Étude fonctionnelle In Vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile

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Genetics

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Summary

L'objectif de ce protocole est de décrire la conception et la performance d'expériences in vivo dans Drosophila melanogaster pour évaluer les conséquences fonctionnelles des variantes génétiques rares associées aux maladies humaines.

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Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

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Abstract

Les progrès de la technologie de séquençage ont rendu les ensembles de données à génome entier et à l'exome entier plus accessibles pour le diagnostic clinique et la recherche de pointe en génétique humaine. Bien qu'un certain nombre d'algorithmes in silico aient été développés pour prédire la pathogénicité des variantes identifiées dans ces ensembles de données, les études fonctionnelles sont essentielles pour déterminer comment des variantes génomiques spécifiques affectent la fonction protéique, en particulier pour le mauvais sens Variantes. Dans le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) et d'autres consortiums de recherche sur les maladies rares, des organismes modèles (MO), y compris Drosophila, C. elegans, le poisson zèbre et les souris sont activement utilisés pour évaluer la fonction de la maladie humaine putative causant des maladies Variantes. Ce protocole décrit une méthode pour l'évaluation fonctionnelle des variantes humaines rares utilisées dans le centre de dépistage des organismes modèles Drosophila Core de l'UDN. Le flux de travail commence par la collecte d'informations humaines et MO à partir de plusieurs bases de données publiques, en utilisant la ressource Web MARRVEL pour évaluer si la variante est susceptible de contribuer à l'état d'un patient ainsi que la conception d'expériences efficaces basées sur disponibles connaissances et ressources. Ensuite, des outils génétiques (p. ex., T2A-GAL4 et UAS-human cDNA lines) sont générés pour évaluer les fonctions des variantes d'intérêt dans Drosophila. Lors du développement de ces réactifs, des essais fonctionnels à deux volets basés sur des expériences de sauvetage et de surexpression peuvent être effectués pour évaluer la fonction de la variante. Dans la branche de sauvetage, les gènes de la mouche endogène sont « humanisés » en remplaçant le gène orthologue Drosophila par des transgènes humains de référence ou de variante. Dans la branche de surexpression, les protéines humaines de référence et de variante sont exogènes entraînées dans une variété de tissus. Dans les deux cas, tout phénotype évolutif (p. ex. létalité, morphologie des yeux, électrophysiologie) peut être utilisé comme lecture, quelle que soit la maladie d'intérêt. Les différences observées entre les alleles de référence et les alleles de variante suggèrent un effet variante-spécifique, et donc la pathogénie probable. Ce protocole permet des évaluations rapides et in vivo des variantes humaines présumées causant des maladies des gènes avec des fonctions connues et inconnues.

Introduction

Les patients atteints de maladies rares subissent souvent un voyage ardu appelé « odyssée diagnostique » pour obtenir un diagnostic précis1. On pense que la plupart des maladies rares ont une forte origine génétique, ce qui rend les analyses génétiques/génomiques des éléments critiques de la prise de contrôle clinique. En plus du séquençage des panneaux génétiques candidats et de l'analyse de la variation des nombres de copies basée sur les microréseaux chromosomiques, les technologies de séquençage du génome entier (WGS) sont devenues des outils de plus en plus précieux au cours de la dernière décennie2, 3. À l'heure actuelle, le taux de diagnostic pour l'identification d'une variante pathogène connue dans WES et WGS est de 25 % (plus élevé dans les cas pédiatriques)4,5. Pour la plupart des cas qui restent non diagnostiqués après le WES/WGS clinique, un problème commun est qu'il y a beaucoup de gènes et de variantes de candidat. Le séquençage de nouvelle génération identifie souvent des variantes nouvelles ou ultra-rares dans de nombreux gènes, et il est difficile d'interpréter si ces variantes contribuent aux phénotypes de la maladie. Par exemple, bien que la plupart des mutations absurdes ou de changement d'image dans les gènes soient considérées comme des allèles de perte de fonction (LOF) en raison de la désintégration non-écrite de la transcription codée, les mutations tronquantes trouvées dans les derniers exons échappent à ce processus et peuvent fonctionner comme alleles bénins ou de gain de fonction (GOF)6.

En outre, prédire les effets d'un allèle de mauvais sens est une tâche intimidante, car il peut entraîner un certain nombre de scénarios génétiques différents comme décrit pour la première fois par Herman Muller dans les années 1930 (c.-à-d., amorphe, hypomorphe, hypermorphe, antimorphe, néomorphe, ou isomorphe)7 . De nombreux programmes et méthodologies silico ont été développés pour prédire la pathogénicité des variantes de mauvais sens basées sur la conservation évolutive, le type de changement d'acide aminé, la position dans un domaine fonctionnel, la fréquence d'allèle dans la population générale, et d'autres paramètres8. Cependant, ces programmes ne sont pas une solution complète pour résoudre le problème complexe de l'interprétation des variantes. Fait intéressant, une étude récente a démontré que cinq algorithmes de prédiction de la pathogène variante largement utilisés (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) s'accordent sur la pathogénicité 80 % du temps8 . Notamment, même lorsque tous les algorithmes sont d'accord, ils renvoient une prédiction erronée de la pathogénicité jusqu'à 11% du temps. Ceci mène non seulement à l'interprétation clinique défectueuse mais peut également dissuader des chercheurs de suivre vers le haut de nouvelles variantes en les énumérant faussement comme bénins. Une façon de compléter la limitation actuelle de la modélisation silico est de fournir des données expérimentales qui démontrent l'effet de la fonction de variante in vitro, ex vivo (par exemple, les cellules cultivées, les organoïdes), ou in vivo.

Les études fonctionnelles in vivo des variantes associées aux maladies rares dans MO ont des forces uniques13 et ont été adoptées par de nombreuses initiatives de recherche sur les maladies rares à travers le monde, y compris le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) aux États-Unis et Rare Diseases Models and Mechanisms (RDMM) Networks in Canada, Japan, Europe, and Australia14. En plus de ces efforts coordonnés visant à intégrer les chercheurs de MO dans le flux de travail du diagnostic des maladies rares et des études mécanistes à l'échelle nationale, un certain nombre d'études individuelles en collaboration entre les chercheurs cliniques et les chercheurs de MO ont mené à la découverte et la caractérisation de nombreux nouveaux gènes et variantes pathogènes82,83,84.

Dans l'UDN, un centre centralisé de dépistage des organismes modèles (MOSC) reçoit des soumissions de gènes et de variantes candidats avec une description de l'état du patient et évalue si la variante est susceptible d'être pathogène à l'aide d'outils informatiques et in vivo Expériences. Dans la phase I (2015-2018) de l'UDN, le MOSC composé d'un drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] et Zebrafish Core (University of Oregon) qui a travaillé en collaboration pour évaluer les cas. En utilisant l'analyse informatique et un certain nombre de stratégies expérimentales différentes dans la drosophile et le poisson zèbre, le MOSC a jusqu'à présent contribué au diagnostic de 132 patients, l'identification de 31 nouveaux syndromes55, la découverte de plusieurs nouveaux humains gènes de la maladie (par exemple, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) et l'expansion phénotypique de la maladie connue (p. ex., CACNA1A21,ACOX122).

En plus des projets au sein de l'UDN, les chercheurs du MOSC Drosophila Core ont contribué à de nouvelles découvertes de gènes pathogènes en collaboration avec les Centers for Mendelian Genomics et d'autres initiatives (p. ex. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) en utilisant le même ensemble d'informatique et de génétique stratégies développées pour l'UDN. Compte tenu de l'importance des études de MO sur le diagnostic des maladies rares, le MOSC a été élargi pour inclure un noyau de C. elegans et un deuxième noyau de poisson zèbre (tous deux à l'Université de Washington à St. Louis) pour la phase II (2018-2022) de l'UDN.

Ce manuscrit décrit un protocole d'étude fonctionnel in vivo qui est activement utilisé dans le noyau d'ODN MOSC Drosophila pour déterminer si les variantes de mauvais sens ont des conséquences fonctionnelles sur la protéine d'intérêt à l'aide de mouches transgéniques qui expriment l'homme Protéines. L'objectif de ce protocole est d'aider les chercheurs de MO à travailler en collaboration avec des groupes de recherche clinique afin de fournir des preuves expérimentales qu'une variante candidate d'un gène d'intérêt a des conséquences fonctionnelles, facilitant ainsi le diagnostic clinique. Ce protocole est le plus utile dans un scénario dans lequel un chercheur de Drosophila est approché par un chercheur clinique qui a un patient rare de maladie avec une variante spécifique de candidat dans un gène d'intérêt.

Ce protocole peut être divisé en trois éléments : (1) la collecte d'informations pour évaluer la probabilité que la variante d'intérêt soit responsable du phénotype du patient et la faisabilité d'une étude fonctionnelle dans Drosophila, (2) la collecte d'outils génétiques existants et d'en établir de nouveaux, et (3) d'effectuer des études fonctionnelles in vivo. Le troisième élément peut en outre être subdivisé en deux sous-éléments en fonction de la façon dont la fonction d'une variante d'intérêt peut être évaluée (expérience de sauvetage ou stratégies basées sur la surexpression). Il est important de noter que ce protocole peut être adapté et optimisé à de nombreux scénarios en dehors de la recherche sur les maladies monogéniques rares (p. ex., maladies courantes, interactions gènes-environnement et écrans pharmacologiques/génétiques pour identifier des cibles thérapeutiques). La capacité de déterminer la fonctionnalité et la pathogénicité des variantes profitera non seulement au patient d'intérêt en fournissant un diagnostic moléculaire précis, mais aura également des impacts plus larges sur la recherche scientifique translationnelle et fondamentale.

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Protocol

1. Collecte d'informations humaines et MO pour évaluer: Probabilité d'une variante de l'intérêt étant responsable des phénotypes de la maladie et la faisabilité des études fonctionnelles dans la drosophile

  1. Effectuer des recherches approfondies dans les bases de données et la littérature afin de déterminer si les gènes et les variantes d'intérêt spécifiques sont de bons candidats pour expliquer le phénotype du patient d'intérêt. Plus précisément, recueillir les informations suivantes.
    1. Évaluer si le gène d'intérêt a déjà été impliqué dans d'autres troubles génétiques (expansion phénotypique du gène de la maladie connue) ou s'il s'agit d'un gène candidat à la maladie entièrement nouveau [variante génétique d'une signification incertaine (GVUS)].
    2. Évaluer la fréquence allèle de la variante de l'intérêt pour la maladie ou contrôler les bases de données des populations.
    3. Évaluer s'il existe des variations de nombre de copies (VNC) qui incluent ce gène dans les bases de données des populations de la maladie ou la lutte contre la maladie.
    4. Évaluer ce que les gènes orthologues sont dans différentes espèces MO, y compris la souris, le poisson zèbre, Drosophila, C. elegans, et la levure, puis d'étudier plus avant les fonctions connues et les modèles d'expression de ces gènes orthologues.
    5. Évaluer si la variante d'intérêt est présente dans un domaine fonctionnel de la protéine et si l'acide aminé d'intérêt est conservé de façon évolutive.
      REMARQUE: Les réponses à ces cinq questions (étapes 1.1.1-1.1.5) peuvent être obtenues en accédant individuellement à un certain nombre de bases de données humaines et MO ou en utilisant la ressource Web MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (voir tableau 1 pour les ressources en ligne)30, qui est décrit en profondeur dans un article d'accompagnement31. Consultez la section des résultats représentatifs pour obtenir des exemples précis. Le site Web monarch Initiative32 et Gene2Function33 fournissent également des renseignements utiles.
  2. Recueillir des informations supplémentaires pour évaluer davantage si la variante est un bon candidat de la maladie à partir d'une fonction protéique et la structure point de vue.
    1. Évaluer si la variante d'intérêt est prévue pour être dommageable en fonction des algorithmes de prédiction silico.
      REMARQUE: De nombreux groupes de recherche ont mis au point des algorithmes de pathogénicité variable au cours des 15 dernières années, et certains sont également affichés dans les résultats de recherche MARRVEL. Des programmes plus récents, y compris les deux énumérés ci-dessous, combinent des algorithmes de rediction de pathogènes de variantes multiples et des approches d'apprentissage automatique pour générer un score de pathogénicité. Pour plus d'informations sur les algorithmes de prédiction desvariantes et leurs performances, consultez Ghosh et al.8 . (i) CADD (épuisement combiné dépendant de l'annotation) : outil d'annotation intégrative construit à partir de plus de 60 caractéristiques génomiques, qui fournit des scores pour les SNV humains ainsi que pour les insertions et suppressions courtes11. (ii) REVEL (rare exome variante apprenante d'ensemble) : combine plusieurs algorithmes de pathogénicité de variantes (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP et phastCons) pour fournir un score intégré pour toutes les variantes possibles de mauvais sens humain34.
    2. Déterminer si le gène humain/protéine d'intérêt ou ses orthologs MO ont été montrés pour interagir génétiquement ou physiquement avec des gènes/protéines précédemment liés aux maladies génétiques. Si c'est le cas, évaluez si le patient d'intérêt présente des phénotypes qui se chevauchent avec ces troubles.
      REMARQUE: Plusieurs outils ont été développés pour analyser les interactions génétiques et protéines-protéines basées sur des publications MO ainsi que la protéomique à grande échelle à partir de plusieurs écrans d'espèces. STRING (outil de recherche pour les cas récurrents de gènes voisins)35: base de données pour les interactions protéines-protéines connues et prédites. Il intègre des ensembles de données d'interaction génétique et de coexpression ainsi que des outils d'extraction de texte pour identifier les gènes et les protéines qui peuvent fonctionner ensemble dans une variété d'organismes. MIST (outil de recherche d'interaction moléculaire)36: une base de données qui intègre des données génétiques et d'interaction protéine-protéine des Mde génétiques de base (levure, C. elegans, Drosophila, poisson zèbre, grenouille, rat, souris) et des humains. La prévision des interactions déduites des gènes/protéines orthologues (interlogs) sont également affichées.
    3. Déterminer si la structure 3D de la protéine d'intérêt a été résolue ou modélisée. Si c'est le cas, déterminez où la variante de la carte d'intérêt par rapport aux domaines fonctionnels clés.
      REMARQUE: Les structures protéiques résolues par la cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la microscopie cryo-électronique peuvent être trouvées dans les bases de données publiques, y compris la PDB (banque de données protéiques) et EMDatabank37. Bien qu'il n'existe pas de base de données unique pour les structures protéiques prédites/modélisées, un certain nombre d'algorithmes (c.-à-d. SWISS-MODEL38, Modeller39, et Phyre240) sont disponibles pour les utilisateurs d'effectuer la modélisation des protéines.
  3. Communiquez avec les collaborateurs cliniques pour discuter de l'information recueillie à partir des analyses informatiques dans les sections 1.1-1.2. Si les collaborateurs cliniques estiment également que la variante et le gène d'intérêt sont de bons candidats pour expliquer les phénotypes observés chez le patient, passez à la section 2. S'il y a des questions spécifiques au sujet du génotype et du phénotype du patient, discutez-en avec les collaborateurs cliniques avant d'aller de l'avant.
    REMARQUE: Si l'on estime que la variante d'intérêt est peu susceptible d'expliquer le phénotype d'intérêt (p. ex., variante identique trouvée dans la population témoin à haute fréquence), discutez-en avec des collaborateurs cliniques pour déterminer si la variante est une bonne candidat, car il peut ne pas y avoir l'expertise appropriée pour interpréter les phénotypes cliniques.

2. Rassembler les outils génétiques existants et établir de nouveaux réactifs pour étudier une variante spécifique de l'intérêt

REMARQUE: Une fois que la variante d'intérêt a été déterminée comme un bon candidat pour poursuivre expérimentalement, rassembler ou générer des réactifs pour effectuer des études fonctionnelles in vivo. Pour les études fonctionnelles décrites dans ce protocole, certains réactifs clés de melanogaster de Drosophila sont nécessaires : 1) les souches transgéniques humaines réglées par séquence d'activation en amont qui portent la séquence de référence ou de variante, 2) une perte de fonction allele d'un gène de mouche d'intérêt, et 3) une ligne GAL4 qui peut être utilisée pour des expériences de sauvetage.

  1. Génération de uAS-human cDNA construit et mouches transgéniques
    1. Identifier et obtenir les constructions d'ADNc humain appropriées. De nombreux clones sont disponibles auprès du MGC (collection de gènes mammifères)43 et peuvent être achetés auprès de distributeurs sélectionnés. Pour les gènes qui sont alternativement épissés, vérifiez quel adNdain isoforme correspond à l'utilisation d'Ensembl ou refSeq.
      REMARQUE: De nombreux cDNA sont disponibles dans les réactifs compatibles du système de clonage recombinase-mediaed44, ce qui simplifie l'étape de subcloning. les cDNA peuvent être livrés dans un format « ouvert (sans codon d'arrêt) » ou « fermé (avec codon d'arrêt endogène ou artificiel) ». Bien que les clones ouverts permettent le marquage C'-tagging des protéines qui sont utiles pour biochimiques (par exemple, tache occidentale) et les cellules biologiques (par exemple, immunostaining) essais pour surveiller l'expression de la protéine d'intérêt, il peut interférer avec la fonction de protéine dans certains cas.
    2. Sous-cloner l'ADNc de référence et de variante dans le vecteur transgénique drosophila. Utilisez le système de transgenèse à médiation C31, car cela permet d'intégrer les cDNA de référence et de variante au même endroit dans le génome45. Pour ce projet, le MOSC Drosophila Core utilise régulièrement le vecteur pGW-HA.attB46.
      REMARQUE: Si l'ADNc humain se trouve dans des vecteurs compatibles avec le système de clonage médié par recombinase (p. ex., pDONR221, pENTR221), passez à la section 2.1.4, qui explique les réactions De LR pour subcloner les CDNA en pGW-HA.attB.
      1. Si l'ADNC humain n'est pas dans un système de clonage à médiation recombinase compatible plasmide, sublimer les cDNA humains dans un vecteur d'entrée de passerelle en utilisant des techniques biologiques moléculaires standard (un exemple de tel protocole est documenté ci-dessous).
        1. Effectuer un SURplomb PCR pour introduire attB1 et attB2 bras. L'apprêt avant devrait avoir la séquence attB1 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGCAGGCTTCACC-3' suivi des 22 premiers nucléotides de l'ADNC cible. L'amorce inverse devrait avoir la séquence attB2 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3' suivi par le complément inverse des 25 derniers nucléotides de l'ADNc d'intérêt. Exclure le codon d'arrêt de l'ADNc, puis ajouter une étiquette C's'il est souhaité d'"ouvrir" un clone, ou ajouter un codon d'arrêt pour "fermer" un clone.
        2. Préparer un mélange PCR haute fidélité de 100 l l composé de 50 l de mix maître PCR haute fidélité, de 36 l d'eau distillée, de 5 L de chaque amorce avant et inversée énumérée à l'étape 2.1.2.1.1 dilué à 10 'M, et de 4 oL d'ADNc cible (150 ng/L).
        3. Effectuer PCR en utilisant le protocole de mutagénèse standard pour ajouter des bras attB1 et attB2 sur l'ADNc d'intérêt. Les conditions varient en fonction de la construction et des variantes d'intérêt.
        4. Isolez l'ADNc cible avec des bras homologiques ajoutés par électrophorèse de gel et extraction de gel. Créez 1% de gel agarose et effectuez l'électrophorèse en utilisant des méthodes standard. Accise la bande qui correspond à la taille de l'ADNc plus la longueur supplémentaire des bras homologiques. Extraire l'ADN du gel par les méthodes standard95. Des kits commerciaux d'extraction de gel sont disponibles auprès de plusieurs entreprises.
        5. Effectuer une réaction in vitro recombinase basée sur le protocole de clonage recombinase-négocié selon le système qui est utilisé.
        6. Transformez le mélange de réaction BP en cellules E. coli chimiquement compétentes. Les cellules compétentes peuvent être fabriquées à l'interne ou achetées auprès de fournisseurs commerciaux. Culture les cellules transformées pendant la nuit sur une plaque LB contenant des antibiotiques appropriés pour la sélection des colonies. Le lendemain, sélectionnez plusieurs colonies et cultivez-les dans des cultures liquides indépendantes du jour au lendemain.
        7. Isoler l'ADN des cultures du jour au lendemain grâce à la mini-préparation. Sanger séquence les clones positifs pour s'assurer que l'ADNc a la séquence correcte96. Maintenir les cellules des cultures qui sont positives pour la séquence désirée dans 25% de glycérol stocké à -80 oC.
    3. Effectuer la mutagénèse dirigée par le site pour introduire la variante d'intérêt dans le plasmide de la porte avec la référence humaine cDNA97. Un protocole détaillé pour cette méthode peut être trouvé dans le site Web du vendeur48,49. Valider la présence de la variante dans le plasmide muté via le séquençage de Sanger de l'ensemble du cadre de lecture ouverte (ORF) pour s'assurer qu'il n'y a pas de variantes supplémentaires introduites par cette étape de mutagénèse.
    4. Sublimer la référence et la variante des cDNA humains dans le plasmide des donneurs (plasmides de la passerelle avec des sites attL1 et attL2) dans le plasmide transgénique (p.p., p.g., pGW-HA.attB avec attR1 et attR2 sites) via une réaction llonase.
      REMARQUE: Il existe des vecteurs UAS C31 conçus pour le sous-clonage à base d'enzymes de restriction conventionnelle (p.p., pUAST.attB50) s'il est préférable de subcloner les CDNA humains par l'intermédiaire de méthodes d'enzymes de restriction.
    5. Sélectionnez les sites d'amarrage C31 pour intégrer les transgènes uAS-cDNA humain. Un certain nombre de sites d'amarrage ont été générés par plusieurs laboratoires et sont publiquement disponibles à partir des centres de stock50,52,53.
      REMARQUE: Puisqu'il est commode d'avoir le transgène humain sur un chromosome qui ne contient pas l'ortholog de mouche du gène d'intérêt, il est recommandé d'employer un deuxième site d'amarrage de chromosome [VK37 (stock de BDSC #24872] quand l'ortholog de mouche est sur le X , troisième, ou quatrième chromosomes, et utilisez un troisième site d'amarrage de chromosome [VK33 (stock de BDSC #24871] quand l'ortholog de mouche est sur le deuxième chromosome.
    6. Injecter uAS-humain cDNA construit dans les mouches exprimant l'intégrase C31 dans leur lignée germinale (par exemple, vas-C31, nos-C31).
      REMARQUE : La microinjection peut être effectuée en interne ou envoyée à des installations de base ou à des entités commerciales pour la transgenèse. Le protocole détaillé pour générer des mouches transgéniques peut être trouvé dans le chapitre51du livre cité.
    7. Établir des souches transgéniques stables des embryons injectés. Injecter 100 à 200 embryons par construction94. Un système de croisement représentatif pour une insertion de transgène dans un deuxième site d'amarrage chromosomique (VK37) est représenté dans la figure 1A. Consultez les livres cités54,55 pour l'information de base sur la génétique drosophila.
  2. Obtenir ou générer une ligne T2A-GAL4 qui facilite les essais fonctionnels basés sur le sauvetage (voir la figure 2 et la section 3.1).
    REMARQUE: Cette ligne servira à deux fins. Tout d'abord, la plupart des lignées T2A-GAL4 testées se comportent aussi fortes allèles LOF en fonctionnant comme un allèle de piège à gènes. Deuxièmement, les lignes T2A-GAL4 fonctionnent comme un pilote GAL4 qui permet l'expression de constructions UAS (p. ex. UAS-GFP, CDNA UAS-humain) en vertu des éléments de régulation endogènes du gène d'intérêt56,57 (figure 2A-C).
    1. Rechercher des collections d'actions publiques pour les lignes T2A-GAL4 disponibles, y compris le Drosophila Gene Disruption Project (GDP)58 dans lequel 1 000 lignes T2A-GAL4 ont été générées59. Ces souches sont actuellement disponibles à partir du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) et sont consultables à la fois par le PIB et les sites Web BDSC.
    2. Si une ligne T2A-GAL4 pour le gène de mouche d'intérêt n'est pas disponible, vérifiez si une ligne de code intronic InMIC (cassette d'intégration médiéepar Minos)est disponible pour la conversion en une ligne T2A-GAL4 à l'aide d'échange de cassettes médiées par recombinase (RMCE )60 (Figure 2A).
      REMARQUE: RMCE permet de convertir des éléments MiMIC introniques entre deux exons codants en ligne T2A-GAL4 par microinjection d'une construction de donneur (un exemple de système de croisement est indiqué à la figure 1B)ou en série de croix, comme décrit en détail57,59.
    3. Si une ligne T2A-GAL4 n'est pas disponible et qu'il n'existe pas de codage intronic MiMIC approprié, explorez la possibilité de générer une ligne T2A-GAL4 via le système CRIMIC (cassette d'intégration à médiation CRISPR)59.
      REMARQUE: Cette méthodologie utilise le clivage d'ADN négocié par CRISPR et la réparation dirigée par l'homologie (HDR) pour intégrer une cassette miMIC-like dans un intron de codage dans un gène d'intérêt.
    4. Si le gène d'intérêt n'a pas un grand intron (150 pb) ou n'a pas d'introns, essayez de frapper dans un transgène GAL4 dans le gène de la mouche avec le système CRISPR/Cas9 en utilisant HDR comme décrit20,61,62.
      REMARQUE: Si la génération d'un allele t2A-GAL4 ou GAL4 est difficile, essayez d'effectuer des expériences de sauvetage à l'aide de ces alleles préexistants ou lignes RNAi et de pilotes GAL4 omniprésents ou spécifiques aux tissus tels que décrits92 (REF).

3. Exécution de l'analyse fonctionnelle de la variante humaine de l'intérêt In Vivo dans Drosophila

REMARQUE: Effectuer une analyse basée sur le sauvetage (section 3.1) ainsi que des études de surexpression (section 3.2) à l'aide des outils recueillis ou générés à la section 2 pour évaluer les conséquences de la variante de l'intérêt in vivo dans Drosophila. Envisagez d'utiliser les deux approches, puisque les deux sont complémentaires.

  1. Effectuer des analyses fonctionnelles au moyen d'expériences basées sur le sauvetage
    note: Expériences de sauvetage hétérologues enDrosophilal'utilisation de protéines humaines détermine si la fonction moléculaire des deux gènes orthologues a été conservée sur plus de 500 millions d'années d'évolution. Ils évaluent également la fonction de la variante dans le contexte de la protéine humaine63. Bien qu'une analyse systématique de centaines de paires de gènes n'ait pas été signalée, plusieurs dizaines de gènes humains et mammifères (p. ex., souris) sont en mesure de remplacer la fonction deDrosophilaGènes13.
    1. Dans l'approche basée sur le sauvetage, déterminez d'abord s'il y a des phénotypes évidents, évolutifs et reproductibles chez les mutants LOF dans l'ortholog de mouche avant d'évaluer les fonctions des variantes.
      REMARQUE: La littérature précédente sur le gène de la mouche est un bon endroit pour la mine de données d'abord, et il peut être trouvé à l'aide de bases de données, y compris FlyBase et PubMed. D'autres bases de données telles que MARRVEL, Monarch Initiative et Gene2Funcion sont également utiles pour recueillir ces informations.
    2. Effectuer une étude globale des phénotypes corsables chez les homozygotes et les hémizygous (allèle T2A-GAL4 sur un animal déficience chromosomique défini moléculairement, surtout si l'allèle T2A-GAL4 est la première mutation à être caractérisée pour un gène spécifique. Évaluer les phénotypes tels que la létalité, la stérilité, la longévité, la morphologie (p. ex., la taille et la morphologie de l'œil) et le comportement (p. ex., cour, vol, escalade et défauts de sensibilité au bang).
      REMARQUE: S'il n'y a pas de phénotypes majeurs identifiés à partir de cet écran primaire, des phénotypes plus subtils tels que les défauts neurologiques mesurés par des enregistrements électrophysiologiques peuvent être utilisés s'ils sont hautement reproductibles et spécifiques. À titre d'exemple, les études fonctionnelles à l'aide d'électrorétinogramme (ERG) sont décrites à l'étape 3.2.3. S'il n'y a pas de décelement de phénotype évolutif, passez à la section 3.2 et effectuez l'étude fonctionnelle basée sur la surexpression.
    3. Une fois qu'un phénotype scorable est identifié dans le mutant LOF mouche, testez si l'ADNc humain de référence peut remplacer la fonction de l'ortholog de mouche en essayant d'utiliser l'ADNc humain pour sauver la ligne de mouche mutante. L'analyse phénotypique à effectuer ici dépend des résultats de l'étape 3.1.2 et sera spécifique au gène étudié.
      REMARQUE: Si l'« humanisation » du gène de la mouche est réussie, il existe maintenant une plate-forme pour comparer l'efficacité du sauvetage pour la variante d'intérêt par rapport à la contrepartie de référence. Le sauvetage vu avec l'ADNc humain de référence n'a pas besoin d'être parfait. Le sauvetage partiel du phénotype mutant de mouche utilisant un cDNA humain fournit toujours un point de référence pour effectuer des études comparatives utilisant la souche humaine variable de cDNA.
    4. À l'aide du système d'analyse choisi à l'étape 3.1.2, comparez le sauvetage observé avec l'ADNc humain de référence au sauvetage observé avec la variante de l'ADNc humain pour déterminer si la variante de l'intérêt a des conséquences sur le gène d'intérêt.
      REMARQUE: Si la variante de l'ADNc humain fonctionne moins bien que l'allèle de référence, cela suggère que la variante d'intérêt est délétère pour la fonction protéique. Si la variante et la référence ne peuvent pas être fonctionnellement distinguées, alors 1) l'allèle peut être un isomorphe (une variante qui n'affecte pas la fonction protéique) ou 2) l'analyse n'est pas assez sensible pour détecter des différences subtiles.
    5. Si la variante s'acquiesce à un allèle délétère, alors évaluez plus en détail l'expression et la localisation intracellulaire des protéines de référence et de variante d'intérêt in vivo par l'intermédiaire de la tache occidentale, de la coloration d'immunofluorescence, ou d'autres méthodes93.
      REMARQUE: Si l'ADNc UAS-humain est généré à partir d'un clone ouvert dans un vecteur pGW-HA.attB, utilisez un anticorps anti-HA pour effectuer ces essais biochimiques et cellulaires. Si le clone d'origine est un clone fermé, testez si des anticorps commerciaux contre les protéines humaines peuvent être utilisés pour ces essais. Une différence dans les niveaux d'expression et la localisation intracellulaire peut révéler comment la variante de l'intérêt affecte la fonction protéique.
  2. Effectuer l'analyse fonctionnelle par le biais d'études sur expression
    REMARQUE: La surexpression ubiquitaire ou tissulaire des ADNC humaines chez des mouches de type sauvage peut fournir des renseignements complémentaires aux expériences de sauvetage discutées à la section 3.1. Bien que les essais basés sur le sauvetage soient principalement conçus pour détecter les variantes LOF (amorphiques, hypomophiques), les essais basés sur la surexpression peuvent également révéler des variantes de gain de fonction (GOF) qui sont plus difficiles à évaluer (hypermorphiques, antimorphes, néomorphes).
    1. Sélectionnez un ensemble de pilotes GAL4 pour surexprimer les cDNA humains d'intérêt. Un certain nombre de conducteurs GAL4 omniprésents et spécifiques aux tissus et aux stades sont disponibles dans les centres publics d'actions (p. ex., BDSC), dont certains sont plus fréquemment utilisés que d'autres. D'abord se concentrer sur les conducteurs omniprésents et les phénotypes facilement décorables (létalité, stérilité, phénotypes morphologiques), puis passer à des conducteurs spécifiques aux tissus et des phénotypes plus spécifiques.
      REMARQUE : Validez l'expression des pilotes GAL4 avec une ligne de journaliste (p. ex., UAS-GFP) pour confirmer les modèles d'expression avant utilisation dans les expériences.
    2. Exprimer la référence et la variante des CDNA humains en utilisant le même conducteur dans la même condition (p. ex., température) en croisant 3 à 5 femelles vierges de la ligne GAL4 (p. ex. ey-GAL4 pour l'expression du disque imaginaire pour les yeux) avec 3 à 5 mouches mâles des lignes uAS [p. ex., UAS-TBX2 (MD) ou UAS-TBX2(p.R.R305H) pour l'exemple indiqué à la section 4.2 dans une seule fiole.
      1. Transférer les croix tous les 2-3 jours pour avoir de nombreux animaux qui s'élit d'une seule croix.
    3. Examiner la progéniture et détecter les différences entre les souches de référence et les souches variables (p. ex., la morphologie des yeux) au microscope à dissection. Imagez les mouches à l'aide d'une caméra fixée à un microscope à dissection pour documenter le phénotype.
      REMARQUE: Si un phénotype n'est vu que dans la référence mais pas dans la ligne de variante, alors la variante peut être un allèle amorphe ou hypomorphe fort. Si le phénotype est vu dans les deux génotypes mais la référence cause un défaut plus fort, alors la variante peut être un allèle hypomorphique doux-à-faible. Si la référence ne montre pas un phénotype ou ne présente qu'un phénotype faible, mais la variante montre un défaut fort, alors la variante peut être un allèle GOF.
    4. Si un phénotype n'est pas observé dans des conditions de culture standard (RT ou à 25 oC), placez les croix à des températures différentes allant de 18 à 29 oC, puisque le système UAS/GAL4 est connu pour être sensible à la température64,65). Typiquement, l'expression des transgènes UAS est plus élevée à des températures plus élevées.
  3. Effectuer d'autres études fonctionnelles liées aux gènes et aux protéines d'intérêt.
    note: En plus d'examiner les défauts généraux, un système d'analyse peut être sélectionné pour sonder les fonctions moléculaires du gène et de la variante. Dans un exemple discuté dans les résultats représentatifs (TBX2cas), les enregistrements ERG ont été utilisés pour déterminer les effets de la variante sur la fonction photorécepteur, puisque le gène de mouche d'intérêt (bifid) avait fait l'objet d'études approfondies dans le contexte du développement du système visuel. Protocoles détaillés pour ERG enDrosophilapeuvent être trouvés comme précédemment publié66,67,68.
    1. Générer des mouches pour tester les défauts fonctionnels dans le système visuel. Croisez les femelles vierges de la ligne Rhodopsin e (Rh1)-GAL4 aux mâles avec référence ou variante UAS-humain cDNA transgenes pour exprimer les protéines humaines d'intérêt dans les photorécepteurs R1-R6.
      REMARQUE: Croisez 3-5 femelles vierges à 3-5 mouches mâles dans une seule fiole et transférez les croix tous les 2-3 jours pour avoir beaucoup d'animaux s'éfermant d'une seule croix. Toutes les croix doivent être conservées dans un incubateur réglé à la température expérimentale pour obtenir des résultats cohérents.
    2. Une fois que les mouches commencent à s'éfermer (à 25 oC, 10 jours après la mise en place de la croix initiale), recueillir la progéniture (Rh1-GAL4/ UAS-human cDNA/ ') dans des flacons frais et les remettre dans l'incubateur réglé à la température expérimentale pendant 3 jours supplémentaires pour que le système visuel mûrisse.
      REMARQUE: Bien qu'ERG puisse être effectué sur des mouches de 1 à 2 jours, les mouches nouvellement fermées peuvent avoir de grandes fluctuations dans leur signal ERG. S'il est souhaitable d'examiner un phénotype dépendant de l'âge, ces mouches peuvent être vieillies pendant plusieurs semaines tant qu'elles sont régulièrement (p. ex., tous les 5 jours) transférées dans une nouvelle fiole pour éviter de se noyer dans les aliments humides.
    3. Préparer les mouches à l'enregistrement ERG en anesthésiant d'abord les mouches à l'aide du CO2 ou en les plaçant dans une fiole sur la glace. Collez délicatement un côté de la mouche sur une lame de microscope en verre pour les immobiliser.
      REMARQUE: Les mouches de référence et de variante s'ils peuvent être collées sur une seule diapositive. Placez toutes les mouches dans environ la même orientation avec un œil étant accessible pour l'électrode d'enregistrement. Veillez à ne pas obtenir de la colle sur l'œil et de laisser le proboscis libre.
    4. Préparer l'enregistrement et les électrodes de référence. Placer un capillaire en verre de 1,2 mm dans un pulleur à aiguilles et activer. Casser le tube capillaire pour obtenir deux électrodes acffilées. Les électrodes qui en résultent doivent être creuses et avoir des diamètres finaux de 0,5 mm.
    5. Remplissez les capillaires d'une solution saline (100 mM NaCl), en vous assurant qu'il n'y a pas de bulles d'air. Faites glisser les capillaires de verre sur les électrodes de fil argenté (à la fois l'électrode d'enregistrement et l'électrode de référence, voir figure 4) et fixer les capillaires en place.
    6. Configurer le stimulateur et l'amplificateur. Une mise en place détaillée peut être trouvée dans Lauwers, et al.67. La mise en place de l'UDN Drosophila MOSC se compose d'équipements répertoriés dans la section matériaux.
      1. Définir l'amplificateur à 0,1 Hz filtre à haute passe, 300 Hz filtre à faible passage, et 100 gain.
      2. Définir le stimulateur à 1 s période, 500 ms largeur d'impulsion, 500 ms de retard d'impulsion, mode de course, et 7 Ampli.
      3. Préparer la source de lumière pour la photostimulation. Utilisez une source de lumière halogène pour activer les photorécepteurs de mouche.
      4. Préparer le logiciel d'enregistrement sur un ordinateur connecté à la configuration ERG. Créez un protocole de stimulation avec le modèle d'acquisition «événements de longueur fixe» et la durée de 20 s.
    7. Acclimater les mouches pour compléter l'obscurité avant d'initier les enregistrements ERG. Placez les mouches dans l'obscurité complète pendant au moins 10 minutes avant de commencer l'expérience.
      REMARQUE: Comme les mouches ne peuvent pas détecter la lumière rouge, utilisez une source de lumière rouge pendant la période d'accouturation sombre.
    8. Placez la glissière contenant les mouches sur l'appareil d'enregistrement et déplacez les micromanipulateurs transportant la référence et enregistrant les électrodes à un point proche de la mouche d'intérêt sur la glissière. Surveillez la pointe de l'électrode et placez soigneusement l'électrode de référence dans le thorax de la mouche (pénétrer la cuticule). Une fois que l'électrode de référence est insérée de façon stable, placez l'électrode d'enregistrement à la surface de l'œil.
      REMARQUE: La position exacte de cette électrode de référence n'a pas d'impact majeur sur le signal ERG. L'électrode d'enregistrement doit être placée à la surface de l'œil puisque l'ERG est un enregistrement potentiel sur le terrain plutôt qu'un enregistrement intracellulaire. La bonne quantité de pression appliquée à l'électrode d'enregistrement provoque une petite fossette sans pénétrer l'œil.
    9. Éteignez toutes les lumières pendant 3 min pour acclimater les mouches à l'environnement sombre.
    10. Configurez le logiciel d'enregistrement et commencez l'enregistrement du signal. Si vous utilisez une source de lumière halogène avec obturateur manuel, allumez la source de lumière avec l'obturateur fermé. Commencez à enregistrer le signal.
    11. Exposez les yeux de mouche à la lumière en ouvrant et fermant l'obturateur tous les 1 s pour la durée de 20 s d'une seule course.
      REMARQUE: L'on/off de la source de lumière halogène peut être contrôlé manuellement ou programmé pour devenir automatisé à l'aide d'une source de lumière LED blanche. Un ERG plus robuste et fiable peut être obtenu en utilisant une source de lumière halogène par rapport à une LED de lumière blanche, probablement due au spectre de lumière plus large émis par la source de lumière halogène.
    12. Enregistrez les ERG de toutes les mouches montées sur la glissière de verre. Effectuer des ERG à partir de 15 mouches par génotype par condition.
      REMARQUE: Certains paramètres qui peuvent être modifiés pour trouver une condition qui présente des différences solides entre les cDNDe de référence et les variantes peuvent inclure la température, l'âge ou les conditions environnementales (p. ex., élevée dans un cycle clair-obscurité ou une lumière/obscurité constante).
    13. Effectuer l'analyse des données : comparez les ERG à partir de la référence, de la variante et des contrôles pour déterminer s'il y a des différences. Évaluer les données de l'ERG pour les changements dans les transactions, la dépolorisation, les non-transitoires et la repolarisation69 (figure 4B).
      REMARQUE: La dépolarisation et la repolarisation reflètent l'activation et l'inactivation de la cascade de phototransduction dans les photorécepteurs, tandis que les sur-transitoires sont des mesures des activités des cellules post-synaptiques qui reçoivent des signaux de les photorécepteurs. L'amplitude diminuée et la cinétique altérée de la repolarisation sont souvent associées aux défauts avec la fonction et la santé de photorécepteur, alors que des défauts dans les sur- et hors-transitoires sont trouvés dans les mutants avec le développement, la fonction, ou l'entretien défectueux de synapse 70.
    14. Après identification des différences dans les phénotypes ERG avec surexpression de référence par rapport à la variante cDNA humaine, déterminer si ce phénotype électrophysiologique est associé à des défauts structurels et ultrastructuraldans les photorécepteurs et leur synapses en effectuant une analyse histologique et une microscopie électronique de transmission.
      REMARQUE: D'autres discussions sur l'interprétation des défauts de l'ERG et l'analyse structurale/ultrastructurale ont déjà été décrites69.

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Representative Results

Étude fonctionnelle de la variante de de novo Missense dans EBF3 liée aux phénotypes neurodéveloppementaux
Chez un homme de 7 ans présentant des phénotypes neurodéveloppementaux, y compris l'hypotonie, l'ataxie, le retard de développement global et le trouble de la parole expressif, les médecins et les généticiens humains du National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) a identifié une variante de de novo missense (p.R.R163Q) dans EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, un gène qui code un facteur de transcription de la famille COE (Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor). Ce cas a été soumis au MOSC de l'UDN en mars 2016 pour des études fonctionnelles. Pour évaluer si ce gène était un bon candidat pour ce cas, le MOSC a rassemblé l'information génétique et génomique humaine de l'OMIM, de ClinVar, de l'ExAC (maintenant étendu au gnomAD), de Geno2MP, de DGV, et de DECIPHER. En outre, les gènes orthologues chez les principales espèces de MO ont été identifiés à l'aide de l'outil DIOPT. L'expression génique et l'information phénotypique provenant de bases de données INDIVIDUELLES (p. ex. Wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI) ont ensuite été obtenues. Les analyses informatiques effectuées pour EBF3 et d'autres études pionnières dans le MOSC UDN ont constitué la base pour le développement ultérieur de la ressource MARRVEL30.

L'information recueillie à l'aide de cette méthode indiquait que l'EBF3 n'était associé à aucune maladie génétique humaine connue au moment de l'analyse, et il a été conclu que la variante p.R163Q était un bon candidat basé sur les renseignements suivants. (1) Cette variante n'avait pas été précédemment rapportée dans les bases de données de population témoin (ExAC) et la base de données de population de maladie (Geno2MP), indiquant qu'il s'agit d'une variante très rare. (2) Basé sur ExAC, le score de pLI (probabilité d'intolérance de LOF) de ce gène est 1.00 (les scores de pLI vont de 0.00-1.00). Ceci indique qu'il y a une pression sélective contre des variantes de LOF dans ce gène dans la population générale et suggère que l'haploinsufficiency de ce gène puisse causer la maladie. Pour plus d'informations sur le score pLI et son interprétation, un article de tutoriel MARRVEL d'accompagnement dans JoVE31 et des articles connexes fournissent des détails30,71.

La variante p.R163Q a également été considérée comme un bon candidat parce que (3) elle est située dans le domaine de liaison d'ADN conservé en évolution de cette protéine, suggérant qu'elle peut affecter la liaison d'ADN ou d'autres fonctions de protéine. (4) Le résidu p.R.R163 est conservé de façon évolutive de C. elegans et Drosophila à l'homme, ce qui suggère qu'il peut être essentiel pour les protéines fonctionnelles à travers les espèces. (5) Les orthologs d'EBF3 ont été impliqués dans le développement neuronal dans le MO72 multiple comprenant C. elegans73, Drosophila74, Xenopus75,et les souris76. (6) Pendant le développement du cerveau chez la souris, Ebf3 a été montré pour fonctionner en aval d'Arx ( Homebox Aristaless-connexes)77, un gène associé à plusieurs épilepsie et incapacité intellectuelle syndromes chez l'homme78. Par conséquent, ces données ensemble suggèrent que L'EBF3 est fortement susceptible d'être crucial pour le neurodéveloppement humain et que la variante p.R163Q peut avoir des conséquences fonctionnelles.

Pour évaluer si p.R163Q affecte la fonction EBF3, une ligne T2A-GAL4 pour noeud (kn; l'ortholog de mouche de l'homme EBF379) a été générée via RMCE d'un codage intronic MiMIC insertion15. La ligne T2A-GAL4 de kn est récessive mortelle et n'a pas réussi à compléter la létalité d'un allèle de kn classique (kncol-1) ainsi que l'insuffisance moléculairement définie qui couvre kn [Df(2R)BSC429]80 . Les modèles d'expression du GAL4 ont également reflété des modèles précédemment rapportés d'expression de kn dans le cerveau aussi bien que dans le disque imaginal d'aile15. Des mouches transgéniques de UAS ont alors été produites pour permettre l'expression de l'ADNC EBF3 humain de référence et de variante ainsi que de l'ADNC de mouche sauvage-type de kn. Les trois protéines ont été étiquetées avec une étiquette C-terminal 3xHA. Fait important, uAS sauvage de type mouche kn (kn)ou de référence humaine EBF3 (EBF3)transgènes sauvé la létalité de knT2A-GAL4/Df(2R)BSC429 dans une mesure similaire ( Figure 3C, panneau gauche)81.

En revanche, UAS-humain EBF3 transgène avec la variante p.R163Q (EBF3p.R163Q) n'a pas été en mesure de sauver ce mutant, ce qui suggère que la variante p.R163Q affecte la fonction EBF3 in vivo15. Fait intéressant, lorsqu'elle a été évaluée à l'aide d'un anticorps anti-HA, la protéine EBF3p.R.R163Q a été exprimée avec succès dans les tissus de la mouche, et ses niveaux et sa localisation subcellulaire (principalement nucléaire) étaient indiscernables de ceux de l'EBF3et Kn-. Ceci suggère que la variante ne cause pas un phénotype de LOF dû à l'instabilité de protéine ou à la mauvaise localisation. Pour évaluer davantage si la variante p.R163Q a affecté la fonction d'activation transcriptionnelle d'EBF3, un résultat d'exécution de journaliste basé sur la luciferase a été effectué dans les cellules HEK29315. Cette expérience dans les cellules humaines cultivées a indiqué que la variante EBF3p.R.R163Q n'a pas activé la transcription des constructions de journaliste, soutenant le modèle de LOF obtenu des expériences de Drosophila.

Parallèlement aux études expérimentales, des collaborations avec des médecins, des généticiens humains et des conseillers génétiques de BCM ont mené à l'identification de deux autres personnes présentant des symptômes similaires. Un patient a porté la variante identique de p.R163Q, et un autre a porté une variante de mauvais sens qui a affecté le même résidu (p.R163L). La variante p.R.R163L n'a pas non plus réussi à sauver le mutant de kn de mouche93 suggérant que cet allèle ait également affecté la fonction d'EBF3. Fait intéressant, ce travail a été publié dos à dos avec deux études indépendantes de génétique humaine qui ont rapporté d'autres individus avec de novo missense, non-sens, frameshift, et les variantes épissage dans EBF3 liés à des variantes similaires phénotypes neurodéveloppementaux82,83. Par la suite, trois autres articles ont été publiés faisant état de cas supplémentaires de variantes de novo EBF3 et de suppression du numéro de copie84,85,86. Ce nouveau syndrome neurodéveloppemental est maintenant connu sous le nom d'hypotonie, d'ataxie et de syndrome de développement retardé (HADDS, MIM #617330) dans l'héritage mendélien en ligne chez l'homme (OMIM, une base de données faisant autorité pour les relations génotype-phénotype chez l'homme).

Étude fonctionnelle de la variante de missense héritée dominante dans TBX2 lié à un trouble du développement cardiovasculaire et squelettique syndromic
Dans une petite famille affectée avec des spectres de chevauchement du dysmorphism craniofacial, des anomalies cardiaques, de la malformation squelettique, de l'insuffisance immunitaire, des anomalies endocriniennes, et de l'affaiblissement développemental, le site clinique de duke d'UDN a identifié une variante de mauvais sens (p.R20Q) dans TBX2 qui sépare avec les phénotypes de la maladie87. Trois (fils, fille, mère) des quatre membres de la famille sont affectés par cette condition, et le fils a exhibé le phénotype le plus grave. Cliniquement, il a rencontré un diagnostic de « syndrome complet de DiGeorge », une condition souvent provoquée par l'haploinsufficiency de TBX1. Bien qu'il n'y ait eu aucune mutation identifiée dans TBX1 dans cette famille, les cliniciens et les généticiens humains se sont concentrés sur une variante dans TBX2, puisque des études précédentes chez les souris ont montré que ces gènes ont des fonctions qui se chevauchent au cours du développement88 . TBX1 et TBX2 appartiennent tous deux à la famille de facteurs de transcription de T-box (TBX) qui peuvent agir comme répresseurs transcriptionnels ainsi que des activateurs selon le contexte.

Auparavant, des variantes dans 12 des 17 membres des gènes de la famille TBX étaient liées à des maladies humaines. Le MOSC a décidé de poursuivre expérimentalement cette variante sur la base des informations suivantes recueillies par marrVEL et d'autres ressources. (1) Cette variante n'a été rapportée qu'une seule fois dans une cohorte de 90 000 personnes « témoins » en gnomAD (cette variante a été filtrée dans une vue par défaut, probablement en raison de faibles lectures de couverture). Considérant la présentation phénotypique plus douce de la mère, ceci peut encore être considéré comme variante rare qui peut être responsable des phénotypes de la maladie. (2) Les scores de pLI de TBX2 dans ExAC/gnomAD sont 0.96/0.99, qui est élevé (maximum 1.00). En outre, le score LOF o/e (observé/attendu) dans le gnomAD est de 0,05 (seulement 1/18,6 variante prévue de LOF est observée dans le gnomAD). Ces nombres suggèrent que des variantes de LOF dans ce gène sont sélectionnées contre dans la population générale.

En outre, (3) le p.R20 est évolutivement conservé de C. elegans et Drosophila à l'homme, ce qui suggère que cela peut être un résidu important pour la fonction TBX2. (4) Plusieurs programmes prédisent que la variante est probablement dommageable (polyphen: peut-être /probablement dommageable, SIFT: délétère, Score CADD: 24.4, score REVEL: 0.5). (5) Les mutants MO présentent des défauts dans les tissus affectés chez les patients (p. ex., les souris knock-out présentant des défauts dans le système cardiovasculaire, les systèmes digestifs/alimentaires, le craniofacial, les membres/chiffre). Ainsi, avec les liens biologiques entre TBX1 et TBX2 et les liens phénotypiques entre ces patients et le syndrome de DiGeorge, il était optimal d'effectuer des études fonctionnelles des variantes de ce gène utilisant Drosophila.

Pour évaluer si la variante p.R20Q affecte la fonction TBX2, une ligne T2A-GAL4 en bifide (bi; l'ortholog Drosophila de TBX2humain ), a été générée via RMCE d'un codage intronic MiMIC (Figure 2)87. Cet allèle, biT2A-GAL4, était pupal récessif mortel et se comporte comme un mutant LOF forte, semblable aux allèles lOF bi précédemment signalés (par exemple, biD2, biD4; Figure 2 E). La létalité de ces allèles bi classiques et nouvellement générés a été sauvée par une construction de sauvetage génomique de 80 kb transportant l'ensemble du bi locus, ce qui indique que ces réactifs sont en effet des allèles LOF propres. Le modèle d'expression de GAL4 dans la ligne biT2A-GAL4 correspondait bien aux modèles précédemment rapportés de bi expression dans plusieurs tissus, y compris dans le disque imaginaire d'aile (Figure 2D).

En parallèle, des lignes uAS-transgéniques pour TBX2 portant les séquences de référence ou de variante (p.R20Q) ont été générées. Malheureusement, ni l'un ni l'autre transgène n'a pu sauver la létalité de la ligne biT2A-GAL4. Fait important, un transgène UAS-bi mouche de type sauvage n'a pas non plus réussi à sauver l'allèle biT2A-GAL4, probablement en raison de la sensibilité à la posologie de ce gène. En effet, la surexpression de UAS-biet de UAS-TBX2 a causé un certain degré de létalité lorsqu'elle est surexprimée chez un animal de type sauvage. Cet effet toxique de la surexpression bi/TBX2 a été utilisé comme analyse fonctionnelle pour évaluer si la variante p.R20Q peut affecter la fonction TBX2. Puisque le gène bi de Drosophila a été étudié intensivement dans le contexte du système visuel [le gène est également connu sous le nom d'aveugle d'optomotor ( omb)], les phénotypes liés au système visuel ont été étudiés intensivement. Lorsque la référence TBX2 a été exprimée à l'aide d'un pilote ey-GAL4 qui exprime des transgènes UAS dans l'œil et des parties du cerveau pertinentes pour le système visuel, la létalité de 85 % (figure3C, panneau droit) et significative réduction de la taille des yeux (figure 4B) ont été observées. Ce phénotype était plus fort que le phénotype observé quand un transgène uAS-bi de mouche sauvage-type a été exprimé, suggérant que le TBX2 humain soit plus préjudiciable à la mouche une fois surexprimé.

Fait intéressant, le p.R20Q TBX2 a été moins puissant pour causer la létalité (figure3C, panneau droit) et en induisant un petit phénotype oculaire (figure 4B) en utilisant le même conducteur dans l'état identique87, suggérant que la variante affecte la fonction protéique. En outre, la fonction des photorécepteurs surexprimant la référence et la variante TBX2 à l'aide d'un autre pilote GAL4(Rh1-GAL4) qui exprime spécifiquement les transgènes UAS dans les photorécepteurs R1-R6, a révélé que la variante TBX2 présentait un phénotype ERG beaucoup plus doux par rapport à la référence TBX2 (Figure 4B)87. Fait intéressant, la plupart de la protéine p.R20Q TBX2 a encore été trouvée dans le noyau, semblable à la protéine de référence, suggérant que la variante n'a pas affecté la localisation nucléaire. Un jeu d'estomatéur de répression à base de luciférase dans les cellules HEK293T a montré que le p.R20Q n'était pas en mesure de réprimer efficacement la transcription d'une construction de journaliste avec des sites palindromic T-box87. En outre, des diminutions des niveaux de protéines de TBX2p.R20Q ont été observées par rapport àTBX2, suggérant que la variante peut affecter la traduction ou la stabilité des protéines de TBX2, qui à son tour affecte son abondance au sein d'une cellule.

D'autres patients présentant des variantes rares dans TBX2 ont été identifiés par des cliniciens au site clinique de Duke d'UDN en parallèle à ces études expérimentales.  Un garçon de 8 ans avec un missense de novo (p.R305H) variante d'une famille indépendante a montré beaucoup de caractéristiques trouvées dans la première famille87. D'autres études fonctionnelles dans Drosophila et les lignées cellulaires humaines ont indiqué que la variante p.R305H affecte également la fonction TBX2 et les niveaux de protéines, suggérant fortement que les défauts de ce gène sous-tendent probablement de nombreux phénotypes trouvés dans les deux familles. Ce désordre a été récemment organisé en tant qu'« anomalies vertébrales et dysfonctionnement endocrinien et t de cellules variables » (VETD, MIM #618223) dans OMIM. L'identification d'individus additionnels avec des variantes préjudiciables dans TBX2 avec des phénotypes se chevauchant est critique pour comprendre le spectre complet des relations de génotype-phénotype pour ce gène dans la maladie humaine.

Figure 1
Figure 1 : Système d'injection et de croisement pour générer des lignes UAS-human cDNA et T2A-GAL4. (A) Génération de transgènes uAS-human cDNA par microinjections et croisements. Le schéma de croisement pour intégrer les transgènes dans un deuxième site d'amarrage chromosomique (VK37) à l'aide de mouches mâles de la première et de la deuxième génération est montré à titre d'exemple. Lors de l'injection de la construction transgénique cDNA de c31 (pGW-HA.attB) dans les premiers embryons qui contiennent une source germinale d'intégrase C31 (étiquetée avec 3xP3-GFP et 3xP3-RFP) et VK37 site d'amarrage [étiqueté avec un jaune' (y' ) marqueur], les événements transgéniques peuventêtre suivis avec le minigène blanc de la maladie qui est présent dans le vecteur transgénique. Il est recommandé de croiser l'intégrase C31 en sélectionnant contre les mouches avec GFP et DP. Le stock stable final peut être maintenu en tant qu'homozygotes ou comme stock équilibré si le chromosome porte une mutation mortelle/stérile de coup de deuxième emplacement. La présence de mutations létales/stériles du deuxième site sur une construction transgénique n'affecte généralement pas les résultats des études fonctionnelles tant que ces transgènes sont utilisés dans un état hétérozygote (figure 3). (B) Génération de lignes T2A-GAL4 par microinjection et croisements. Le schéma de croisement pour convertir une deuxième insertion miMIC de chromosome dans un élément T2A-GAL4 est montré comme exemple. En micro-injectant un vecteur d'expression pour l'intégrase C31 et le vecteur RMCE pour T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70, un cadre de lecture approprié pour le MiMIC d'intérêt est sélectionné. Voir les documents suivants pour les détails57,59 en embryons portant un MiMIC dans un intron de codage dans le gène d'intérêt, on peut convertir le MiMIC original en une ligne T2A-GAL4. Figure 2 A montre un diagramme schématique de la conversion RMCE. L'événement de conversion peut être sélectionné par le dépistage par rapport au marqueur ydans la cassette MiMIC60d'origine. Étant donné que RMCE peut se produire dans deux directions, seulement 50% de l'événement de conversion réussie conduit à la production réussie de GAL4, qui peut être détecté par un journaliste UAS-GFP transgène dans la prochaine génération. Le stock stable final peut être conservé en tant qu'homozygotes ou en tant que stock équilibré si le LOF du gène est mortel/stérile. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Conversion d'éléments MiMIC en lignes T2A-GAL4 via RMCE. (A) l'intégrase C31 facilite la recombinaison entre les deux sites attP à la mouche (en haut) et deux sites attB flanquant une cassette T2A-GAL4 montrée comme vecteur circulaire (en bas). (B) Les événements RMCE réussis conduisent à la perte d'un marqueur sélectionnable (jaune)et à l'insertion de la cassette T2A-GAL4 dans la même orientation du gène d'intérêt. Étant donné que l'événement RMCE peut se produire en deux orientations, seulement 50% de la réaction RMCE donne un produit désiré. Un produit RMCE inséré dans l'orientation opposée ne fonctionnera pas comme un allèle de gène-piège ou gal4 d'expression. La directionnalité de la construction doit être confirmée par le séquençage de Sanger. (C) Transcription (en haut) et traduction (en bas) du gène d'intérêt conduit à la génération d'un ARNm tronqué et de protéines en raison du signal polyA présent à la fin 3' de la cassette T2A-GAL4. Le T2A est un signal de saut de ribosome, qui permet au ribosome d'arrêter et de relancer la traduction après ce signal. Ceci est utilisé pour générer un élément GAL4 qui n'est pas covalentement attaché au produit génétique tronqué d'intérêt. Le GAL4 entrera dans le noyau et facilitera la transcription des transgènes qui sont sous contrôle des éléments uAS. UAS-GFP peut être utilisé comme un journaliste d'expression génique, et UAS-adnuçat humain peut être utilisé pour des expériences de sauvetage via le gène "humanisation". (D) Montré est un exemple d'un élément T2A-GAL4 dans l'expression bi conduite de UAS-GFP (en haut). Ce modèle d'expression ressemble à une ligne de piège d'exhausteur précédemment générée pour le même gène (biomb-GAL4; bas). (E) Comparaison de l'allèle T2A-GAL4 de bi avec des allèles LOF bi précédemment rapportés. Ce chiffre a été adopté et modifié à partir des publications précédentes57,87. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse fonctionnelle des variantes humaines à l'aide d'études basées sur le sauvetage (à gauche) et surexpression (à droite). (A) (panneau gauche) : La fonction des variantes EBF3 a été évaluée à l'aide d'une analyse basée sur le sauvetage de l'allèle LOF de noeud de mouche (kn) mettant l'accent sur la létalité/viabilité; (panneau droit) : la fonction des variantes de TBX2 a été évaluée en effectuant une surexpression des transgènes TBX2 humains chez les mouches de type sauvage, en mettant l'accent sur la létalité/viabilité, la morphologie oculaire et les phénotypes d'électrophysiologie (figure 4) . (B) Des schémas de croisement pour obtenir les mouches à tester dans les études fonctionnelles. Il est conseillé de toujours utiliser un élément UAS neutre (par exemple, UAS-lacZ, UAS-GFP) comme une expérience de contrôle. (C) Résultats représentatifs d'études fonctionnelles des variantes EBF3p.R.R.R.R.R.R.R.R.R20Q, respectivement, ainsi que des expériences de contrôle appropriées qui sont nécessaires pour interpréter les résultats. Les deux études d'analyse basée sur le sauvetage et les études de surexpression révèlent que les variantes se comportent comme des allèles amorphes ou hypomorphes. Les données sur la létalité/viabilité présentées ici sont basées sur des données expérimentales présentées dans les publications précédentes15,87. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Analyse fonctionnelle d'une variante rare de mauvais sens dans TBX2 humain basé sur la morphologie d'oeil et l'électrorétinogramme dans Drosophila. (A) Une image schématique montrant le placement typique des électrodes d'enregistrement et de référence sur l'œil de mouche, avec un enregistrement représentatif d'électrorétinogramme avec quatre composants principaux (sur-transitoire, dépolarisation, hors-transitoire, repolarisation). (B) Variante TBX2 (p.R20Q) fonctionne comme un allèle LOF partiel basé sur des études de surexpression dans l'œil de mouche en utilisant des pilotes GAL4 spécifiques au système visuel (ey-GAL4 et Rh1-GAL4). Ceci a prouvé que la référence TBX2 a causé un phénotype morphologique et électrophysiologique fort comparé à la protéine de variante. (Top panels): une réduction sévère de la taille des yeux est observée lors de la surexpression de UAS-TBX2avec ey-GAL4. UAS-TBX2p.R20Q. Entraîné avec ey-GAL4 provoque également un œil plus petit, mais le phénotype est beaucoup plus doux. (Panneaux de fond) : lorsque uAS-TBX2est exprimé dans les photorécepteurs R1-R6 de base utilisant Rh1-GAL4, il y a une perte de sur et hors-transitoires, une dépolarisation réduite, et une dépolarisation prolongée anormale grande après le phénotype potentiel (PDA), qui n'est pas vu dans les mouches de contrôle. Ces phénotypes ne sont pas aussi graves que lorsque UAS-TBX2p.R20Q est exprimé en utilisant le même Rh1-GAL4. Ce chiffre a été adopté et modifié à partir des publications précédentes69,87. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

objet outil Url
Fonction variable
algorithmes de prédiction
PolyPhen-2
tamiser
Cadd
PROVEAN (EN)
MutationTaster
se délecter
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
Rare et non diagnostiqué
recherche sur les maladies
Consortiums
Udn
RDMM (RDMM)
L'IRUD
SOLVE-RD (EN)
AFGN (En)
https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
Base de données intégrative pour
humain et modèle
Informations sur l'organisme
MARRVEL (EN)
Initiative Monarch
Gene2Function (en)
Phénologs
http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
Génétique humaine et
Bases de données en génomique
Omim
ClinVar ClinVar
ExAC (En)
gnomAD (gnomAD)
GenoMP (GénoMP)
DGV (En anglais)
décoder
https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
Outil d'identification Ortholog DIOPT DIOPT https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Organisme modèle
Bases de données et biomédecine
Recherche de littérature
WormBase (C elegans)
FlyBase (Drosophila)
ZFIN (Zebrafish)
MGI (Souris)
Pubmed
https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Génétique et protéines
bases de données d'interaction
ficelle
brume
https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Structure protéique
bases de données et
outils de modélisation
WWPBD (en anglais)
MODÈLE SUISSE
modeleur
Phyre2
http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Matchmaking patient
Plates-formes
Échange de matchmaker
GeneMatcher (en)
Archives AGHA
boîte
décoder
MyGene2 (en)
Phénomé central
http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
Transcription humaine
annotation et cDNA
informations clone
Collection de gènes mammifères
Ensembl
Refseq (En)
https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tableau 1 : Ressources en ligne liées à ce protocole.

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Discussion

Les études expérimentales utilisant le melanogaster de Drosophila fournissent un système d'ascompte robuste pour évaluer les conséquences des variantes humaines maladie-associées. Cela est dû à l'ampleur des connaissances et des divers outils génétiques qui ont été générés par de nombreux chercheurs dans le domaine de la mouche au cours du siècle dernier89. Tout comme tout autre système expérimental, cependant, il est important de reconnaître les mises en garde et les limites qui existent.

Mises en garde associées à l'exploration de données
Bien que la première étape de ce protocole consiste à extraire des bases de données pour obtenir de l'information relative à un gène d'intérêt, il est important de ne l'utiliser que comme point de départ. Par exemple, bien que dans la prédiction silico de la fonction variante fournit des informations précieuses, ces données doivent toujours être interprétées avec prudence. Il y a quelques cas dans lesquels tous les algorithmes principaux prédisent qu'une variante humaine est bénigne, pourtant les études fonctionnelles dans Drosophila ont clairement démontré la nature préjudiciable de telle variante24. De même, bien que les interactions protéines-protéines, la coexpression et les données de modélisation structurelle soient toutes des informations perspicaces, il peut y avoir des informations pseudo-positives et pseudo-négatives présentes dans ces grands ensembles de données -omics. Par exemple, certaines des interactions protéines-protéines précédemment identifiées ou prévues peuvent être artificielles ou seulement observées dans certains types de cellules et de tissus.

En outre, il peut y avoir de nombreuses interactions fausses négatives non capturées dans ces ensembles de données, puisque certaines interactions protéines-protéines sont transitoires (p. ex., interactions enzyme-substrat). La validation expérimentale est essentielle pour démontrer que certains gènes ou protéines interagissent génétiquement ou physiquement in vivo dans le contexte biologique d'intérêt. De même, les structures prévues sur la base de la modélisation homologie devraient être traitées comme un modèle plutôt que comme une structure résolue. Bien que cette information puisse être utile s'il est constaté qu'un acide aminé d'intérêt est présent dans une partie structurellement importante de la protéine, les données négatives n'excluent pas la possibilité que la variante puisse être dommageable. Enfin, certaines des informations de génotype-phénotype précédemment rapportées devraient également être traitées avec prudence, puisque certaines informations archivées dans les bases de données publiques peuvent ne pas être exactes. Par exemple, certaines informations contenues dans les bases de données MO sont basées sur des expériences qui ont été bien contrôlées et exécutées rigoureusement, tandis que d'autres peuvent provenir d'un document grand écran sans autres études de suivi et contrôles rigoureux.

Expériences d'« humanisation » utilisant la stratégie T2A-GAL4 pas toujours réussies
Bien que les études fonctionnelles basées sur le sauvetage et la surexpression utilisant des CDNA humaines permettent l'évaluation des variantes dans le contexte de la protéine humaine, cette approche n'est pas toujours réussie. Si un aDNc humain de référence ne peut pas sauver le phénotype mutant de mouche, il y a deux explications probables. La première possibilité est que la protéine humaine n'est pas fonctionnelle ou a considérablement réduit l'activité dans le contexte d'une cellule volante. Cela peut être dû à 1) réduction de l'expression des protéines, la stabilité, l'activité et / ou la localisation ou 2) un manque de compatibilité avec les protéines de mouche qui fonctionnent dans un complexe multi-protéines. Étant donné que le système UAS/GAL4 est sensible à la température, les mouches peuvent être soulevées à une température relativement élevée (p. ex., 29 oC) pour voir la possibilité d'un sauvetage dans cet état. En outre, une construction d'ADNc de vol UAS-vol et transgène comme un contrôle positif peut être produite. Si la variante d'intérêt affecte un acide aminé conservé, la variante analogue peut être introduite dans l'ADNc de mouche pour l'étude fonctionnelle de la variante dans le contexte de l'ortholog de mouche. Bien que cela ne soit pas nécessaire, il aide grandement l'étude dans les cas où l'utilisation de lignées transgéniques de l'ADNc humain donne des résultats négatifs ou non concluants (Figure 3).

La deuxième possibilité est que l'expression de la protéine humaine provoque une certaine toxicité au niveau cellulaire ou de l'organisme. Cela peut être dû à l'antimorphe (p. ex., agissant comme protéine négative dominante), hypermorphe (p. ex., trop d'activité) ou néomorphique (p. ex., gain d'une nouvelle fonction toxique telle que l'agrégation de protéines qui n'est pas toujours liée à la fonction endogène du gène de intérêt) effets. Dans ce cas, le fait de maintenir les mouches à basse température (p. ex., 18 oC) peut atténuer certains de ces problèmes. Enfin, il existe certains scénarios dans lesquels la surexpression d'un cDNA de mouche peut ne pas sauver la mouche T2A-GAL4 ligne comme on le voit dans l'exemple TBX2, probablement en raison de la dépendance à la posologie trict du produit génique. Pour éviter la surexpression d'une protéine d'intérêt, le gène de la mouche d'intérêt peut être modifié directement via CRISPR, une construction de sauvetage génomique peut être conçu qui contient la variante d'intérêt, ou des expériences de sauvetage peuvent être effectuées à l'aide d'un Allèle LOF21. Pour les petits gènes, « humaniser » la construction de sauvetage génomique de mouche peut être considérée pour tester des variantes humaines qui affectent les acides aminés non conservés24. En résumé, d'autres stratégies devraient être envisagées lorsque l'expérience d'humanisation ne permet pas d'évaluer fonctionnellement la variante de l'intérêt.

Interprétation des résultats négatifs et positifs
Si 1) les cDNA humains de référence et de variante sauvent les phénotypes mutants de mouche à un degré semblable et 2) il n'y a aucune différence observée dans toutes les conditions examinées, alors on peut supposer que la variante est fonctionnellement indiscernable dans Drosophila dans Vivo. Il est important de noter, cependant, que cette information n'est pas suffisante pour exclure que la variante de l'intérêt est non pathogène, puisque l'évaluation de Drosophila peut ne pas être assez sensible ou capturer toutes les fonctions potentielles du gène/protéine d'intérêt pertinentes pour les humains. Les données positives, d'autre part, est une indication forte que la variante a des conséquences néfastes sur la fonction protéique, mais ces données seules ne sont toujours pas suffisantes pour revendiquer la pathogénie. L'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) a publié un ensemble de normes et de lignes directrices pour classer les variantes des gènes associés aux maladies humaines en gènes « bénins », « probablement bénins », « variants d'importance inconnue (VUS), « probablement pathogènes » et "pathogène"90. Bien que cette classification ne s'applique qu'aux gènes associés à la maladie établis et ne s'applique pas directement aux variantes des « gènes d'importance incertaine » (GUS), tous les individus impliqués dans des études fonctionnelles de variantes humaines sont fortement encouragés à respecter cette ligne directrice lors du signalement de la fonction de la variante.

Extraire des informations biologiques utiles lorsque les phénotypes MO ne modélisent pas une condition de maladie humaine
Il est important de garder à l'esprit que les essais fonctionnels basés sur l'expression excessive ont des limites, d'autant plus que certains des phénotypes étant marqués peuvent avoir peu de pertinence à l'état de la maladie d'intérêt. De même, les phénotypes qui sont évalués dans le cadre d'expériences de sauvetage peuvent ne pas avoir de pertinence directe pour la maladie d'intérêt. Étant donné que ces expériences sont menées en dehors des contextes endogènes dans un système d'invertébrés, elles ne devraient pas être considérées comme des modèles de maladies, mais plutôt comme un test de la fonction génique utilisant Drosophila comme un « tube à essai vivant ».

Même si l'organisme modèle n'imite pas une maladie humaine, les phénotypes brûlés utilisés dans les expériences de sauvetage peuvent souvent fournir des informations biologiques utiles sur les conditions de la maladie. Le concept de « phénologs (phénotypes homologues non évidents)» 91 peut être utilisé pour déterminer davantage les connexions moléculaires sous-jacentes entre la drosophile et les phénotypes humains. Par exemple, les phénotypes morphologiques dans l'aile de mouche, le thorax, les jambes, et les yeux sont d'excellentes lectures phénotypiques pour des défauts dans la voie de signalisation de Notch, une voie évolutivement conservée liée à beaucoup de désordres congénitaux, y compris des défauts cardio-vasculaires chez l'homme62. En comprenant la logique moléculaire derrière certains phénotypes dans Drosophila, il est possible d'identifier les liens biologiques cachés entre les gènes et les phénotypes chez l'homme qui ne sont pas encore compris.

Communication continue avec les collaborateurs cliniques
En travaillant avec des cliniciens pour étudier la fonction d'une variante rare trouvée dans le patient, il est important d'établir une relation de collaboration forte. Bien que les chercheurs biomédicaux cliniques et de base puissent partager des intérêts dans les mêmes gènes/voies génétiques, il existe un grand écart culturel et linguistique (p. ex., jargon médical, nomenclature propre à l'organisme modèle) entre les domaines clinique et scientifique. Une relation solide et fondée sur la confiance entre les deux parties peut être établie grâce à une communication approfondie. De plus, la communication bidirectionnelle est essentielle à l'établissement et au maintien de cette relation. Par exemple, dans les deux cas décrits dans la section représentative des résultats, l'identification de patients supplémentaires présentant des génotypes et des phénotypes similaires, ainsi qu'une étude fonctionnelle ultérieure, était essentielle pour prouver la pathogénicité des variantes d'intérêt. Même avec de solides données fonctionnelles, les chercheurs et les cliniciens ont souvent des difficultés à convaincre les généticiens humains qu'une variante identifiée dans les cas « n - 1 » est la véritable cause de la maladie.

Une fois que le chercheur de MO identifie qu'une variante d'intérêt est dommageable, il est essentiel de communiquer de nouveau aux collaborateurs cliniques dès que possible afin qu'ils puissent activement essayer d'identifier les cas correspondants en réseautant avec d'autres cliniciens et généticiens humains. Des outils tels que Geno2MP [Genotypes to Mendelian Phenotypes: a de-identified database of 9,650 individuals sinscrit in the University of Washington's Center for Mendelian Genomics Study41;includes patients and family members suspected of troubles génétiques] peuvent être recherchés pour évaluer les personnes qui peuvent avoir le même trouble. Ensuite, le clinicien principal peut être contacté à l'aide d'une fonction de messagerie.

Alternativement, GeneMatcher peut être utilisé, qui est un site de jumelage pour les cliniciens, les chercheurs de base, et les patients qui partagent des intérêts dans les mêmes gènes pour identifier les patients supplémentaires qui portent des variantes rares. Depuis GeneMatcher fait partie d'un plus grand réseau intégratif de sites De correspondance appelé Matchmaker Exchange42, des bases de données supplémentaires à travers le monde peuvent être recherchées, y compris l'Australian Genomics Health Alliance Patient Archive, Broad Matchbox , DECIPHER, MyGene2 et PhenomeCentral dans une seule soumission de gènes GeneMatcher. Bien que la participation à GeneMatcher soit possible en tant que « chercheur », il est recommandé que les scientifiques de base utilisent ce site Web avec leurs collaborateurs cliniques, puisque la communication avec d'autres cliniciens après un match exige certains niveaux de compétences.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions Jose Salazar, Julia Wang et karen Schulze pour la lecture critique du manuscrit. Nous reconnaissons les Drs Ning Liu et Xi Luo pour la caractérisation fonctionnelle des variantes TBX2 discutées ici. Le Centre de dépistage des organismes modèles du Réseau des maladies non diagnostiquées a reçu l'appui du National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. a également reçu l'appui des NIH[CNCDP-K12 et NINDS (1K12 NS098482)], de l'American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society et Child Neurology Foundation ( PERF Elterman), et le Prix pour l'indépendance anticipée du directeur des NIH (DP5 OD026426). M. F. W. a également reçu le soutien de la Fondation Simons (Prix SFARI : 368479). S. Y. a également reçu le soutien des NIH (R01 DC014932), de la Fondation Simons (Prix SFARI : 368479), de la Alzheimer's Association (New Investigator Research Grant : 15-364099), du Fonds familial Naman pour la recherche fondamentale et du Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en Médecine moléculaire. La microscopie confocale au BCM est appuyée en partie par la subvention U54HD083092 des NIH au centre de neurovisualisation du Centre de recherche sur les déficiences intellectuelles et développementales (CRDI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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