Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

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Cancer Research

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Summary

Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

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Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

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Abstract

La metastasi ematica rappresenta la maggior parte dei decessi correlati al cancro e coinvolge le cellule tumorali circolanti (CTC) che hanno successo nella creazione di nuovi tumori in siti lontani. I CTC si trovano nel flusso sanguigno dei pazienti come cellule singole (CTC singole) o come aggregati multicellulari (cluster CTC e cluster di globuli bianchi CTC), con questi ultimi che mostrano una maggiore capacità metastatica. Oltre all'enumerazione, l'analisi fenotipica e molecolare è straordinariamente importante per dissezionare la biologia CTC e per identificare le vulnerabilità perseguibili. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un flusso di lavoro che include l'immunocolorazione CTC e la micromanipolazione, la cultura ex vivo per valutare le capacità proliferativa e di sopravvivenza delle singole cellule e i saggi in vivo di formazione di metastasi. Inoltre, forniamo un protocollo per raggiungere la dissociazione dei cluster CTC in singole celle e l'analisi dell'eterogeneità intra-cluster. Con questi approcci, per esempio, quantifichiamo con precisione la sopravvivenza e il potenziale proliferativo dei singoli CTC e delle singole cellule all'interno dei cluster CTC, che ci portano all'osservazione che le cellule all'interno dei cluster mostrano una migliore sopravvivenza e proliferazione in ex rispetto ai singoli CTC. nel complesso, il nostro flusso di lavoro offre una piattaforma per dissezionare le caratteristiche dei CTC a livello di singola cellula, puntando all'identificazione di percorsi rilevanti per la metastasi e a una migliore comprensione della biologia CTC.

Introduction

La manifestazione clinica della metastasi negli organi distanti rappresenta la fase finale della progressione del cancro e costituisce oltre il 90% dei decessi correlati al cancro1. La transizione dalla malattia localizzata a quella metastatica è un processo a più fasi, spesso mediato da cellule tumorali circolanti (CTCs)2,3,4. Queste cellule sono sparate dal tumore primario nella circolazione sanguigna e vengono trasportate in organi distanti, dove possono stravasare e stabilire lesioni metastatiche5,6. Anche se i tumori solidi possono rilasciare un numero relativamente elevato di CTC, la maggior parte dei CTC sono destinate a morire, a causa di forze di taglio elevate in circolazione, morte cellulare mediata da anoikis, attacco immunitario o capacità limitate di adattarsi a un microambiente straniero7. Pertanto, è fondamentale stabilire strumenti che consentano la dissezione delle caratteristiche molecolari di quei CTC che sono dotati di capacità di semina metastasi. Recenti studi preclinici e clinici suggeriscono che la presenza e la quantità di singoli cluster CTCs e CTC è associata a un risultato peggiore in pazienti con vari tipi di tumori solidi8,9,10 , 11 il , 12 anni di , 13 anni di , 14 anni di . I cluster CTC sono gruppi di due o più ctc collegati tra loro durante la circolazione e sono più efficienti nella formazione delle metastasi rispetto ai singoli CTCs3,15,16. Le cellule all'interno di un cluster mantengono una forte adesione delle cellule cellulari attraverso i desmosomi e gli incroci aderenti, che possono aiutare a superare gli anoikis17,18. Recentemente, abbiamo osservato che il clustering dei CTC è legato all'ipometilazione dei siti di legame per i fattori di trascrizione associati a stemosi e proliferazione, portando ad una maggiore capacità di avviare con successo la metastasi19. La dissociazione del cluster CTC provoca il rimodellamento dei siti di legame chiave e, di conseguenza, la soppressione del loro potenziale metastatico19. Inoltre ai gruppi di cellule tumorali, i CTC possono anche associarsi al globulo bianco (più frequentemente neutrofili) per mantenere alti livelli di proliferazione in circolazione e aumentare la loro capacità metastatica20. Tuttavia, la biologia dei CTC è intesa solo in parte e restano aperte diverse domande, tra cui le caratteristiche molecolari sottostanti e le vulnerabilità delle cellule singole e del cluster.

Negli ultimi anni, sono state stabilite diverse strategie che sfruttano i modelli di espressione della superficie cellulare e le proprietà fisiche dei CTC per il loro isolamento21,22,23,24, 25. i metodi di isolamento dipendenti dall'antigene dipendono principalmente dall'espressione della superficie cellulare molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM)26. L'unica piattaforma approvata dalla FDA per l'enumerazione CTC, la più frequentemente utilizzata e (attualmente), è il sistema CellSearch, che si basa su una procedura in due fasi per isolare i CTCs21. Nella prima fase, i componenti del plasma vengono rimossi mediante centrifugazione, mentre i CTC vengono catturati con ferrofluidi magnetici accoppiati agli anticorpi anti-EpCAM. Nella seconda fase, la soluzione arricchita con CTC è macchiata per le cellule nucleate (DAPI-positive) che esprimono la citocheratina (CK)8,18,19, mentre i globuli bianchi (WBCs) sono identificati utilizzando il marcatore Pan-leucocitario CD45. Infine, le cellule catturate vengono posizionate su una piattaforma di screening integrata e i CTC sono identificati attraverso l'espressione di EpCAM, CKs e DAPI, pur essendo negativi per CD45. Anche se questo è considerato il gold standard per l'enumerazione CTC, analisi molecolare a valle è impegnativo con questa tecnologia a causa di vincoli intrinseci nel recupero CTC. Inoltre, data la sua procedura di isolamento, CellSearch può favorire l'arricchimento dei CTC con livelli di EpCAM superiori rispetto ai CTC con un'espressione EpCAM più bassa, dovuta ad esempio all'eterogeneità del cancro27 o alla downregulation dei marcatori epiteliali 28,29. Per superare queste limitazioni, sono emerse tecnologie indipendenti dall'antigene per l'arricchimento dei CTC. Ad esempio, CTC-iChip integra la separazione idrodinamica delle cellule nucleate, compresi i CTC e i WBC dai restanti componenti del sangue, seguita da un esaurimento immunomagnetico dei WBC con tag anticorpali, che consente la purificazione di CTC senza tag e vitali in soluzione25. Inoltre, il fatto che la maggior parte dei CTC sono leggermente più grandi dei globuli rossi (RBC) o dei WBC ha portato allo sviluppo di tecnologie di arricchimento CTC basate sulle dimensioni23,30 (ad esempio, il sistema parsortix (Angle)) che fa uso di un tecnologia basata su microfluidica, comprendente un canale di restringimento attraverso la cassetta di separazione, portando le cellule a un gap terminale di 10, 8, 6,5 o 4,5 μm (sono disponibili diverse dimensioni a seconda del diametro atteso delle cellule tumorali bersaglio). La maggior parte delle cellule del sangue passano attraverso lo stretto divario, mentre i CTC vengono intrappolati a causa delle loro dimensioni (ma anche a causa della loro deformabilità inferiore) e sono, pertanto, conservati nella cassetta. Il ripristino della direzione del flusso consente il rilascio di CTC catturati, che sono in uno stato vitale e adatti per l'analisi a valle. Indipendentemente dal protocollo scelto per l'isolamento CTC, tuttavia, le procedure tipiche di post-arricchimento continuano a produrre CTC che vengono miscelate con un numero relativamente ridotto di globuli rossi e globuli bianchi, rendendo difficile l'analisi di CTCs puri singoli o sfusi. Per risolvere questo problema, abbiamo stabilito un flusso di lavoro che consente la manipolazione CTC senza potenziali pregiudizi introdotti dai contaminanti delle cellule del sangue. L'aggiunta di immunocolorazione in anticipo, con combinazioni di anticorpi variabili, distingue i CTC dalle cellule del sangue e permette anche di identificare sottogruppi CTC con profili di espressione di superficie-marcatore distinti. Questa procedura altamente personalizzabile può essere ulteriormente combinata con applicazioni downstream specifiche.

Qui, descriviamo un flusso di lavoro che parte da un prodotto arricchito con CTC (ottenuto con qualsiasi tecnologia di arricchimento CTC di scelta) e combina diversi approcci per ottenere informazioni sulla biologia CTC alla risoluzione di una singola cellula. In poche parole, il nostro flusso di lavoro consente l'identificazione di singoli CTC, cluster CTC e cluster CTC-WBC mediante immunostaining dal vivo, seguita da micromanipolazione a singola cellula e analisi a valle utilizzando protocolli di coltura ex vivo , cellule singole sequenziamento e analisi in vivo delle metastasi.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono i campioni di sangue dei pazienti sono state eseguite previo consenso informato dei partecipanti. Le procedure sono state eseguite secondo i protocolli EKNZ BASEC 2016-00067 e EK 321/10, approvati dal comitato di revisione etico-istituzionale (Commissione etica nord-occidentale/Svizzera centrale [EKNZ]), e in conformità con la dichiarazione di Helsinki.

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite nel rispetto delle direttive istituzionali e cantonali (protocollo approvato del mouse #2781, ufficio veterinario cantonale di Basilea città).

1. preparazione del campione del paziente

  1. Prima di iniziare, assicurarsi di lavorare con soluzioni asettiche e materiali per mantenere la sterilità durante l'intera procedura.
  2. Prelevare 7,5 mL di sangue periferico da un paziente con tumore al seno in un tubo di raccolta del sangue EDTA da 10 mL.
  3. Incubare i tubi contenenti sangue per un breve periodo di tempo (fino a 1 h) a temperatura ambiente (RT) su uno shaker a dondolo a 40 oscillazione al minuto (OSC/min).
  4. Arricchirsi per singoli cluster CTCs e CTC utilizzando un metodo di isolamento CTC di scelta21,22,23,25. Rilasciare CTC in una soluzione 1x DPBS.
    Nota: a seconda della tecnologia di arricchimento CTC scelta, potrebbero essere presenti globuli bianchi e globuli rossi rimanenti. Regolare la pressione di rilascio al fine di preservare le strutture del cluster CTC.
  5. Procedere immediatamente al passaggio successivo nella sezione 3.

2. preparazione del campione del mouse

  1. Prima di iniziare, preparare una siringa da 1 mL di insulina con un ago 25G, una soluzione filtrata da 5 mM EDTA e 2 mL di provette di raccolta del sangue EDTA.
  2. Assicurarsi di lavorare con soluzioni asettiche e materiali per mantenere la sterilità durante l'intera procedura.
  3. Pre-lavare la siringa con soluzione EDTA da 5 mM.
  4. Caricare la siringa con 100 μL di EDTA da 5 mM e rimuovere le bolle.
  5. Euthanize il mouse utilizzando 80% CO2 /20% O2 gas inalazione e procedere immediatamente al passaggio successivo.
    Nota: un'alternativa al metodo di inalazione di CO2 è l'anestesia isoflurano (3 vol% isoflurano e ossigeno (gas vettore) alla portata di 600 ml/min) seguita da lussazione cervicale, o iniezione di sovradosaggio di soluzione di chetamina/xylazina. Il metodo specifico di eutanasia può variare a seconda del protocollo approvato del mouse.
  6. Confermare la morte dell'animale per assenza di attività respiratoria, riflesso corneale mancante e minzione senza stimoli esterni.
  7. Eseguire una puntura cardiaca introducendo con cautela l'ago della siringa pre-caricata di EDTA con un angolo di 30 ° nel torace dallo sterno verso il cuore.
    Nota: per gli sperimentatori inesperti, si raccomanda di aprire prima la cavità toracica, prima di eseguire la puntura cardiaca, per visualizzare meglio il cuore.
  8. Recuperare fino a 1 mL di sangue. Senza rilasciare lo stantuffo, estrarre la siringa dal torace dell'animale, rimuovere in modo sicuro l'ago, aprire il coperchio del tubo di raccolta del sangue EDTA da 2 mL e dispensare il sangue direttamente all'interno. Chiudere il coperchio e invertire il tubo 10x.
  9. Incubare i tubi contenenti sangue per un breve periodo di tempo (fino a 1 h) a RT su uno shaker a dondolo a 40 osc/min.
    Attenzione: l'ago deve essere smaltito in un sicuro smaltimento a rischio biologico.
    Nota: sono possibili forature multiple per aumentare il volume totale del sangue. Usare siringhe separate precaricate con EDTA per diversi ritiri per evitare l'aspirazione di sangue coagulato presente nell'ago precedente.
  10. Arricchimento per i singoli cluster CTCs e CTC utilizzando il metodo di isolamento CTCs di scelta21,22,23,25. Rilasciare CTC in una soluzione 1x DPBS.
    Nota: a seconda della tecnologia di arricchimento CTC scelta, potrebbero essere presenti globuli bianchi rimanenti e globuli rossi. Regolare la pressione di rilascio al fine di preservare le strutture del cluster CTC.
  11. Procedere immediatamente al passaggio successivo nella sezione 3.
    Nota: per tutte le procedure riportate di seguito, assicurarsi che venga utilizzato il sangue non fisso e appena isolato.

3. i CTC vivono immunocolorazione

  1. Centrifugare la sospensione cellulare arricchita con CTC a 72 x g per 4 min.
    Nota: 72 x g corrisponde a 800 giri/min se il rotore ha un diametro di 100 mm. convertire il numero di forza g in base al rotore.
  2. Risospendere delicatamente il pellet in soluzione di 1% BSA in 1x DPBS e aggiungere 2 μg/mL di anticorpo EpCAM-AF488 anti-umano e 1 μg/mL di anticorpo CD45-BV605 anti-umano o 2 μg/mL di anticorpo anti-topo CD45-BV605 in un volume totale di 500 μL.
    Nota: per i CTC derivati da tumore al seno, i pazienti con EGFR anti-uomo e HER2-AF488 anti-umani possono essere aggiunti in aggiunta a anti-EpCAM e anti-CD45. Ciò consente di identificare meglio i CTC che esprimono livelli inferiori di EpCAM.
  3. Incubare per 30 minuti a RT e proteggerlo dalla luce.
  4. Lavare la sospensione CTCs utilizzando 1 mL di 1% BSA in 1x soluzione DPBS e centrifugazione a 72 x g per 4 min. Ripetere questo lavaggio due volte.
  5. Risospendere le cellule colorate in 2 mL di 1% BSA in 1x soluzione DPBS e trasferire il volume totale in 1 Pozzo di una piastra di attacco ultra-bassa a 6 pozzetti.
  6. Incubare la piastra per 10-15 min a 4 ° c protetta dalla luce per consentire la sedimentazione dei CTC e delle cellule del sangue residue.

4. micromanipolazione di CTC e prelievo a cellule singole

Nota: prima di iniziare, tenere presente che il micromanipolatore richiede fino a 45 minuti per la configurazione completa. Una volta impostata, la procedura per l'identificazione CTC e la micromanipolazione richiede fino a 2 minuti per cella (o cluster).

  1. Assicurarsi di terminare la procedura di prelievo CTC entro 2 h dalla fine della colorazione.
  2. Avviare il software del micromanipolatore e accendere il micromanipolatore. Collegare il micromanipolatore al computer e inizializzare il braccio robotico e lo stadio del microscopio premendo il pulsante Connect seguito dal dispositivo int.
  3. Chiudere l'armadio protettivo dopo ogni manipolazione della macchina per essere in grado di manovrare attraverso il computer.
  4. Pulire le superfici da polvere e fuoriuscite spruzzando etanolo e asciugando le superfici interne del cabinet. Un ambiente pulito garantirà la sterilità del processo.
  5. Installare un nuovo capillare di vetro sul braccio robotico. Per il prelievo a cella singola, utilizzare un capillare da 20-30 μm mentre 30-50 μm è preferibile per la raccolta di cluster CTC.
  6. Rimuovere tutte le bolle presenti nel tubo erogando o aspirando l'olio del sistema.
    Attenzione: il capillare di vetro è affilato e fragile. Maneggiare con cautela.
  7. Riempire il serbatoio di sterilizzazione 1 con 70% di etanolo, il serbatoio di sterilizzazione 2 con H2O senza nucleasi sterile e il serbatoio tampone con 1x DPBS sterile.
    Attenzione: non chiudere i coperchi dei serbatoi, poiché durante i passaggi successivi il capillare avrà bisogno di accedere liberamente ai serbatoi.
  8. Sterilizzare il capillare due volte con 70% di etanolo.
  9. Sostituire il serbatoio di sterilizzazione 1 con il serbatoio 2 e lavare il capillare in H2O almeno tre volte utilizzando la funzione di sterilizzazione.
  10. Utilizzando il software del micromanipolatore, avviare un nuovo esperimento e scegliere il tipo di esperimento di prelievo tra le modalità di selezione automatica e manuale.
    Nota: scegliere il tipo di esperimento in base al punto finale della manipolazione. La modalità manuale consente di manovrare un braccio robotico dopo che il capillare entra nella sospensione cellulare. Questo passaggio è necessario per la dissociazione dei cluster CTC in singole celle. È possibile modificare il tipo di prelievo durante l'esperimento.
  11. Configurare il vassoio di coperta specificando la posizione del serbatoio di sterilizzazione (liquido 1), il serbatoio tampone (liquido 2) e il vassoio di deposito (bersaglio 1 o 2). Target 1 permette di depositare in piastre, bersaglio 2 permette di depositare in tubi PCR o piastre PCR.
  12. Impostare la temperatura dei serbatoi del liquido e il vassoio di deposito scelto a 4 ° c.
    Nota: il processo di prelievo può richiedere molto tempo. Il raffreddamento dei serbatoi liquidi e del vassoio di deposito è quindi consigliato
  13. Posizionare la piastra di fissaggio ultra-bassa contenente la soluzione CTCs rilasciata al microscopio all'interno dell'armadietto del micromanipolatore. Togliere il coperchio dalla piastra e chiudere l'armadietto. Tenere la piastra a RT per il resto del set up e durante la procedura di prelievo.
  14. Selezionare manualmente l'obiettivo del microscopio per il prelievo (10-20x) e il tempo di esposizione di tutti i canali necessari (canali Brightfield, FITC e TRITC).
  15. Selezionare Mostra bene navigatore dalla barra degli strumenti per visualizzare e selezionare il tipo di piastra di prelievo (piastra 6-well).
    Nota: qualsiasi piastra o formato ben può essere installato solo dal produttore.
  16. Calibrare la posizione di prelievo al centro del pozzo contenente la soluzione CTCs, ma senza celle al centro del campo visivo. La calibrazione eseguita ai bordi dei pozzetti può comportare una calibrazione difettosa a causa della superficie di pozzo irregolare.
  17. Utilizzare il sensore per toccare delicatamente il fondo della piastra con il capillare (velocità 0,01 mm/passo e 1% di velocità).
  18. Impostare la posizione di prelievo 0,05 mm sopra la parte inferiore della piastra.
    Nota: prima di procedere, assicurarsi di aprire e rimuovere coperchi di piastre e serbatoi. Il capillare può rompersi su un coperchio chiuso o non rimosso.
    Attenzione: se il capillare si rompe a contatto con coperchi, il vetro rotto può essere trovato nei dintorni o nelle soluzioni.
  19. Selezionare il tipo di cella e i parametri di prelievo. Il parametro di prelievo può essere impostato e caricato ad ogni avvio. Per il prelievo a cella singola, selezionare la modalità manuale.
  20. All'interno delle impostazioni di preparazione del prelievo :
    1. Impostare il volume dell'airgap tra l'olio del sistema e il campione a 1 μl
    2. Impostare il volume del liquido tampone da assumere prima di ogni prelievo a 0,5 μl.
      Nota: il volume del liquido tampone viene regolato al volume massimo totale di prelievo. I piccoli volumi non influiscono sull'efficienza di prelievo o di deposito.
    3. Impostare la velocità di aspirazione del liquido tampone tra 1-6%.
    4. Impostare il tempo di attesa dopo l'aspirazione del buffer a 1 s.
      Nota: l'opzione di prendere il buffer dal bersaglio bene invece di serbatoio liquido tampone può essere utilizzato, se necessario
    5. Impostare per riutilizzare i capillari di vetro e Nessuna sterilizzazione tra i prelievi.
      Nota: la sterilizzazione tra i prelievi può essere eseguita manualmente se necessario. Eseguire più lavi in H2o tra plettri o due sterilizzazione in etanolo seguita da più Lavini in h2o.
  21. All'interno delle impostazioni di prelievo :
    1. Modificare le impostazioni della fotocamera durante il prelievo e il tempo di esposizione al microscopio a 7.500 μs.
    2. Selezionare altezza di prelievo fissa.
      Nota: il sensore utensile o l'autofocus possono essere scelti invece. Tuttavia, piccole imperfezioni della piastra possono disturbare la sensibilità del sensore o la messa a fuoco automatica che può causare un impatto del capillare nella piastra.
    3. Impostare la velocità di aspirazione del capillare entrando nella piastra sorgente a 7-15%.
    4. Attivare il prelievo interattivo.
    5. Impostare il volume di aspirazione in μl a 0-0.05.
    6. Impostare la velocità di aspirazione al 5%.
    7. Impostare il tempo di attesa dopo l'aspirazione in s a 0-1.
    8. Impostare il numero di particelle prelevate per capillare su 1.
    9. Impostare Nessun prelievo multiplo nella stessa posizione e nessuna funzione di raschiatura . Le proprietà di aspirazione devono essere impostate in base al tipo di esperimento (ad esempio, la modalità di prelievo automatico può richiedere volumi di aspirazione maggiori).
  22. All'interno delle impostazioni di deposito :
    Nota: le impostazioni di deposito dipendono rigorosamente dalla piastra/tubo di deposito.
    1. Per la raccolta a cella singola, definire la velocità del capillare che immette la piastra di destinazione al 25%.
    2. Impostare la velocità di erogazione al 6%.
    3. Impostare il tempo di attesa dopo l'erogazione in s a 0.
    4. Impostare la quantità di airgap dispensato nel pozzo di destinazione a 100%.
    5. Non risciacquare dopo il deposito.
      Nota: la sterilizzazione può essere eseguita dopo il deposito per pulire il capillare.
    6. Impostare la quantità massima di particelle di deposito per pozzo e il numero di bersagli per distribuire le particelle a 1.
    7. Calibrare l'altezza di deposito sulla posizione a1 del bersaglio 1 per le piastre o sulla posizione a1 del bersaglio 2 per i tubi. Posizionare un tubo aperto o una piastra senza coperchio per la calibrazione e utilizzare il sensore per toccare delicatamente il pozzo di deposito (velocità 0,01 mm/passo e 1% di velocità). Impostare l' altezza di deposito 1 mm sopra la parte inferiore della piastra.
  23. All'interno delle Impostazioni:
    1. Impostare la velocità dello stage durante il prelievo a 5-10%.
      Nota: i movimenti rapidi della piastra possono causare il movimento delle cellule in sospensione e difficoltà nel prelievo di più cellule a causa di mispositioning.
    2. Impostare le proprietà di sterilizzazione utilizzando il volume di risciacquo a 1 μl, 3 cicli di risciacquo e 2 s di tempo di attesa per ogni ciclo di sterilizzazione.
    3. Applicare le modifiche prima della chiusura.
  24. Navigare il capillare di vetro utilizzando il joystick nel pozzo e posizionarlo sopra la singola cellula di interesse. Scegliere di raccogliere le posizioni a una distanza di sicurezza dal bordo ben (1 mm) come il capillare può rompere sul bordo del pozzo.
  25. Aggiungere manualmente le particelle utilizzando il pulsante del joystick o selezionando manualmente dal menu.
  26. Selezionare Scegli particelle attivate per avviare il prelievo.
  27. Il capillare si fermerà 0,05 mm sopra la parte inferiore della piastra e sopra la posizione di prelievo selezionata a causa del prelievo interattivo (modalità manuale). Ruotare delicatamente la manopola del joystick in senso orario per aspirare manualmente la particella e la soluzione DPBS circostante. Il volume massimo non è fisso quando il modo manuale è acceso. Tuttavia, il volume massimo consentito nella siringa sarà di 25 μL.
  28. Erogare la soluzione DPBS in eccesso o particelle indesiderate ruotando delicatamente la manopola del joystick in senso antiorario. Troppa erogazione rilascerà l'airgap della siringa formando bolle nella soluzione e compromettendo la visibilità.
  29. Premere Next per procedere con il deposito.
  30. Osservare il capillare entrando nel tubo PCR di deposito o nella piastra PCR, rilasciando il volume e tornando alla posizione di partenza con un capillare vuoto.
    Nota: se c'è del volume rimasto nel capillare, procedere con la sterilizzazione. Quindi, controllare nuovamente le impostazioni, il livello dell'olio e l'altezza dell'olio prima di eseguire un nuovo prelievo.
  31. Procedere dal punto 26 della sezione 4 per avviare una nuova raccolta a cella singola. Durante il prelievo potrebbe essere necessario sostituire il capillare. Dopo l'installazione, deve essere eseguita una nuova calibrazione della posizione di prelievo. Al termine della calibrazione, selezionare la funzione applicare le modifiche calibrate in altezza Z per depositare l'altezza al fine di correggere l'altezza di deposito alla nuova calibrazione capillare e di saltare la calibrazione altezza deposito (sezione 4,16).
    Nota: i passaggi descritti nella sezione 1-4 si applicano alla maggior parte dei metodi di arricchimento e isolamento CTCs. Qui riportiamo i passaggi facoltativi per specifiche analisi CTCs.

5. prelievo e semina a cellula singola per l'analisi della sopravvivenza e della proliferazione

  1. Assicurarsi di lavorare con soluzioni asettiche e materiali per mantenere la sterilità durante l'intera procedura.
  2. Preparare una piastra di pozzo 384 per contenere i CTC singoli prelevati per la coltura con 20 μL di coltura CTC media31. Assicurarsi che i CTC siano seminati in piccoli volumi del mezzo dopo la manipolazione (ad esempio 10-20 μL per una piastra di pozzetto 384).
  3. Ruotare la soluzione sul fondo della piastra. Posizionare 384 piastra pozzetto nel bersaglio 1 e conservarlo a 4 ° c.
  4. Eseguire tutti i passaggi con il micromanipolatore descritto nella sezione 4 per impostare il micromanipolatore e avviare un nuovo prelievo.
    Nota: selezioni multiple delle singole celle causerà la formazione di una distinta di prelievo. Le particelle saranno prelevate e depositate una ad una in pozzi consecutivi (vedere paragrafo 4.22.6). Tuttavia, la modalità interattiva (modalità manuale) fermerà il capillare a destra prima dell'aspirazione, permettendo quindi allo sperimentatore di controllare questo passo critico e di garantire una raccolta di successo. I movimenti rapidi della piastra possono comportare il movimento delle cellule in sospensione e difficoltà nel prelievo di più cellule.
  5. Dopo il deposito, ripetere il passaggio 4 per avviare un nuovo prelievo.
  6. Alla fine del prelievo, centrifugare la piastra a 72 x g per 4 min per garantire che le celle prelevate siano posizionate nella parte inferiore del pozzo.

6. CTC cluster rottura e singola cella prelievo per il sequenziamento

  1. Assicurarsi di lavorare con soluzioni asettiche e materiali per mantenere la sterilità durante l'intera procedura.
  2. Preparare i singoli tubi PCR o una piastra PCR che conterrà le singole cellule del cluster rotto con la soluzione di lisi totale 2,5 μl di cellule che comprende 1 U/μl di inibitore dell'RNA.
  3. Ruotare rapidamente la soluzione sul fondo del tubo. Collocare i contenitori di deposito nel bersaglio 2 e conservarlo a 4 ° c.
  4. Eseguire tutti i passaggi descritti nella sezione 4 con il micromanipolatore per impostare il micromanipolatore.
  5. Inizia una nuova raccolta. Il capillare si fermerà 0,05 mm sopra la parte inferiore della piastra e sulla parte superiore del cluster CTC selezionato a causa del prelievo interattivo (modalità manuale).
  6. Ruotare delicatamente la manopola del joystick in senso orario per aspirare manualmente il cluster e la soluzione DPBS circostante. Erogare il volume aspirato compreso il cluster CTC ruotando delicatamente la manopola del joystick in senso antiorario.
  7. Ripetere l'aspirazione/smaltimento del cluster CTC descritto nel passaggio 6 fino a quando le singole celle che formano il cluster si spezzeranno.
    Nota: una quantità eccessiva di erogazione rilascerà l'airgap della siringa formando bolle nella soluzione e compromettendo la visibilità.
  8. Seguire per occhio la posizione delle singole cellule. Aggiungere manualmente le particelle utilizzando il pulsante del joystick o selezionando manualmente dal menu.
    Nota: selezioni multiple delle singole celle causerà la formazione di una distinta di prelievo. Le particelle saranno prelevate e depositate una ad una in provette/pozzetti di PCR consecutivi (vedere paragrafo 4.22.6). Tuttavia, la modalità interattiva (modalità manuale) fermerà il capillare a destra prima dell'aspirazione, permettendo quindi allo sperimentatore di controllare questo passo critico e di garantire una raccolta di successo.
  9. Selezionare Scegli particelle attivate per avviare il prelievo.
    Nota: la quantità di soluzione di lisi cellulare consentirà a una singola cellula di lisare completamente. Tuttavia, una lunga esposizione del contenuto lizzato all'agente liente può degradare il DNA o l'mRNA. Pertanto, procedere immediatamente al passaggio successivo.
  10. Chiudere immediatamente il tubo contenente la singola cella prelevata e trasferire sul ghiaccio secco per il congelamento a scatto.
  11. Girare rapidamente il tubo e verificare l'assenza di gocce sui lati del tubo per garantire una corretta Lisse della cella depositata.
  12. Ripetere il passaggio 5 per avviare un nuovo prelievo.
    Nota: la fase del microscopio si sposterà da una particella aggiunta all'altra alla velocità descritta nella sezione 4.23.1. La sospensione CTCs nella piastra di fissaggio ultra-bassa può muoversi, causando un prelievo difettoso a causa della mispositioning.

7. isolamento CTCs per l'iniezione del mouse

  1. Assicurarsi di lavorare con soluzioni asettiche e materiali per mantenere la sterilità durante l'intera procedura.
  2. Preparare un tubo PCR con 5 μL di 1x DPBS sterile.
  3. Ruotare rapidamente la soluzione sul fondo del tubo. Collocare i contenitori di deposito nel bersaglio 2 e conservarlo a 4 ° c.
  4. All'interno delle impostazioni di deposito applicare una modifica al passo 4.22.6: impostare la quantità massima di particelle di deposito per pozzo a 1.000 e il numero di bersagli per distribuire le particelle a 1. Questo passaggio assicura che le celle selezionate vengano depositate nello stesso tubo per 1.000 volte.
  5. Utilizzare solo la modalità interattiva (modalità manuale) per controllare con precisione la fase di prelievo e mantenere la soluzione prelevata priva di cellule contaminanti.
    Nota: se sono necessarie più di 1.000 celle, aumentare il numero di bersagli per distribuire le particelle per evitare la perdita di campione dopo 1.000 cellule.
  6. Continuare i passaggi della sezione 4,26 per avviare un nuovo prelievo. Ripetere il passaggio 6 per eseguire più operazioni di picking. Annotare il numero di celle raccolte ad ogni prelievo per tenere traccia del numero di celle disponibili per l'iniezione del mouse.
  7. Alla fine del prelievo, centrifugare il tubo a 72 x g per 4 min (vedere paragrafo 3,1.) e aspirato supernatante.
  8. Risospendere i CTC raccolti nel buffer di scelta, adatto per l'iniezione del mouse. Per l'iniezione di grasso mammario, risospendere i CTC raccolti in un rapporto 1 a 1 di 1x DPBS e la membrana del seminterrato ricostituita estratta, e tenere a 4 ° c fino all'iniezione. Per l'iniezione endovenosa, risospendere i CTC raccolti solo in DPBS.
    Nota: il volume della soluzione dipende rigorosamente dal numero di CTC che verranno iniettati. Si consiglia di iniettare nel tampone grasso mammario o per via endovenosa un massimo di 100 μL per mouse. Quando si calcola il volume, considerare sempre il volume morto per la manipolazione e il caricamento della siringa.

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Representative Results

Il flusso di lavoro presentato consente la preparazione di singoli CTC, sia da singoli CTC che separati da cluster CTC. I CTC di pazienti o topi affetti da tumore sono arricchiti da sangue intero con metodi di arricchimento CTC disponibili e poi macchiati con anticorpi contro marcatori associati al cancro (ad esempio, EpCAM, verde) e marcatori specifici di WBC (ad esempio, CD45, rosso) (Figura 1a ). Il prodotto CTC macchiato viene poi trasferito alla stazione di micromanipolazione sono state raccolte singole cellule, depositate in tubi PCR o piastre multipozzetto e preparate per l'analisi a valle, tra cui sequenziamento a singola cellula, coltura in vitro o saggi in vivo (Figura 1B).

L'affidabilità di questo metodo si basa su una corretta distinzione tra cellule bersaglio durante la raccolta manuale delle cellule. L'immunocolorazione dal vivo con anticorpi anti-EpCAM Visualizza le cellule tumorali nella sospensione e consente una distinzione accurata da eventi CD45 positivi (molto probabilmente, WBC) (Figura 2a). Se opportunamente calibrato e mantenuto, CellCelector fornisce una manipolazione delle cellule ben controllata. L'isolamento CTC preciso è caratterizzato dall'aspirazione del solo bersaglio desiderato senza cellule contaminanti circostanti (RBC o WBC), come mostrato nelle immagini scattate prima e dopo l'aspirazione del cluster CTC (Figura 2B, C).

Come descritto in precedenza, i cluster CTC mostrano un fenotipo più metastatico rispetto ai singoli CTCs19abbinati. Eppure, se la presenza di cellule vicine è sufficiente per aumentare il tasso di proliferazione delle cellule all'interno di cluster è sconosciuta. Al fine di affrontare questa domanda, 1009 singoli cluster CTC e 1008 CTC che vanno tra 2-17 cellule (con 89,5% di essi essendo 2-5 cluster di cellule) derivato dalla linea di cellule BR16 derivate da ctc sono stati micromanipolati in singoli pozzi di 384-bene piastre di fissaggio ultra-basse. Il numero di cellule vive in ogni pozzo è stato conteggiato manualmente sotto il microscopio e registrato settimanalmente. Tutte le analisi sono state eseguite dopo la normalizzazione del numero di cellulare (cioè, il cluster a tre cellule è stato analizzato come tre singole cellule). Le colonie non riuscite erano caratterizzate dalla mancanza di cellule viventi nel pozzo alla fine dell'esperimento. Come sospettato, i cluster CTC hanno mostrato una maggiore sopravvivenza rispetto ai singoli CTC e hanno dato luogo a colonie cellulari entro 56 giorni dalla coltura in vitro (Figura 3A, 3B). In particolare, i cluster CTC hanno mostrato un tasso di proliferazione più elevato e quindi hanno raggiunto numeri di cellule finali più elevati (Figura 3C), indicando che il contatto diretto con altre cellule tumorali ha un impatto sia sulla loro vitalità che sul tasso di proliferazione.

Infine, forniamo dati di sequenziamento di RNA a cellule singole di CTC direttamente isolati dai pazienti affetti da tumore al seno. In particolare, mostriamo una t-Distributed stocastico Neighbor incorporamento (tSNE) di singole cellule derivate da singoli CTC, cluster CTC o cluster CTC-WBC (Figura 4). Questo approccio consente l'identificazione di cellule con profilo di espressione genica simile, nonché la distinzione delle popolazioni cellulari che differiscono in base all'espressione di geni particolari.

Figure 1
Figura 1 . Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. A) i CTC sono ottenuti dal sangue dei malati di cancro o dei modelli di cancro del topo, arricchiti con metodi disponibili e etichettati con anticorpi per discriminare le cellule tumorali (verde) dai globuli bianchi (rosso). B) la micromanipolazione precisa dei CTC facilita molteplici procedure e applicazioni, ad esempio sequenziamento a cellule singole, coltura CTC o esperimenti in vivo sui trapianti. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 2
Figura 2 . Immagini rappresentative dei CTC prima e dopo la micromanipolazione. A) immagini rappresentative di CTC derivate da un xenotrapianto derivato da CTC (NSG-CDX-BR16) e macchiate con anticorpi anti-EpCAM (verde) e anti-CD45 (rosso) per consentire la visualizzazione rispettivamente di CTC e globuli bianchi. Viene visualizzato l'ingrandimento 40x. (B, C) La micromanipolazione consente la separazione precisa dei CTC dalle cellule indesiderate, come mostrato nelle immagini prima della procedura di aspirazione delle cellule (asinistra) e dopo (destra). Ingrandimento 10x. Vengono mostrati, rispettivamente, il campo visivo più ampio (B) e il campo visivo più stretto (C) . Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. 

Figure 3
Figura 3 . Analisi di sopravvivenza e di proliferazione di singoli cluster CTC e CTC. Le singole cellule provenienti da singole CGV o cluster CTC provenienti da cellule BR16 derivate da CTC sono state micromanipolate in piastre da 384 pozzetti. (A) trama di Kaplan-Meier che mostra la probabilità di sopravvivenza delle singole cellule seminate contro i cluster di cellule. P< 0,0001 per pairwise log-rank test. (B) grafico a barre che rappresenta la proporzione di colonie che consisteva di cellule vive alla fine dell'esperimento (giorno 56). P< 0,0001 per test chi-quadrato. (C) mappe termiche che visualizzano la distribuzione del numero di cellule normalizzata nel corso dell'esperimento (giorno 0, 8, 32, 56). Ogni blocco rappresenta una cella iniziale e la mappa di calore Mostra il numero di celle per pozzetto in un determinato punto temporale. d = giorno. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 4
Figura 4 . Sequenziamento dell'RNA a cellule singole. Visualizzazione dei dati dell'espressione CTC RNA utilizzando t-Distributed stocastico Neighbor incorporamento (tSNE). Ogni punto rappresenta una singola cella derivata da un singolo CTC, un cluster CTC o un cluster CTC-WBC. I colori dei puntini corrispondono all'ID del donatore. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

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Discussion

La caratterizzazione molecolare dei CTC contiene la promessa di migliorare la nostra comprensione del processo metastatico e di guidare lo sviluppo di nuove terapie anti-metastasi. Qui forniamo una descrizione dettagliata di quei protocolli che consentono la micromanipolazione CTC e l'analisi a valle, compresi i saggi funzionali basati su singola cellula, l'analisi dell'espressione genica e il trapianto in vivo per il potenziale metastatico valutazione20.

Tra le fasi più critiche del nostro protocollo, la micromanipolazione dei prodotti arricchiti con CTC mira a ottenere una risoluzione singola delle cellule da sospensioni cellulari relativamente eterogenee, permettendo così di raggiungere i più alti livelli di purezza e di migliorare la qualità dei successive analisi funzionali o molecolari. Ad esempio, la raccolta delle singole cellule dei CTC ha consentito a noi e ad altri di indagare l'eterogeneità CTC (ad esempio, le differenze tra i singoli CTC, i cluster CTC e i cluster CTC-WBC), sia dal punto di vista molecolare che dalla prospettiva di poter valutare capacità di iniziare la metastasi. Mentre generalmente preferiamo i protocolli di prelievo delle cellule che consentono allo sperimentatore di isolare manualmente i CTC (cioè permettendo un maggiore grado di flessibilità a seconda delle caratteristiche dei singoli bersagli), sono ora disponibili soluzioni automatizzate per facilitare la raccolta delle cellule e accelerare il processo di isolamento CTC in esperimenti ben controllati.

Quando si considera la micromanipolazione a singola cellula nel contesto dell'analisi CTC, il tempo è un fattore limitante molto critico. Poiché il nostro protocollo è destinato ad essere condotto sulle cellule viventi, è imperativo procedere il più velocemente possibile per minimizzare i cambiamenti dovuti all'ambiente ex vivo, come l'upregulation o la downregulation dei geni che dipendono dal contesto. Rispetto alle tecniche esistenti per l'analisi CTC, la micromanipolazione a singola cellula dei CTC vivi offre una maggiore flessibilità per l'analisi a valle della scelta, che va dal sequenziamento a singola cellula ai saggi funzionali diretti.

In questo manoscritto forniamo anche nuovi dati che evidenziano importanti differenze tra i CTC singoli e cluster mediante la micromanipolazione e la semina di più di mille cluster CTC o CTC (con una dimensione ben definita) da una linea cellulare derivata da CTC in singoli pozzetti di una piastra di microtitolazione. In primo luogo, osserviamo che i cluster CTC (cioè la presenza di cellule vicine) sono sufficienti per ottenere migliori tassi di sopravvivenza delle cellule seminate, sostenendo i nostri dati in vivo suggerendo tassi apoptotici inferiori di cluster CTC al momento della semina in un sito lontano 19. Inoltre, anche dopo la normalizzazione per il numero di cellule seminate, le cellule tumorali coltivate come cluster mostrano tassi di proliferazione molto più elevati, rafforzando ulteriormente il concetto che i CTC raggruppati sono contributori di metastasi altamente efficienti.

Insieme, presentiamo protocolli specifici per l'analisi CTC con lo scopo di promuovere le singole indagini relative alle cellule nel campo CTC. In futuro, prevediamo che questi protocolli potrebbero essere utili per le indagini relative a CTC, che mirano a una migliore comprensione della biologia che caratterizza le metastasi trasmissibili per il sangue in vari tipi di cancro.

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Disclosures

N.A. e BMS sono elencati come inventori nelle domande di brevetto che riguardano le cellule tumorali circolanti e il trattamento del cancro. N.A. è un consulente a pagamento per le aziende farmaceutiche e assicurative con un interesse per la biopsia liquida.

Acknowledgments

Ringraziamo tutti i pazienti che hanno donato il sangue per il nostro studio, così come tutti i medici coinvolti e gli infermieri di studio. Ringraziamo Jens Eberhardt, Uwe Birke e Dr. Katharina Uhlig di ALS Automated Lab Solutions GmbH per il supporto continuo. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio aceto per il feedback e le discussioni. La ricerca nel laboratorio di aceto è sostenuta dal Consiglio europeo della ricerca, dall'Unione europea, dalla Fondazione Nazionale Svizzera per la scienza, dalla Lega Svizzera per il cancro, dalla lega di cancro di Basilea, dai due Cantoni di Basilea attraverso il Politecnico federale di Zurigo e dall'Università di Basilea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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