ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מדווחים על שליח RNA (mrna) אלקטרופורציה כשיטה המאפשרת ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים במערכת דגם העובר שליו. שיטה זו ניתן להשתמש כדי לתייג תאים במהירות ולהקליט את התנועות שלהם vivo על ידי הזמן לשגות המיקרוסקופיה זמן קצר לאחר electroporation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנו מדווחים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר חלבונים פלורסנט כדי לתייג תאים בעוברי שליו חיים במהירות רבה יותר ובאופן נרחב יותר אלקטרופורציה DNA. היעילות הגבוהה ביותר מאפשרת לפחות 4 mRNAs ברורים להיות שיתוף מעבר עם ~ 87% יעילות. רוב מוצרי ה-mRNAs החשמליים מפוקעים במהלך 2 השעות הראשונות של הפוסט-אלקטרופורציה, ומאפשרות ניסויים תלויי זמן להתבצע בעובר המתפתח. בסופו של דבר, אנו מתארים כיצד התמונה באופן דינאמי בשידור חי העוברים עם mRNAs כי קידוד שונים ממוקד חלבונים פלורסנט ממוקדות.

Introduction

אלקטרופורציה היא שיטת העברה פיזית המשתמשת בפולס חשמלי כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום הפלזמה, המאפשר חומרים כמו חומצות גרעין או כימיקלים לעבור לתוך ציטוסול. אלקטרופורציה משמשת רבות כדי לספק דנ א לתוך חיידקים, שמרים, צמחים, ותאים מהיונקים1,2,3. הוא משמש באופן שגרתי כדי להחדיר מדים גנטיים לתוך תאים ורקמות היעד בתוך העובר העופות המתפתח ללמוד את השליטה הגנטית של פיתוח או תווית הגירה אוכלוסיות של תאים4,5,6, 7. לאחר מכן עם זאת, מספר מגבלות נסיוניות קיימות גם עם אלקטרופורציה DNA8. למשל, אלקטרופורציה DNA מציג לעתים קרובות מספר משתנה מאוד של וקטורים ביטויים לכל תא ולאחר מכן mRNAs וחלבונים הם לקודד. השונות הזאת עלולה להוביל לטרוגניות משמעותית בתאי התא, המסבך את ניתוח התמונה ואת פרשנות הנתונים9,10. בנוסף, חלבונים מ-DNA אלקטרופורציה רק מתחילים לבטא ~ 3 h פוסט אלקטרופורציה ולא להגיע ליעילות המקסימלית של מספר התא ואת עוצמת הקרינה עד 12 h, כנראה בשל הזמן הנדרש להעביר לתוך הגרעין ולהשלים תמלול ותרגום בvivo11.

לעומת זאת, השימוש ב-mrna משמש באופן יעיל במגוון מערכות מודל, כולל xenopus זריזה oocytes על ידי מיקרוהזרקה12,13, התכנות משנה את תאי הגזע האנושי על ידי mrna lipofectamine החצייה14 , ומרדנות בתאי גזע עצביים בעכברים למבוגרים15. בדקנו את היכולת של mrna אלקטרופורציה כדי לתייג ביעילות תאים במהלך פיתוח מוקדם העופות מתחלקים באמצעות מסונתז mrna באופן מתורבת לקודד חלבונים פלורסנט ברורים (FPs). ללימודים שלנו, השתמשנו pCS2 + וקטור, וקטור ביטוי רב-תכליתי המשמש בדרך כלל להבעת חלבונים ב xenopus ו-דג זברה עוברי. ה-RNA פולימו T7 מיזמים בpCS2 + היתר את הסינתזה של mRNA וחלבון מכל גן משוכפל כאשר משתמשים ב תמלול/מערכת תרגום של מבחנה.

כאן, אנו מדגימים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים. עיצבנו ויצרנו רבים מוקטורי הביטוי בהם נעשה שימוש במחקרים אלה. לדוגמה, אנו שיכלנו משנה את הגן LifeAct-eGFP16 לתוך pCS2 + וקטור17 לבטא מן היזם CMV ו-SP6 מקדם. הגן המוסף נמצא במורד הזרם של מקדם SP6 ובמעלה הזרם של הזנב SV40 פולי (A)18. ב עוברים שיתוף electroporated עם mRNA ו-DNA, FPs מקודד מ-Mrna המועתק מחוץ לתחום שזוהו לראשונה בתוך 20 דקות של אלקטרופורציה, בעוד FPs של וקטורים ביטוי DNA אותרו רק לאחר 3 h. קידוד Mrna מרובים עבור גרעיני, Golgi, ו חלבונים קרום יכול להיות electroporated לתוך העובר בו זמנית, וכתוצאה מכך ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בתאים בודדים. בסופו של דבר, באמצעות התאוששות vivo פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) שיטת, אנו מראים כי רוב הריקבון Mrporated הדעיכה בתוך 2 h. כך, ייצור חלבון ראשוני מהיר בשילוב עם תרגום חלבון חדש מוגבל הופך את mrna אלקטרופורציה טכניקה רבת ערך כאשר השליטה הטמפורלית של הביטוי הוא הכרחי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הליכי החיות בוצעו בהתאם הנחיות מאושרות מבית החולים לילדים לוס אנג'לס ואוניברסיטת דרום קליפורניה טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות השימוש.

1. הדור ביטוי מבוסס pCS2 וקטורים

  1. לשכפול pCS2. Lifeact-eGFP, להכין את עמוד השדרה וקטור על ידי עיכול 2 μg של pCS2. CycB1-GFP (בונה המכיל הוספה אחרת) עם BamHI (10 U) ו BsrGI (10 U) במאגר העיכול המתאים (ראה טבלת חומרים) מדולל 1 x בתגובה סה כ נפח של 50 μL עבור 1 h ב 37 ° צ' (ראה איור 1 עבור שרטוט של הליך השכפול).
    1. Deזרחנות בחינם 3 ' הו סוף השדרה הווקטורית מן תגובת האנזים ההגבלה על ידי הוספת שרימפס בסיסי פוספספטאז (1 U). דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
    2. הפעל את כל התערובת ב 1% agarose ג'ל/1x טריס מאגר EDTA (טה) ב-90 V עבור ~ 50 min ולאחר מכן כתם את ג'ל בתמיסה משנת ה0.5 μg/mL של אתידיום ברומיד ב 1 x טה מאגר עבור 15 דקות עם נדנדה עדינה. כמו כן, הקפד לטעון סמני משקל מולקולרי במסלול חופשי כדי לעזור לקבוע את גודלי ה-DNA.
    3. באמצעות DNA בטוח הטרנסמאטור UV כדי להימנע מפני קיצוץ, לגזור את עמוד השדרה הווקטורית (בגודל הלהקה צפוי של 4kb) מן הג agarose במהירות לבודד את קטע ה-DNA מן החלק ג'ל באמצעות ערכת טיהור ג'ל באמצעות הוראות היצרן.
  2. במקביל עם שלב 1.1, להכין את הכנס על ידי עיכול 2 μg של pEGFP-N1-Lifeact עם BglII (10 U) ו Bglii (10 U) במאגר העיכול המתאים מדולל ל 1x בנפח התגובה הכולל של 50 μL עבור 1 h ב 37 ° c. הפעל את התערובת כולה 1% agarose ג'ל כדי לבודד את הלהקה 800 bp כפי שהוסבר בעבר בשלב 1.1.2-1.1.3.
  3. לאחר הן וקטור ולהוסיף מטוהרים וכימות על ספקטרוסקופיה, לשלב 50 ng של וקטור 38 ng של הכנס (1:3 היחס הטוחנת של וקטור להוסיף) במאגר של ה-dna לליגאז t4 לפני הוספת t4 dna ליגאז כדי לזרז את תגובת החיבור. בנוסף, הגדר בקרת דנ א, בקרה וקטורית בלבד, והוספת שליטה בלבד. דגירה כל התגובות בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
    1. שינוי הצורה 1 μL של התערובת הDH10 לתוך E. coli המוסמכת. כמו כן, להפוך את המים רק שליטה שלילית 20 pg של pUC19 חיוביים בקרה. התפשטות חיידקים על לוריא ציר (LB) אגר לוחות המכילים 50 μg/mL אמפיצילין ו דגירה לילה ב 37 ° c.
    2. בבוקר שלמחרת, ספור את. המושבות על כל צלחת
      הערה: באופן אידיאלי, לא צריך להיות מושבות על לוחות הבקרה השלילית, > 100 מושבות על וקטור + להוסיף לוחיות לחות, ופחות מושבות על הצלחת וקטור בלבד.
    3. בחר לפחות 8 מושבות חיידקי מן הצלחת אגר השתנה עם וקטור + להוסיף תערובת הקשר והאיחסן אותם באמצעות קיסמים סטרילית או טיפים pipet לתוך 2 מ ל של המרק LB נוזלי המכיל 50 μg/mL אמפיצילין.
    4. לחלץ דנ א מכל אחד שיבוטים באמצעות מסחרי פלמאמיהכן ערכות miniprep.
    5. הפעל תקציר הגבלת אבחון באמצעות 500 ng של ה-DNA מכל שיבוט באמצעות NotI (10 U) ו BamHI (10 U) במאגר העיכול המתאים מדולל ל 1x עבור 1 h ב 37 ° צ' ולהפעיל את ה-DNA מתעכל על 1% agarose ג'ל במאגר 1 x טאה. גדלי הלהקה צפויים עבור pCS2. Lifeact-eGFP שיבוטים חיוביים הם 3.9 kb ו 978 bp.
    6. המרה 1 pg-100 ng של דנ א מן השיבוט החיובי לתוך E. coli DH10, ולהכין 3-4 miniprep התגובות כמפורט בשלבים הקודמים כדי להשיג כמות מספקת של DNA עבור התגובה שעתוק מבחנה (10 μg מינימום).

2. הכנת mRNA על ידי תמלול חוץ גופית

  1. Linearize 10 μg של pCS2. LifeAct-eGFP על 3 ' סוף של הכנס עם NotI (10 U) במאגר העיכול המתאים מדולל 1 x בנפח התגובה הכולל של 50 μL ב 37 ° c לילה.
    הערה: כדי למנוע זיהום RNase ולהפחית את השפלה mRNA, ללבוש כפפות תוך כדי טיפול בדגימות mRNA.
  2. לטהר את ה-DNA באמצעות תערובת של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1, v/v).
    1. הוסף 150 μL של מים ללא RNase-כדי להפוך את הנפח הכולל של תגובת העיכול שווה 200 μL. לאחר מכן, הוסף 200 μL של פנול: כלורופורם, אלכוהול isoamyl ומערבולת התערובת עבור 20 s.
    2. צנטריפוגה ב microfuge במהירות מקסימלית (18,400 x g) עבור 2 דקות. בזהירות להסיר את השלב העליון מימית המכיל את ה-DNA לינתית. חזור על שלב זה כדי להסיר זיהומים נוספים ולהיזהר שלא לשבש את הזרז הלבן שעשוי להיווצר בין השלבים התחתונים לעליונים.
  3. מזרז DNA לינינאנס על ידי הוספת 1/10 נפח 3M אצטט נתרן (RNase-חינם) ו 2.5 כרכים של 100% אתנול. להשאיר את התערובת ב-20 ° c עבור > 30 דקות, ואז הגלולה ה-DNA על ידי תפרידו במהירות מקסימלית (18,400 x g).
    1. לשטוף את הגלולה DNA עם 70% אתנול, ולאחר מכן האוויר יבש את הגלולה עבור > 5 דקות.
    2. לפזר את הגלולה DNA ב 5 μL of RNase-מים ללא תשלום. . לכמת את הדנ א על ידי ספקטרוסקופיה
      הערה: ריכוז ה-DNA הצפוי הוא ~ 0.5-1 μg/μL עם יחס A260/A280 בין 1.7-2.0.
  4. השתמש 1 μg של pCS2. LifeAct-eGFP ל-DNA שעתוק מבחנה (IVT). בצע את הוראות היצרן בערכה המסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לכלול 10 μL של אנלוגי כובע (הריכוז הסופי 0.8 mM) ו NTPs (הריכוז הסופי 1 מ"מ עבור ATP, CTP, ו-טרומבוזית; 0.2 mM עבור GTP), 2 μL של מאגר התגובה 10x (ריכוז סופי 1x), 2 μL של SP6 RNA פולימראז ו-RNase-מים ללא תשלום עד 20 μL.
    1. מודב את תערובת ה-IVT במשך כ 2 שעות או יותר, בהתאם לגודל התעתיק.
      הערה: הדגירה 2 h עובד היטב עבור תעתיק 3 kb, אבל הדגירה לילה עובד טוב יותר עבור תעתיקים הגדולים מ 5 kb.
    2. כדי להסיר בחינם נוקלאוטידים מן תגובת תמלול, להוסיף 30 μL של ליקיל RNA פתרון משקעים (7.5 M ליתיום כלוריד, 50 mM EDTA) כדי לזרז את mRNA. מערבולת התערובת לזמן קצר ולאחסן ב-20 ° c עבור 30 דקות לסובב את mRNA למטה עבור 15 דקות ב microfuge במהירות max (18,400 x g) ולשטוף עם 70% אתנול (RNase-חינם).
  5. לפזר את mRNA מסונתז ב 15 μL of RNase-מים ללא תשלום. לוותר על mRNA מסונתז ב 5 μL/tube (3 צינורות בסך הכל) ומקום ב-80 ° c עבור אחסון לטווח ארוך. בדיקת מבנה ה-mRNA. בעזרת ספקטרוסקופיה
    הערה: התשואה הצפויה היא 15-20 μg של mRNA (~ 1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) מספיקה עבור ניסוי עם ~ 10 עוברים, בהנחה כי mRNA הוא מדולל מ-1 μg/μL כדי 500 ng/μL ושכל עובר מוזרק עם ~ 200 nL. כל צינור צריך, לפיכך, להכיל מספיק mRNA עבור ניסויים ~ 5.
  6. הפעל ~ 300 ng של mRNA על 1% agarose ג'ל במאגר 1 x טה לאחר ניקוי כל ציוד ג'ל עם פתרון הטיהור RNase (g., RNase משם) ולהבטיח כי mRNA מופיע כלהקה אחת (להקות מרובות יכול להיות נוכח אם המבנה המשני טופס) וכי אין למרוח ppears בנתיב ג'ל, אשר מצביע על השפלה RNA.

3. הכנת שילוב של mRNA אלקטרופורציה

  1. להפשיר ולדלל mRNA על הריכוז הרצוי (250-500 ng/μL ב-RNase מים חינם עובד היטב עבור כל Mrna נבדק בעבודה זו). הוסף 1/10 נפח של צבע צבעוני (ראה טבלת חומרים, RNAse-חינם, 0.1% הריכוז הסופי) כדי לעזור להמחיש את האתר הזרקת mRNA וכיצד למקם כראוי את האלקטרודות.
    הערה:
    אם ה-dna ו-RNA משולבים כדי לבצע שיתוף אלקטרופורציה, ודא כי ה-dna הוא חופשי מזיהום RNases באמצעות החילוץ פנול-כלורופורם משקעים אתנול לפני mRNA ו-DNA תערובת.
    1. הקפד להכין שליטה שלילית באמצעות מדמה (לא הוסיף RNA) פתרון אלקטרופורציה. במידת האפשר, הכן פקד חיובי באמצעות mRNA המאומת מראש (mRNA אשר הוכח לייצר FP בהצלחה בניסויים קודמים).
      הערה: השליטה השלילית חיונית לכל ניסויי ההדמיה כדי ליצור רמות של זריחה ברקע לנרמול נתונים. השליטה החיובית חשובה במיוחד כאשר עובדים עם mRNA החדש שהוצמדה על-ידי כך שהיא מסייעת לאשר שהגדרות האלקטרופורציה עבדו.
  2. אחסן את פתרון ה-mrna אלקטרופורציה על שאיפה קרח כדי למנוע השפלה עד שהוא מוכן להמשיך באמצעות אלקטרופורציה.

4. האלקטרופוראט mRNAs לתוך עוברי שליו חיים

  1. לאסוף טרי ביצים שלווים הופרות מדי יום ולאחסן 13 ° c במקרר מחולל לחות עבור לא יותר משבוע 1. הביצה השליו ב-38 ° c עד לשלב ההתפתחותי המבוקש19,20,21.
    הערה: HH3 to HH5 שימשו במחקר זה עבור דימות סטטי ודינאמי. עבור עוברים HH3, להשאיר את הביצים בטמפרטורת החדר עבור 2 h לפני הקציר עושה את תהליך הבידוד הרבה יותר קל כמו העוברים הם בדרך כלל עמידים יותר למניפולציות פיזית כאשר התקרר.
  2. בידוד והכנת עוברים לפי מערכת התרבות של EC22. לאסוף לפחות 5 עוברים בכל תנאי, כולל אחד לפחות לשמש שליטה שלילית (לא אלקטרופורבטים).
    1. בעדינות לשבור ויוצקים את הביצה לתוך 10 ס מ צלחת פטרי. להסיר את רוב אלבומין עבה עם פיפטה העברה ולהסיר את האלבומין עבה הנותרים סביב העובר על ידי ניגוב בעדינות את פני השטח של החלמון עם מחיקה רקמות כדי להבטיח כי העובר מנדבק הדוק לטבעת נייר.
    2. שכבה נייר סינון חתוכים (ראה טבלת חומרים) על העובר ולהשתמש במספריים לחתוך בצורה חלקה סביב היקף העובר.
    3. השתמש בפיפטה פסטר כדי לשכב עם העובר עם PBS, תוך שימוש בזרמים עדינים כדי לפנות את כל החלמון הנדבק לעובר.
      הערה: שלב זה הוא קריטי כאשר עובדים עם העוברים הצעירים (< HH3) בגלל העוברים האלה נוטים להיצמד יותר לחלמון ולעיתים קרובות להתנתק מקרום ויטלין במהלך השטיפה העוקבת.
    4. משוך באיטיות את העובר/נייר בזווית אלכסונית מעלה ומחוץ לחלמון לצלחת פטרי המלאה ב-PBS לניקוי נוסף. ברגע שרוב החלמון הוסר, מניחים את הצד השני של העובר על צלחת פטרי 35 מ"מ מכוסה בתערובת חצי מוצקה של אגר/אלבומין.
  3. הכינו 6 עד 8 10 ס מ מיקרונימים זכוכית ארוכים (מנת יתר = 1.2 מ"מ) באמצעות מכשיר מיקרופיפטה זכוכית פולר.
  4. מניחים את העובר בצד השני. בחדר החשמל מלא בערוץ החלל באמצעות מיקרוקפילר זכוכית, להזריק את המנת של 200 nL של mrna או DNA/mrna אלקטרופורציה לערבב לתוך החלל בין הקרום epielline ויטאלין המכסה את האזור הרצוי.
    הערה: השטח הקדמי כולו עבור pelלבדה וכמה אזור עבור opaca היה אלקטרופורated ברוב הניסויים המוצגים בכתב היד הזה.
  5. מניחים את האלקטרודות חיובי ושלילי (פלטינה כיכר אלקטרודה שטוחה; אורך של 5 מ"מ) על העליון והתחתון של העובר בהתאמה אלקטרופוראט באמצעות רצף הדופק הבא: חמישה פולסים חשמליים רבועים של 5 V, 50 ms משך עם 100 ms מרווחי זמן באמצעות vivo electroporator. ודא כי המרחק בין האלקטרודות הוא ~ 5 מ"מ.
    הערה: אופטימיזציה של הפרמטרים האלקטרופורציה חיונית כדי למנוע תנאים שיכולים להרוג את התאים העובריים שבריריים. פרמטרים של מתח, אורך הדופק, מרווחי הדופק, ואת מספר פולסים ל-DNA ו-mRNA צריך להיחשב עבור מכשירי אלקטרופורציה שונים.
  6. מודחלת העוברים אלקטרופורביים ב 38 ° צ' לשלב ההתפתחותי המבוקש.
    הערה: הפלורסנט מבתר את סטריאוסקופ (ראה טבלת חומרים) מסייע למסך עוברים מזוהמים לעומת עוברי מעבר לא-מעבר.
  7. אם העוברים הם להיות בתמונה סטטית, לתקן אותם ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS עבור 1 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c.
    1. להסיר את העוברים מן הקרום vitelline על ידי חיתוך חלק סביב היקף נייר מסנן עם מספריים לקלף את קרום מבריק על פני השטח עם מלקחיים חדים בעדינות.
    2. לשטוף את העוברים קבוע ב PBS/טריטון (0.1%) 2x עבור 5 דקות ולהמשיך עם היברידיזציה באתרו או החיסוני במידת הצורך.
    3. לבסוף, כתם העובר ב 0.5 μg/μL DAPI ב PBS/טריטון (0.1%) לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את העוברים ב PBS/טריטון 2x עבור 5 דקות ולנקות את העובר בקנה מידה-U2 פתרון23 לילה.
  8. כדי לנתח את היעילות של אלקטרופורציה (ראה איור 2), השתמש בכלי ניתוח בינארי וחלקיקים ובערוץ dapi ב-imagej לקבלת קווי מתאר גרעיניים מכל התאים בתמונה.
    1. כדי להשתמש בכלי הבינארי ב-ImageJ, השתמש בפרוסת z אחת בערוץ DAPI המכיל את רוב התאים ולחץ על תהליך > בינארי > הפוך לבינארי. כדי להפריד תאים סמוכים, לחץ על תהליך > בינארי ≫ פרשתהדרך. השג קווי מתאר של תאים על-ידי לחיצה על ניתוח ≫ נתח חלקיקים, הגודל מוגדר ל 100-500 (μm2).
    2. ודא שרוב התאים מתוארים בערוץ DAPI ושמור את קווי המתאר של התא על-ידי לחיצה על יותר > שמור בחלון המוקפץ של מנהל הROI.
    3. השתמש בקווי מתאר אלה כדי לקבל ערכי עוצמה של אור השמש עבור הערוץ mRNA ו-DNA על ידי פתיחת הקובץ שנשמר בעבר על z-פרוסה אחת ב-mRNA או בערוץ ה-DNA ולאחר מכן לחץ על מדידה במנהל הROI.
    4. לבסוף, לסנן את ערכי העוצמה האלה, לספור תאים עם < 6000 עוצמה פלואורסצנטית כמו מנוכר ותאים עם > 6000 עוצמה פלואורסצנטית כמו מזוהמים.

5. FPs תמונה מקודד על ידי מוצרי mRNAs

  1. בחר את העובר electroporated בריא והטוב ביותר עבור ניסויים הדמיה דינמית לאחר הסתכלות על כל העוברים electroporated תחת הפלורסנט מבתר סטריאוסקופ.
    1. המשיכו לטחון את העוברים האלקטרו-חשמליים האחרים ואת העובר שאינו אלקטרופורף (השליטה השלילית) בחממה נפרדת תוך הדמיה של העובר הנבחר במקרה שעובר זה מת במהלך הניסוי.
  2. עבור ההדמיה הדינמית, השתמש בתרבות העובר כולו של לאקס בקובו, כפי שמתואר בעבר24,25,26 עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי הפוך.
    הערה:
    המיקרוסקופ מצויד בחממה לבמה (ראו טבלת חומרים) השומרת על הטמפרטורה ב-36 ° c במהלך ההדמיה. זה נצפתה במהלך הגדרת מיקרוסקופ שעוברים מודלים ב 36 ° c לשרוד יותר מאשר בטמפרטורות גבוהות יותר, אולי בגלל הלייזר עלול לגרום לחימום המקומי על העובר. על הקוראים לקבוע את טמפרטורת הדגירה האופטימלית על הבמה לצורך הגדרת המיקרוסקופ שלהם.
    1. באופן דינמי תמונה ולהמחיש embryogenesis, לנקות את העובר electroporated בקצרה עם PBS כדי להסיר כל בועות שעשוי להיווצר בצד השני של העובר במהלך תהליך אלקטרופורציה על ידי הזזת העובר סביב באמצעות מלקחיים ב-PBS נקי פתרון.
    2. מניחים את העובר נקי ישירות על צלחת הדמיה המכילה שכבה דקה של אלבומין-אגר (~ 150 μL) לוודא שלא לייצר בועות על פני השטח של העובר22.
    3. כדי להבטיח הישרדות לטווח ארוך הדמיה, להוסיף פיסת התגלגל לחות קטנה של נייר טישו בקצוות הפנימיים של צלחת ההדמיה לאטום את התבשיל באמצעות סרט פרפין כדי למזער אידוי במהלך הדמיה ודגירה.
    4. הזיזו את התבשיל הזה במהירות לשלב הטרום-שחומם של מיקרוסקופ ממוקד ואתרו את הצבע הצבעוני בעובר באמצעות ערוץ ברייטפילד (לייזר PMT 20%), המזהה את האזור המוזרק והאלקטרו-מבוקר.
  3. הגדרת תוכנת הדמיה למטרה הרצויה (10 או 20x), דיקרואיק שיקוף (488 nm for GFP nm, 561 עבור RFP), ספקטרום פליטה (499-562 nm עבור GFP, 570-695 nm עבור RFP), ולהפעיל לייזר המתאים (488 nm עבור GFP, 561 nm עבור RFP).
    הערה:
    מחשב mRNA החשמלי תורגם לחלבונים שנראו בתוך 20 דקות (ראה איור 3). המטא-נתונים של ההדמיה המשמשים את רוב התמונות בנייר זה היו: מיקרוסקופ קונקטאני הפוך עם מטרה 20x (ראה טבלת חומרים); פיקסל לשכון זמן, ~ 1.5 μs; מתכוון. לסריקות של 4 שורות
    1. לחץ על Live בתוכנת הדימות והתאם את כוח הלייזר להגדרה המתאימה לעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית, בהתאם לעוצמת הלייזר של כל המיקרוסקופ. התחל על ידי הדמיה של העובר באמצעות 1% כוח לייזר, 800 לצבור, ולהגדיל את כוח הלייזר לאט על ידי 1% במרווחים עד הפיקסלים רווי נראים.
    2. בצע זאת על-ידי הפחתת עוצמת הלייזר מעט עד שלא ייראו פיקסלים רוויים יותר.
      הערה: כוח הלייזר שנבחר לתחילת הפעלת הדמיה של העובר יכול להיות טוב נקודות זמן מוקדם יותר, אבל לא אידיאלי בזמן מאוחר יותר נקודות אם הזריחה של התאים הופך הרבה יותר בהיר או עמעם לאורך זמן. כדי להתייחס לכך, התמונה העובר במעט הגדרות צריכת החשמל נמוך בתחילה מאז התאים electroporated בדרך כלל לקבל בהיר יותר 6 שעות לאחר האלקטרופורציה (ראה איור 3A-E לכמת את העלייה באות). אם התמונות המאוחרות רוויות, המשיכו לצלם עם הגדרות ההדמיה המקוריות, אך קחו תמונה נוספת מיד אחרי הגדרות הדמיה חלשות יותר (מנקב קטן יותר או כוח לייזר חלש יותר).
    3. התמונה העובר כל 3-5 דקות כדי לעקוב אחר הגירה תא בודדים על פני נקודות זמן שונות. עבור עבודה זו, התמונות היו z-ערימות (~ 50 יקרומטר עבה) של אזור electroporated כולו, ועוד כמה חדר נוסף לקראת החלק התחתון של מחסנית z במקרה העובר שוקע לתוך המיטה agarose לאורך המפגש הדמיה.
    4. שים לב באיזו מהירות התאים מתקדמים באמצעות בדיקת נקודות הזמן הראשונות של הסרט הראשון. אם התאים זזים בקצב מהיר (כלומר, הם יוצאים מהאזור של אזור הדימות בתוך עוד כמה נקודות זמן), שקול להרחיב את הזום של אזור התמונה (1x à 0.8 x) או להדמיה באזור אחר.
      הערה: אזורים עובריים באזור pellucida לנוע הרבה יותר מהר מאשר אלה באזור opaca. בנוסף, עוברים צעירים (HH3, HH5) מכילים לעתים קרובות תאים העוברים תנועה מהירה יותר בהשוואה לעוברים מבוגרים (> HH7).
    5. לאחר הדמיה של האזור electroporated של העובר, התמונה אזור בלתי אלקטרואלקטרו של העובר אותו כדי לקבוע רמות של קרינה אוטומטית (צריך להיות מינימלי אם כוח לייזר נמוך < 10% משמש לדמות העובר).

6. התאוששות פלואורסצנטית לאחר Photobleaching לבנה (FRAP) לדרישות mRNA שלמות

הערה: A ב vivo התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) ניתן להשתמש כדי לקבוע כיצד mRNA מנוכר ארוך יכול להיות מתורגם FPs. הפרוטוקול הבא מתאר ניסוי FRAP כדי לזהות את מחצית החיים של H2B. . מבנה הסיטרין, בעובר אלקטרופורנטי

  1. בצע ניסויים frap על המיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך באמצעות מטרה 0.8 לגמרי NA לפתוח לחלוטין.
    1. לאחר אישור אלקטרופורציה של H2B-סיטרין על הstereomicroscope והצבת העובר על הבמה מחומם מראש על מיקרוסקופ קונפוקלית הפוך (ראה שלב 5.2.4), פוטואקונומיקה רוב הקרינה התאית מH2B-סיטרין במגוון זמן נקודות (45 דקות, 2 h, ו 5 שלאחר אלקטרופורציה) באמצעות 405 לייזר nm עם 70% כוח לייזר, 100 חזרות, מהירות סריקה 4, אשר משאיר רק 5% של זריחה שנותרה.
      הערה: תהליך זה אמור להימשך מספר דקות.
    2. המשך להמשיך בדגירה של העוברים על הבמה ב 36 ° c לאחר הלבנת התמונות.
  2. הקפידו לשים לב לחלק באופן פעיל את התאים באזור הצילום, אשר מצביעים על כך שתאי הצילום לא מתו לגמרי לאחר הטיפול.
  3. לרכוש תמונות שלאחר אקונומיקה (מערימות z של האזור electroporated) עבור עד 30 דקות במרווחי זמן קבועים (3 או 5 דקות) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
    הערה: אם הוא זמין, השתמש בשורה H2B-XFP בתור פקד חיובי להבטחת הישרדות התא באזור התמונות. שיעור של התאוששות פלואורסצנטית עבור FP מקודד על ידי mRNA electroporated צריך להקטין, אבל זה עבור FP מקודד באמצעות transgene צריך להישאר עקבי לאורך כל הסרט כולו.
  4. כדי להבטיח כי תנאי ההדמיה אינם משפיעים על הישרדות העובר, במקביל העוברים הדמיה של מסגרות אלקטרופורמיות שאינן מפוטנות, שעשויות לשמש כשליטה להדמיה.
  5. כדי לכמת את התוצאות של הלבנה עבור הריקבון mrna אחרי האלקטרופורציה, לעקוב אחר הזריחה של התא לאורך זמן (3 או 5 דקות) על ידי מדידת עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של המרכז (a 7.5 יקרומטר מעגל) של כל תא באמצעות imagej. למדוד את זה עבור כל התאים בתוך האזור photobleached ולבן כי הם לא עוברים מיטוזה והיה לחלוטין photobleached ולבן.
    הערה: שקול להשמיט את התאים הmitotic מן הקוונפיקציה מאז הגרעין mitotic יש קרינה חזקה יותר מאשר גרעיני בין הפאזה עקב עיבוי כרומטין.
  6. להתוות את עוצמת הקרינה לאורך זמן לאחר אקונומיקה במגוון של נקודות זמן (45 דקות, 2 h, ו 5 h).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA אלקטרופורציה יעילה יותר מאלקטרופורציה של DNA

השתמשנו pCS2 +. H2B-סיטרין כדי להכין ב-mRNA העתק מבחנה. מאז ה-DNA אלקטרופורציה מבוצע בדרך כלל ב 1-2 μg/μl, השתמשנו ריכוז שווה ערך של mrna (מחושב להיות סביב 0.25-0.5 μg/μl עבור H2B-סיטרין) עבור mrna אלקטרופורציה. בדקנו לראשונה את יעילות האלקטרופורציה של pCS2 +. H2B-DNA הסיטרין בהשוואה ל H2B-סיטרין (בתוך מבחנה מחוץ לתכנון SP6 של pCS2 +. H2B-סיטרין) על ידי ה-DNA או mRNA בנפרד לעוברים HH5 שליו אז בדיקת יעילות אלקטרופורציה ב 12 h פוסט-אלקטרופורציה. למרות שאלקטרופורציה של DNA מובילה לזריחה בהירה יותר בתאים אלקטרופורבטים מסוימים, היעילות של אלקטרופורציה של DNA הייתה בלתי נראית נמוכה יותר בהשוואה ל-mRNA מקודד באופן נרחב (איור 2A ו-B).

כדי להסביר על השתנות העובר-אל-העובר הפנימי בפרוטוקול אלקטרופורציה, שילוב שווה של mrna קידוד H2B-סיטרין ו-DNA המבטא H2B-mKate2 היה אלקטרופורציה לתוך העור העובר של HH5 עוברים ונצפתה 12 h . לאחר האלקטרופורציה בעת השוואת ה-DNA ו-mRNA שיתוף אלקטרופורציה באותו עובר, DNA המבטא FP היה גם באופן משמעותי ועקבי פחות יעיל מזו של mRNA (איור 2C). על ידי כימות כל העוברים electroporated עם mRNA בלבד, דנ א, או שילוב של השניים, מצאנו כי מעבר mRNA ~ 75% של תאים באזור נתון, בעוד ה-DNA רק לשנות את ~ 25% התאים באזור נתון (איור 2D). התפשטות ביטוי של חלבונים פלורסנט המקודדים על ידי mRNA או DNA לא היה שונה באופן משמעותי בכל העוברים שכונתיות (איור 2E).

ביטוי החלבון מהיר יותר ב-mRNA אלקטרופורציה מאשר אלקטרופורציה של דנ א

MRNA מזוהמים צריך להוביל לייצור חלבון מהיר יותר מאז הוא יכול להיות מזוהה באופן מיידי על ידי מכונות תרגום cytosolic כפי שניתן לראות באיור 3. ה-DNA חייב להיות translocated מוקם לגרעין, משועתק, ו-mRNA הועבר חזרה ציטוסול שבו הוא מוכר על ידי מכונות תרגום cytosolic, צפוי לקחת יותר זמן. כדי להשוות באופן ישיר mRNA לעומת שיעורי ביטוי DNA של ייצור החלבון, אנו ביצעו סדרה של ניסויים בקורס זמן שבו אנו שיתוף שכונתיות שילוב equimolar של DNA (pCMV. H2B-mKate2) ו-mRNA (H2B-סיטרין) לתוך העור של HH5 עוברים. גילינו mRNA-מקודד ביטוי FP סביב 22 דקות לאחר האלקטרופורציה, אשר ממשיך להגדיל את עוצמת הקרינה היחסית של ~ 6 h (איור 3a-E, המשלים. סרט S1b). לעומת זאת, DNA-קודד ביטוי FP הוא ראה לראשונה ב ~ 1.5 h פוסט אלקטרופורציה (איור 3A'-E ', משלים. Movie S1c) וממשיך להגדיל את הבהירות עד 6 שעות כאשר הסרט הופסק. בגלל התאים האלקטרו-מגנטיים של ה-DNA רוויים על ידי סימן 6 h, אנו מחדש את המצב עם מצבי הדמיה חלשה יותר (איור 3F-f '). בכל נקודות הזמן של פקיעה בזמן זה (22 דקות עד 6 שעות), mRNA מעביר כמה פעמים יותר תאים מ-DNA (המשלים. סרט S1a, היעילות הכוללת של אלקטרופורציה באמצעות שדה ברברייטדה DAPI אינם מוצגים משום תמונות אלה נלקחים מתוך השגות של העובר שליו סוג פראי. בהתבסס על זה, אנו מסיקים כי mrna אלקטרופורציה מוביל החלבון הביע מוקדם יותר.

האלקטרופורציה של mRNAs מרובים היא יעילה מאוד

לאחר מכן, ביקשו לבדוק עוד יותר את היעילות של האלקטרופורציה של mRNA על-ידי אלקטרופורטינג של Mrna מרובים לאזור מעניין. שיתוף אלקטרופורציה של DNAs מרובים הוכח בעבר להיות יעיל יחסית, מראה עם מספר רב התווית להיות 25%, 14%, ו 10% עבור 2, 3, ו 4 בנייה DNA electroporation, מחושב כחלק מהמספר הכולל של תאים11 . אנו הראשון electroporated שני mRNAs הקידוד FPs ברורים באופן שונה (Turquoise2-Golgi/H2B-סיטרין) לתוך HH5 עוברים והשיגו יעילות מעבר גבוה בכל האזורים electroporated. השתמשנו זה כפול אלקטרופורציה כדי ללכוד סרטים של התרחבות רדיאלית בין השטח pelלבין opaca בעובר HH4 gastrulating, התמונה 2 h פוסט אלקטרופורציה (סרט משלים S2a, b, ו-c). H2B-סיטרין מקומית בתוך גרעין התא ומאפשרת הפצת תאים למעקב27. Turquoise2-golgi FP מופיע להראות קוטביות subcellular בתוך התאים העובריים אבל לא מופיע לתאם עם מהירות או כיוון של הזזת תאים אאקטודרם ב vivo28. הסרט הזה (משלים סרט S2) מראה כי תאים electroporated עם מספר mrnas יכול להמשיך פעילות סלולרית נורמלית ללא פגמים גלויים לעין.

יתר על כן, co-אלקטרופורציה של 4 mRNAs-Turquoise2-Golgi (כדי להמחיש מכשיר Golgi), LifeAct-eGFP (כדי לדמיין את F-actin), H2B-סיטרין (כדי להמחיש את הגרעין), ו ממברנה-דובדבן FP (כדי להמחיש ממברנות) — הביא 87% העברה החוצה יעילות של כל 4 mRNAs בכל האזורים electroporated (איור 4). LifeAct-EGFP ו-H2B-סיטרין הופרדו מכלי העיבוד הליניארי בתוכנה המסחרית.

שיטת FRAP מראה את ההתדרדרות המהירה של האלקטרופורציה mRNA במהלך השעתיים הראשונות שלאחר הפגיעה.

זה ידוע כי mRNAs עירום מושפל במהירות על ידי RNAases הסלולר29. אנו מרשים כי mrna אלקטרופורציה עשוי להיות שימושי עבור אובדן או לקבל הפונקציה ניסויים על ידי המאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים בעובר מתפתח. לכן, זה יהיה מועיל לכמת את קצב הריקבון mRNA אחרי mRNA electroporation, מאז mRNA מדבר מהר יותר מ-DNA בתאים. בדוחות הקודמים של mrna אלקטרופורציה בתאי גזע העכבר למבוגרים בלבד, סביב 80% mrna זוהה 2 h פוסט אלקטרופורציה על ידי רביעיית-PCR, עדיין לא מעט mrna זוהה על ידי 24 h פוסט אלקטרופורציה15. ביקשו להוסיף לכמת mRNA ביטוי פוסט-אלקטרופורציה על ידי עיצוב בתוך vivo FRAP בדיקות לזיהוי רמות mRNA בתאי electroporation.

פוטוהלבנת היא ההרס הבלתי הפיך של fluorophore שיכול להתרחש כאשר fluorophore חלבונים פלורסנט במקרה שלנו הוא במצב נרגש, אשר מבטלת את הניאון במהלך התבוננות30,31. כל אור הנפלט מחלבונים פלורסנט (FPs) כי ניתן לזהות בתאים מולבן מעל רמות בסיסית צריך, לכן, לייצג FPs שתורגם לאחרונה מקודד על ידי mRNAs שלמים, מזוהמים. לכן, אנו מחפשים לצלם את התאים electroporated כדי לחסל את כל הזריחה הקיימת הנגזרת FP במגוון נקודות זמן ולעקוב אחר התאוששות זריחה הבאים.

באמצעות מיטוב הגדרות photobleaching לבנת כמתואר בסעיף הפרוטוקול, מצאנו כי הלבנה מפחיתה בתחילה את עוצמת הזריחה בכל התאים המולבן על ידי ~ 95% כאשר מייד לאחר האירוע photobleaching לבנה. זה נעשה ב 45 דקות, 2 h, ו 5 h פוסט אלקטרופורציה (איור 5A-C). התאוששות פלואורסצנטית בכל תא בתוך האזור הלבנה היה מעקב במשך 30 דקות זמן אחרי הלבנת בכל נקודת זמן על ידי הדמיה באותו אזור במרווחי זמן קבועים (3 או 5 דקות). הנתונים שלנו מראים כי יש ירידה משמעותית ברמות mRNA מנוכר בין 45 דקות ו 5 h פוסט אלקטרופורציה. זה מוצג על ידי הירידה הגדולה FRAP נמדד ב 5 h לעומת 45 מינימום post-אלקטרופורציה. כדי להדגיש את ההחלמה הפלואורסצנטית בתאים מולבן במיוחד בנקודת הזמן 5 h, שיפרתי את הבהירות באיור 5A-C באמצעות הכלי בהירות/ניגודיות ב-imagej ולהראות אלה תמונות שהשתנו באיור 5A-F. מעניין, יש טרוגניות גדול התאוששות פלואורסצנטית מתא אל התא בתוך האזור photobleached ולבן ב 2 h כי כמה תאים לשחזר את הזריחה מהר יותר מאשר תאים אחרים (איור 5E ', ראה ראשי חץ). עם זאת, כל התאים בתוך האזור מולבן 5 h לשחזר את הזריחה איטית יותר (איור 5F ') מאשר תאים מולבן ב 2 h. אנו גם לזהות באופן פעיל מחלוקת תאים בתוך אזור התמונה שלנו, הרומז כי תאים לא מתו כתוצאה של הלבנת תהליך (איור 5E ').

אנו מכמת את התוצאות באיור 6A על-ידי הצגת עוצמת האות המנורמלת של כל תא בתוך האזורים המולבן במשך 30 דקות לאחר האירוע photobleached לבנה. עבור כל תא, ערכי הזריחה היו מנורמלות כנגד עוצמת האות של אותו תא מיד לאחר הלבנה. נורמליזציה זו נעשתה עבור כל התאים ברחבי כל הזמנים התמונה (45 דקות, 2 h, 5 h). הערכים המנורמטיים של התאוששות פלואורסצנטית של התאים בתוך אזור מולבן אותו צילום היו אז במאגר יחד והגרף לאורך זמן לאחר האירוע הלבנה; לכן, כל נקודה בגרף מייצגת ~ 35 תאים. הנתונים הבלתי מנורמלים מוצגים גם באיור 6B, בו כל שורה מייצגת תא עם שחזור עוצמת אות הזריחה מיד לאחר הלבנת האור. נתונים אלה הכולל מציע כי על ידי 5 h, כל התאים התרוקנו רוב mRNA שלהם, עם חלק גדול של הירידה הזו המתרחשים בין 45 דקות ו 2 h פוסט אלקטרופורציה.

Figure 1
איור 1: סכמטית של הליך שיבוט להפוך pCS2 + LifeAct-eGFP לבנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ה-mrna אלקטרופורציה יעיל יותר מאשר אלקטרופורציה DNA. (א-א ') דנ א המבטא pCS2. H2B-סיטרין היתה אלקטרופורלתוך האקטועור של עוברים HH5. הקרינה הפלואורסצנטית נצפתה 12 h פוסט-אלקטרופורציה. סרגל בקנה מידה = 50 μm. (b-b ' ') mrna הבעת H2B-הסיטרין היתה אלקטרופורתה לתוך העור של עוברי HH5. קרינה פלואורסצנטית נצפתה 12 שעות פוסט-אלקטרופורציה. סרגל בקנה מידה = 50 μm. (c-C ') שילוב equimolar של ה-DNA (pcmv. H2B-mKate2) ו-MRNA (H2B-סיטרין) היה electroporated לתוך HH5 עוברים ונצפתה 12 h פוסט אלקטרופורציה. שלושה עוברים נבדקו בכל תנאי (n = 2 ניסויים). סרגל בקנה מידה = 50 μm. (ד) שלושה עוברים מ A, B ו-C (9 העוברים כולל) היו כמותית עבור יעילות אלקטרופורציה באמצעות כלי ניתוח חלקיקים על imagej. אזור מ200 יקרומטר מכל עובר היה כימות (לפחות 150 תאים נספרו לכל אזור). המקף האמצעי מייצג ממוצע, בעוד שמייצגי הפעילויות העליונים והתחתונים מייצגים את סטיית התקן מהממוצע. (E) העוברים שכונתיות (DNA ו-mrna) עוברי מנותח להפצת האות על פני כל התאים electroporated באזור נתון 200 יקרומטר. כל עובר היה סביב 100 תאים חיובי ל-mrna אלקטרופורציה ו 30 תאים חיובי עבור אלקטרופורציה DNA. המקף האמצעי מייצג ממוצע, בעוד שמייצגי הפעילויות העליונים והתחתונים מייצגים את סטיית התקן מהממוצע. אין הבדל משמעותי בין התפשטות mrna vs. DNA אלקטרופורציה, אבל mrna אלקטרופורציה הוא הרבה יותר יעיל מזה של DNA. (א-ג) מידות = 425.10 x 425.10 x 55 μm. פיקסל לשכון 2.55 μs. קו ממוצע 4. סיביות לפיקסל = 16. מטה-נתונים של מיקרוסקופ = מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי הפוך, המטרה 20x (ראה טבלת חומרים) (A) Ex: 488 nm (0.05%), פליטה מסלול S1 = 508-579 nm; (ב) Ex = 488 nm (5.0%), פליטת מסלול S1 = 508-579 nm; (ג) Ex = 488 nm (5.0%), 561 nm (5.0%), פליטה מסלול S1 = 508-579 nm; S2 = 606-695 ננומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: mrna אלקטרופורציה מראה ביטוי על ידי 22 דקות לאחר האלקטרופורציה והוא מהיר הרבה יותר מאשר אלקטרופורציה DNA. תמונות מייצגות של קורס הזמן לאחר mrna (H2B-סיטרין) ו-DNA (pcmv. H2B-mKate2) אלקטרופורציה עם ניתוח פרופיל עלילה ב 22 דקות (a-a), 45 min (b-b '), 1.5 h (c-c '), 3 h (d-d '), ו 6 h (e-E ') ב תחילת ההדמיה (n = 1). ניתוח פרופיל מתווה מסופק עבור כל נקודת זמן המוצגת על החץ המצויר בתמונה הממוזגת. כל שיא בפרופיל ההתוויה מייצג את הגרעין של תא אלקטרופורנטי. התאים בדרך כלל להיות בהירים יותר על 6 מרווח h של הסרט, המציין כי mRNA עדיין מתורגם לחלבון פלורסנט חדש. עבור 6 שעה זמן, תמונות של אותו אזור שנתפסו באמצעות תנאי הדמיה זהים (e-e ' ') ותנאים הדמיה חלשה יותר (F-f ') מוצגים מכיוון התמונות של תאים אלקטרופורמיות DNA היו רוויים מאוד באמצעות הראשונית תנאי הדמיה. סרגל בקנה מידה = 20 μm. מידות: 425.10 x 425.10 x 55 μm. התמונה מוצגת כהטלה בעוצמה מרבית בכל נקודות הזמן. פיקסל לשכון 2.55 μs. קו ממוצע 4. סיביות לפיקסל = 16. מטה-נתונים מיקרוסקופ = מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי הפוך, המטרה 20x (ראה טבלת חומרים) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5.0%) להתחלה; Ex = 488 nm (7.5%), 594 nm (0.5%) עבור נקודת הזמן האחרונה (איור 2F), מסלול פליטה S1 = 499-562 ננומטר; S2 = 605-661 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שיתוף האלקטרופורציה של ארבעה מבני mRNAs המכוון למבנים תת-סלולריים שונים הוא יעיל מאוד. העור של העובר HH3 היה electroporated עם mRNAs כי לקודד mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-סיטרין, ו ממברנה-דובדבן. העובר תוקן והוא נוצר בתמונה ב -4 שעות פוסט-אלקטרופורציה. רוב התאים הם electroporated בתוך אזור ייעודי האלקטרודה עם כל ארבע mRNAs (87%). דמויות מייצגים הראו (3 עוברים כל אחד, n = 2 ניסויים). סרגל קנה מידה = 50 μm. (א) מיזוג כל ארבע mrnas (MTurquoise2-Golgi, lifeact-EGFP, H2B-סיטרין, ו ממברנה-דובדבן). (ב) רק H2B בערוץ הסיטרין (Ex = 488 ננומטר (0.7%), Em = 455-499 nm). (ג) רק MTurquoise2-golgi ערוץ (Ex = 458 ננומטר (22.0%), Em = 455-499 nm). (ד) מיזוג H2B-סיטרין ו-MTurquoise2-golgi מראה כי golgi מעטפות צד אחד של הגרעין ברוב התאים. (ה) רק הערוץ היחיד-Egfp (Ex = 488 ננומטר (0.7%), Em: 455-499 nm). (ו) רק ממברנה-דובדבן ערוץ (Ex = 594 ננומטר (37.1%), Em = S2:570-695 nm). (G) מיזוג Lifeact-egfp ו ממברנה-דובדבן מראה חופפים ברוב התאים. מידות = 425.10 x 425.10. פיקסל לשכון 1.58 μs. קו ממוצע 4. סיביות לפיקסל = 16. מטה-נתונים של מיקרוסקופ = מיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך, המטרה 20x (ראה טבלת חומרים) Ex = 405 nm (2.4%), 458 nm (22.0%), 488 nm (0.7%), 594 nm (37.1%), פליטת מסלול S1 = 455-499 nm; S2 = 570-695 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שיטת הלבנה מראה ירידה מהירה של mRNA electroporated במהלך חמש השעות הראשונות שלאחר הפוסט-אלקטרופורציה. צילום הלבנת של מחוז 100 μm ² המכיל תאים אלקטרופורתיים עם mRNA ביטוי H2B-הסיטרין מבוצעת ב 45 דקות, 2 h, ו 5 h פוסט-אלקטרופורציה. העובר היה בתמונה במרווחי זמן קבועים לאחר הפוטולבנת (3 או 5 דקות). תנאי הלבנת התמונה הם כדלקמן: 70% 405 ננומטר לייזר, 100 איטראציות, כ 5 דקות משך עבור האזור כולו. סרגל קנה מידה 50 = μm. (a-a ') 45 דקות לפני ואחרי אקונומיקה. ב מראה העובר מיד לאחר photobleaching לבנת ו C מראה העובר 30 דקות לאחר האקונומיקה. סרגל קנה מידה = 50 μm. (b-b ' ') 2 h לפני ואחרי אקונומיקה. היקף הכיכר מוזז מכיוון שהתאים שבתוך אזור הצילום נעו מעט במהלך תקופת האקונומיקה. (C-C ' ') 5 h לפני ואחרי אקונומיקה. (D-D ') אותן תמונות כמו A-A ' ' עם בהירות משופרת (ערך מרבי המותאם ל-11550 כדי לשפר את הבהירות שלאחר האיסוף). (E-E ' ') תמונות זהה ל-B-B ' עם בהירות משופרת (ערך מרבי המותאם ל-11550 כדי לשפר את הבהירות שלאחר האיסוף). ראשי החץ הלבנים מצביעים על תאים בעלי שחזור קרינה גבוהה יותר מתאים מסביב. ראש החץ הציאן מצביע על תא מולבן שעבר לאחרונה מיטוזיס. (F-F ') תמונות כמו C-C ' ' עם בהירות משופרת (הערך המירבי המותאם ל-11550 כדי לשפר את הבהירות שלאחר האיסוף). מידות = 425.10 x 425.10 x 42 μm. התמונה מוצגת כהטלה בעוצמה מרבית בכל נקודות הזמן המוצגות בתמונה. פיקסל לשכון 1.58 μs. קו ממוצע 4. סיביות לפיקסל = 16. מטה-נתונים מיקרוסקופ = הפוך מיקרוסקופ קונפוקלית המטרה 20x (ראה טבלת חומרים) Ex = 488nm (1.5%), פליטת מסלול S1 = 508-553 nm אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: קוונפיקציה של התאוששות הזריחה בתאי הצילום. (א) האינטנסיביות הפלואורסצנטית של כל התאים באזורים הלחיים (~ 35 תאים) אותרו עבור כל תא בודד בכל פרק זמן שלאחר אקונומיקה. יש ירידה גדולה בקצב של עוצמת האות התאושש מ 45 דקות כדי 2 h, ואחריו טיפה קטנה יותר מ 2 h כדי 5 h. שורת השגיאה העליונה מוצגת עבור כל נקודה, המייצגת את סטיית התקן מהממוצע. השורה המוצגת היא קו רגרסיה ליניארי. R ² עבור 45 דקות, 2 h, ו-5 h הוא 0.83, 0.58, ו 0.84 בהתאמה. החלק העליון של שורת השגיאה מוצג עבור כל נקודה. (ב) מתבצע מעקב אחר העוצמה הפלואורסצנטית של כל התאים באזורים הלחיים (~ 35 תאים) עבור כל תא בודד במהלך כל תקופה שלאחר אקונומיקה והוספת גרף ללא נורמליזציה. יש ירידה גדולה בקצב של עוצמת האות התאושש מ 45 דקות כדי 2 h, ואחריו טיפה קטנה יותר 2 h כדי 5 h. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט משלים 1: mRNA אלקטרופורציה מובילה לביטוי חלבון מוקדם יותר מאשר אלקטרופורציה DNA. H2B-סיטרין mRNA ו H2B-mKate2-DNA electroporated לתוך עור של העובר HH5. התמונה באזור היא בגבול של רקמות עובריים ועובריים במיוחד. סרגל קנה מידה = 50 μm. (א) הן H2B-סיטרין וH2B-mKate2 ערוץ המוצג (Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5.0 499-562%) S2:605-661 nm). (ב) רק MRNA H2B-הסיטרין ערוץ המוצג (Ex = 488 nm (15%), אם = 499-562 nm). (ג) רק H2B-MKATE2 ערוץ DNA המוצג (Ex = 594 ננומטר (5.0%), Em = 605-661 nm). מידות = 850.19 x 850.19 x 110 μm. התמונה מוצגת כהטלה בעוצמה מרבית בכל נקודות הזמן המוצגות בתמונה. פיקסל לשכון 2.55 μs. קו ממוצע 4. סיביות לפיקסל = 16. מטה-נתונים מיקרוסקופ: מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי הפוך, המטרה 20x (ראה טבלת חומרים) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5.0%), פליטה מסלול S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרט משלים 2: שיתוף אלקטרופורציה של mRNAs מתיר התנהגויות תא שונות ללמוד באופן דינאמי. התרחבות הרדיאלי של התאים בין הגבול העובריים והעובריים ביותר הם אלקטרופורעם mRNA (H2B-סיטרין ו-mTurquoise2-Golgi) ומתבצעת התמונה במהלך הגירה כלפי חוץ. סרט זה הושפע על ידי מיקרוסקופ מוקד מ 2 כדי 5 h פוסט אלקטרופורציה על ידי הדמיה כל 6 דקות. סרגל סרגל = 50 μm.  (א) גם ערוצי H2B-סיטרין וmTurquoise2-golgi המוצגים (Ex = 458 ננומטר (28%), 488 nm (5.0%), Em = 446-526 nm; S2:508-553 nm). (ב) רק H2B הצהוב ערוץ המוצג (Ex = 488 ננומטר (5.0%), Em = S2:508-553 nm). (ג) רק MTurquoise2-golgi ערוץ המוצג (Ex = 458 ננומטר (28%), Em = 446-526 nm). מידות = 425.10 x 425.10 x 32.5 μm. התמונה מוצגת כהטלה בעוצמה מרבית בכל נקודות הזמן המוצגות בתמונה. פיקסל לשכון 0.79 μs. קו ממוצע 4. סיביות לפיקסל = 16. מטה-נתונים מיקרוסקופ = מיקרוסקופ קונפוקלית הפוך, המטרה 20x (ראה טבלת חומרים) Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5.0%), פליטה מסלול S1 = 446-526 nm; S2 = 508-553 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, סיפקנו צעד אחר צעד הוראות על איך בדיוק מיקרו הזרקת ו אלקטרופורטה mRNA לתוך התאים של עוברי שליו הגאוגעיים. הדגמנו כי בתוך מתורבת מסונתז mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים (איור 2 ו -3). קרינה פלואורסצנטית H2B-צהוב מתורגם מ-mRNAs באמצעות מיקרוסקופ conporated בתוך ~ 20 דקות וגדל בזריחה FP במשך שעות (איור 3, משלים סרט 1). זה מהיר באופן מפתיע וקרוב לזמן ההבשלה המשוער לסיטרין32,33. FPs הביע מווקטורים DNA אותרו לאחר 2-3 h (איור 3, משלים. סרט 1), הדומה לדוחות הקודמים8,34,35. FPs שונים יש זמנים התבגרות ייחודי, כך תכנון מתקדם תבטיח כי FP אידיאלי נבחר במונחים של ההבחנה ספקטרלית והתבגרות הקינטיקה הרצויה לניסוי. בנוסף, מסונתז mRNAs ביעילות רבה יותר שיתוף התאים העובריים מאשר וקטורים DNA11. היעילות הגבוהה יותר גורמת ליותר תאים להיות מפוחים באזור העניין עם יחיד (איור 2) או אוכלוסיות מרובות של mrnas (איור 4).

היציבות של mrna מוסדר ביותר, והיא יכולה להיות מושפעת על ידי פוליאדלציה, שחבור, תרגום, מבנה משני, ואזורים לא מתורגמים לשם כמה36,37. מחצית החיים של שניהם אנדודוגני ו מסונתז mrna בתוך תאים יכולים להשתנות מדקות עד ימים36,38. השתמשנו התאוששות vivo פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) כדי אקונומיקה הקיים מקודד mRNA H2B-סיטרין והוא ראה את ההתאוששות ביותר משמעותי H2B-סיטרין במהלך 2 השעות הראשונות פוסט-אלקטרופורציה (איור 5 ו 6). mrnas שונים ללא ספק יש שונה מחצית חיים מבוסס על אורכם, רצפים פנימיים, 5 ' ו 3 ' שינויים36,37, אז כל אחד חייב להיות מקבל במידת הצורך.

הדמיה חיונית בדרך כלל דורש הסחר-off בין התנאים האופטימליים עבור דימות באיכות גבוהה ומהיר, הדמיה פחות-רעילים39,40. כאשר הדמיה, מומלץ להשתמש ככוח לייזר נמוך ככל האפשר כדי למזער את הלבנת והנזק לתאים העובריים (ראה הערות לשלב 5.3 של הפרוטוקול)40. שינוי הגדרת המיקרוסקופ עבור אוספים מהירים (למשל, מהירות סריקה מהירה יותר, פחות ממוצע) יכול לעזור לעתים קרובות מבלי לאבד את רזולוציית התמונה הנחוצה41. לבסוף, הטיפול צריך להילקח בטיפול ומניפולציה של העוברים במהלך הקציר, אלקטרופורציה, והדמיה (ראה שלב 4). העוברים בשלב מוקדם הם עדינים ועלולים להיפגע בקלות.

באופן כללי, העיתוי המדויק והלוקליזציה המדויקת של מחקרים מסוימים של mrna אלקטרופורציה מאפשרים לנצל את הביטוי המהיר, יעילות משותפת, והתפרקות מהירה של התעתיקים של mrna. ביטוי מיותר או משפט של גן של עניין יכול להתבצע באמצעות אלקטרופורציה של מסונתז . העומס הריכוז עבור כל mRNA הוא קריטי, כמו electroporating יותר מדי mRNA עלול לגרום רעילות תאית שאינה ספציפית, בעוד mRNA מעט מדי ייתכן לא תווית התאים הרצויים או לגרום לשינויים פנוטימית כראוי. שפע של וקטורים שנוצרו עבור סינתזה מחוץ לתחום של mRNAs לקודד סמנים FP fusions עבור ויזואליזציה או מוצרי גנים שונים עבור רטבאליות של תהליכים ביולוגיים מגוונים כבר קיימים ממערכות מודל שונות בעלי חיים. רבים מאותם בונים המיועדים בסינתזה של מבחנה mRNA יכול להיות במהירות ובזול המתקבלים ממאגרי פלביניים ללא כוונת רווח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין להצהיר עליהם.

Acknowledgments

אנו מודים לדוד הוס על תובנות מועילות בעבודה זו. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מלגת מחקר הקיץ של קרן רוז הילס (2016-2018) ומלגת מחקר של אוניברסיטת דרום קליפורניה ל-ת, מכון מחקר סבן במסגרת הכשרת טרום-דוקטורט לרפואה, ואוניברסיטת דרום קליפורניה מחקר הסמכה עמיתים התוכנית פרס ר

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1, (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174, (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3, (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007, (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3, (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296, (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41, (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42, (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39, (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32, (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13, (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144, (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8, (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12, (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216, (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149, (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5, (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8, (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88, (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97, (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414, (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121, (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233, (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39, (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102, (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12, (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55, (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics