (f. eks. VAS-φc31, NOS-φc31).
      Bemærk: mikroinjektion kan udføres internt eller sendes til kernefaciliteter eller kommercielle enheder til Trans Genesis. Detaljeret protokol for generering af transgene fluer kan findes i den citerede bog kapitel51.
    7. Opret stabile transgene stammer fra de injicerede embryoner. Injicer ~ 100-200 embryoner pr. konstruktion94. En repræsentativ krydsnings ordning for en transgene indsættelse i et andet kromosom docking-sted (VK37) er afbildet i figur 1a. Se de citerede bøger54,55 for grundlæggende Drosophila genetik information.
  2. Opnå eller generere en T2A-GAL4 linje, der letter rednings baserede funktionelle assays (Se figur 2 og punkt 3,1).
    Bemærk: denne linje vil tjene to formål. Første, de fleste T2A-GAL4 linjer testet opfører sig som stærke LOF alleler ved at fungere som en gen Trap allele. For det andet fungerer T2A-GAL4 Lines som en GAL4 driver, der tillader udtryk for UAS-konstruktioner (f. eks. UAS-gfp, UAS-Human cdnas) under de endogene reguleringselementer i genet af interesse56,57 (figur 2a-C).
    1. Søg i offentlige Stock-samlinger efter tilgængelige T2A-GAL4-linjer, herunder Drosophila gene disruption-projektet (bnp)58 , hvor ~ 1.000 T2A-GAL4 linjer er genereret59. Disse stammer er i øjeblikket tilgængelige fra Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc) og kan søges gennem både BNP-og bdsc-webstederne.
    2. Hvis der ikke findes en T2A-GAL4-linje for interesse-genet, kan du kontrollere, om der er en passende kodning intronic-linje (Minos-mediated integration-kassette) til konvertering til en T2A-GAL4-linje ved hjælp af rekombinase-medieret kassette udveksling (rmce )60 (figur 2A).
      Bemærk: rmce tillader, at intronic Mimic-elementer, der er mellem to kodende exoner, konverteres til en T2A-GAL4-linje gennem mikroinjektion af en donor konstruktion (et eksempel på en krydsnings ordning er vist i figur 1B) eller en række Kors, som beskrevet i detaljer57,59.
    3. Hvis en T2A-GAL4 linje ikke er tilgængelig, og en passende kodning intronic MiMIC ikke eksisterer, udforske muligheden for at generere en T2A-GAL4 linje via CRIMIC (CRISPR-mediated integration kassette) system59.
      Bemærk: denne metode bruger crispr-MEDIATED DNA spaltning og Homology-rettet reparation (HDR) til at integrere en Mimic-lignende kassette i en kodning intron i et gen af interesse.
    4. Hvis interesse genet mangler en stor intron (> 150 BP) eller ikke har nogen introns, forsøge at banke på en GAL4 transgene i flue genet med crispr/Cas9 systemet ved hjælp af HDR som beskrevet20,61,62.
      Bemærk: Hvis generering af en T2A-GAL4 eller GAL4 Knock-in allel er vanskelig, forsøge at udføre redning eksperimenter ved hjælp af disse præ-eksisterende alleler eller RNAi linjer og allestedsnærværende eller vævs-specifikke GAL4 chauffører som beskrevet92 (ref).

3. udførelse af funktionelle analyser af menneskelig variant af interesse in vivo i Drosophila

Bemærk: Udfør en rednings baseret analyse (afsnit 3,1) samt overekspressions undersøgelser (afsnit 3,2) ved hjælp af de værktøjer, der er indsamlet eller genereret i afsnit 2 for at vurdere konsekvenserne af den variant af interessen in vivo i Drosophila. Overvej at udnytte begge tilgange, da de to er komplementære.

  1. Udførelse af funktionelle analyser gennem rednings baserede eksperimenter
    Bemærk: Heteroloøse rednings-baserede eksperimenter iDrosophilaved hjælp af humane proteiner afgøre, om den molekylære funktion af de to ortologøse gener er blevet bevaret over ~ 500.000.000 års Evolution. De vurderer også funktionen af varianten i forbindelse med det humane protein63. Selv om en systematisk analyse af hundredvis af genpar ikke er blevet rapporteret, er flere dusin menneskelige og pattedyr (f. eks. mus) gener i stand til at erstatte funktionen afDrosophilaGener13.
    1. I den rednings baserede tilgang, først afgøre, om der er indlysende, scorable, og reproducerbare fænotyper i LOF mutanter i flyve ortholog før vurdere funktioner af varianterne.
      Bemærk: tidligere litteratur om flue genet er et godt sted at data mine først, og det kan findes ved hjælp af databaser, herunder flybase og PubMed. Yderligere databaser som MARRVEL, Monarch Initiative og Gene2Funcion er også nyttige i indsamlingen af disse oplysninger.
    2. Udfør en global undersøgelse af point fænotyper i homozygot og hemizygous (T2A-GAL4 allel over en molekylært defineret kromosomale mangel dyr, især hvis T2A-GAL4 allelen er den første mutation, der skal karakteriseres for et bestemt gen. Vurder fænotyper såsom dødelighed, sterilitet, lang levetid, morfologiske (f. eks. størrelse og morfologi i øjet) og adfærd (f. eks. frieri, flyvning, klatring, og Bang følsomhed defekter).
      Bemærk: Hvis der ikke er identificeret større fænotyper fra denne primære skærm, kan der anvendes mere subtile fænotyper såsom neurologiske defekter målt ved elektrofysiologiske optagelser, hvis de er meget reproducerbare og specifikke. Som et eksempel er funktionelle studier med elektroretinogram (ERG) beskrevet i trin 3.2.3. Hvis der ikke opdages en forbrændt fænotype, skal du gå til afsnit 3,2 og udføre den over ekspressivitets baserede funktionelle undersøgelse.
    3. Når en scorbar fænotype er identificeret i fluen LOF mutant, skal du teste, om referencen Human cDNA kan erstatte funktionen af flue ortholog ved at forsøge at bruge humant cDNA til at redde den mutante flyve linje. Den fænotypiske analyse, der skal udføres her, afhænger af resultaterne fra trin 3.1.2 og vil være specifik for det gen, der undersøges.
      Bemærk: Hvis "humanisering" af flue genet er vellykket, er der nu en platform til at sammenligne effektiviteten af redning for varianten af interesse i forhold til reference modstykket. Redningen set med reference Human cDNA behøver ikke at være perfekt. Delvis redning af flyve mutant fænotype ved hjælp af et humant cDNA giver stadig et referencepunkt til at udføre sammenlignende undersøgelser ved hjælp af varianten Human cDNA stamme.
    4. Ved hjælp af analysesystemet valgt i trin 3.1.2, Sammenlign den observerede redning med referencen Human cDNA til undsætning observeret med varianten Human cDNA at afgøre, om den variant af interesse har konsekvenser for genet af interesse.
      Bemærk: Hvis varianten humant cDNA klarer sig dårligere end reference allelen, tyder dette på, at varianten af interesse er skadelig for protein funktionen. Hvis varianten og referencen ikke kan skelnes funktionelt, så 1) allelen kan være en isomorph (en variant, der ikke påvirker protein funktion) eller 2) analysen er ikke følsom nok til at detektere subtile forskelle.
    5. Hvis varianten findes at være en skadelig allel, derefter yderligere vurdere udtrykket og intracellulær lokalisering af reference og variant proteiner af interesse in vivo via Western blot, immunofluorescens farvning, eller andre metoder93.
      Bemærk: Hvis UAS-humant cDNA genereres fra en åben klon i en PGW-ha. attb-vektor, skal du bruge et anti-ha-antistof til at udføre disse biokemiske og cellulære assays. Hvis den oprindelige klon er en lukket klon, test, om kommercielle antistoffer mod de menneskelige proteiner kan bruges til disse assays. En forskel i udtryks niveauer og intracellulær lokalisering kan afsløre, hvordan varianten af interesse påvirker protein funktionen.
  2. Udførelse af funktionelle analyser gennem overekspressions undersøgelser
    Bemærk: allestedsnærværende eller vævs specifikt overekspression af humane cdna'er i ellers kan vildtype fluer give oplysninger, der supplerer de rednings baserede eksperimenter, som diskuteres i afsnit 3,1. Mens rednings baserede assays primært er designet til at detektere LOF-varianter (amorfe, hypomophic), kan overekspressions baserede analyser også afsløre Gain-of-Function-varianter (GOF), som er sværere at vurdere (hypermorf, antimorfe, neomorfe).
    1. Vælg et sæt GAL4-drivere for at over gengive de humane cDNAs af interesse. En række allestedsnærværende og vævs-/Stage-specifikke GAL4-drivere er tilgængelige fra offentlige lager Centre (f. eks. BDSC), hvoraf nogle oftere bruges end andre. Først fokusere på allestedsnærværende bilister og let point fænotyper (dødelighed, sterilitet, morfologiske fænotyper), derefter gå videre til vævsspecifikke drivere og mere specifikke fænotyper.
      Bemærk: Valider udtrykket for GAL4-drivere med en reporter-linje (f. eks. UAS-GFP) for at bekræfte udtryks mønstre, før de bruges i eksperimenterne.
    2. Udtrykke reference og variant Human cDNAs ved hjælp af den samme driver under samme tilstand (f. eks temperatur) ved at krydse 3-5 jomfru hunner fra GAL4 line (f. eks ey-GAL4 for Eye imaginal Disc udtryk) med 3-5 mandlige FLUER fra UAS linjer [f. eks UAS-TBX2 (+) eller UAS-TBX2 (s. R305H) for eksemplet vist i afsnit 4,2] i et enkelt hætteglas.
      1. Overfør krydsene hver 2-3 dage for at have mange dyr, der går fra et enkelt Kors.
    3. Undersøg afkom, og opdag eventuelle forskelle mellem reference-og variant stammerne (f. eks. øjen morfologi) under et dissektions mikroskop. Billede fluerne ved hjælp af et kamera, der er knyttet til en dissektion mikroskop til at dokumentere fænotype.
      Bemærk: Hvis en fænotype kun ses i referencen, men ikke i variant linjen, kan varianten være en amorfe eller en stærk hypomorphic allel. Hvis Fænotypen ses i begge genotyper, men referencen forårsager en stærkere defekt, kan varianten være en mild til svag hypomorphic allel. Hvis referencen ikke viser en fænotype eller kun udviser en svag fænotype, men varianten viser en stærk defekt, så varianten kan være en GOF allel.
    4. Hvis en fænotype ikke er set i standard dyrkningsbetingelser (rt eller ved 25 °c, så sæt kryds ved forskellige temperaturer, der spænder 18-29 °c, da UAS/GAL4 systemet vides at være temperaturfølsom64,65). Typisk er ekspression af UAS transgener højere ved højere temperaturer.
  3. Udføre yderligere funktionelle undersøgelser relateret til gener og protein af interesse.
    Bemærk: Ud over at undersøge generelle defekter kan et analyse system vælges til at sonde ind i molekylære funktioner af genet og variant. I et eksempel, som blev drøftet i de repræsentative resultater (TBX2tilfælde) blev ERG-optagelser anvendt til at bestemme effekten af varianten på fotoreceptor-funktionen, da flue genet af interesse (bifid) var blevet undersøgt udførligt i forbindelse med udviklingen af det visuelle system. Detaljerede protokoller for ERG iDrosophilakan findes som tidligere offentliggjort66,67,68.
    1. Generer fluer for at teste for funktionelle defekter i det visuelle system. Cross Virgin hunner fra rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 linje til mænd med reference eller variant UAS-humane cDNA transgener at udtrykke de humane proteiner af interesse i R1-R6 photoreceptors.
      Bemærk: Cross 3-5 Virgin hunner til 3-5 mandlige fluer i et enkelt hætteglas og overføre krydsninger hver 2-3 dage at have mange dyr ectabende fra et enkelt Kors. Alle Kors skal holdes i en inkubator indstillet ved forsøgstemperaturen for at opnå ensartede resultater.
    2. Når fluer begynder at eclose (ved 25 °C, ~ 10 dage efter indstilling af den oprindelige Kors), samle afkom (Rh1-GAL4/+; UAS-humant cDNA/+) i friske hætteglas og placere dem tilbage i inkubator sat ved eksperimentel temperatur i yderligere 3 dage for det visuelle system til moden.
      Bemærk: selv om ERG kan udføres på 1-2 dag gamle fluer, kan nyligt eclosed fluer have store udsving i deres ERG signal. Hvis det ønskes at undersøge en aldersafhængig fænotype, kan disse fluer blive ældre i flere uger, så længe de regelmæssigt (f. eks. hver ~ 5 dage) overføres til et nyt hætteglas for at undgå at drukne i våd mad.
    3. Forbered fluerne til ERG-optagelse ved først at bedøve fluerne ved hjælp af CO2 eller placere dem i et hætteglas på is. Lim forsigtigt den ene side af flue på et glas mikroskop slide for at immobilisere dem.
      Bemærk: flere reference-og variant fluer kan limes på et enkelt dias. Placer alle fluer i omtrent samme retning med et øje, der er tilgængeligt for optagelses elektroden. Vær omhyggelig med ikke at få lim på øjet og til at forlade proboscis gratis.
    4. Klargør optage-og reference elektroderne. Placer en 1,2 mm glas kapillær i en nål aftrækker og aktivere. Bryd Kapillarrøret for at opnå to skarpe tilspidsede elektroer. De resulterende elektroder skal være hule og have endelige diametre på < 0,5 mm.
    5. Fyld kapillærer med saltvandsopløsning (100 mM NaCl), og sørg for, at der ikke er luftbobler. Skub glas kapillærer over sølv wire elektroderne (både optagelses elektroden og reference elektroden, se figur 4) og fastgør kapillærer på plads.
    6. Konfigurer stimulatoren og forstærkeren. En detaljeret opsætning findes i Lauwers, et al.67. UDN Drosophila mosc-opsætning består af udstyr, der er anført i materiale afsnittet.
      1. Indstil forstærkeren til 0,1 Hz High-Pass Filter, 300 Hz low-pass filter og 100 Gain.
      2. Indstil stimulatoren til 1 s periode, 500 MS Pulse bredde, 500 MS Pulse forsinkelse, Run mode, og 7 amp.
      3. Forbered lyskilden til foto stimulation. Brug en halogen lyskilde til at aktivere flue fotoreceptorer.
      4. Klargør optagelses softwaren på en computer, der er sluttet til ERG-set-up. Opret en stimulerings protokol med anskaffelses model "begivenheder med fast længde" og 20 s varighed.
    7. Acclimate fluerne til at fuldføre mørket, før du starter ERG optagelser. Placer fluerne i fuldstændig mørke i mindst 10 minutter, før eksperimentet påbegyndes.
      Bemærk: da fluer ikke kan detektere rødt lys, brug en rød lyskilde i perioden med mørk tilvænning.
    8. Placer det dias, der indeholder fluerne, på optageapparatet, og Flyt micromanipulatorerne med reference-og optagelses elektroderne til et punkt tæt på den flue, der er interesseret i diaset. Se spidsen af elektroden og Placer forsigtigt reference elektroden i flyve thorax (trænge ind i neglebånd). Når reference elektroden er stabilt indsat, placeres optage elektroden på øjets overflade.
      Bemærk: den nøjagtige position af denne referenceelektrode har ikke nogen større indvirkning på ERG-signalet. Optagelses elektroden skal placeres på øjets overflade, da ERG er en potentiel registrering i marken i stedet for en intracellulær optagelse. Den korrekte mængde tryk, der påføres optage elektroden, forårsager en lille Dimple uden at trænge ind i øjet.
    9. Sluk alle lysene for yderligere 3 minutter for at acclimere fluerne til det mørke miljø.
    10. Indstil optagelses softwaren, og begynd optagelsen af signalet. Hvis du bruger en halogen lyskilde med manuel udløser, skal du tænde for lyskilden med lukkeren lukket. Begynd at optage signalet.
    11. Udsætte flue øjnene for lys ved at åbne og lukke udløseren hver 1 s for 20 s varighed af en enkelt kørsel.
      Bemærk: on/off af halogen lyskilden kan styres manuelt eller programmeres til at blive automatiseret ved hjælp af en hvid LED-lyskilde. Mere robust og pålidelig ERG kan opnås ved hjælp af en halogen lyskilde sammenlignet med et hvidt LED-lys, sandsynligvis på grund af det bredere lysspektrum, der udsendes fra halogen lyskilden.
    12. Optag ERGs fra alle fluer, der er monteret på glas diaset. Udfør ERGs fra 15 fluer pr. genotype pr. tilstand.
      Bemærk: nogle parametre, der kan ændres for at finde en tilstand, der viser robuste forskelle mellem reference og variant cdnas, kan omfatte temperatur, alder eller miljømæssige forhold (f. eks. opdrættet i lys-mørk cyklus eller konstant lys/mørke).
    13. Udfør dataanalyse: Sammenlign ERGs fra referencen, varianten og kontrolelementerne for at afgøre, om der er forskelle. Vurder ERG-data for ændringer i transienter, depolorisering, off-transienter og repolarisering69 (figur 4B).
      Bemærk: depolarisering og repolarisering afspejler aktivering og inaktivering af phototransduktions kaskade inden for photoreceptorer, mens on-og off-transienter er målinger af aktiviteterne i de post-synaptiske celler, der modtager signaler fra photoreceptors. Nedsat amplitude og ændret kinetik af repolarisering er ofte forbundet med defekter med fotoreceptor funktion og sundhed, hvorimod defekter i on-og off-transienter er fundet i mutanter med defekt synapse udvikling, funktion, eller vedligeholdelse 70.
    14. Ved identifikation af forskelle i ERG-fænotyper med overekspression af reference vs. variant Human cdnas, afgøre, om denne elektrofysiologiske fænotype er forbundet med strukturelle og ultrastrukturelle defekter i foto og deres synapser ved at udføre histologisk analyse og transmission elektronmikroskopi.
      Bemærk: yderligere diskussioner om fortolkning af ERG-defekter og strukturel/ultrastrukturel analyse er tidligere beskrevet69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Funktionel undersøgelse af de Novo missense variant i EBF3 forbundet med neuroudviklingsmæssige fænotyper
I en 7-årig mand med neuroudviklingsmæssige fænotyper, herunder hypotoni, ataksi, Global udviklingsmæssige forsinkelse, og udtryksfuld taleforstyrrelse, læger og menneskelige genetikere på National Institutes of Health udiagnosticerede sygdomme projekt (UDP) identificerede en de Novo missense variant (p. R163Q) i EBF3 (tidlig b-celle faktor 3)15, et gen, der koder en Coe (Collier/olfactory-1/tidlig b-celle faktor) familie transkriptionsfaktor. Denne sag blev forelagt UDN MOSC i marts 2016 for funktionelle undersøgelser. For at vurdere, om dette gen var en god kandidat til denne sag, indsamlede MOSC menneskelige genetiske og genomiske oplysninger fra OMIM, ClinVar, ExAC (nu udvidet til gnomAD), Geno2MP, DGV, og DECHIFRERE. Desuden blev de ortologøse gener i nøgle-MO-arter identificeret ved hjælp af DIOPT-værktøjet. Genekspression og fænotypiske oplysninger fra individuelle MO-databaser (f. eks. Wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI) blev derefter opnået. De Informatik analyser, der blev udført for EBF3 og andre banebrydende studier i udn mosc, dannede grundlag for senere udvikling af marrvel-ressourcen30.

De oplysninger, der blev indsamlet ved hjælp af denne metode, indikerede EBF3 var ikke forbundet med nogen kendt menneskelig genetisk lidelse på analysetidspunktet, og det konkluderedes, at p. R163Q varianten var en god kandidat baseret på følgende oplysninger. (1) denne variant var ikke tidligere rapporteret i kontrol population databaser (ExAC) og sygdomspopulation database (Geno2MP), hvilket indikerer, at dette er en meget sjælden variant. (2) baseret på ExAC, pLI (sandsynlighed for LOF intolerance) score på dette gen er 1,00 (pLI scores spænder fra 0.00-1.00). Dette indikerer, at der er selektivt pres mod LOF varianter i dette gen i den almindelige befolkning og antyder, at haploinsufficiens af dette gen kan forårsage sygdom. For mere information om pli score og dens fortolkning, en ledsagende marrvel tutorial artikel i Jove31 og relaterede papirer giver detaljer30,71.

P. R163Q variant blev også betragtet som en god kandidat, fordi (3) det er placeret i den evolutionært bevaret DNA binding domæne af dette protein, hvilket tyder på, at det kan påvirke DNA-binding eller andre protein funktioner. (4) p. R163 rest er evolutionært bevaret fra C. elegans og Drosophila til mennesker, hvilket tyder på, at det kan være kritisk for protein funktionelle på tværs af arter. (5) EBF3 orthologs har været impliceret i neuronal udvikling i multiple mo72 herunder C. elegans73, Drosophila74, xenopus75, og mus76. (6) under hjernens udvikling i mus har Ebf3 vist sig at fungere nedstrøms for Arx (aristaless-relateret HomeBox)77, et gen forbundet med flere epilepsi og intellektuelle handicap syndromer hos mennesker78. Derfor, disse data sammen tyder på, at EBF3 er meget sandsynligt, at være afgørende for menneskelig Neuro udvikling, og at p. R163Q variant kan have funktionelle konsekvenser.

For at vurdere, om p. R163Q påvirker EBF3 funktion, blev en T2A-GAL4 linje for Knude (KN; flyve ortholog af human EBF379) genereret via rmce af en kodning intronic Mimic indsættelse15. KNT2A-GAL4 linjen er recessiv dødelig og undlod at supplere dødelighed af en klassisk KN allel (KNCol-1) samt molekylært defineret mangel, der dækker KN [DF (2R) BSC429]80 . Udtryks mønstrene i GAL4 afspejlede også tidligere rapporterede mønstre af KN -ekspression i hjernen såvel som i Wing imaginal Disc15. UAS transgene fluer blev derefter genereret for at tillade ekspression af reference og variant Human EBF3 cDNA samt vild-type flyve KN cDNA. Alle tre proteiner blev mærket med en C-Terminal 3xHA tag. Det er vigtigt, at UAS Wild-type fly KN (KN+) eller reference humane EBF3 (EBF3+)-transgener reddede Letaliteten af KNT2A-GAL4/DF (2R) BSC429 i samme omfang ( Figur 3C, venstre panel)81.

I modsætning hertil var UAS-Human EBF3 transgene med p. R163Q varianten (EBF3p. R163Q) ikke i stand til at redde denne mutant, hvilket tyder på, at p. R163Q varianten påvirker EBF3 funktion in vivo15. Interessant, når vurderet ved hjælp af anti-HA-antistoffer, den EBF3p. R163Q protein blev med succes udtrykt i flue vævet, og dets niveauer og subcellulære lokalisering (primært nukleare) var ikke skelnes fra dem af EBF3+ og KN+. Dette tyder på, at varianten ikke forårsager en LOF fænotype på grund af protein ustabilitet eller mis-lokalisering. For yderligere at vurdere, om p. R163Q-varianten påvirkede den transkriptionelle aktiveringsfunktion i EBF3, blev der udført en luciferase-baseret reporter-analyse i HEK293 cellerne15. Dette eksperiment i dyrkede humane celler afslørede, at EBF3p. R163Q variant undladt at aktivere transkriptionen af reporter konstruktioner, støtte LOF model opnået fra Drosophila eksperimenter.

Parallelt med de eksperimentelle undersøgelser førte samarbejde med læger, menneskelige genetikere og genetiske rådgivere ved BCM til identifikationen af to yderligere personer med lignende symptomer. En patient bar den identiske p. R163Q variant, og en anden bar en missense variant, der påvirkede den samme restkoncentration (s. R163L). Den p. R163L variant også undladt at redde flue KN mutant93 tyder på, at denne ALLEL også påvirket EBF3 funktion. Interessant, dette arbejde blev offentliggjort back-to-back med to uafhængige humangenetik undersøgelser, der rapporterede yderligere personer med de Novo missense, nonsens, frameshift, og splejsning varianter i EBF3 knyttet til lignende neuroudviklingsmæssige fænotyper82,83. Efterfølgende blev der offentliggjort tre yderligere papirer, som rapporterer om yderligere tilfælde af de Novo EBF3 varianter og kopi nummer sletning84,85,86. Denne roman neuroudviklingsmæssige syndrom er nu kendt som hypotoni, ataksi, og forsinket udvikling syndrom (HADDS, MIM #617330) i online Mendelian arv i mennesket (OMIM, en autoritativ database for genotype-fænotype relationer i mennesker).

Funktionel undersøgelse af dominantly nedarvede missense variant i TBX2 forbundet med en syndromisk kardiovaskulær og skelet udviklingsmæssige lidelse
I en lille familie ramt af overlappende spektre af kraniofacial dysmorphism, kardiale anomalier, skelet misdannelse, immundefekt, endokrine abnormiteter, og udviklingsmæssige svækkelse, identificerede UDN Duke Clinical site en missense variant (s. R20Q) i TBX2 , der adskiller med sygdoms fænotyper87. Tre (søn, datter, mor) ud af de fire familiemedlemmer er påvirket af denne betingelse, og Sønnen udstillet den mest alvorlige fænotype. Klinisk, han mødte en diagnose af "komplet DiGeorge syndrom", en tilstand ofte forårsaget af haploinsufficiens af TBX1. Mens der ikke var nogen mutationer identificeret i TBX1 i denne familie, fokuserede klinikere og menneskelige geneticister på en variant i TBX2, da tidligere undersøgelser i mus viste, at disse gener har overlappende funktioner under udvikling88 . TBX1 og TBX2 begge tilhører T-box (TBX) familie af transkriptionsfaktorer, der kan fungere som transkriptionelle undertrykkere samt aktivatorer afhængigt af konteksten.

Tidligere var varianter i 12 ud af 17 medlemmer af TBX -familiens gener forbundet med sygdomme hos mennesker. MOSC besluttede at eksperimentelt forfølge denne variant baseret på følgende oplysninger indsamlet gennem MARRVEL og andre ressourcer. (1) denne variant blev kun rapporteret én gang i en kohorte af ~ 90.000 "Control" individer i gnomAD (denne variant blev filtreret ud i en standardvisning, sandsynligvis på grund af lav dækning læser). I betragtning af den mildere fænotypiske præsentation af moderen, dette kan stadig betragtes som en sjælden variant, der kan være ansvarlig for sygdommens fænotyper. (2) pLI-scoren på TBX2 i exac/gnomAD er 0.96/0,99, hvilket er højt (maksimum = 1,00). Desuden er o/e (observeret/forventet) LOF score i gnomAD 0,05 (kun 1/18.6 forventet LOF variant er observeret i gnomAD). Disse tal tyder på, at LOF varianter i dette gen er valgt mod i den almindelige befolkning.

Desuden, (3) den p. r20 er evolutionært bevaret fra C. elegans og Drosophila til mennesker, hvilket tyder på, at dette kan være en vigtig rest for TBX2 funktion. (4) flere programmer forudsige, at varianten er sandsynligt skadelige (polyphen: muligvis/sandsynligvis skadeligt, SIFT: deleterious, CADD score: 24,4, REVEL score: 0,5). (5) MO-mutanter udviser defekter i væv, som er berørt af patienter (f. eks. udskærings-mus, som udviser defekter i hjerte-kar-systemet, fordøjelsessystemer/mave-tarmsystem, kraniofacial, lemmer/ciffer). Derfor, sammen med de biologiske forbindelser mellem TBX1 og TBX2 og fænotypiske forbindelser mellem disse patienter og DiGeorge syndrom, det var optimalt at udføre funktionelle undersøgelser af varianter i dette gen ved hjælp af Drosophila.

For at vurdere, om p. R20Q varianten påvirker TBX2 funktion, blev en T2A-GAL4 linje i Bifid (bi; Drosophila ortholog af human TBX2) genereret via Rmce af en kodning intronic Mimic (figur 2)87. Denne allele, biT2A-GAL4, var recessiv før lethal og opførte sig som en stærk LOF mutant, svarende til tidligere rapporterede bi LOF alleler (f. eks biD2, bid4; Figur 2 E). den dødelighed af disse klassiske og nyligt genererede bi alleler blev reddet af en ~ 80 KB genomisk redning konstruere bærer hele bi locus, hvilket indikerer, at disse reagenser er faktisk ren LOF alleler. Udtryks mønstret for GAL4 i biT2A-GAL4- linjen matchede også godt med tidligere rapporterede mønstre af bi -udtryk i flere væv, herunder i Wing imaginal Disc (figur 2D).

Parallelt hermed blev der genereret UAS-transgene linjer for TBX2 med reference-eller variant (p. R20Q)-sekvenser. Desværre, hverken transgene var i stand til at redde dødelighed af biT2A-GAL4 linje. Vigtigere, en vild-type flyve UAS-bi transgene heller ikke at redde biT2A-GAL4 allele, sandsynligvis på grund af dosering-følsomhed af dette gen. Faktisk, overekspression af UAS-bi+ og UAS-TBX2+ forårsagede en vis grad af dødelighed, når overudtrykt i en vild-type dyr. Denne toksiske effekt af bi/TBX2 overekspression blev udnyttet som en funktionel analyse til at vurdere, om p. R20Q variant kan påvirke TBX2 funktion. Da Drosophila bi -genet er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med det visuelle system [gen er også kendt som optomotor blind (OMB)], blev fænotyper, der er relateret til det visuelle system, efterforsket i udstrakt grad. Når reference TBX2 blev udtrykt ved hjælp af en ey-GAL4 driver, der udtrykker UAS-transgener i øjet og dele af hjernen er relevante for det visuelle system, ~ 85% dødelighed (figur 3C, højre panel) og signifikant reduktion af øjen størrelse (figur 4B) blev observeret. Denne fænotype var stærkere end den fænotype observeret, når en vild-type flyve UAS-bi transgene blev udtrykt, tyder på, at den menneskelige TBX2 er mere skadeligt for flue, når overudtrykt.

Interessant, p. R20Q TBX2 var mindre potent i at forårsage dødelighed (figur 3C, højre panel) og i inducerende en lille øjen fænotype (figur 4B) ved hjælp af samme driver under den identiske tilstand87, tyder på at varianten påvirker protein funktionen. Desuden viser funktionen af foto, der overudtrykker reference og variant TBX2 ved hjælp af en anden GAL4 driver (Rh1-GAL4) , som specifikt udtrykker UAS-transgener i R1-R6 photoreceptorer, at varianten TBX2 udviste en meget mildere ERG fænotype sammenlignet med reference TBX2 (figur 4B)87. Interessant, de fleste af p. R20Q TBX2 protein blev stadig fundet i kernen, svarende til referenceprotein, tyder på, at varianten ikke påvirkede nuklear lokalisering. En luciferase-baseret transkriptional undertrykkelse analyse i HEK293T celler viste, at p. R20Q ikke var i stand til effektivt at undertrykke transkription af en reporter konstruere med palindromiske T-box sites87. Desuden blev der observeret fald i protein niveauer af TBX2p. R20Q sammenlignet med TBX2+, hvilket tyder på, at varianten kan påvirke oversættelsen eller protein stabiliteten af TBX2, hvilket igen påvirker dens overflod i en celle.

Yderligere patienter med sjældne varianter i TBX2 blev identificeret af klinikere på udn Duke Clinical-stedet parallelt med disse eksperimentelle undersøgelser.  En 8-årig dreng med en de Novo missense (p. R305H) variant fra en uafhængig familie udstillet mange af de funktioner, der findes i den første familie87. Yderligere funktionelle undersøgelser i Drosophila og humane cellelinjer afslørede, at p. R305H variant også påvirker TBX2 funktion og protein niveauer, stærkt tyder på, at defekter i dette gen sandsynligvis ligger til grund for mange fænotyper fundet i de to familier. Denne lidelse blev for nylig kurateret som "vertebrale anomalier og variable endokrine og T celle dysfunktion" (VETD, MIM #618223) i OMIM. Identifikation af yderligere personer med skadelige varianter i TBX2 med overlappende fænotyper er afgørende for at forstå det fulde spektrum af genotype-fænotype relationer for dette gen i sygdomme hos mennesker.

Figure 1
Figur 1 : Injektion og passage ordning til at GENERERE UAS-Human cDNA og T2A-GAL4 linjer. A) generation af UAS-humane cDNA-transgener gennem mikroinjektioner og krydsninger. Krydsnings ordningen for at integrere Trans generne i et andet kromosom docking-sted (VK37) ved hjælp af mandlige fluer i første og anden generation vises som et eksempel. Ved injektion af humant cDNA φc31 transgene konstruere (PGW-ha. attb) i tidlige embryoner, der indeholder en kimcelle kilde til φc31 integrasehæmmer (mærket med 3xp3-gfp og 3xp3-RFP) og VK37 docking site [mærket med en gul+ (y+ ), kan transgene hændelser følges med det hvide+ (w+) mini gen, der findes i den transgene vektor. Det anbefales at krydse φC31 integrasehæmmer ved at vælge mod fluer med GFP og RFP. Den endelige stabile bestand kan holdes som homozygoter eller som en afbalanceret bestand, hvis kromosom bærer en anden site dødelig/steril hit mutation. Tilstedeværelsen af andet sted dødbringende/sterile mutationer på en transgene konstruktion påvirker normalt ikke resultatet af funktionelle undersøgelser, så længe disse transgener anvendes i en heterozygot tilstand (figur 3). (B) generering af T2A-GAL4 linjer gennem mikroinjektion og krydsninger. Krydsning ordning hen til omforme en other kromosom MiMIC indsættelse i en T2A-GAL4 element er vist som et eksempel. Ved mikroindsprøjtning af et udtryks vektor for φC31 integrasehæmmer og RMCE Vector for T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70, vælges en passende læse ramme til den efterfølgende vurdering af interessen. Se følgende papirer for detaljer57,59 i embryoner, der bærer en efterligne i en kodning intron i gen af interesse, kan man konvertere den oprindelige Mimic til en T2A-GAL4 linje. Figur 2 A viser et skematisk diagram over rmce-konverteringen. Konverteringshændelsen kan vælges ved at screene mod y+- mærket i den originale Mimic-kassette60. Da RMCE kan forekomme i to retninger, fører kun 50% af den vellykkede konverteringshændelse til en vellykket produktion af GAL4, som kan påvises af en UAS-GFP-reporter-transgene i den næste generation. Den endelige stabile bestand kan opbevares som homozygoter eller som en afbalanceret bestand, hvis LOF af genet er dødelig/steril. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Konvertering af MiMIC-elementer til T2A-GAL4 linjer via RMCE. (A) φc31 integrasehæmmer letter rekombinationen mellem de to attp sites i flue (top) og to attb sites ledsage en T2A-GAL4 kassette vist som en cirkulær vektor (bund). (B) vellykkede rmce-hændelser fører til tab af et valgbart mærke (gult +) og indsættelse af T2A-GAL4-kassetten i samme retning som det, der interesserer genet. Da RMCE-hændelsen kan ske i to retninger, giver kun 50% af RMCE-reaktionen et ønsket produkt. Et RMCE-produkt, der er indsat i modsat retning, vil ikke fungere som en gen-Trap-allel eller Express-GAL4. Konstruktions retningen skal bekræftes via sanger sekvensering. (C) transskription (top) og oversættelse (nederst) af det gen af interesse fører til generering af en trunkeret mRNA og protein på grund af polya signal til stede i 3 ' enden af T2A-GAL4 kassetten. T2A er et ribosom springe signal, som gør det muligt for ribosom at standse og genopstarte oversættelsen efter dette signal. Dette bruges til at generere et GAL4 element, der ikke er kovalent knyttet til det afkortede genprodukt af interesse. GAL4 vil komme ind i kernen og vil lette transkriptionen af transgener, der er under kontrol af UAS elementer. UAS-GFP kan bruges som genekspressions reporter, og UAS-humant cDNA kan bruges til rednings eksperimenter via gen "humanization". (D) vist er et eksempel på et T2A-GAL4 element i bi -kørsels EKSPRESSION af UAS-gfp (top). Dette udtryks mønster ligner en tidligere genereret forstærker-traplinje for det samme gen (biOMB-GAL4; bund). (E) sammenligning af T2A-GAL4 allel af bi med tidligere rapporterede LOF bi alleler. Dette tal er blevet vedtaget og ændret fra tidligere publikationer57,87. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Funktionel analyse af humane varianter ved hjælp af rednings baserede (venstre) og overekspressions baserede (højre) undersøgelser. (A) (venstre panel): funktionen af EBF3 varianter blev vurderet med en rednings baseret analyse af flyve knuden (KN) LOF allel med fokus på dødelighed/levedygtighed; (højre panel): funktionen af varianter i TBX2 blev vurderet ved at udføre overekspression af humane TBX2 transgener i vild-type fluer, med fokus på dødelighed/levedygtighed, Eye morfologi og Elektrofysiologi fænotyper (figur 4) . B) krydsnings ordninger for at opnå de fluer, der skal testes i de funktionelle undersøgelser. Det tilrådes altid at bruge et neutralt UAS-element (f. eks. UAS-lacZ, UAS-gfp) som kontrol eksperiment. C) repræsentative resultater af funktionelle undersøgelser af henholdsvis EBF3s. R163Q og TBX2p. R20Q varianter samt passende kontrol eksperimenter, der er nødvendige for at fortolke resultaterne. Både rednings baserede analyser og overekspressions undersøgelser viser, at varianterne opfører sig som amorfe eller hypomorphic alleler. De tal for dødelighed/levedygtighed, der er vist her, er baseret på forsøgsdata præsenteret i tidligere publikationer15,87. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Funktionel analyse af en sjælden missense variant i human TBX2 baseret på Eye morfologi og elektroretinogrammet i Drosophila. A) et skematisk billede, der viser den typiske placering af optagelses-og reference elektroder på flue øjet, sammen med en repræsentativ elektroretinogram optagelse med fire hovedkomponenter (on-transient, depolarisering, off-forbigående, repolarisering). (B) TBX2 variant (p. R20Q) fungerer som en delvis LOF allel baseret på overekspressions undersøgelser i flue ØJET ved hjælp af GAL4 chauffører, der er specifikke for det visuelle system (ey-GAL4 og Rh1-GAL4). Dette viste, at reference TBX2 forårsagede en stærk morfologisk og elektrofysiologisk fænotype sammenlignet med variant proteinet. (Toppaneler): en alvorlig reduktion i øjen størrelse ses ved overekspression af UAS-TBX2+ med ey-GAL4. UAS-TBX2s. R20Q. Kørt med ey-GAL4 også forårsager et mindre øje, men fænotype er meget mildere. (Bundpaneler): når UAS-TBX2+ udtrykkes i Core R1-R6 photoreceptorer ved hjælp af Rh1-GAL4, er der et tab af on-og off-transienter, reduceret depolarisering og stor unormal forlænget depolarisering efter potentiel (PDA) fænotype, som ikke ses i kontrol fluer. Disse fænotyper er ikke så alvorlige, som når UAS-TBX2p. R20Q udtrykkes ved hjælp af samme Rh1-GAL4. Dette tal er blevet vedtaget og ændret fra tidligere publikationer69,87. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Formål Værktøj Url
Funktionen variant
forudsigelses algoritmer
PolyPhen-2
Støvtætte
CADD
PROVEAN
MutationTaster
Svælge
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
Sjælden og udiagnosticeret
sygdoms forskning
Konsortier
Udn
RDMM
IRUD
LØSE-RD
AFGN
https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
Integrativ database for
menneske og model
organismens oplysninger
MARRVEL
Monarch Initiative
Gene2Function
Phenologs
http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
Menneskelige genetiske og
Genomics-databaser
OMIM
ClinVar
ExAC
gnomAD
GenoMP
GD V
Dechifrere
https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
Ortholog identifikationsværktøj DIOPT https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Model organisme
Databaser og biomedicinske
Litteratursøgning
WormBase (C elegans)
FlyBase (Drosophila)
ZFIN (Zebrafish)
MGI (mus)
Pubmed
https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Genetisk og protein
interaktions databaser
Streng
Tåge
https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Protein struktur
databaser og
modelleringsværktøjer
WWPBD
SCHWEIZISK MODEL
Umbrello modeller
Phyre2
http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Patient matchmaking
Platforme
Matchmaker Exchange
GeneMatcher
AGHA Arkiv
Matchbox
Dechifrere
MyGene2
Phenome central
http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
Menneskelig afskrift
annotation og cDNA
klon oplysninger
Mammalian gensamling
Ensembl
Refseq
https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tabel 1: online ressourcer i forbindelse med denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksperimentelle undersøgelser med Drosophila melanogaster giver et robust analyse system til at vurdere konsekvenserne af sygdomsrelaterede humane varianter. Dette skyldes den store mængde af viden og forskellige genetiske værktøjer, der er blevet genereret af mange forskere i flue marken i løbet af de sidste århundrede89. Ligesom ethvert andet eksperimentelt system er det imidlertid vigtigt at erkende de forbehold og begrænsninger, der findes.

Forbehold i forbindelse med datamining
Selv om det første skridt i denne protokol er at mine databaser for oplysninger om et gen af interesse, er det vigtigt at bruge det kun som et udgangspunkt. For eksempel, selv om i silico forudsigelse af variant funktion giver værdifuld indsigt, bør disse data altid fortolkes med forsigtighed. Der er nogle tilfælde, hvor alle større algoritmer forudsige, at en menneskelig variant er godartet, men funktionelle undersøgelser i Drosophila klart demonstreret den skadelige karakter af sådanne variant24. På samme måde, selv om protein-protein interaktioner, co-Expression, og strukturelle modellering data er alle indsigtsfulde stykker af information, kan der være pseudo-positive og pseudo-negative oplysninger til stede i disse store omics datasæt. For eksempel kan nogle af de tidligere identificerede eller forventede protein-protein interaktioner være kunstige eller kun ses i visse celle-og vævstyper.

Derudover kan der være mange falske negative interaktioner, som ikke er registreret i disse datasæt, da visse protein-protein interaktioner er forbigående (f. eks. enzym-substrat interaktioner). Eksperimentel validering er afgørende for at påvise, at visse gener eller proteiner genetisk eller fysisk interagerer in vivo i den biologiske kontekst af interesse. Tilsvarende, strukturer forudsagt baseret på homologi modellering bør behandles som en model snarere end løst struktur. Selv om disse oplysninger kan være nyttige, hvis det konstateres, at en aminosyre af interesse er til stede i en strukturelt vigtig del af proteinet, negative data udelukker ikke muligheden for, at varianten kan være skadelige. Endelig bør nogle af de tidligere rapporterede genotype-phenotype-oplysninger også behandles med forsigtighed, da nogle oplysninger, der arkiveres i offentlige databaser, muligvis ikke er nøjagtige. For eksempel er nogle oplysninger i MO-databaser baseret på eksperimenter, der har været velkontrollerede og udført strengt, mens andre kan komme fra et stort skærm papir uden yderligere opfølgende undersøgelser og strenge kontroller.

"Humanisering" eksperimenter ved hjælp af T2A-GAL4 strategi ikke altid vellykket
Mens Rescue-og overexpression-baserede funktionelle undersøgelser ved hjælp af human cDNAs tillade vurdering af varianter i forbindelse med det menneskelige protein, denne tilgang er ikke altid vellykket. Hvis en reference humant cDNA ikke kan redde flyve mutant fænotype, er der to sandsynlige forklaringer. Den første mulighed er, at det menneskelige protein er nonfunktionelle eller har signifikant reduceret aktivitet i forbindelse med en flue celle. Dette kan skyldes 1) reduceret protein ekspression, stabilitet, aktivitet og/eller lokalisering eller 2) manglende kompatibilitet med flyve proteiner, der arbejder i et multi-protein kompleks. Da UAS/GAL4-systemet er temperaturfølsomt, kan fluerne hæves ved en relativ høj temperatur (f. eks. 29 °C) for at se muligheden for en redning i denne tilstand. Desuden kan der genereres en UAS-fly cDNA konstruktion og transgene som en positiv kontrol. Hvis varianten af interesse påvirker en bevaret aminosyre, kan den analoge variant indføres i flue cDNA for funktionel undersøgelse af varianten i forbindelse med flue ortholog. Selv om dette ikke er nødvendigt, det i høj grad hjælper undersøgelsen i tilfælde, at ved hjælp af humane cDNA transgene linjer giver negative eller inkonklusive resultater (figur 3).

Den anden mulighed er, at udtryk for det menneskelige protein forårsager nogle cellulære-eller organisme-niveau toksicitet. Dette kan skyldes antimorfe (f. eks. som et dominerende negativt protein), hypermorf (f. eks. for meget aktivitet) eller neomorfe (f. eks. gevinst ved en ny toksisk funktion såsom protein aggregering, der ikke altid er relateret til den endogene funktion af genet af rente) virkninger. I dette tilfælde kan det lindre nogle af disse problemer at holde fluerne i en lav temperatur (f. eks. 18 °C). Endelig er der nogle scenarier, hvor overekspression af en flue cDNA kan ikke redde flue T2A-GAL4 linje, som det ses i TBX2 eksempel, sandsynligvis på grund af distrikt dosering afhængighed af genproduktet. For at undgå over ekspression af et protein af interesse, kan flue genet af interesse ændres direkte via crispr, en genomisk rednings konstruktion kan konstrueres, der indeholder den variant af interesse, eller redning eksperimenter kan udføres ved hjælp af en LOF allel21. For små gener, "humanisere" flue genomisk redning konstruere kan anses for at teste humane varianter, der påvirker ikke-bevaret aminosyrer24. Sammenfattende bør alternative strategier overvejes, når humaniserings forsøget ikke giver mulighed for funktionel vurdering af varianten af interesse.

Fortolkning af negative og positive resultater
Hvis 1) både reference og variant Human cDNAs redde flyve mutant fænotyper til en lignende grad og 2) der er ingen forskel observeret i alle testede tilstande, så kan det antages, at varianten er funktionelt umulig at skelne i Drosophila i In vivo. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at disse oplysninger ikke er tilstrækkelige til at udelukke, at varianten af interesse er ikke-sygdomsfremkaldende, da Drosophila -analysen ikke kan være følsom nok eller fange alle potentielle funktioner af genet/protein af interesse relevante for mennesker. Positive data, på den anden side, er en stærk indikation af, at varianten har skadelige konsekvenser for protein funktionen, men disse data alene er stadig ikke tilstrækkeligt til at kræve patogenicitet. American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) har offentliggjort et sæt af standarder og retningslinjer for at klassificere varianter i menneskelige sygdoms associerede gener i "godartet", "sandsynligt godartet", "variant af ukendt signifikans (VUS)", "sandsynlig sygdomsfremkaldende", og "sygdomsfremkaldende"90. Selv om denne klassifikation kun gælder for etablerede sygdomsrelaterede gener og ikke er direkte anvendelig på varianter i "gener af usikker betydning" (GUS), opfordres alle personer, der er involveret i funktionelle undersøgelser af menneskelig variant, kraftigt til at Overhold denne retningslinje ved rapportering af variant funktion.

Udvinding af nyttige biologiske oplysninger, når MO-Phenotyper ikke modellere en sygdomstilstand hos mennesker
Det er vigtigt at huske på, at over ekspressions baserede funktionelle assays har begrænsninger, især da nogle af de fænotyper, der bliver scoret, kan have ringe relevans for sygdomstilstanden af interesse. Tilsvarende kan fænotyper, der vurderes ved hjælp af redningsforsøg, ikke have nogen direkte relevans for den pågældende sygdom. Da disse eksperimenter udføres uden for de endogene kontekster i et hvirvelløse system, bør de ikke betragtes som sygdomsmodeller, men snarere som en genfunktions test ved hjælp af Drosophila som et "levende testrør".

Selv hvis den model organisme ikke efterligner en menneskelig sygdom tilstand, kan de brændende fænotyper, der anvendes i redning eksperimenter ofte give nyttig biologisk indsigt i sygdomstilstande. Begrebet "phenologs (ikke-indlysende homologe fænotyper)"91 kan anvendes til yderligere at bestemme underliggende molekylære forbindelser mellem Drosophila og humane fænotyper. For eksempel er morfologiske fænotyper i flue fløjen, thorax, ben og øjne fremragende fænotypiske udlæsninger for defekter i notch signalering pathway, en evolutionært bevaret pathway forbundet med mange medfødte lidelser, herunder hjerte-kar-defekter hos mennesker62. Ved at forstå den molekylære logik bag visse fænotyper i Drosophilaer det muligt at identificere skjulte biologiske forbindelser mellem gener og fænotyper hos mennesker, som endnu ikke er forstået.

Kontinuerlig kommunikation med kliniske samarbejdspartnere
Når man arbejder med klinikere for at studere funktionen af en sjælden variant, der findes i patienten, er det vigtigt at etablere et stærkt samarbejdsforhold. Selv om kliniske og grundlæggende biomedicinske forskere kan dele interesser i de samme gener/genetiske veje, er der en stor kulturel og sproglig (f. eks., medicinsk jargon, model organisme-specifik nomenklatur) kløft mellem de kliniske og videnskabelige områder. En stærk, tillidsbaseret forbindelse mellem de to parter kan bygges gennem omfattende kommunikation. Desuden er tovejskommunikation afgørende for at etablere og vedligeholde dette forhold. I de to tilfælde, der er beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater, var det for eksempel vigtigt at identificere yderligere patienter med lignende genotyper og fænotyper samt efterfølgende funktionelle undersøgelser for at påvise patogenicitet af varianterne af interesse. Selv med stærke funktionelle data, forskere og klinikere ofte har svært ved at overbevise menneskelige genetikere, at en variant identificeret i "n = 1" tilfælde er den egentlige årsag til sygdom.

Når MO-forskeren identificerer, at en variant af interesse er skadelig, er det afgørende at kommunikere tilbage til kliniske samarbejdspartnere så hurtigt som muligt, så de aktivt kan forsøge at identificere matchende sager ved at netværke med andre klinikere og menneskelige geneticister. Værktøjer såsom Geno2MP [genotyper til Mendelian fænotyper: en de-identificeret database af 9.650 personer indskrevet i University of Washingtons Center for Mendelian Genomics undersøgelse41; omfatter patienter og familiemedlemmer, der mistænkes for at at have genetiske lidelser] kan søges for at vurdere personer, der kan have den samme lidelse. Derefter kan den ledende kliniker kontaktes ved hjælp af en messaging-funktion.

Alternativt kan GeneMatcher bruges, som er en matchmaking hjemmeside for klinikere, grundlæggende forskere, og patienter, der deler interesser i de samme gener til at identificere yderligere patienter, der bærer sjældne varianter. Da GeneMatcher er en del af en større Integrativ netværk af matchmaking hjemmesider kaldet matchmaker Exchange42, yderligere databaser rundt om i verden kan søges, herunder den australske Genomics Health Alliance patient arkiv, bred Matchbox , DECHIFRERE, MyGene2 og Fænomecentral i et enkelt Genematchers genindsendelse. Selv om deltagelse i GeneMatcher er mulig som en "forsker", anbefales det, at grundlæggende videnskabsfolk udnytter denne hjemmeside med deres kliniske samarbejdspartnere, da kommunikation med andre klinikere efter en kamp kræver visse niveauer af medicinsk Ekspertise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Jose Salazar, Julia Wang, og Dr. Karen Schulze for kritisk læsning af manuskriptet. Vi anerkender DRs. ning Liu og XI Luo for den funktionelle karakterisering af de TBX2 varianter, som diskuteres her. Udiagnosticerede sygdomme netværk model organismer screening Center blev støttet gennem National Institutes of Health (NIH) fælles fond (U54 NS093793). H. T. C. blev yderligere støttet af NIH [CNCDP-K12 og NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research tilskud), Burroughs Wellcome fond (Career Award for medicinske videnskabsfolk), Child Neurology Society og Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) og NIH-direktørens tidlige uafhængigheds pris (DP5 OD026426). M. F. W. blev yderligere støttet af Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. blev yderligere støttet af NIH (R01 DC014932), Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer's Association (ny investigator forskning Grant: 15-364099), naman Familiefond for grundforskning, og Caroline Wiess lov fond for forskning i Molekylær medicin. Confocal mikroskopi hos BCM understøttes delvist af NIH Grant U54HD083092 til Neuro visualiserings kernen for intellektuel og udviklingsmæssige handicap Research Center (iddrc).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100, (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362, (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14, (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312, (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312, (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103, (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18, (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7, (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11, (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7, (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207, (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19, (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100, (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102, (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27, (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103, (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103, (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13, (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12, (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93, (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99, (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45, (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27, (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103, (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100, (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7, (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99, (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46, (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44, (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45, (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10, (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158, (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19, (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2, (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314, (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140, (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9, (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314, (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190, (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10, (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188, (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8, (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199, (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34, (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5, (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4, (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536, (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22, (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125, (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56, (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233, (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131, (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17, (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16, (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108, (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13, (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100, (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100, (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100, (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3, (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3, (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27, (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21, (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17, (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281, (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77, (1), 51-59 (1989).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics