MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz bıldırcın embriyo modeli sistemde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade izin veren bir yöntem olarak haberci RNA (mRNA) elektroporasyonu rapor. Bu yöntem floresan hücreler için kullanılabilir ve Elektroporasyon kısa bir süre sonra zaman atlamalı mikroskopinin in vivo hareketlerini kaydetmek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MRNA Elektroporasyon 'ın floresan proteinlerin, yaşayan bıldırcın embriyoları içinde DNA electroporasyon 'dan daha hızlı ve geniş çapta hücreleri etiketlemesine izin verdiği bildiriyoruz. Yüksek transfeksiyon verimliliği, en az 4 farklı MRI 'nin ~ 87% verimlilik ile ortak transfazine izin verir. Electroporated mRNAs 'ların çoğu, ilk 2 h sonrası Elektroporasyon sırasında bozulur ve gelişmekte olan embriyonun içinde zaman duyarlı deneyler yapılacaktır. Son olarak, çeşitli hücresel hedeflenen floresan proteinleri kodlayan Mros ile electroporated canlı embriyolar dinamik görüntü nasıl açıklar.

Introduction

Electroporation plazma membranında geçici gözenekleri oluşturmak için bir elektrik darbe kullanan bir fiziksel transfeksiyon yöntemidir, nükselik asitler veya kimyasallar gibi maddelerin sitosol içine geçmek için izin. Electroporation yaygın bakteri, Maya, bitkiler ve memelilerin hücreleri1,2,3içine DNA teslim etmek için kullanılır. Gelişmekte olan kuş embriyo içindeki hedef hücrelere ve dokulara genetik yükleri tanıtmak için rutin olarak kullanılır ve hücre4,5,6, kalkınma veya etiket göç nüfusun genetik kontrolünü incelemek için 7' ye kadar. Ancak, DNA Elektroporasyon8ile birçok deneysel sınırlamalar da var. Örneğin, DNA Elektroporasyon genellikle hücre başına ifade vektörler son derece değişken sayılar tanıttı ve daha sonra mrnas ve onlar kodlamak proteinler. Bu değişkenlik, hem görüntü analizi hem de veri yorumlama9,10karmaşıklaşır önemli hücre hücresi heterojenite yol açabilir. Ayrıca, DNA Elektroporasyon proteinleri sadece ~ 3 h sonrası Elektroporasyon ifade etmeye başlar ve 12 h kadar hücre numarası ve floresan yoğunluğu maksimum verimlilik ulaşmaz, muhtemelen çekirdek içine aktarmak için gerekli zaman nedeniyle ve komple hem transkripsiyon ve tercüme vivo11.

Bunun aksine, mRNA transfeksiyon, Xenopus laevis oositler de dahil olmak üzere çeşitli model sistemlerinde etkili bir şekilde kullanılan12,13, mRNA lipofectamine transfeksiyon 14 tarafından insan kök hücrelerini yeniden programlama ve yetişkin fareler15' te realcitrant nöral kök hücrelerini electroporating. MRNA Elektroporasyon 'ın, farklı floresan proteinlerini (FPs) kodlayan in vitro sentezlenmiş mrnas 'ları kullanarak erken kuş embriyonik gelişiminde hücreleri etkili bir şekilde etiketlemeye yönelik yeteneğini test ettik. Çalışmalarımız için, Xenopus ve zebra balığı embriyoları proteinleri ifade etmek için yaygın olarak kullanılan pCS2 + vektörü, çok amaçlı bir ifade vektörü kullandık. PCS2 + ' da bulunan SP6 ve T7 RNA polimeraz promotörleri, bir in vitro transkripsiyon/çeviri sisteminde kullanıldığında klonlanmış genden mRNA ve proteinin sentezine izin verir.

Burada, mRNA elektroporasyonu, gastrulating bıldırcın embriyoları floresan proteinleri (FPs) hızlı ve verimli ifade sağlar göstermektedir. Bu çalışmalarda kullanılan ifade vektörler birçok tasarlanmış ve üretti. Örneğin, lifeact-EGFP geni16 ' nın pCS2 + vector17 ' sini CMV organizatör ve SP6 promotör 'den ifade etmek için subklonladık. Eklenen gen, SP6 organizatör ve upstream bazılarında SV40 Poly (A) kuyruk18aşağı yatıyor. Embriyoların mRNA ve DNA ile birlikte electroporated, FPs içinde vitro transkripsiyonu mRNAs kodlanmış ilk 20 dk Electroporation içinde tespit edildi, DNA ifade vektörler FPs sadece sonra tespit edildi 3 h. nükleer, Golgi ve çok sayıda mRNAs kodlaması membran proteinleri aynı anda bir embriyo içine electroporated olabilir, bireysel hücrelerde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade sonucu. Son olarak, photobleaching (FRAP) tahlil sonra bir in vivo floresans kurtarma kullanarak, biz 2 saat içinde electroporated mRNAs çürümesi çoğunluğu gösterir. Böylece, sınırlı yeni protein çevirisi ile birlikte hızlı ilk protein üretimi mRNA Elektroporasyon ifade geçici kontrol gerektiğinde değerli bir teknik yapar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Los Angeles Çocuk Hastanesi ve Güney Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komiteleri onaylı yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Generation pCS2 tabanlı Ifade vektörler

  1. Klonlamak için pCS2. Lifeact-eGFP, vektör omurgasını hazırlamak 2 μg pCS2. CycB1-GFP (farklı bir ekleme içeren bir yapı) ile BamHI (10 U) ve Bsrgı (10 U) uygun sindirim tamponu (bkz. malzeme tablosu) Toplam reaksiyonda 1x seyreltilmiş 37 °C ' de 1 h için 50 μL hacmi (klonlama prosedürün şematik için bkz. Şekil 1 ).
    1. Dephosphorylate ücretsiz 3 ' OH karides alkalin fosfataz (1 U) ekleyerek kısıtlama enzim reaksiyondan vektör omurgası biter. 37 °C ' de 30 dak.
    2. Tüm karışımı çalıştırın 1% agaroz jel/1x Tris asetat EDTA (Tae) tampon içinde 90 V ~ 50 dk ve sonra jel leke bir 0,5 μg/ml etidium bromür çözeltisi içinde 1x Tae tampon 15 dakika yumuşak sallanan ile. Ayrıca, DNA boyutlarını belirlemeye yardımcı olmak için ücretsiz bir şeritte moleküler ağırlık işaretçileri yüklemek için emin olun.
    3. DNAS 'ın kesilmemesi için DNA güvenli UV transaydınlatıcıyı kullanarak, bir vektör omurgasını (4kb beklenen bant boyutu) agaroz jeli hızlı bir şekilde kesip, üreticinin talimatlarını kullanarak bir jel arıtma kiti kullanarak jel parçasından DNA parçasını izole edin.
  2. Adım 1,1 ile aynı anda, 1 saat 37 °C ' de 50 μL toplam reaksiyon hacminde 1x 'ye seyreltilmiş uygun sindirim tamponunda BglII (10 U) ve Bsrgı (10 U) ile 2 μg pEGFP-N1-Lifeact sindirerek Ekle hazırlayın. Daha önce adım 1.1.2-1.1.3 ' de açıklandığı gibi 800 BP bandı izole etmek için% 1 agaroz jel tüm karışımı çalıştırın.
  3. Hem vektör ve ekleme saflaştırılmış ve spektrofotometre üzerinde nicelik sonra, birleştirmek 50 ng vektör ve 38 ng Ekle (1:3 molar oranı eklemek için Vector) T4 DNA ligaz tampon eklendikten önce T4 DNA ligaz bağlı ligasyon reaksiyonu katalizleme. Ayrıca, hiçbir DNA denetimi, yalnızca bir vektör denetimi ve bir INSERT yalnızca denetimi ayarlayın. Oda sıcaklığında tüm reaksiyonları 30 dakika boyunca kulyın.
    1. Ligasyon karışımı (ler) 1 μL 'yi yetkili E. coli DH10 dönüştürün. Ayrıca, su sadece negatif kontrol ve pUC19 pozitif kontrol 20 pg dönüştürün. Bakteriler, 50 μg/mL ampisilin içeren Luria broth (LB) agar plakalarına yayılır ve bir gecede 37 °C ' de inküyeler.
    2. Ertesi sabah, her plakanın kolonileri saymak.
      Not: İdeal olarak, negatif kontrol plakaları üzerinde koloniler, vektör + Ekle ligasyon plakaları üzerinde > 100 koloniler ve sadece vektör plaka üzerinde daha az koloniler olmalıdır.
    3. En az 8 bakteri kolonileri seçin agar plaka vektör + Ekle ligasyon karışımı ile dönüştürülmüş ve steril kürdan veya pipet uçları kullanarak onları aşılamak 2 ml sıvı lb suyu içeren 50 μg/ml ampisilin.
    4. Ticari Plasmid Sage kitleri kullanarak klonlar her birinden DNA ayıklamak.
    5. Bir tanılama kısıtlama Özeti kullanarak her Klondan DNA 500 ng çalıştırın Noti kullanarak (10 u) ve bamhi (10 u) uygun sindirim tampon içinde 1x için seyreltilmiş 1 h 37 °c ve sindirilmiş DNA çalıştırın 1% agaroz jel 1x Tae tampon. PCS2. Lifeact-eGFP pozitif klonlar için beklenen bant boyutları 3,9 KB ve 978 BP vardır.
    6. 1 pg-100 ng DNA 'nın pozitif Klondan yetkin E. coli DH10 içine dönüştürülmesi ve 3-4 Sage reaksiyonları, in vitro transkripsiyon reaksiyonu için yeterli miktarda DNA elde etmek için önceki adımlarla ayrıntılı olarak hazırlar (10 μg asgari).

2. mRNA 'nın In vitro transkripsiyon ile hazırlanması

  1. PCS2. LifeAct-eGFP ' d e 10 μg, NotI (10 U) ile eklemin 3 ' ucunda, 37 °C ' de 50 μL 'nin toplam reaksiyon hacminde 1x 'ye seyreltilmiş uygun bir sindirim tamponu üzerine doğru.
    Not: RNase kontaminasyonunu önlemek ve mRNA bozulmasını azaltmak için mRNA örneklerini kullanırken eldiven giyin.
  2. DNA 'Yı fenol karışımı kullanarak arındırın: kloroform: isoamill alkol (25:24:1, v/v).
    1. 200 μL 'ye eşit sindirim reaksiyonu toplam hacmini yapmak için 150 μL RNase-Free su ekleyin. Daha sonra, 200 μL fenol ekleyin: kloroform: isoamill alkol ve Vortex karışımı 20 s.
    2. Maksimum hızda bir mikrofuge Santrifüjü (18.400 x g) için 2 dk. dikkatle doğrandırılmış DNA içeren üst sulu faz çıkarın. Ek kirleri kaldırmak için bu adımı tekrarlayın ve alt ve üst sıvı fazlar arasında olabilir beyaz çökelme bozmaya dikkatli olun.
  3. 1/10 hacmi 3M sodyum asetat (RNase-Free) ve 2,5 hacimleri% 100 etanol ekleyerek doğrulanmış DNA 'Yı çökeltir. Karışımı-20 °c ' de > 30 dakika boyunca bırakın, sonra maksimum hızda santrifüpleme ile DNA 'yı Pelet (18.400 x g).
    1. 70% etanol ile DNA Pelet yıkayın, sonra > 5 dakika için Pelet hava kuru.
    2. 5 μL RNase-Free su içinde DNA Pelet çözülür. Spektrofotometrenin DNA 'sını ölçün.
      Not: Beklenen DNA konsantrasyonu 1.7-2.0 arasında A260/A280 oranında ~ 0.5-1 μg/μL 'dir.
  4. İn vitro transkripsiyon için (ıVT) pCS2. LifeAct-eGFP DNA 'nın 1 μg 'ını kullanın. 10 μL Cap analog (son konsantrasyon 0,8 mM) ve NTPs (ATP, CTP ve TTP için son konsantrasyon 1 mM; 0,2 mM GTP için), 2 μL 10X reaksiyon tamponu (son konsantrasyon 1x), 2 μL SP6 RNA polimeraz ve 20 μL 'ye kadar RNase içermeyen su.
    1. Transkript boyutuna bağlı olarak, ıVT karışımı yaklaşık 2 saat veya daha uzun bir süre için inküye.
      Not: 2 h inkübasyon iyi bir 3 KB transkript için çalışır, ancak gece kuluçta 5 KB 'den büyük transkriptler için daha iyi çalışır.
    2. Transkripsiyon reaksiyondan serbest nükleotidler kaldırmak için, mRNA 'yı çökeltmek için 30 μL LiCl RNA yağış çözeltisi (7,5 M Lityum klorür, 50 mM EDTA) ekleyin. Karışım kısaca Vortex ve 30 dakika boyunca-20 °C ' de saklayın. Max Speed (18.400 x g) bir mikrofuge 15 dakika Için aşağı mRNA spin ve% 70 etanol (RNase-Free) ile durulayın.
  5. Sentezlenmiş mRNA 'yı 15 μL RNase-Free suyla çözün. Sentezlenmiş mRNA 'yı 5 μL/tüpte (Toplam 3 tüp) dağıtın ve uzun süreli depolama için-80 °C ' ye yerleştirin. MRNA 'yı Spektrofotometre ile quantitate.
    Not: Beklenen verim 15-20 μg mRNA (~ 1 μg/μL) ' dir. 1 μL (1 μg/μL), mRNA 'nın 1 μg/μL 'den 500 ng/μL 'ye seyreltilmiş olduğunu ve her embriyonun ~ 200 nL ile enjekte edildiğini varsayarak, ~ 10 embriyoya sahip bir deney için yeterlidir. Her tüp, bu nedenle, ~ 5 denemeler için yeterli mRNA içerir.
  6. RNase dekontaminasyon çözeltisi (örn., RNase away) ile tüm jel ekipmanlarını temizledikten sonra 1% agaroz jel üzerinde mRNA ~ 300 ng çalıştırın ve mRNA 'nın bir bant olarak göründüğünden emin olun (ikincil yapılar formunda birden fazla bant mevcut olabilir) ve hiçbir smear RNA düşüşünü gösteren jel şeritte ppears.

3. mRNA Elektroporasyon karışımı hazırlanması

  1. İstenilen konsantrasyonda çözülme ve seyreltici mRNA (250-500 ng/μL RNase-ücretsiz su bu çalışmanın tüm mRNAs için iyi çalışır). Renkli boya 1/10 hacmi ekleyin (bkz: malzeme tablosu, RNAse-Free, 0,1% son konsantrasyon) mRNA enjeksiyon site görselleştirmek ve düzgün elektrotlar yerleştirmek için.
    Not:
    Eğer DNA ve RNA bir Co-Elektroporasyon gerçekleştirmek için birleştirildiğinde, DNA 'Nın mRNA ve DNA karışımı öncesinde Phenol-Chloroform ekstraksiyon ve etanol yağış kullanarak RNases kontamine ücretsiz olduğundan emin olun.
    1. Bir sahte (RNA eklenmez) Elektroporasyon çözeltisi kullanarak negatif bir kontrol hazırlamanıza dikkat ediniz. Mümkünse, önceden doğrulanmış mRNA (önceki deneylerde FP başarıyla üretmek için gösterilen mRNA) kullanarak pozitif bir denetim hazırlayın.
      Not: Negatif denetim, verilerin normalleşmesi için arka plan floresan seviyeleri oluşturmak tüm görüntüleme denemeleri için gereklidir. Pozitif kontrol özellikle Elektroporasyon ayarlarının çalıştığını onaylamak için yardımcı olarak yeni transkripsiyonu mRNA ile çalışırken önemlidir.
  2. Elektroporasyon ile devam etmeye hazır olana kadar bozulmayı önlemek için mRNA Elektroporasyon çözümünü bir buz Bulamaç üzerine saklayın.

4. electroporate mRNAs içine yaşam bıldırcın embriyo

  1. Her gün taze yapılmış döllenmiş bıldırcın yumurtaları toplayın ve 1 haftadan fazla olmayan bir nemlendirilmiş buzdolabında 13 °C ' de saklayın. 38 °c ' de arzu edilen embriyonik Gelişimsel aşamalara kadar bıldırcın yumurtalarını19,20,21.
    Not: Bu çalışmada hem statik hem de dinamik görüntüleme için HH3 ila HH5 kullanılmıştır. HH3 embriyolar için, yumurta oda sıcaklığında bırakarak 2 saat önce hasat için embriyolar genellikle daha fazla fiziksel manipülasyonlar daha dayanıklıdır olarak yalıtım süreci çok daha kolay yapar soğutulur.
  2. Embriyoları ak kültür sistemi22' ye göre yalıtın ve hazırlayın. En az bir negatif kontrol (electroporated değil) olarak hizmet vermek dahil olmak üzere en az 5 embriyo, koşul başına toplayın.
    1. Yavaşça kırmak ve 10 cm Petri çanak içine yumurta dökün. Bir transfer pipetiyle kalın albümin çoğunu çıkarın ve embriyonun kağıt halka sıkıca yapışdığından emin olmak için bir doku silme ile sarısı yüzeyini hafifçe silerek embriyonun etrafında kalan kalın albumini çıkarın.
    2. Ön filtre kağıdı ( malzeme tablosunabakınız) embriyo üzerine Lay ve düzgün embriyonun çevresindeki kesmek için makas kullanın.
    3. Bir Pasteur pipet ile embriyonun PBS ile ilgili olarak, embriyo yapışmasını herhangi bir sarısı boşaltmak için nazik akışları kullanarak.
      Not: Bu embriyo sarısı daha sopa eğilimindedir ve genellikle sonraki yıkama adımları sırasında vitellus membrandan ayrılacaktır çünkü genç (< HH3) embriyolar ile çalışırken bu adım önemlidir.
    4. Yavaşça, daha fazla temizlik için PBS ile dolu bir petri tabağı içine ve sarısı kapalı bir eğik açı embriyo/kağıt yüzük çekin. Bir kez sarısı çoğu kaldırıldı, bir 35 mm Petri tabak agar/Albumen bir yarı katı karışımı ile kaplı üzerinde embriyo ventral tarafı yukarı yerleştirin.
  3. Cam mikropipet çektirme aleti kullanılarak altı ila 8 10 cm uzunluğunda cam mikrokapillarleri (O.D. = 1,2 mm) hazırlayın.
  4. Embriyo ventral tarafı PBS ile dolu Elektroporasyon odasına yerleştirin. Cam mikrokapiller kullanarak, mRNA veya DNA/mRNA Elektroporasyon karışımı 200 nl bir bolus istenilen bölgeyi kaplayan epiblast ve vitellus membran arasındaki boşluğa enjekte.
    Not: Pellucida için tüm ön alan ve opaca için bazı alan bu yazıda gösterilen deneylerin çoğunda electroporated oldu.
  5. Pozitif ve negatif elektrotları (Platin düz kare elektrot; 5 mm yan uzunluğu) sırasıyla embriyonun üst ve alt kısmına ve aşağıdaki darbe sırasını kullanarak electroporate yerleştirin: 5 V 'lik beş kare elektrik darbeleri, 100 ms aralıkla 50 MS süresi bir In vivo electroporator kullanarak. Elektrotlar arasındaki mesafenin ~ 5 mm olduğundan emin olun.
    Not: Elektroporasyon parametreleri optimize kırılgan embriyonik hücreleri öldürebilirim koşulları önlemek için çok önemlidir. Çeşitli Elektroporasyon cihazları için gerilim, darbe uzunluğu, nabız aralıkları ve DNA ve mRNA için darbe sayısı parametreleri dikkate alınmalıdır.
  6. Electroporated embriyoları 38 °C ' de istenilen gelişim aşamasına kadar kulyatın.
    Not: Floresan diseksiyon stereoskopi (bkz. malzeme tablosu) transferyon dışı embriyolar ile transfeksiyon yaparak ekrana yardımcı olur.
  7. Embriyoların statik olarak görüntülenmiş olması halinde, PBS 'de% 4 civarında formaldehite ile Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °c ' de bir gecede düzeltin.
    1. Filtre kağıdının çevresindeki makas ile pürüzsüz bir şekilde kesme ve keskin forseps ile dorsal yüzeyinde parlak membran soyma tarafından vitellus membrandan embriyolar çıkarın nazikçe.
    2. PBS/Triton 'da sabit embriyoları yıkayın (% 0,1) 2x 5 dakika ve in situ hibridizasyon veya immün boyama ile devam isterseniz.
    3. Son olarak, PBS/Triton 'da 0,5 μg/μL DAPI 'de embriyo leke (0,1%) Oda sıcaklığında en az 30 dakika. Embriyoları PBS/Triton 2x 'de 5 dakika yıkayın ve Skala-U2 çözeltisi23 gecede embriyo temizleyin.
  8. Elektroporasyon verimliliğini analiz etmek için (bkz. Şekil 2), görüntüdeki tüm hücrelerden nükleer anahatlar elde etmek Için ımagej 'deki ikili ve parçacık analiz aracını ve DAPI kanalını kullanın.
    1. İkili aracı ımagej üzerinde kullanmak için tek bir z-Slice hücre çoğunluğu içeren DAPı kanalda kullanın ve işlem ≫ ikili ≫ Ikili yap'ı tıklatın. Yakındaki hücreleri ayırmak için işlem ≫ ikili ≫ Watershedseçeneğini tıklatın. Analiz ≫ parçacıkları analizedin, boyut 100-500 (μm2) olarak ayarlanmış olarak hücre anahatlarını edinin.
    2. Hücrelerin çoğunluğunun DAPı kanalında özetlendiğinden emin olun ve YG Yöneticisi açılır penceresinde daha fazla ≫ kaydet 'i tıklatarak hücre anahatlarını kaydedin.
    3. Daha önce kaydedilmiş dosyayı mRNA veya DNA kanalındaki tek bir z diliminde açarak mRNA ve DNA kanalı için floresan yoğunluğu değerleri elde etmek için bu anahatları kullanın ve ardından YG yöneticisinde ölçü 'i tıklatın.
    4. Son olarak, bu yoğunluk değerlerini filtreleyin, transfitleştirilmiş olarak < 6000 floresan yoğunluğa sahip hücreleri sayma ve > 6000 floresan yoğunluğu olan hücreler.

5. Electroporated mRNAs tarafından kodlanmış görüntü FPs

  1. Floresan diseksiyon stereoskopinin altında bulunan tüm elektroporasyonlu embriyolar baktıktan sonra dinamik görüntüleme deneyleri için en sağlıklı ve iyi electroporated embriyo seçin.
    1. Bu embriyonun deney sırasında ölmesi durumunda, seçilmiş embriyonun görüntülenmesi sırasında diğer elektroporasyonlu embriyoları ve elektroporated olmayan embriyo (negatif kontrol) ile ayrı bir kuluçlan içinde yer almaya devam edin.
  2. Dinamik görüntüleme için, daha önce24,25,26 tersine çevrilmiş bir konfokka mikroskop ile açıklandığı gibi tüm Mount EX OVO kuş embriyo kültürünü kullanın.
    Not:
    mikroskop, görüntüleme sırasında 36 °c ' de sıcaklık tutan bir aşama kuluçta ( malzeme tablosunabakın) ile donatılmıştır. 36 °C ' de embriyoların, yüksek sıcaklıklarda daha uzun süre hayatta kaldıkları mikroskop kurma sırasında gözlemlenmiştir, çünkü lazer embriyo üzerinde yerel ısıtmaya neden olabilir. Okuyucular kendi mikroskop seti için optimum aşama kuluçta sıcaklığını belirlemelisiniz.
    1. Dinamik olarak görüntü için ve embriyogenesis görselleştirmek için, PBS ile electroporated embriyo kısaca bir PBS temiz forseps kullanarak etrafında embriyo taşıyarak Elektroporasyon işlemi sırasında embriyonun dorsal tarafında oluşturabilir herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için temizleyin Çözüm.
    2. Temiz embriyo Albumen ince bir tabaka içeren bir görüntüleme çanak üzerine doğrudan yerleştirin-agar (~ 150 μL) embriyo22dorsal yüzeyinde herhangi bir kabarcıklar oluşturmak için emin olun.
    3. Uzun süreli görüntüleme için hayatta kalma sağlamak için, görüntüleme çanak iç kenarları küçük bir nemli haddelenmiş kağıt parçası ekleyin ve görüntüleme ve inkübasyon sırasında buharlaşma en aza indirmek için parafin filmi kullanarak çanak mühür.
    4. Bu tabağı hızlı bir şekilde bir Konfokal mikroskop ön ısıtılmış aşamaya taşıyın ve enjekte ve electroporated bölgeyi tanımlayan aydınlık alan kanal (PMT lazer% 20) kullanarak embriyo renkli boya bulun.
  3. İstenilen amaca (10 veya 20X), dikroik Mirror (Gfp nm için 488 Nm, RFP için 561), emisyon Spectra (Gfp için 499-562 Nm, RFP için 570-695 Nm) için görüntüleme yazılımını ayarlayın ve uygun bir lazer (Gfp için 488 Nm, RFP için 561 Nm) açın.
    Not:
    electroporated mRNA 20 dakika içinde görülen proteinlere çevrildi (bkz. Şekil 3). Bu yazıda görüntüleri çoğu için kullanılan görüntüleme meta: 20X amacı ile ters bir konfokit mikroskop (bkz. malzeme tablosu); piksel bekleme süresi, ~ 1,5 μs; 4 satırlı taramalar anlamına gelir.
    1. Görüntüleme yazılımında canlı tıklayın ve lazer gücünü her mikroskop lazer gücüne bağlı olarak floresan yoğunluğu için uygun bir ayara ayarlayın. Embriyo% 1 lazer gücü kullanarak görüntüleme ile başlayın, 800 kazanç ve doymuş pikseller görülene kadar lazer gücünü% 1 artışlarla yavaşça artırın.
    2. Artık doymamış pikseller görülene kadar lazer gücünü biraz azaltarak izleyin.
      Not: Bir embriyonun görüntüleme oturumunun başlangıcı için seçilen lazer gücü daha önceki zaman noktaları için iyi olabilir ama hücrelerin floresan zaman içinde çok daha parlak veya dimmer olur daha sonra zaman noktalarında ideal değil. Bunu gidermek için, electroporated hücreler genellikle Elektroporasyon sonra ilk 6 saat içinde daha parlak olsun bu yana biraz daha düşük güç ayarlarında embriyo görüntü (bkz Şekil 3A-E sinyal artışı miktarlama için). Sonraki görüntüler doygunsa, orijinal görüntüleme ayarları ile görüntüye devam edin, ancak daha zayıf görüntüleme ayarları (küçük iğne deliği veya zayıf lazer gücü) ile hemen sonra ek bir görüntü alın.
    3. Farklı zaman noktalarında bireysel hücre göç izlemek için her 3-5 min embriyo görüntü. Bu çalışma için, görüntüleri z-yığınları (~ 50 μm kalınlığında) tüm electroporated alanı, artı z-yığını altına doğru bazı ekstra oda, embriyo görüntüleme oturumu boyunca agaroz yatak içine lavabolar.
    4. İlk filmin ilk birkaç zaman noktalarını kontrol ederek hücrelerin ne kadar hızlı hareket ettiğini inceleyin. Hücreler hızlı bir hızda hareket ederse (yani görüntülenmiş bölgenin alanından birkaç zaman noktası içinde çıkacaklar anlamına gelir), görüntülenmiş alanın yakınlaştırmasını (1x à 0.8 x) veya farklı bir bölgeyi görüntülemesini deneyin.
      Not: Bölgede embriyonik bölgeler pellucida çok daha hızlı alan opaca daha hareket. Ayrıca, Genç embriyo (HH3, HH5) genellikle eski embriyolar (> HH7) ile karşılaştırıldığında daha hızlı hareket geçiren hücreler içerir.
    5. Embriyonun electroporated bölgesini görüntülemenin ardından, aynı embriyonun bir un-electroporated bölgesi olan otofloresans düzeylerini belirlemek için (düşük lazer gücü <% 10 ' luk bir embriyo görüntü için kullanılır) minimal olmalıdır.

6. floresans kurtarma Photobleaching sonra (FRAP) assay mRNA bütünlüğü için

Not: Photobleaching sonra bir in vivo floresan kurtarma (frap) tahlil ne kadar uzun transfekte mRNA FPs içine çevrilebilir belirlemek için kullanılabilir. Aşağıdaki protokol, H2B yarı ömrünü algılamak için bir FRAP deneyi özetliyor. Bir electroporated embriyo içinde Citrine mRNA.

  1. 20X 0,8 NA objektif ve tamamen açık pinhole kullanarak ters Konfokal mikroskop üzerinde FRAP denemeleri gerçekleştirin.
    1. Stereomikoscope üzerinde H2B-Citrine Elektroporasyon teyit ve ters Konfokal mikroskop üzerinde önceden ısıtmalı aşamada embriyo ayarı sonra (bkz: adım 5.2.4), çeşitli zaman H2B-Citrine hücresel floresans en photobleach puan (45 dk, 2 h, ve 5 h-Electroporation) ile 405 nm lazer kullanarak 70% lazer gücü, 100 yineleme, tarama hızı 4, kalan floresan sadece% 5 bırakır.
      Not: Bu işlem birkaç dakika sürebilir.
    2. Photobleaching sonrası 36 °C ' de embriyoları sahnede kulymaya devam edin.
  2. Photobleached hücrelerin tamamen Post-Treatment ölmedi olduğunu gösteren fotoksüeli bölge içindeki hücreleri aktif olarak bölünmesine dikkat ettiğinizden emin olun.
  3. Konfokal mikroskobu kullanarak düzenli zaman aralıklarında (3 veya 5 dakika) 30 dakikaya kadar (elektroporated bölgenin z-yığınları) çamaşır suyu görüntüleri alın.
    Not: Varsa, photobleached bölgede hücre hayatta kalma sağlamak için pozitif bir kontrol olarak transgenik H2B-XFP hattı kullanın. Electroporated mRNA tarafından kodlanmış FP için floresan kurtarma oranı azalmalıdır, ancak transgene ile kodlanmış FP için tüm film boyunca tutarlı kalması gerekir.
  4. Görüntüleme koşullarının, embriyo hayatta kalmadığından emin olmak için, aynı zamanda fotobleerli olmayan electroporated embriyoları, görüntüleme için bir kontrol olarak hizmet edebilir.
  5. MRNA çürümesi sonrası Elektroporasyon için photobleaching sonuçlarını quantitate için, ımagej kullanarak her hücrenin Merkezi (7,5 μm Daire) Floresan yoğunluğunu ölçerek zaman içinde hücre floresans (3 veya 5 dk) izleyin. Bu mitoz geçirmiyor ve tamamen photobleached olmuştur photobleached bölgede tüm hücreler için bunu ölçün.
    Not: Mitotik çekirdekler kromatin yoğuşması nedeniyle interfaz çekirdekleri daha güçlü floresans var bu yana kantifikasyon mitotik hücreler atlayarak düşünün.
  6. Çeşitli zaman noktalarında (45 dk, 2 h ve 5 h) zaman içinde floresans yoğunluğunu zaman sonrası çamaşır suyu üzerine çizin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA Elektroporasyon DNA Elektroporasyon daha etkilidir

Biz pCS2 + kullandık. H2B-Citrine in vitro transkripsiyonu mRNA hazırlamak için. DNA elektroporasyonu genellikle 1-2 μg/μL 'de gerçekleştirildiği için, mRNA elektroporasyonu için (H2B-Citrine için 0.25-0.5 μg/μL civarında olmak üzere hesaplanan) mRNA equimolar konsantrasyonu kullandık. İlk olarak pCS2 + ' nın Elektroporasyon verimliliğini test ettik. H2B-Citrine DNA H2B-Citrine mRNA (in vitro pCS2 + SP6 Organizatör den transkripsiyonu ile karşılaştırıldığında. H2B-Citrine) HH5 bıldırcın embriyoları içine ayrı olarak DNA veya mRNA electroporating tarafından, sonra 12 h-Elektroporasyon Elektroporasyon verimliliği inceleniyor. DNA Elektroporasyon bazı electroporated hücrelerde parlak floresans yol açar rağmen, DNA Elektroporasyon verimliliği yaygın olarak ifade mRNA kodlanmış FPs (Şekil 2a ve B) ile karşılaştırıldığında daha düşük oldu.

Elektroporasyon protokolünde içsel embriyo-embriyo değişkenliği için hesaba, mRNA kodlama H2B-Citrine ve DNA ifade H2B-mKate2 equimolar kombinasyonu HH5 embriyolar ektoderm içine electroporated ve gözlenen 12 h Elektroporasyon sonrası. Aynı embriyo DNA ve mRNA Co-Electroporation karşılaştırırken, DNA FP ifade de önemli ölçüde ve tutarlı bir şekilde mRNA daha az verimlidir (Şekil 2C). Sadece mRNA, DNA veya ikisinin bir kombinasyonu ile electroporated tüm embriyolar miktarının tarafından, biz mRNA belirli bir bölgedeki hücrelerin ~% 75 transfects bulundu, DNA yalnızca belirli bir bölgedeki hücrelerin ~% 25 transfakeler (Şekil 2D). MRNA veya DNA tarafından kodlanmış floresan proteinlerin ifadesinde yayılan tüm Co-electroporated embriyo önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 2e).

Protein ifadesi mRNA Elektroporasyon daha hızlı DNA Elektroporasyon daha

Nakledilmiş mRNA, Şekil 3' te görüldüğü gibi sitosolik çeviri makineleri tarafından hemen tanınabilecek olduğundan daha hızlı protein üretimine yol açmalıdır. DNA çekirdeğe transloke olmalıdır, transkripsiyonu, ve mRNA geri sitosolik çeviri makineleri tarafından tanınmaktadır nerede, daha fazla zaman almak için bekleniyordu. Direkt olarak mRNA 'yı protein üretiminin DNA ifadesi oranlarına karşı karşılaştırmak için, HH5 embriyolarının ektoderm 'inin içine DNA (pcmv. H2B-mKate2) ve mRNA (H2B-Citrine) equimolar kombinasyonu ile birlikte electroporated bir dizi zaman ders denemeleri gerçekleştirdik. MRNA kodlu FP ifadesini, ~ 6 h (Şekil 3A-E, ek) için bağıl floresan yoğunlukta artan devam eden 22 dk sonrası Electroporation civarında tespit ettik. Film S1b). Buna karşın DNA kodlu FP ifadesi ilk olarak ~ 1,5 h sonrası Elektroporasyon (Şekil 3A'-E ', ek) olarak görülür. Film S1c) ve film durdurulduğunda 6 h kadar parlaklıkta artan devam eder. DNA electroporated hücreler 6 h işareti ile doymuş olduğu için, daha zayıf görüntüleme koşulları (Şekil 3F-f ' ') ile bu durumu reimaged. Bu zaman atlamalı tüm zaman noktaları (22 dk 6 h), mRNA DNA daha birkaç kez daha fazla hücre transfects (ek. Film S1A, bu görüntüler bir vahşi tip bıldırcın embriyo bir zaman atlamalı alınır çünkü aydınlık alan ve DAPI aracılığıyla Elektroporasyon toplam verimliliği gösterilmez). Buna dayanarak, mRNA Elektroporasyon daha önce ifade protein yol açar sonuçlandırmak.

Birden fazla MRA 'nın Co-electroporasyonu son derece etkilidir

Sonra, daha fazla mRNA Elektroporasyon verimliliğini test etmek için bir ilgi bölgeye çoklu MRI electroporating için çalıştı. Birden fazla DNAs 'ın Co-Electroporation daha önce nispeten verimsiz olarak gösterildi, çok etiketli sayısı ile gösterilen 25%, 14%, ve 10% 2, 3, ve 4 DNA yapıları electroporated, hücrelerin toplam sayısının bir oranı olarak hesaplanan11 . İlk olarak ışıksal farklı FPs 'yi (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine) HH5 embriyolara kodlayan ve tüm electroporated bölgelerde yüksek transfeksiyon verimliliği elde eden iki mrnas 'ı elektroporasyonlu yaptık. Biz bir HH4 gastrulating embriyo içinde alan pellucida ve opaca arasında radyal genişleme filmleri yakalamak için bu çift Elektroporasyon kullanılır, 2 h sonrası Electroporation (Tamamlayıcı film S2a, b ve c) görüntülenmiş. H2B-Citrine hücre çekirdeği içinde lokalize ve hücre proliferasyonu izlenmesine izin27. Turquoise2-Golgi FP, embriyonik hücrelerde hücre içi polariteyi göstermek için görünür ancak hız veya hareketli ektoderm hücrelerinin yönünü vivo28ile ilişkilendirmek için görünmüyor. Bu film (ek film S2), birden fazla MRI ile electroporated hücrelerin herhangi bir belirgin kusurları olmadan normal hücresel aktivite devam edebilir gösterir.

Ayrıca, Co-Electroporation 4 mRNAs-Turquoise2-Golgi (Golgi aparatı görselleştirilmesi için), LifeAct-eGFP (F-actin görselleştirmek için), H2B-Citrine (çekirdeği görselleştirmeye), ve membran-kiraz FP (membranların görselleştirmek için)-sonuçlanan 87% transfeksiyon Tüm elektroporated bölgelerde 4 mRNAs 'ın verimliliği (Şekil 4). LifeAct-EGFP ve H2B-Citrine ticari yazılım doğrusal karıştırma işleme aracı ile ayrıldı.

FRAP assay ilk iki saat sonrası Electroporation sırasında electroporated mRNA hızlı Bozulması gösterir.

Bu çıplak MRI 'lar hızlı bir şekilde hücresel RNAases29tarafından düşürülmüş olduğu bilinmektedir. Biz mRNA Elektroporasyon gelişmekte olan bir embriyo proteinlerin hızlı ve verimli ifade vererek kaybı veya kazanç fonksiyonu deneyler için yararlı olabilir öne. Bu nedenle, mRNA Electroporation sonra mRNA çürüme oranını quantitate yararlı olacaktır, mRNA hücrelerde DNA daha hızlı düşer beri. Yetişkin fare nöral kök hücrelerinde mRNA Elektroporasyon önceki raporlarda, yaklaşık 80% mRNA tespit edildi 2 QRT-PCR tarafından elektronik sonrası Elektroporasyon, henüz hiçbir mRNA az tarafından tespit edildi 24 h Post-Elektroporasyon15. Biz daha fazla mRNA ifade sonrası Elektroporasyon electroporated hücrelerde mRNA düzeylerini algılamak için bir in vivo FRAP tahlil tasarlayarak ölçmek için çalıştı.

Fotobleaching, fluorophore (bizim durumumuzda floresan proteinleri), gözlem sırasında floresans ortadan kaldıran heyecanlı bir durumda olduğunda ortaya çıkabilecek olan florophin geri dönüşümlü imha edilir30,31. Temel düzeylerin üzerinde photobleached hücrelerde tespit edilebilir floresan proteinleri (FPs) herhangi bir yayılan ışık, bu nedenle, yeni çevrilmiş FPs sağlam, transfekte mrnas tarafından kodlanmış temsil etmelidir. Bu nedenle, electroporated hücreleri photobleach için çeşitli zaman noktalarında mevcut tüm FP-türetilen floresan ortadan kaldırmak ve sonraki floresans kurtarma izlemek için çalıştı.

Protokol bölümünde açıklandığı gibi optimize photobleaching ayarlarını kullanarak, photobleaching başlangıçta tüm photobleached hücrelerde floresan yoğunluğu azaltır bulundu ~ 95% fotobleaching olaydan hemen sonra tespit edildiğinde. Bu 45 dk, 2 h ve 5 h sonrası Elektroporasyon (Şekil 5A-C) yapıldı. Photobleached bölgedeki her hücredeki floresan kurtarma, normal zaman aralıklarında (3 veya 5 dakika) aynı bölgeyi görüntüleyerek her zaman noktasında photobleaching sonrasında 30 dk. süre boyunca izleniyor. Verilerimizde 45 dk ve 5 h sonrası Elektroporasyon arasında transfekte mRNA düzeylerinde önemli bir azalma olduğunu göstermektedir. Bu, 45 dk sonrası Elektroporasyon ile karşılaştırıldığında 5 h ölçülen FRAP büyük azalma tarafından gösterilir. Özellikle 5 saat noktasında, ağartılmış hücrelerdeki floresan iyileşmesini vurgulamak için, ımagej 'deki Parlaklık/Kontrast aracını kullanarak Şekil 5A-C ' d a k i parlaklığını artırdık ve bu değiştirilmiş görüntüleri Şekil 5D-F' d e gösterdik. İlginç bir şekilde, bazı hücreler diğer hücrelerden daha hızlı floresans kurtardığından (Şekil 5E ' ', okuçlarına bakın), çünkü 2 saat içinde photobleached alanda hücre-hücreden floresan kurtarma büyük bir heterojenlik vardır. Ancak, 5 h photobleached alan içindeki tüm hücreler floresan daha yavaş (Şekil 5F ' ') photobleached hücreler daha 2 saat kurtarır. Ayrıca, Fotobleerik bölgenizdeki hücreleri aktif olarak bölerek, hücrelerin photobleaching sürecinin bir sonucu olarak öldüklerini düşündürmektedir (Şekil 5E ' ').

Bu sonuçları fotobleaching etkinliğinden sonra 30 dak süre içinde photobleached alanlarda her hücrenin normalleştirilmiş sinyal yoğunluğunu göstererek Şekil 6a 'da ölçeceğiz. Her hücre için, floresan değerleri, fotobleaching sonrası hücrenin sinyal yoğunluğuna karşı normale döndü. Bu normalleştirme tüm zaman noktalarında görüntülenmiş tüm hücreler için yapıldı (45 dk, 2 h, 5 h). Aynı fotoğraf ağartılmış bölge içindeki hücrelerin floresan kurtarma Normalleştirilmiş değerleri daha sonra birlikte havuza ve fotobleaching olay sonra zaman içinde grafik oldu; Bu nedenle, grafiğin her noktası ~ 35 hücreleri temsil eder. Normalleştirilmiş veriler aynı zamanda her satırın fotobleaching hemen sonra floresan sinyal yoğunluğunu kurtararak bir hücreyi temsil ettiği Şekil 6B 'de de gösterilir. Bu veri genel öneriyor 5 h, tüm hücreler onların mRNA çoğunu tükenmiş, bu damla büyük bir bölümü ile 45 dk ve 2 h sonrası Elektroporasyon arasında meydana.

Figure 1
Şekil 1: pCS2 + LifeAct-eGFP yapı yapmak için klonlama prosedürü Schematic. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: mRNA Elektroporasyon DNA Elektroporasyon daha etkilidir. (a-a ' ') DNA ifade pCS2. H2B-Citrine HH5 embriyo ektoderm içine electroporated oldu. Flüoresan 12 h Elektroporasyon sonrası görüldü. Ölçek çubuğu = 50 μm. (b-b ' ') mRNA H2B-Citrine ifade HH5 embriyoların ektoderm içine electroporated oldu. Floresan 12 saat Elektroporasyon sonrası gözlenen. Ölçek çubuğu = 50 μm. (c-c ' ') equimolar DNA kombinasyonu (pcmv. H2B-mKate2) ve mRNA (H2B-CITRINE) HH5 embriyo içine electroporated ve gözlenen 12 h sonrası Elektroporasyon. Üç embriyo koşul başına test edildi (n = 2 denemeler). Ölçek çubuğu = 50 μm. (D) A, B ve C 'den (9 Toplam embriyo) gelen üç embriyo, ımagej 'de parçacık analiz aracını kullanarak Elektroporasyon verimliliği için niceleyilmiş. Her bir embriyonun 200 μm bölgesi nicelik (en az 150 hücre bölge başına sayılıyordu). Üst ve alt çubukları ortalama standart sapma temsil ederken orta çizgi ortalama temsil eder. (E) üç adet Co-ELECTROPORATED (DNA ve mRNA) embriyo, belirli bir 200 μm bölgesindeki tüm elektroporated hücrelerde sinyal yayılması için analiz edilir. Her embriyo 100 hücre mRNA Elektroporasyon için pozitif ve 30 hücreler DNA Elektroporasyon için pozitif civarında vardı. Üst ve alt çubukları ortalama standart sapma temsil ederken orta çizgi ortalama temsil eder. MRNA 'nın DNA elektroporasyonu ile yayılması arasında önemli bir fark yoktur, ancak mRNA Elektroporasyon DNA 'dan çok daha etkilidir. (A-C) Boyutlar = 425,10 x 425,10 x 55 μm. piksel durmak 2,55 μs. Ortalama satır 4. Piksel başına bit = 16. Mikroskop Metadata = ters Konfokal mikroskop, 20X objektif (bkz . malzeme tablosu) (A) Ex: 488 Nm (0,05%), emisyon parça S1 = 508-579 Nm; (B) EX = 488 Nm (5,0%), emisyon parça S1 = 508-579 Nm; (C) EX = 488 Nm (5,0%), 561 Nm (5,0%), emisyon parça S1 = 508-579 Nm; S2 = 606-695 nm Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: mRNA Elektroporasyon 22 dk sonrası Elektroporasyon ile ifade gösterir ve DNA Elektroporasyon çok daha hızlıdır. MRNA (H2B-Citrine) ve DNA (pCMV) sonrası zaman kursu temsilcisi görüntüleri. H2B-mKate2) Arsa profil analizi ile Elektroporasyon 22 dk (a-a ' '), 45 min (b-b ' '), 1,5 h (c-c ' '), 3 h (d-d ' ') ve 6 h (e-e ' ') görüntüleme başlangıcı (n = 1). Çizim profili analizi, birleştirilmiş görüntüde çizilen ok üzerinde gösterilen her zaman noktası için sağlanır. Arsa profilindeki her tepe, electroporated bir hücrenin çekirdeğini temsil eder. Hücreler genellikle filmin 6 saat aralığında daha parlak olur, mRNA 'nın hala yeni floresan proteine çevrildiğini gösterir. 6 saatlik zaman noktası için, aynı görüntüleme koşulları (e-e ' ') ve daha zayıf görüntüleme koşulları (f-f ' ') kullanılarak yakalanan aynı bölgenin GÖRÜNTÜLERI gösterilir, çünkü DNA electroporated hücrelerinin görüntüleri ilk kez kullanarak çok doymuştu görüntüleme koşulları. Ölçek çubuğu = 20 μm. Boyutlar: 425,10 x 425,10 x 55 μm. görüntü, görüntülenmiş tüm zaman noktalarında maksimum yoğunluk projeksiyon olarak gösterilir. Piksel durmak 2,55 μs. Ortalama satır 4. Piksel başına bit = 16. Mikroskop Metadata = ters Konfokal mikroskop, 20X objektif (bkz . malzeme tablosu) EX = 488 Nm (% 15), 594 Nm (% 5,0) ilk için; EX = 488 Nm (7,5%), 594 Nm (% 0,5) Son zaman noktası için (Şekil 2F), emisyon parça S1 = 499-562 Nm; S2 = 605-661 Nm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: farklı alt hücresel yapıları hedefleyen dört MRA 'Nın Co-electroporasyonu son derece etkilidir. HH3 embriyonun ektoderm mTurquoise2-Golgi, lifeact-EGFP, H2B-Citrine ve membran-kiraz kodlayan mrnas ile electroporated oldu. Embriyo, Electroporation sonrası 4 saat boyunca sabit ve görüntülenmiştir. Çoğu hücre, dört MRI (% 87) ile elektrot hedeflenen bölge içinde electroporated. Gösterilen temsili rakamlar (her biri 3 embriyo, n = 2 deney). Ölçek çubuğu = 50 μm. (A) dört mrnas 'ı (MTurquoise2-Golgi, Lifeact-EGFP, H2B-Citrine ve membran-Cherry) birleştirin. (B) sadece H2B-Citrine kanal (Ex = 488 nm (0,7%), Em = 455-499 Nm). (C) sadece MTurquoise2-Golgi kanal (Ex = 458 nm (22,0%), Em = 455-499 Nm). (D) birleştirme H2B-Citrine ve MTurquoise2-Golgi gösterir Golgi zarfların çoğu hücrelerde çekirdeğin bir tarafı. (E) sadece lifeact-EGFP kanal (Ex = 488 nm (0,7%), Em: 455-499 Nm). (F) sadece membran-kiraz kanalı (Ex = 594 nm (37,1%), Em = S2:570-695 Nm). (G) Lifeact-EGFP ve membran-kiraz birleştirme çoğu hücrelerde örtüşme gösterir. Boyutlar = 425,10 x 425,10. Piksel durmak 1,58 μs. Ortalama satır 4. Piksel başına bit = 16. Mikroskop Metadata = ters Konfokal mikroskop, 20X objektif (bkz . malzeme tablosu) Ex = 405 nm (2,4%), 458 nm (22,0%), 488 nm (0,7%), 594 Nm (% 37,1), emisyon parça S1 = 455-499 Nm; S2 = 570-695 Nm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Photobleaching assay ilk beş saat sonrası Electroporation sırasında electroporated mRNA hızlı Bozulması gösterir. MRNA ifade H2B-Citrine ile electroporated hücreleri içeren bir 100 μm ² bölgenin photobleaching 45 dk, 2 h ve 5 h sonrası Elektroporasyon gerçekleştirilir. Embriyo, photobleaching (3 veya 5 dakika) sonra düzenli zaman aralıklarında görüntülenmiş. Photobleaching koşulları aşağıdaki gibidir: 70% 405 nm lazer, 100 yineleme, tüm bölge için yaklaşık 5 dk süre. Ölçek çubuğu 50 = μm. (a-a ' ') 45 min ön ve sonrası çamaşır suyu. B fotobleaching hemen sonra embriyo gösterir ve C embriyo gösterir 30 dakika sonrası çamaşır suyu. Ölçek çubuğu = 50 μm. (b-b ' ') 2 h ön ve sonrası çamaşır suyu. Fotoğraf duvarındaki hücreler, çamaşır suyu döneminde biraz hareket ettirildiğinden meydanın çevresi kaydırılır. (C-c ' ') 5 saat öncesi ve sonrası çamaşır suyu. (d-d ' ') Aynı görüntüler A-A ' ' ile gelişmiş parlaklık (maksimum değeri 11550 için ayarlanmış parlaklık sonrası toplama geliştirmek için). (e-e ' ') Gelişmiş parlaklık ile B-B ' ' olarak aynı görüntüler (maksimum değer 11550 için ayarlanabilir parlaklık sonrası toplama geliştirmek için). Beyaz ok uçları, çevreleyen hücrelerden daha yüksek floresan iyileşmesi olan hücrelere işaret ederler. Camgöbeği ok ucu, son zamanlarda mitosis geçirmiş bir photobleached hücreye işaret ediyor. (f-f ' ') C-C ile aynı görüntüler ' ' gelişmiş parlaklık (maksimum değer 11550 için ayarlanabilir parlaklık sonrası toplama geliştirmek için). Boyutlar = 425,10 x 425,10 x 42 μm. görüntü, görüntülenmiş tüm zaman noktalarında maksimum yoğunluk projeksiyon olarak gösterilir. Piksel durmak 1,58 μs. Ortalama satır 4. Piksel başına bit = 16. Mikroskop Metadata = ters Konfokal mikroskop, 20X objektif (bkz . malzeme tablosu) EX = 488nm (1,5%), emisyon parça S1 = 508-553 nm Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: photobleached hücrelerde floresans geri kazanım ölçümü. (A) ağartılmış bölgelerde bulunan tüm hücrelerin floresan yoğunluğu (~ 35 hücreler) her bir hücre için her zaman sırasında, çamaşır suyu sonrası izlenen. 45 dakika 2 h, 2 saat 5 h daha küçük bir damla takip tarafından kurtarılan sinyal yoğunluğu oranı büyük bir düşüş vardır. En üst hata çubuğu, ortalama standart sapmayı temsil eden her nokta için gösterilir. Gösterilen satır doğrusal regresyon çizgesidir. 45 dk, 2 h ve 5 h için R ² sırasıyla 0,83, 0,58 ve 0,84. Hata çubuğunun üst yarısı her nokta için gösterilir. (B) ağartılmış bölgelerde bulunan tüm hücrelerin floresan yoğunluğu (~ 35 hücre) her bir hücre için her zaman boyunca takip edildi-çamaşır suyu ve normalleştirme olmadan grafikli. 45 dk 'dan 2 h 'ye kadar kurtarılan sinyal yoğunluğuna göre büyük bir düşüş vardır, daha küçük bir damla tarafından izlenen 2 saat 5 h. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın.

Ek film 1: mRNA Elektroporasyon DNA Elektroporasyon daha önceki protein ifadesine yol açar. H2B-Citrine mRNA ve H2B-mKate2 DNA 'sı HH5 embriyonun ektoderm 'ine electroporated. Bölge görüntülenmiş ekstra-embriyonik ve embriyonik doku sınırında. Ölçek çubuğu = 50 μm. (a) her iki H2B-CITRINE ve H2B-mKate2 kanal gösterilen (Ex = 488 Nm (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 Nm; S2:605-661 Nm). (b) sadece mRNA H2B-Citrine kanal gösterilen (Ex = 488 Nm (% 15), Em = 499-562 Nm). (c) sadece H2B-mKate2 DNA kanalı gösterilir (Ex = 594 nm (5,0%), Em = 605-661 Nm). Boyutlar = 850,19 x 850,19 x 110 μm. görüntü, görüntülenmiş tüm zaman noktalarında maksimum yoğunluk projeksiyon olarak gösterilir. Piksel durmak 2,55 μs. Ortalama satır 4. Piksel başına bit = 16. Mikroskop Metadata: ters Konfokal mikroskop, 20X objektif (bkz . malzeme tablosu) EX = 488 Nm (% 15), 594 Nm (% 5,0), emisyon parça S1 = 499-562 Nm; S2 = 605-661 Nm. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Ek film 2: mRNAs 'ın Co-electroporasyonu, farklı hücre davranışlarını dinamik olarak incelenmesine izin verir. Embriyonik ve ekstra embriyonik sınır arasındaki hücrelerin radyal genişlemesi mRNA (H2B-Citrine ve mTurquoise2-Golgi) ile electroporated ve dışa göç sırasında görüntülenmiş. Bu film, her 6 dakikada bir görüntüleme tarafından 2 ila 5 h sonrası Elektroporasyon konfokk mikroskopisi tarafından görüntülenmiş, ölçek çubuğu = 50 μm.  (a) H2B-Citrine ve MTurquoise2-Golgi kanallarında gösterilen (Ex = 458 Nm (% 28), 488 Nm (% 5,0), Em = 446-526 Nm; S2:508-553 Nm). (b) sadece H2B-Citrine kanal gösterilen (Ex = 488 nm (5,0%), Em = S2:508-553 Nm). (c) sadece MTurquoise2-Golgi kanalı gösterilir (Ex = 458 Nm (% 28), Em = 446-526 Nm). Boyutlar = 425,10 x 425,10 x 32,5 μm. görüntü, görüntülenmiş tüm zaman noktalarında maksimum yoğunluk projeksiyon olarak gösterilir. Piksel durmak 0,79 μs. Ortalama satır 4. Piksel başına bit = 16. Mikroskop Metadata = ters Konfokal mikroskop, 20X objektif (bkz . malzeme tablosu) Ex = 458 Nm (% 28), 488 Nm (% 5,0), emisyon parça S1 = 446-526 Nm; S2 = 508-553 Nm. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde, biz nasıl tam mikroenjeksiyon ve elektrostatik bıldırcın embriyoları hücrelerine mRNA electroporate hakkında adım adımı talimatlar sağladı. İn vitro sentezlenmiş mRNA elektroporasyonu, gastrulating bıldırcın embriyoları içinde floresan proteinlerin (FPs) hızlı ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar (Şekil 2 ve 3). Electroporated mRNAs 'dan çevrilmiş H2B-Citrine proteininden floresans, ~ 20 dakika içinde Konfokal mikroskobik tarafından tespit edilebilir ve saat için FP floresans ile artar (Şekil 3, ek film 1). Bu şaşırtıcı hızlı ve Citrine32,33için varsayılmış olgunlaşma zamana yakın. DNA vektörler ifade FPs sonra tespit edildi 2-3 h (Şekil 3, ek. Film 1), önceki raporlara benzer8,34,35. Çeşitli FPs benzersiz olgunlaşma kez var, bu yüzden gelişmiş planlama ideal FP spektral ayrım ve olgunlaşma kinetik deneme için istenen açısından seçilir sağlayacaktır. Ayrıca sentezlenmiş MRI 'lar, embriyonik hücreleri DNA vektörler11' den daha verimli bir şekilde birlikte transfekt. Daha yüksek transfeksiyon verimliliği, tek (Şekil 2) veya mrnas 'ın birden fazla nüfusu (Şekil 4) ile ilgili bölgede transferasyonun daha fazla hücresinde sonuçlanır.

MRNA istikrar son derece düzenlenmiş ve polyadenylation, splicing, çeviri, ikincil yapısı ve birkaç36,37adı için tercüme edilmemiş bölgeler etkilenebilir. Hücrelerin içinde endojen ve sentezlenmiş mRNA hem yarı hayatları dakika arasında değişebilir36,38. Mevcut mRNA kodlu H2B-Citrine proteinlerinin çamaşır suyu için photobleaching (FRAP) sonrası içinde vivo floresan kurtarma kullandık ve Electroporation sonrası ilk 2 saat boyunca en önemli H2B-Citrine floresans iyileşmesini gözlemledik (Şekil 5 ve 6). farklı mrnas kuşkusuz farklı Half-yaşam uzunluğu, iç dizileri, 5 ' ve 3 ' modifikasyonları36,37, böylece her isteniyorsa farklı teknik kullanılarak olmalıdır dayalı olacak.

Hayati görüntüleme genellikle yüksek kaliteli görüntüleme ve hızlı, daha az toksik görüntüleme39,40için optimum koşullar arasında bir ticaret-off gerektirir. Görüntüleme sırasında, embriyonik hücrelere photobleaching ve photodam en aza indirmek için mümkün olduğunca düşük lazer gücü olarak kullanmak için tavsiye edilir (protokol adım 5,3 için Notlar bakın)40. Hızlı koleksiyonlar için mikroskop ayarını değiştirmek (örneğin, daha hızlı tarama hızları, daha az ortalama) genellikle gerekli görüntü çözünürlüğü41kaybetmeden yardımcı olabilir. Son olarak, hasat, Elektroporasyon ve görüntüleme sırasında embriyolar üzerinde bakım ve manipülasyon alınması gerekir (bkz. Adım 4). Erken evre embriyo hassastır ve kolayca zarar görebilir.

Genel olarak, hassas zamanlama ve mRNA Elektroporasyon doğru lokalizasyonu hızlı ifade, Co-transfeksiyon verimliliği ve mRNA transkriptlerinin hızlı çürümesi üzerinde büyük harf pertürbasyon deneyler izin verir. Sentezlenmiş MRI 'ların elektroporasyonu yoluyla, ilgi geninin aşırı ifade veya yanlış ifadesi gerçekleştirilebilir. Her mRNA için konsantrasyon tittering, çok fazla mRNA non-spesifik hücresel toksisite neden olabilir electroporating gibi, çok az mRNA istenen hücreler etiket olmayabilir veya yeterli fenotürsel değişiklikler neden. Çeşitli biyolojik süreçlerin perturbations için görselleştirme veya değiştirilmiş gen ürünleri için FP Fusions belirteçleri kodlayan mRNAs in vitro sentezi için oluşturulan vektörler bir bolluk, farklı hayvan modeli sistemlerinden zaten var. İn vitro mRNA sentezi için tasarlanan bu yapıların çoğu, kar amacı gütmeyen plazmid depolarından hızlı ve ucuza elde edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir ilgi anlaşmazlıkları bildirmek zorunda.

Acknowledgments

Biz bu işe yardımcı bilgiler için David Huss teşekkür ederiz. Bu çalışma tarafından kısmen desteklenmektedir Rose Hills Vakfı yaz Araştırma Bursu (2016-2018) ve USC Provost 's Altgrad araştırma bursu MT, saban Araştırma Enstitüsü Intramural eğitim doktora öncesi Ödülü MD, ve Üniversitesi Güney Kaliforniya lisans araştırma Associates programı Ödülü ı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1, (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174, (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3, (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007, (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3, (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296, (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41, (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42, (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39, (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32, (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13, (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144, (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8, (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12, (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216, (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149, (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5, (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8, (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88, (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97, (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414, (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121, (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233, (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39, (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102, (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12, (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55, (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics