अनुप्रवाह आण्विक विश्लेषण और मेटास्टेटिक संभावित मूल्यांकन के लिए परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के micromanipulation

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

यहाँ, हम परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (ctcs) की विशेषता है कि लक्षणप्ररूपी और आणविक सुविधाओं की पहचान करने के लिए एक एकीकृत कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं । हम एकल और संकुल CTCs के अनुप्रवाह विश्लेषण और मेटास्टेसिस-बोने की क्षमता के मूल्यांकन के लिए एक सेल आधारित तकनीकों के साथ जीना immunostaining और रोबोट micromanipulation गठबंधन ।

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Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

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Abstract

रक्त जनित मेटास्टेसिस सबसे कैंसर से संबंधित मौतों के लिए खातों और ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) है कि दूर साइटों पर नए ट्यूमर की स्थापना में सफल रहे है परिसंचारी शामिल है । CTCs एक उच्च मेटास्टेटिक क्षमता प्रदर्शित उत्तरार्द्ध के साथ एकल कोशिकाओं (एकल CTCs) के रूप में या बहु कोशिकीय समुच्चय (सीटीसी क्लस्टर और सीटीसी-सफेद रक्त कोशिका समूहों) के रूप में रोगियों के खून में पाए जाते हैं । गणना से परे, लक्षणप्ररूपी और आणविक विश्लेषण ctc जीवविज्ञान का विघटन और कार्रवाई की कमजोरियों की पहचान करने के लिए असाधारण रूप से महत्वपूर्ण है. यहां, हम एक कार्यप्रवाह है कि ctc immunostaining और micromanipulation, पूर्व vivo के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रफलन और अस्तित्व की क्षमताओं का आकलन संस्कृति शामिल है, और vivo में मेटास्टेसिस-गठन assays हैं, का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । इसके अतिरिक्त, हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए पृथक्करण CTC क्लस्टर्स को व्यक्तिगत कक्षों में और इंट्रा-क्लस्टर विषमता की जांच । इन तरीकों के साथ, उदाहरण के लिए, हम संक्षेप में जीवन रक्षा और एकल ctcs और ctcs क्लस्टर्स के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रफलन क्षमता, हमें इस प्रेक्षण के लिए अग्रणी है कि समूहों के भीतर कोशिकाओं को बेहतर अस्तित्व और पूर्व में प्रसार प्रदर्शन vivo संस्कृतियों एकल CTCS की तुलना में । कुल मिलाकर, हमारे कार्यप्रवाह एकल कोशिका स्तर पर CTCs की विशेषताओं को टुकड़े-टुकड़े करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं, जो मेटास्टेसिस-प्रासंगिक रास्ते की पहचान और सीटीसी जीवविज्ञान की एक बेहतर समझ की दिशा में लक्ष्य है ।

Introduction

दूर के अंगों में मेटास्टेसिस की नैदानिक अभिव्यक्ति कैंसर प्रगति और कैंसर से अधिक ९०% के लिए खातों के अंतिम चरण का प्रतिनिधित्व करता है से संबंधित मौतें1. मेटास्टेटिक रोग के लिए स्थानीयकृत से संक्रमण एक बहु कदम प्रक्रिया है, अक्सर परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (ctcs)2,3,4द्वारा मध्यस्थता । इन कोशिकाओं को रक्त परिसंचरण में प्राथमिक ट्यूमर से बहाया जाता है और दूर के अंगों को ले जाया जाता है, जहां वे extravasate और मेटास्टेटिक घावों5,6स्थापित कर सकते हैं । हालांकि ठोस ट्यूमर CTCs की एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या जारी कर सकते हैं, सबसे CTCs मरने के लिए किस्मत में हैं, संचलन में उच्च कतरनी बलों के कारण, anoikis-मध्यस्थता सेल मौत, प्रतिरक्षा हमले या सीमित क्षमताओं के लिए एक विदेशी microenvironment के अनुकूल करने के लिए7. इसलिए, यह उपकरण है कि उन CTCs कि metastasis-बोने की क्षमता के साथ संपंन है की आणविक सुविधाओं के विच्छेदन सक्षम स्थापित करने के लिए निर्णायक है । हाल ही में पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों से पता चलता है कि उपस्थिति और एकल ctcs और ctcs समूहों की मात्रा ठोस ट्यूमर के विभिन्न प्रकार के साथ रोगियों में एक बदतर परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . Ctc क्लस्टर्स दो या अधिक ctc के समूह हैं जो सर्कुलेशन के दौरान एक-दूसरे से अनुलग्न होते है और एकल ctc3,15,16की तुलना में मेटास्टेसिस बनाने में अधिक कुशल होते हैं । किसी क्लस्टर के भीतर कक्ष desmosomes और आसंजन जंक्शनों के माध्यम से मजबूत कोशिका-कोशिका आसंजन बनाए रखने, जो anoikis17,18से उबरने में मदद कर सकते हैं । हाल ही में, हमने देखा कि CTCs का क्लस्टरिंग stemness-और प्रसार-संबद्ध ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर्स के लिए बाइंडिंग साइट्स के hypomethylation से जुड़ा हुआ है, जिससे मेटास्टेसिस19को सफलतापूर्वक प्रारंभ करने की क्षमता बढ़ी है । Ctc क्लस्टर वियोजन परिणाम कुंजी बाइंडिंग साइटों के remodeling में, और फलस्वरूप, उनके मेटास्टेटिक संभावित19का दमन । इसके अतिरिक्त कैंसर की कोशिकाओं के समूहों के लिए, ctcs भी सफेद रक्त कोशिका (सबसे अक्सर neutrophils) संचलन में उच्च प्रसार स्तर को बनाए रखने और उनके मेटास्टेटिक क्षमता20बढ़ाने के लिए संबद्ध कर सकते हैं । हालांकि, CTCs के जीवविज्ञान केवल हिस्से में समझा जाता है और कई सवाल खुले रहते हैं, जिनमें अंतर्निहित आणविक सुविधाएँ और एकल और संकुल कोशिकाओं की खामियां शामिल हैं ।

हाल के वर्षों में, कई रणनीतियों की स्थापना की है कि सेल-सतह अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ctcs के भौतिक गुणों का शोषण उनके अलगाव के लिए21,22,23,24, 25. प्रतिजन पर निर्भर अलगाव के तरीकों ज्यादातर कोशिका सतह उपकला कोशिका आसंजन अणु (epcam)26की अभिव्यक्ति पर भरोसा करते हैं । सबसे अक्सर प्रयोग किया जाता है और (वर्तमान में) CTC गणन के लिए केवल एफडीए को मंजूरी दी मंच, CellSearch प्रणाली है, जो एक दो कदम प्रक्रिया पर Ctc को अलग करने के लिए21आधारित है । पहले चरण में, प्लाज्मा घटकों को अपकेंद्रण द्वारा हटा दिया जाता है, जबकि CTCs को एंटी-EpCAM एंटीबॉडी के साथ युग्मित चुंबकीय फेरोफ्लूइड के साथ कैप्चर किया जाता है । दूसरे चरण में, सीटीसी-संवर्धित समाधान (dapi-positive) कोशिकाओं के लिए दाग होता है जो कोशिकाकर्तिन (CK)8,18,19को व्यक्त करते हैं, जबकि श्वेत रक्त कोशिकाओं (wbcs) का उपयोग करके पहचाना जाता है पैन-ल्यूकोसाइट मार्कर CD45 । अंत में, पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं को एक एकीकृत स्क्रीनिंग मंच पर रखा जाता है और CTCs EpCAM, CKs, और DAPI की अभिव्यक्ति के माध्यम से पहचाने जाते हैं, जबकि CD45 के लिए नकारात्मक किया जा रहा है । हालांकि यह सीटीसी गणना के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण सीटीसी पुनः प्राप्ति में अंतर्निहित बाधाओं के कारण इस तकनीक के साथ चुनौतीपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, अपने अलगाव की प्रक्रिया को देखते हुए, CellSearch उच्च EpCAM अभिव्यक्ति के साथ ctcs की तुलना में अधिक के साथ सीटीसी का संवर्धन एहसान कर सकते हैं, के लिए उदाहरण के लिए कैंसर विषमता27 या उपकला मार्करों के downregulation के लिए कारण 28,29. इन सीमाओं से उबरने के लिए, सीटीसी के संवर्धन के लिए प्रतिजन-स्वतंत्र प्रौद्योगिकियां उभर कर आई हैं । उदाहरण के लिए, CTC-iChip, शेष रक्त अवयवों से Ctc और WBCs सहित न्यूनीकृत कोशिकाओं के हाइड्रोडायनेमिक पृथक्करण को एकीकृत करता है, जिसके बाद एंटीबॉडी-टैग की गई WBCs की इम्यूनोमैग्नेटिक कमी होती है, जिसमें अनटैग और व्यवहार्य Ctc की शुद्धि की अनुमति है समाधान25। इसके अतिरिक्त, तथ्य यह है कि अधिकांश ctcs थोड़ा लाल रक्त कोशिकाओं (rbcs) या wbcs से बड़ा आकार के विकास के लिए नेतृत्व में सीटीसी संवर्धन प्रौद्योगिकियों23,30 (जैसे, parsortix प्रणाली (कोण)) जो एक का उपयोग करता है microfluidic आधारित प्रौद्योगिकी, जुदाई कैसेट भर में एक संकीर्ण चैनल शामिल है, या तो 10, 8, ६.५ या ४.५ μm (विभिन्न आकारों के एक टर्मिनल अंतराल के लिए अग्रणी कोशिकाओं को लक्षित कैंसर कोशिकाओं के संभावित व्यास के आधार पर उपलब्ध हैं). अधिकांश रक्त कोशिकाएं संकीर्ण अंतर से गुजरती हैं, जबकि CTCs अपने आकार के कारण फंस जाता है (लेकिन यह भी उनके कम विकृति की वजह से) और इसलिए, कैसेट में बने रहते हैं । प्रवाह की दिशा वापस ले कब्जा कर लिया CTCs, जो एक व्यवहार्य राज्य में है और नीचे की ओर विश्लेषण के लिए उपयुक्त है की रिहाई सक्षम बनाता है । CTC अलगाव के लिए चुना प्रोटोकॉल के स्वतंत्र रूप से, तथापि, ठेठ बाद संवर्धन प्रक्रियाओं अभी भी Ctc कि RBCs और WBCs की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के साथ मिश्रित कर रहे है उपज, शुद्ध एकल या थोक Ctc चुनौतीपूर्ण का विश्लेषण कर रही है । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम एक कार्यप्रवाह है कि संभावित रक्त कोशिका contaminants द्वारा शुरू पूर्वाग्रह के बिना CTC हेरफेर की अनुमति देता है की स्थापना की । पहले से ही immunostaining के अलावा, चर एंटीबॉडी-संयोजनों के साथ, CTCs रक्त कोशिकाओं से अलग है और यहां तक कि विशिष्ट सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ CTCS उपसमूहों की पहचान करने के लिए अनुमति देता है । यह उच्च अनुकूलन प्रक्रिया तो आगे विशिष्ट डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ संयुक्त किया जा सकता है ।

यहां, हम एक कार्यप्रवाह है कि एक CTC-संवर्धित उत्पाद से शुरू होता है का वर्णन (पसंद के किसी भी सीटीसी संवर्धन प्रौद्योगिकी के साथ प्राप्त) और एक सेल संकल्प पर CTC जीवविज्ञान में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए कई तरीकों को जोड़ती है । संक्षेप में, हमारे कार्यप्रवाह लाइव immunostaining द्वारा एकल ctcs, सीटीसी क्लस्टर्स और सीटीसी-wbc क्लस्टर्स की पहचान करने में सक्षम बनाता है, इसके बाद एकल-कोशिका micromanipulation और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण द्वारा ex vivo संवर्धन प्रोटोकॉल, एकल सेल का उपयोग अनुक्रमण, और vivo में मेटास्टेसिस assays हैं ।

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Protocol

सभी रोगियों से रक्त के नमूनों को शामिल प्रक्रिया प्रतिभागियों के हस्ताक्षर सूचित सहमति पर प्रदर्शन किया गया । प्रक्रियाओं प्रोटोकॉल EKNZ BASEC 2016-00067 और एक 321/10, नैतिक और संस्थागत समीक्षा बोर्ड (नीतिशास्त्र समिति नॉर्थवेस्ट द्वारा अनुमोदित के अनुसार चलाने/

सभी जानवरों से संबंधित प्रक्रियाओं संस्थागत और छायांतर दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया (अनुमोदित माउस प्रोटोकॉल #2781, बेसल-शहर के कैंटोनल पशु चिकित्सा कार्यालय) ।

1. रोगी नमूना तैयारी

  1. शुरू करने से पहले, अपूतित समाधान और सामग्री के साथ काम करने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान बंध्यता बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. एक 10 मिलीलीटर EDTA रक्त संग्रह ट्यूब में एक स्तन कैंसर के रोगी से परिधीय रक्त के ७.५ मिलीलीटर वापस लें ।
  3. एक कम समय अवधि के लिए रक्त युक्त ट्यूबों सेबेट (अप करने के लिए 1 एच) कमरे के तापमान पर (आरटी) ४० दोलन प्रति मिनट (osc/min) पर एक कमाल शेखर पर ।
  4. विकल्प21,22,23,25की एक सीटीसी अलगाव विधि का उपयोग कर एकल ctcs और सीटीसी क्लस्टर के लिए समृद्ध । एक 1x DPBS समाधान में CTCs छोड़ें ।
    नोट: चुना CTC-संवर्धन प्रौद्योगिकी के आधार पर, शेष सफेद रक्त कोशिकाओं और लाल रक्त कोशिकाओं मौजूद हो सकता है । आदेश CTC क्लस्टर संरचनाएं को संरक्षित करने के लिए रिलीजिंग दबाव समायोजित करें ।
  5. अनुभाग 3 में अगले चरण पर तुरंत आगे बढ़ें ।

2. माउस नमूना तैयारी

  1. शुरू करने से पहले, एक 25G सुई, 5 मिमी EDTA समाधान फ़िल्टर्ड, और 2 मिलीलीटर EDTA रक्त संग्रह ट्यूबों के साथ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज तैयार करते हैं ।
  2. पूरी प्रक्रिया के दौरान बंध्यता बनाए रखने के लिए अपूतित समाधान और सामग्री के साथ काम करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  3. 5 एमएम ईटीए सॉल्यूशन के साथ सिरिंज को प्री-वॉश कर लें ।
  4. 5 मिमी EDTA के १०० μL के साथ सिरिंज लोड और बुलबुले को दूर ।
  5. ८०% CO2 /20% O2 गैस साँस लेना और अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ने का उपयोग कर माउस euthanize ।
    नोट: सह2 के लिए एक वैकल्पिक साँस लेना विधि isoflurane संज्ञाहरण (3 vol% isoflurane और ऑक्सीजन (वाहक गैस) ६०० मिलीलीटर की प्रवाह दर पर है) और इसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, या ketamine/xylazine समाधान का इंजेक्शन अधिक मात्रा में । विशिष्ट इच्छामृत्यु विधि अनुमोदित माउस प्रोटोकॉल के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
  6. श्वास क्रिया के अभाव, कॉर्नियल प्रतिवर्त गुम होने, और बाह्य उत्तेजनों के बिना पेशाब करने से पशु की मृत्यु की पुष्टि करें ।
  7. दिल की ओर उरोस्थि से छाती में 30 डिग्री के कोण के साथ EDTA प्री-लोडेड सिरिंज की सुई को सावधानीपूर्वक पेश करते हुए कार्डियक पंचर का प्रदर्शन करें ।
    नोट: अनुभवहीन experimenters के लिए, यह छाती गुहा पहले खोलने के लिए सिफारिश की है, हृदय पंचर प्रदर्शन करने से पहले, बेहतर दिल कल्पना करने के लिए.
  8. रक्त के 1 मिलीलीटर तक निकालते हैं । प्लंजर रिहा बिना, जानवरों के सीने से सिरिंज बाहर खींच, सुरक्षित रूप से सुई हटाने, 2 मिलीलीटर EDTA रक्त संग्रह ट्यूब के ढक्कन खोलने के लिए और सीधे अंदर रक्त बांटना । ढक्कन बंद करें और ट्यूब 10x पलटी ।
  9. एक कम समय अवधि के लिए रक्त युक्त ट्यूबों सेबेट (अप करने के लिए 1 एच) पर आरटी में एक कमाल शेखर पर ४० osc/
    चेतावनी: सुई का निपटारा तेज-सुरक्षित जैविक जोखिम निपटान में किया जाना चाहिए ।
    नोट: कई पंचर के लिए कुल रक्त की मात्रा में वृद्धि संभव है । पूर्व सुई में मौजूद पका हुआ खून से बचने के लिए अलग वापस लेने के लिए edta के साथ पहले से भरी हुई अलग सिरिंज का प्रयोग करें ।
  10. विकल्प21,22,23,25के ctcs अलगाव विधि का उपयोग कर एकल ctcs और सीटीसी क्लस्टर के लिए समृद्ध । एक 1x DPBS समाधान में CTCs छोड़ें ।
    नोट: चयनित CTC-संवर्धन प्रौद्योगिकी के आधार पर, शेष श्वेत रक्त कोशिकाओं और लाल रक्त कोशिकाओं, मौजूद हो सकता है । आदेश CTC क्लस्टर संरचनाएं को संरक्षित करने के लिए रिलीजिंग दबाव समायोजित करें ।
  11. अनुभाग 3 में अगले चरण पर तुरंत आगे बढ़ें ।
    नोट: सभी निम्न कार्यविधियों के लिए, सुनिश्चित करें कि अनिर्धारित और हौसले से अलग रक्त का उपयोग किया जाता है ।

3. CTCs लाइव इम्यूनोरंजन

  1. 4 मिनट के लिए ७२ x g पर अपकेंद्रित्र सीटीसी-समृद्ध सेल निलंबन ।
    नोट: ७२ एक्स जी ८०० rpm को मेल खाती है यदि रोटर १०० मिमी का व्यास है । रोटर के अनुसार जी-फोर्स संख्या में कनवर्ट करें ।
  2. धीरे 1x DPBS में 1% BSA समाधान में गोली resuspend और ५०० μL की कुल मात्रा में विरोधी मानव CD45-BV605 एंटीबॉडी या 2 μg/एमएल विरोधी माउस CD45-BV605 एंटीबॉडी के 2 μg/
    नोट: स्तन कैंसर रोगी के लिए-CTCs व्युत्पंन, विरोधी मानव EGFR-FITC, और विरोधी मानव HER2-AF488 अतिरिक्त विरोधी EpCAM और विरोधी CD45 के लिए जोड़ा जा सकता है । यह बेहतर है कि कम EpCAM स्तर व्यक्त कर रहे हैं CTCs की पहचान करने के लिए अनुमति देता है.
  3. RT पर 30 मिनट के लिए सेक्यूबेट और प्रकाश से रक्षा करना ।
  4. धोने CTCs 1x DPBS समाधान और ७२ x g में 4 मिनट के लिए 1% बीएसए के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर निलंबन । इस वॉश को दो बार दोहराएं ।
  5. 1x DPBS समाधान में 1% BSA के 2 मिलीलीटर में सना हुआ कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक 6 कुओं अल्ट्रा कम लगाव थाली के 1 अच्छी तरह से कुल मात्रा हस्तांतरण ।
  6. CTCs और अवशिष्ट रक्त कोशिकाओं के अवसादन की अनुमति देने के लिए प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए थाली सेते ।

4. CTCs और एकल सेल के micromanipulation उठा

नोट: शुरू करने से पहले, ध्यान रखें कि micromanipulator पूरा सेट अप के लिए ४५ मिनट तक की आवश्यकता है. एक बार स्थापित, सीटीसी पहचान और micromanipulation के लिए प्रक्रिया के लिए प्रति सेल (या क्लस्टर) 2 मिनट तक की आवश्यकता है ।

  1. को धुंधला के अंत से 2 घंटे के भीतर CTC उठा प्रक्रिया को समाप्त करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. Micromanipulator सॉफ्टवेयर शुरू और micromanipulator पर स्विच. कंप्यूटर के लिए micromanipulator कनेक्ट और Int डिवाइसके बाद कनेक्ट बटन दबाने से रोबोट बांह के साथ ही माइक्रोस्कोप मंच शुरू.
  3. मशीन के हर हेरफेर के बाद रक्षा कैबिनेट बंद करने के लिए कंप्यूटर के माध्यम से यह पैंतरेबाज़ी करने में सक्षम हो ।
  4. धूल और फैल इथेनॉल छिड़काव और कैबिनेट की आंतरिक सतहों पोंछते से सतहों साफ । एक स्वच्छ वातावरण प्रक्रिया की बाँझपन सुनिश्चित करेगा ।
  5. रोबोट की बांह पर एक नया ग्लास केशिका स्थापित करें । एकल-कक्ष खरीदना, के लिए 20-30 μm केशिका का उपयोग करें, जबकि 30-50 μm CTC क्लस्टर खरीदना के लिए बेहतर है ।
  6. प्रणाली तेल के वितरण या aspirating द्वारा टयूबिंग में मौजूद सभी बुलबुले निकालें ।
    चेतावनी: ग्लास केशिका तेज और नाजुक है । सावधानी से संभाल लें ।
  7. नसबंदी टैंक 1 ७०% इथेनॉल के साथ भरें, बंध्याकरण टैंक 2 बाँझ nuclease के साथ-मुक्त एच2ओ और बाँझ 1X DPBS के साथ बफर टैंक.
    चेतावनी: टैंक के lids बंद मत करो, क्योंकि अगले कदम केशिका स्वतंत्र रूप से टैंकों का उपयोग करने की आवश्यकता होगी के दौरान ।
  8. ७०% इथेनॉल के साथ केशिका दो बार ।
  9. नसबंदी के टैंक 1 को टैंक 2 के साथ बदलें और एच2ओ में केशिका धो लें ।
  10. Micromanipulator सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एक नया प्रयोग शुरू करने और स्वचालित और मैन्युअल चयन मोड के बीच उठा प्रयोग के प्रकार का चयन करें.
    नोट: हेरफेर के अंत बिंदु के आधार पर प्रयोग का प्रकार चुनें । मैनुअल मोड केशिका के कोशिका निलंबन में प्रवेश करने के बाद एक रोबोटिक आर्म के maneuvering को सक्षम करता है । यह चरण CTC क्लस्टर्स को व्यक्तिगत कक्षों में वियोजन के लिए आवश्यक है । प्रयोग के दौरान चुनने के प्रकार को बदलना संभव है ।
  11. बंध्याकरण टैंक की स्थिति (तरल 1), बफर टैंक (2 तरल) और जमा ट्रे (लक्ष्य 1 या 2) निर्दिष्ट डेक ट्रे कॉंफ़िगर करें । लक्ष्य 1 प्लेटों में जमा करने की अनुमति देता है, लक्ष्य 2 पीसीआर ट्यूब या पीसीआर प्लेटों में जमा करने की अनुमति देता है ।
  12. तरल टैंकों का तापमान सेट करें और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए चुना ट्रे जमा ।
    नोट: खरीदना प्रक्रिया समय लगता हो सकता है । इसलिए तरल टैंक और जमा ट्रे के शीतलक की सलाह दी है
  13. अल्ट्रा कम लगाव micromanipulator कैबिनेट के अंदर माइक्रोस्कोप के तहत जारी CTCs समाधान युक्त थाली स्थिति । थाली से ढक्कन हटाकर कैबिनेट बंद कर दें । सेट अप के बाकी के लिए और खरीदना प्रक्रिया के दौरान आरटी पर थाली रखें ।
  14. मैंयुअल रूप से चुनने के लिए माइक्रोस्कोप उद्देश्य का चयन करें (10-20x) और सभी आवश्यक चैनल के जोखिम समय (Brightfield, FITC, और TRITC चैनल) ।
  15. कल्पना करें और पिक प्लेट (6-कूप प्लेट) के प्रकार का चयन करने के लिए उपकरण पट्टी से अच्छी तरह से नेविगेटर दिखाएँ चुनें ।
    नोट: किसी भी थाली या अच्छी तरह से प्रारूप केवल निर्माता द्वारा स्थापित किया जा सकता है ।
  16. अच्छी तरह से CTCs समाधान युक्त के बीच में पिकअप स्थिति जांचना, लेकिन देखने के क्षेत्र के केंद्र में कोई कोशिकाओं के साथ. कुओं के किनारों पर प्रदर्शन अंशांकन दोषपूर्ण अच्छी सतह के कारण त्रुटिपूर्ण अंशांकन में परिणाम कर सकते हैं ।
  17. सेंसर का उपयोग करने के लिए धीरे केशिका (गति ०.०१ mm/कदम और 1% गति) के साथ थाली के नीचे छूने के लिए ।
  18. पिकअप की स्थिति ०.०५ mm प्लेट के नीचे सेट करें ।
    नोट: खोलने के लिए और आगे बढ़ने से पहले प्लेटों और टैंकों की lids को हटाने के लिए सुनिश्चित करें । केशिका बंद या हटाए गए ढक्कन पर टूट सकती है ।
    चेतावनी: lids के साथ संपर्क पर केशिका टूटता है, तो टूटे हुए ग्लास परिवेश में या समाधान में पाया जा सकता है ।
  19. कक्ष प्रकार और खरीदना पैरामीटर्स का चयन करें । पैरामीटर खरीदना सेट-अप और प्रत्येक स्टार्टअप पर लोड किया जा सकता है । एकल-कक्ष चुनने के लिए, मैंयुअल मोड का चयन करें ।
  20. खरीदना तैयारी सेटिंग्स के भीतर:
    1. 1 μL करने के लिए सिस्टम तेल और नमूना के बीच एयरगैप मात्रा सेट
    2. बफ़र लिक्विड वॉल्यूम ०.५ μL करने के लिए प्रत्येक खरीदना करने से पहले लेने के लिए सेट करें ।
      नोट: बफ़र लिक्विड वॉल्यूम कुल अधिकतम पिकअप वॉल्यूम के लिए समायोजित किया जाता है । छोटी वॉल्यूम्स खरीदना या जमा करने की दक्षता को प्रभावित नहीं करते ।
    3. 1-6% के बीच बफर तरल की आकांक्षा की गति सेट करें ।
    4. 1 एस बफर की आकांक्षा के बाद प्रतीक्षा समय निर्धारित करें ।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो बफर तरल टैंक के बजाय लक्ष्य से अच्छी तरह से बफर लेने का विकल्प इस्तेमाल किया जा सकता है
    5. पिक के बीच ग्लास केशिकाओं और कोई नसबंदीपुनः प्रयोग करने के लिए सेट करें ।
      नोट: पसंद के बीच नसबंदी मैंयुअल रूप से किया जा सकता है यदि आवश्यक है । एच 2 ओ में एकाधिक washes के बाद इथेनॉल में उठाता है या दो नसबंदी के बीच एच2ओ मेंकई washes प्रदर्शन ।
  21. उठा सेटिंग्स के भीतर:
    1. ७,५०० μs करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत उठा और जोखिम समय कैमरा सेटिंग्स बदलें ।
    2. निश्चित उठा ऊँचाईका चयन करें ।
      नोट: उपकरण संवेदक या autofocus के बजाय चुना जा सकता है । हालांकि, थाली की छोटी खामियों संवेदक या autofocus जो केशिका की थाली में प्रभाव पैदा कर सकता है की संवेदनशीलता को परेशान कर सकते हैं ।
    3. 7-15% करने के लिए स्रोत थाली में प्रवेश केशिका की आकांक्षा गति सेट करें ।
    4. सहभागी खरीदनासक्षम करें ।
    5. आकांक्षा मात्रा μl में 0-0.05 करने के लिए सेट करें ।
    6. 5% करने के लिए आकांक्षा की गति सेट करें ।
    7. 0-1 के लिए एस में आकांक्षा के बाद प्रतीक्षा समय निर्धारित करें ।
    8. केशिका प्रति उठाया कणों की संख्या 1 करने के लिए सेट करें ।
    9. एक ही स्थिति और कोई scraping कार्यों पर कोई एकाधिक उठा सेट करें । आकांक्षा गुण प्रयोग के प्रकार के अनुसार सेट किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, स्वत: उठा मोड बड़ा आकांक्षा संस्करणों की आवश्यकता हो सकती है) ।
  22. जमा सेटिंग्स के भीतर:
    नोट: जमा करने की सेटिंग सख्ती से जमा करने की थाली/ट्यूब पर निर्भर करती है ।
    1. एकल कोशिका उठा के लिए, लक्ष्य थाली में प्रवेश केशिका की गति को परिभाषित करने के लिए 25%.
    2. 6% करने के लिए वितरण की गति निर्धारित करें ।
    3. एस 0 में वितरण के बाद प्रतीक्षा समय सेट करें ।
    4. १००% करने के लिए लक्ष्य में वितरित एयरगैप की राशि निर्धारित करें ।
    5. जमा करने के बाद कोई कुल्ला नहींकरें ।
      नोट: नसबंदी केशिका को साफ करने के लिए जमा करने के बाद किया जा सकता है ।
    6. प्रति अच्छी तरह से कणों जमा की अधिकतम राशि और 1 करने के लिए कणों को वितरित करने के लिए लक्ष्यों की संख्या निर्धारित करें ।
    7. प्लेटों के लिए लक्ष्य 1 की स्थिति A1 पर या ट्यूबों के लिए लक्ष्य 2 की स्थिति A1 पर जमा ऊंचाई जांचना । अंशांकन के लिए ढक्कन के बिना एक खुली ट्यूब या थाली प्लेस और सेंसर का उपयोग धीरे जमा अच्छी तरह से छूने के लिए (गति ०.०१ मिमी/ जमा करने की ऊंचाई 1 mm थाली के नीचे ऊपर सेट करें ।
  23. सेटिंग्सके भीतर:
    1. 5-10% करने के लिए चुनने के दौरान चरण की गति सेट करें ।
      नोट: थाली के तेजी से आंदोलनों निलंबन में कोशिकाओं के आंदोलन में परिणाम हो सकता है और कई सेल में कठिनाइयों के कारण गलत इस्तेमाल उठा ।
    2. नसबंदी के दौर के प्रति समय प्रतीक्षा की 1 μL, 3 rinsing छोरों और 2 एस के लिए rinsing मात्रा का उपयोग कर बंध्याकरण गुण सेट करें ।
    3. बंद करने से पहले परिवर्तनों को लागू करें ।
  24. कूप में जॉयस्टिक का उपयोग ग्लास केशिका नेविगेट और ब्याज की एक सेल के शीर्ष पर जगह है । अच्छी तरह से सीमा (1 मिमी) से एक सुरक्षित दूरी पर पदों उठा चुन के रूप में केशिका अच्छी तरह के किनारे पर टूट सकता है ।
  25. मैन्युअल रूप से जॉयस्टिक के बटन का उपयोग कर कणों को जोड़ने या मैन्युअल रूप से मेनू से चयन.
  26. का चयन करें सक्रिय कणों उठाओ उठा शुरू करने के लिए ।
  27. केशिका ०.०५ mm प्लेट के नीचे और इंटरैक्टिव उठा (मैन्युअल मोड) के कारण चयनित पिकअप स्थिति के शीर्ष पर बंद हो जाएगा । धीरे जॉयस्टिक की घुंडी बारी करने के लिए मैंयुअल रूप से कण महाप्राण और आसपास के DPBS समाधान । मैंयुअल मोड चालू होने पर अधिकतम वॉल्यूम ठीक नहीं किया गया है । हालांकि, सिरिंज में अनुमति दी अधिकतम मात्रा 25 μL हो जाएगा ।
  28. धीरे जॉयस्टिक वामावर्त की घुंडी बदल कर अतिरिक्त DPBS समाधान या अवांछित कणों बांटना । बहुत ज्यादा वितरण अपने समाधान में बुलबुले बनाने और दृश्यता समझौता सिरिंज के airgap जारी करेंगे ।
  29. प्रेस आगे जमा के साथ आगे बढ़ना है ।
  30. पीसीआर ट्यूब या पीसीआर प्लेट जमा करने, मात्रा जारी करने और एक खाली केशिका के साथ शुरू की स्थिति के लिए वापस जा रही केशिका का निरीक्षण करें ।
    नोट: केशिका में छोड़ दिया मात्रा है, नसबंदी के साथ आगे बढ़ें. फिर, एक नया उठा प्रदर्शन करने से पहले सेटिंग्स, तेल के स्तर, और तेल की ऊंचाई फिर से जांच करें ।
  31. कोई नया एकल-कक्ष खरीदना प्रारंभ करने के लिए अनुभाग 4 के बिंदु 26 से आगे बढ़ें । चुनने के दौरान यह केशिका की जगह आवश्यक हो सकता है । स्थापना के बाद, पिकअप स्थिति का एक नया अंशांकन किया जाना चाहिए । अंशांकन के अंत में, फ़ंक्शन का चयन करें नए केशिका अंशांकन के लिए जमा ऊंचाई को सही करने के लिए और जमा ऊँचाई अंशांकन (अनुभाग ४.१६) को छोड़ करने के लिए ऊंचाई जमा करने के लिए Z-ऊँचाई में कैलिब्रेट किए गए परिवर्तन लागू होते हैं ।
    नोट: अधिकांश CTCs संवर्धन और आइसोलेशन विधियों के लिए अनुभाग 1-4 में बताए गए चरण लागू होते हैं । यहाँ हम विशिष्ट CTCs विश्लेषण के लिए वैकल्पिक चरणों की रिपोर्ट.

5. एकल सेल उठा और अस्तित्व और प्रसार विश्लेषण के लिए बोने

  1. पूरी प्रक्रिया के दौरान बंध्यता बनाए रखने के लिए अपूतित समाधान और सामग्री के साथ काम करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. एक ३८४ कूप प्लेट तैयार करने के लिए चुना एकल ctcs के साथ संवर्धन के लिए 20 μl सीटीसी संवर्धन मीडिया31। सुनिश्चित करें कि CTCs हेरफेर के बाद माध्यम की छोटी मात्रा (जैसे, 10-20 μL एक ३८४ अच्छी तरह से थाली के लिए) में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।
  3. नीचे थाली के नीचे करने के लिए समाधान स्पिन । 1 लक्ष्य में ३८४ अच्छी तरह से थाली प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं ।
  4. Micromanipulator की स्थापना की और एक नया उठा शुरू करने के लिए में वर्णन किया गया ।
    नोट: एकल कक्षों के एकाधिक चयनों के कारण खरीदना सूची का निर्माण हो जाएगा । कणों उठाया जाएगा और लगातार कुओं में एक एक करके जमा (अनुभाग 4.22.6 देखें) । हालांकि, इंटरैक्टिव मोड (मैनुअल मोड) आकांक्षा से पहले केशिका सही बंद हो जाएगा, इसलिए इस महत्वपूर्ण कदम को नियंत्रित करने के लिए और सफल उठा सुनिश्चित करने के लिए experimenter की अनुमति. प्लेट के तेजी से आंदोलनों निलंबन में कोशिकाओं के आंदोलन में परिणाम हो सकता है और एकाधिक सेल उठा में कठिनाइयों.
  5. जमा करने के बाद, एक नया उठा प्रारंभ करने के लिए चरण 4 दोहराएं ।
  6. उठा के अंत में, 4 मिनट के लिए ७२ x जी पर थाली अपकेंद्रित्र यह सुनिश्चित करने के लिए कि उठाया कोशिकाओं को अच्छी तरह के तल पर रखा जाता है ।

6. CTC क्लस्टर तोड़ने और एकल-कक्ष अनुक्रमण के लिए उठा

  1. पूरी प्रक्रिया के दौरान बंध्यता बनाए रखने के लिए अपूतित समाधान और सामग्री के साथ काम करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. एकल पीसीआर ट्यूब या एक पीसीआर प्लेट है कि कुल २.५ μL सेल lysing समाधान के साथ भंग क्लस्टर की एकल कोशिकाओं को शामिल करेगा तैयार आरएनए निरोधक के 1 यू/μL शामिल है ।
  3. जल्दी से नीचे ट्यूब के नीचे करने के लिए समाधान स्पिन । जमा कंटेनरों को लक्ष्य 2 में रखें और 4 ° c पर रख दें ।
  4. Micromanipulator सेट अप करने के लिए के साथ धारा 4 में वर्णित सभी चरणों का प्रदर्शन.
  5. कोई नया खरीदना प्रारंभ करें । केशिका प्लेट के नीचे और सहभागी खरीदना (मैन्युअल मोड) के कारण चयनित CTC क्लस्टर के शीर्ष पर ०.०५ mm बंद हो जाएगा ।
  6. धीरे से क्लस्टर और आसपास के डीपीबी समाधान के लिए मैंयुअल रूप से महाप्राण करने के लिए जॉयस्टिक की घुंडी बारी । धीरे से जॉयस्टिक वामावर्त की घुंडी बदल कर CTC क्लस्टर सहित aspirated मात्रा बांटना ।
  7. जब तक कि एकल कक्ष क्लस्टर बनाने अलग टूट जाएगा चरण 6 में वर्णित CTC क्लस्टर की आकांक्षा/डिस्पोज़ल दोहराएं ।
    नोट: बहुत ज्यादा वितरण अपने समाधान में बुलबुले बनाने और दृश्यता समझौता सिरिंज के airgap जारी करेंगे ।
  8. आंख द्वारा का पालन करें एकल कोशिकाओं की स्थिति । मैन्युअल रूप से जॉयस्टिक के बटन का उपयोग कर कणों को जोड़ने या मैन्युअल रूप से मेनू से चयन.
    नोट: एकल कक्षों के एकाधिक चयनों के कारण खरीदना सूची का निर्माण हो जाएगा । कणों उठाया जाएगा और लगातार एक पीसीआर ट्यूबों में एक के बाद एक जमा/ हालांकि, इंटरैक्टिव मोड (मैनुअल मोड) आकांक्षा से पहले केशिका सही बंद हो जाएगा, इसलिए, experimenter इस महत्वपूर्ण कदम को नियंत्रित करने के लिए और सफल उठा सुनिश्चित करने के लिए अनुमति दे.
  9. का चयन करें सक्रिय कणों उठाओ उठा शुरू करने के लिए ।
    नोट: सेल lysing समाधान की मात्रा एक एकल कोशिका पूरी तरह से lysing करने के लिए अनुमति देगा । हालांकि, एक एजेंट के लिए एक सामग्री के लंबे समय प्रदर्शन डीएनए या mrna नीचा कर सकते हैं । इसलिए, अगले चरण पर तुरंत आगे बढ़ें ।
  10. तुरंत उठाया एकल सेल और स्नैप ठंड के लिए सूखी बर्फ पर स्थानांतरण युक्त ट्यूब बंद ।
  11. जल्दी ट्यूब स्पिन और ट्यूब के पक्षों पर बूंदों के अभाव के लिए जांच जमा सेल की एक उचित lyse सुनिश्चित करने के लिए ।
  12. एक नया खरीदना प्रारंभ करने के लिए चरण 5 से दोहराएं ।
    नोट: माइक्रोस्कोप चरण खंड 4.23.1 में वर्णित गति से एक जोड़ा कण से दूसरे में ले जाया जाएगा । अल्ट्रा कम लगाव प्लेट में CTCs निलंबन चाल, गलत गलत इस्तेमाल के कारण उठा हो सकता है ।

7. CTCs माउस इंजेक्शन के लिए अलगाव

  1. पूरी प्रक्रिया के दौरान बंध्यता बनाए रखने के लिए अपूतित समाधान और सामग्री के साथ काम करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. बाँझ 1x DPBS के 5 μL के साथ एक पीसीआर ट्यूब तैयार करते हैं ।
  3. जल्दी से नीचे ट्यूब के नीचे करने के लिए समाधान स्पिन । जमा कंटेनरों को लक्ष्य 2 में रखें और 4 ° c पर रख दें ।
  4. जमा सेटिंग्स के भीतर कदम 4.22.6 पर एक परिवर्तन लागू करें: प्रति अच्छी तरह से १,००० और लक्ष्यों की संख्या 1 के कणों को वितरित करने के लिए कणों जमा की अधिकतम राशि निर्धारित करें । यह कदम सुनिश्चित करता है कि उठाया कोशिकाओं १,००० बार के लिए एक ही ट्यूब में जमा हो जाएगा ।
  5. केवल सहभागी मोड (मैन्युअल मोड) खरीदना चरण को नियंत्रित करने और संदूषक कोशिकाओं से उठाया समाधान मुक्त रखने के लिए उपयोग करें ।
    नोट: यदि १,००० से अधिक कक्षों की आवश्यकता है, तो १,००० कक्षों के बाद नमूने की हानि से बचने के लिए कणों को वितरित करने के लिए लक्ष्य की संख्या बढ़ाएं ।
  6. एक नया खरीदना प्रारंभ करने के लिए अनुभाग ४.२६ के चरणों को जारी रखें । एकाधिक pickings निष्पादित करने के लिए चरण 6 को दोहराएं । माउस इंजेक्शन के लिए उपलब्ध कक्षों की संख्या का ट्रैक रखने के लिए प्रत्येक खरीदना पर एकत्रित कक्षों की संख्या एनोटेट करें ।
  7. उठा के अंत में, 4 मिनट के लिए ७२ x जी में ट्यूब केंद्राउत्र (३.१ अनुभाग देखें.) और महाप्राण supernatant ।
  8. माउस इंजेक्शन के लिए उपयुक्त, पसंद के बफर में एकत्र CTCs फिर से निलंबित । स्तन फैट पैड इंजेक्शन के लिए, 1x dpbs के 1 से 1 अनुपात में एकत्र ctcs फिर से निलंबित और पुनर्निर्माण तहखाने झिल्ली निकाला, और इंजेक्शन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें. नसों में इंजेक्शन के लिए, DPBS में ही एकत्र CTCs फिर से निलंबित ।
    नोट: समाधान की मात्रा कड़ाई से CTCs की संख्या है कि इंजेक्शन दिया जाएगा पर निर्भर करता है । यह स्तन वसा पैड में सुई या नसों के द्वारा एक अधिकतम १०० μL प्रति माउस की सलाह दी जाती है । जब मात्रा की गणना, हमेशा हेरफेर और सिरिंज लदान के लिए मृत मात्रा पर विचार करें.

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Representative Results

प्रस्तुत कार्यप्रवाह व्यक्तिगत CTCs की तैयारी की अनुमति देता है, या तो एकल CTCS से या सीटीसी क्लस्टर्स से अलग किया गया । रोगियों या ट्यूमर असर चूहों से CTCs उपलब्ध CTCS-संवर्धन तरीकों के साथ पूरे रक्त से समृद्ध कर रहे हैं और फिर कैंसर से जुड़े मार्कर (जैसे, EpCAM, ग्रीन) और WBC-विशिष्ट मार्कर (जैसे, CD45, लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग (चित्र 1a ). दाग सीटीसी उत्पाद तो micromanipulation स्टेशन के लिए स्थानांतरित कर रहे थे व्यक्तिगत कोशिकाओं को चुना, पीसीआर ट्यूब या multiwell प्लेटों में जमा किया और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए तैयार कर रहे हैं, एकल सेल अनुक्रमण सहित, इन विट्रो संस्कृति या vivo में assays है (चित्र 1b) ।

इस विधि की विश्वसनीयता मैंयुअल कक्ष खरीदना के दौरान एक उचित लक्ष्य-कक्ष भेद पर आधारित है । एंटी-EpCAM एंटीबॉडी के साथ जीना immunostaining निलंबन में कैंसर की कोशिकाओं visualizes और CD45-सकारात्मक घटनाओं (सबसे अधिक संभावना है, WBCs) से एक सटीक अंतर सक्षम बनाता है (चित्रा 2a). जब ठीक से calibrated और बनाए रखा, CellCelector अच्छी तरह से नियंत्रित सेल हेरफेर प्रदान करता है. Ctc क्लस्टर आकांक्षा (चित्र 2b, C) से पहले और बाद में लिए गए चित्रों पर दिखाया गया है, के रूप में सटीक ctc अलगाव संदूषक कोशिकाओं (rbcs या wbcs) के आसपास के बिना केवल वांछित लक्ष्य की आकांक्षा की विशेषता है ।

पहले बताया गया, के रूप में मिलान किया गया एकल ctc19की तुलना में ctc क्लस्टर्स एक अधिक मेटास्टेटिक फेनोटाइप प्रदर्शित करें । फिर भी, कि क्या पड़ोसी कोशिकाओं की उपस्थिति समूहों के भीतर कोशिकाओं की प्रसार दर को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है अज्ञात है । इस प्रश्न को हल करने के लिए, १००९ एकल सीटीसी और १००८ सीटीसी क्लस्टर्स 2-17 कक्षों के बीच (उनमें से ८९.५% के साथ 2-5 सेल क्लस्टर्स जा रहा है) CTC-व्युत्पन्न BR16 सेल लाइन20 से व्युत्पंन की व्यक्तिगत कुओं में micromanipulated थे ३८४-well अल्ट्रा कम लगाव प्लेटें । हर कुएं में जीवित कोशिकाओं की संख्या को माइक्रोस्कोप के नीचे मैन्युअल रूप से गिना गया और साप्ताहिक दर्ज किया गया । सभी विश्लेषण कक्ष संख्या के सामान्यीकरण के बाद किया गया था (यानी, तीन सेल क्लस्टर तीन व्यक्तिगत कोशिकाओं के रूप में विश्लेषण किया गया था). असफल कॉलोनियों में प्रयोग के अंत में कुएं में जीवित कोशिकाएं न होने की विशेषता थी । संदिग्ध के रूप में, सीटीसी क्लस्टर एकल ctc की तुलना में वृद्धि हुई अस्तित्व दिखाया और इन विट्रो संवर्धन के ५६ दिनों के भीतर सेल कालोनियों को जंम दिया (चित्रा 3a, 3b) । विशेष रूप से, सीटीसी क्लस्टर्स ने भी उच्च प्रसार दर दर्शाई है और इस प्रकार उच्च अंतिम सेल संख्या (चित्र 3C) तक पहुंच गई है, जो यह दर्शाती है कि अन्य ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सीधा संपर्क उनकी व्यवहार्यता और प्रसार दर दोनों पर प्रभाव डालता है ।

अंत में, हम सीधे स्तन कैंसर रोगियों से अलग CTCs के एकल सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, हम एकल CTCs, सीटीसी क्लस्टर्स या CTCS-WBC क्लस्टर्स (चित्रा 4) से व्युत्पन्न एक ही सेल के एक टी-डिस्ट्रीब्यूटेड स्टोहास्टिक नेबर एम्बेड (tSNE) दिखाते हैं । इस दृष्टिकोण समान जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के साथ कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है, साथ ही कोशिका आबादी है कि विशेष जीन की अभिव्यक्ति के आधार पर अलग का भेद ।

Figure 1
चित्रा 1 . प्रायोगिक वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध निरूपण । (क) ctcs कैंसर रोगियों के रक्त या माउस कैंसर मॉडलों, समृद्ध उपलब्ध तरीकों का उपयोग करने और सफेद रक्त कोशिकाओं (लाल) से भेदभाव ट्यूमर कोशिकाओं (हरी) के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल से प्राप्त कर रहे हैं । (ख) सी टी सी की सटीक सूक्ष्मीकरण बहु प्रक्रियाओं और अनुप्रयोगों जैसे एकल-कोशिका अनुक्रमण, सीटीसी कल्चर या वीवो ट्रांसप्लांटेशन प्रयोगों में सुविधा प्रदान करता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 . प्रतिनिधि CTCs से पहले और बाद में micromanipulation के चित्र । (क) सीटीसी-व्युत्पन्न xenograft (एनएसजी-CDX-BR16) से प्राप्त ctcs के प्रतिनिधि छवियों और एंटीबॉडी एंटी-epcam (ग्रीन) और एंटी-CD45 (लाल) के साथ दाग ctcs और श्वेत रक्त कोशिकाओं के दृश्य को सक्षम करने के लिए क्रमशः. आवर्धन 40x दिखाया गया है । (ख, ग) Micromanipulation के रूप में छवियों में दिखाया (बाएं) से पहले और (दाएं) सेल आकांक्षा प्रक्रिया के बाद अवांछित कोशिकाओं से ctcs के सटीक जुदाई के लिए अनुमति देता है. आवर्धन 10x । दृश्य का बड़ा क्षेत्र (B) और दृश्य के संकरा क्षेत्र (C) क्रमशः दिखाए गए हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

Figure 3
चित्रा 3 . एकल सीटीसी और सीटीसी समूहों का उत्तरजीविता और प्रसार विश्लेषण । एकल CTCs या CTCS क्लस्टर्स से संस्कारी सीटीसी-व्युत्पन्न BR16 कक्षों से व्यक्तिगत कक्षों को ३८४-well प्लेटों में micromanipulated किया गया था । (क) कैप्लान-मेनियर प्लॉट जिसमें एकल सेल बनाम कोशिका गुच्छ की उत्तरजीविता संभाव्यता दिखाई जाती है । P< 0.0001 द्वारा युग्मन: लॉग-रैंक परीक्षण. (ख) प्रयोग के अंत में जीवित कोशिकाओं के शामिल कालोनियों के अनुपात का प्रतिनिधित्व करने वाला बार ग्राफ (दिन ५६) । ची-स्क्वायर टेस्ट द्वारा P< 0.0001 । (ग) heatmaps प्रयोग के दौरान सेल नंबर वितरण सामांयीकृत visualizing (दिन 0, 8, ३२, ५६) । प्रत्येक ब्लॉक एक प्रारंभिक सेल का प्रतिनिधित्व करता है और heatmap एक दिया timepoint पर अच्छी तरह से प्रति कक्षों की संख्या से पता चलता है । डी = दिन । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 . एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण । CTC आरएनए अभिव्यक्ति डेटा का उपयोग कर टी वितरित Stochastic पड़ोसी Embedding (tSNE) का दृश्य । प्रत्येक डॉट एकल CTC, एक CTC क्लस्टर या एक CTC-WBC क्लस्टर से व्युत्पंन एकल कक्ष का प्रतिनिधित्व करता है । डॉट्स के रंग दाता आईडी के अनुरूप हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

Ctcs के आणविक लक्षण वर्णन के लिए मेटास्टेटिक प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ में सुधार और नए विरोधी metastasis चिकित्सा के विकास के मार्गदर्शन के लिए वादा रखती है । यहां हम उन प्रोटोकॉल का एक विस्तृत वर्णन है कि CTC micromanipulation और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण, दोनों एकल सेल आधारित कार्यात्मक assays हैं, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और मेटास्टेटिक क्षमता के लिए वीवो प्रत्यारोपण में सक्षम है प्रदान आकलन20

हमारे प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से, सीटीसी-समृद्ध उत्पादों के micromanipulation, अपेक्षाकृत विषम सेल निलंबन से एकल कोशिका संकल्प प्राप्त करने का लक्ष्य है, अर्थात् शुद्धता के उच्चतम स्तर तक पहुँचने के लिए और की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए अनुमति बाद में कार्यात्मक या आणविक विश्लेषण । उदाहरण के लिए, CTCs के एकल कक्ष चुनने ने हमें और अन्य लोगों को CTCS विषमता (उदा., एकल CTCs, CTCS क्लस्टर्स, और CTCS-WBC क्लस्टर्स के बीच अंतर) की जांच करने के लिए सक्षम किया है, दोनों एक आणविक दृष्टिकोण से और आकलन करने में सक्षम होने के नजरिए से मेटास्टेसिस-दीक्षा क्षमता । जब तक हम आम तौर पर सेल प्रोटोकॉल है कि experimenter मैंयुअल रूप से अलग CTCs (लचीलेपन का एक उच्च डिग्री के लिए व्यक्तिगत लक्ष्यों की विशेषताओं के आधार पर) की अनुमति यानी की अनुमति के लिए, स्वचालित समाधान अब सुविधा उपलब्ध है उठा एहसान सेल उठा और अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगों में सीटीसी अलगाव प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए ।

सीटीसी विश्लेषण के संदर्भ में एकल कोशिका micromanipulation पर विचार करते समय एक बहुत ही महत्वपूर्ण सीमित कारक है । चूंकि हमारा प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं पर संचालित होने के लिए है, इसलिए पूर्व vivo वातावरण के कारण परिवर्तनों को कम करने के लिए यथासंभव शीघ्रता से आगे बढ़ना आवश्यक है, जैसे कि संदर्भ-निर्भर जीन का गर्भाधान या डाउनरेगुलेशन । जब सीटीसी विश्लेषण के लिए मौजूदा तकनीकों की तुलना में, लाइव Ctc के एकल सेल micromanipulation विकल्प के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उच्च लचीलापन प्रदान करता है, एक सेल अनुक्रमण से सीधे कार्यात्मक assays हैं ।

इस पांडुलिपि में, हम भी एक CTCS-व्युत्पन्न सेल लाइन से एक और एक से अधिक हजार एकल ctcs या सीटीसी क्लस्टर्स (एक स्पष्ट रूप से परिभाषित आकार के साथ) द्वारा micromanipulating द्वारा और एक संकुल CTCs के बीच महत्वपूर्ण अंतर को हाइलाइट नए डेटा प्रदान एक माइक्रोटिटर प्लेट का एक अलग कुआं । सबसे पहले, हम देखते है कि सीटीसी क्लस्टर (यानी, पड़ोसी कोशिकाओं की उपस्थिति) को वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के बेहतर अस्तित्व की दर को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं, हमारे vivo में एक दूर साइट पर बोने पर ctc समूहों के कम अपोप्तोटिक दरों का सुझाव डेटा में समर्थन 19. इसके अलावा, यहां तक कि वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या के लिए सामांयीकरण पर, कैंसर कोशिकाओं के रूप में उगाया अधिक उच्च प्रसार दर प्रदर्शन, आगे की अवधारणा है कि संकुल CTCs अत्यधिक कुशल मेटास्टेसिस योगदानकर्ताओं है मजबूत ।

साथ में, हम सीटीसी क्षेत्र में एकल कोशिका संबंधी जांचों को बढ़ावा देने के उद्देश्य से सीटीसी विश्लेषण के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । भविष्य में, हम आशा करते है कि इन प्रोटोकॉल CTC से संबंधित जांच के लिए उपयोगी हो सकता है, जीव विज्ञान है कि विभिंन प्रकार के कैंसर में रक्त जनित मेटास्टेसिस की विशेषता के एक बेहतर समझ की ओर लक्ष्य ।

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Disclosures

एनए और B.M.S. पेटेंट अनुप्रयोगों है कि ट्यूमर कोशिकाओं और कैंसर के उपचार परिसंचारी से संबंधित में अंवेषकों के रूप में सूचीबद्ध हैं । एनए लिक्विड बायोप्सी में रुचि के साथ दवा और बीमा कंपनियों के लिए एक भुगतान सलाहकार है ।

Acknowledgments

हम सभी रोगियों है कि हमारे अध्ययन के लिए रक्तदान, साथ ही सभी शामिल चिकित्सकों और अध्ययन नर्सों धंयवाद । हम Jens Eberhardt धंयवाद, Uwe Birke, और डॉ कैथरीन के निरंतर समर्थन के लिए स्वचालित लैब समाधान GmbH से Uhlig । हम प्रतिक्रिया और चर्चाओं के लिए Aceto लैब के सभी सदस्यों को धंयवाद । Aceto लैब में शोध यूरोपीय अनुसंधान परिषद, यूरोपीय संघ, स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, स्विस कैंसर लीग, बेसल कैंसर लीग, ETH Zürich के माध्यम से बेसल के दो कैंटन, और बेसल विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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