Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

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Cancer Research

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Summary

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

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Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

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Abstract

As metástases transmitidas pelo sangue representam a maioria das mortes relacionadas ao câncer e envolvem células tumorais circulantes (CTCs) que são bem-sucedidas no estabelecimento de novos tumores em locais distantes. Os CTCs são encontrados na corrente sanguínea de pacientes como células únicas (CTCs simples) ou como agregados multicelulares (clusters CTC e clusters de células sanguíneas CTC-brancas), com este último exibindo uma maior capacidade metastática. Além da enumeração, a análise fenotípica e molecular é extraordinariamente importante para dissecar a biologia de CTC e para identificar vulnerabilidades acionáveis. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de um fluxo de trabalho que inclui imunocoloração e micromanipulação de CTC, cultura ex vivo para avaliar as capacidades proliferativas e de sobrevivência de células individuais e ensaios in vivo de formação de metástases. Adicionalmente, nós fornecemos um protocolo para conseguir a dissociação de clusters de CTC em pilhas individuais e a investigação da heterogeneidade do intra-conjunto. Com essas abordagens, por exemplo, quantificamos com precisão a sobrevida e o potencial proliferativo de CTCs individuais e células específicas dentro dos clusters de CTC, levando-nos à observação de que células dentro de clusters exibem melhor sobrevida e proliferação em ex em comparação com CTCs individuais. em geral, nosso fluxo de trabalho oferece uma plataforma para dissecar as características dos CTCs no nível de célula única, visando a identificação de vias relevantes para metástases e uma melhor compreensão da biologia da CTC.

Introduction

A manifestação clínica da metástase em órgãos distantes representa o estágio final da progressão do câncer e responde por mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer1. A transição da doença localizada para a metastática é um processo de múltiplas etapas, muitas vezes mediada por células tumorais circulantes (CTCs)2,3,4. Estas células são derramadas do tumor primário na circulação sanguínea e são transportadas para órgãos distantes, onde podem extravasar e estabelecer Lesões metastáticas5,6. Embora os tumores sólidos possam liberar um número relativamente elevado de CTCs, a maioria dos CTCs estão destinados a morrer, devido às altas forças de cisalhamento em circulação, morte celular mediada por anoikis, ataque imunológico ou capacidades limitadas para se adaptar a um microambiente estrangeiro7. Portanto, é fundamental estabelecer ferramentas que permitam a dissecção das características moleculares desses CTCs que são dotados de capacidade de propagação de metástases. Estudos pré-clínicos e clínicos recentes sugerem que a presença e a quantidade de CTCs individuais e de clusters de CTC está associada a um pior desfecho em pacientes com vários tipos de tumores sólidos8,9,10 , 11 anos de , 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de . Os clusters CTC são grupos de dois ou mais CTCs conectados entre si durante a circulação e são mais eficientes na formação de metástases em comparação com CTCs simples3,15,16. Células dentro de um cluster mantêm forte adesão de células celulares através de desmossomas e junções aderências, o que pode ajudar a superar anoikis17,18. Recentemente, observou-se que o agrupamento de CTCs está vinculado à hipometilação de sítios de ligação para fatores de transcrição associados à stemness e proliferação, levando a uma maior capacidade de iniciar com sucesso a metástase19. A dissociação do agrupamento CTC resulta na remodelação de sítios de ligação chave e, consequentemente, na supressão do seu potencial metastático19. Adicionalmente aos conjuntos de células cancerosas, os CTCs podem igualmente associar ao glóbulo branco (o mais freqüentemente neutrophils) para manter níveis elevados da proliferação na circulação e para aumentar sua capacidade metastática20. No entanto, a biologia dos CTCs é entendida apenas em parte e várias questões permanecem abertas, incluindo as características moleculares subjacentes e vulnerabilidades de células simples e agrupadas.

Nos últimos anos, foram estabelecidas várias estratégias que exploram padrões de expressão celular-superfície, bem como propriedades físicas de CTCs para seu isolamento21,22,23,24, 25. Antigen-os métodos dependentes da isolação dependem na maior parte da expressão da molécula da adesão da pilha epithelial da superfície da pilha (epcam)26. O mais freqüentemente usado e (atualmente) a única plataforma aprovada pela FDA para a enumeração CTC, é o sistema CellSearch, que é baseado em um procedimento de duas etapas para isolar CTCs21. Na primeira etapa, os componentes do plasma são removidos por centrifugação, enquanto CTCs são capturados com Ferrofluidos magnéticos acoplados a anticorpos anti-EpCAM. Na segunda etapa, a solução enriquecida com CTC é manchada para células nucleadas (DAPI-positivas) expressando citoqueratina (CK)8,18,19, enquanto os glóbulos brancos (WBCs) são identificados usando o marcador de leucocitário CD45. Finalmente, as pilhas capturadas são coloc em uma plataforma de seleção integrada e os CTCs são identificados com a expressão de EpCAM, CKs, e DAPI ao ser negativo para CD45. Embora este seja considerado o padrão ouro para a enumeração de CTC, a análise molecular a jusante é desafiante com esta tecnologia devido às limitações inerentes na recuperação do CTC. Além disso, dado o seu procedimento de isolamento, CellSearch pode favorecer o enriquecimento de CTCs com níveis de EpCAM mais elevados em comparação com CTCs com menor expressão EpCAM, devido, por exemplo, a heterogeneidade do cancro27 ou downregulation de marcadores epiteliais 28,29. Para superar essas limitações, surgiram tecnologias independentes do antígeno para o enriquecimento de CTCs. Por exemplo, o CTC-ichip integra a separação hidrodinâmico de pilhas nucleadas, incluindo CTCs e WBCs dos componentes restantes do sangue, seguidos por um esgotamento imunomagnética de WBCs anticorpo-etiquetados, permitindo a purificação de CTCs untagged e viáveis em solução25. Adicionalmente, o fato de que a maioria dos CTCs são ligeiramente maiores do que os glóbulos vermelhos (RBCs) ou WBCs levou ao desenvolvimento de tecnologias de enriquecimento de CTC baseadas em tamanho23,30 (por exemplo, o sistema parsortix (Angle)) que faz uso de um tecnologia microfluídico-baseada, compreendendo um canal de estreitamento através da gaveta da separação, conduzindo as pilhas a uma abertura terminal de 10, 8, 6,5 ou 4,5 μm (os tamanhos diferentes estão disponíveis dependendo do diâmetro esperado de pilhas de cancro do alvo). A maioria das células sanguíneas passam pela lacuna estreita, enquanto CTCs ficar preso devido ao seu tamanho (mas também devido à sua baixa deformabilidade) e são, portanto, retidos na gaveta. Revertendo a direção do fluxo permite a liberação de CTCs capturados, que estão em um estado viável e adequado para análise downstream. Independentemente do protocolo escolhido para o isolamento de CTC, no entanto, os procedimentos típicos de pós-enriquecimento ainda produzem CTCs que são misturados com um número relativamente pequeno de RBCs e WBCs, fazendo a análise de CTCs puros ou em massa simples desafiador. Para abordar esta questão, estabelecemos um fluxo de trabalho que permite a manipulação de CTC sem potencial viés introduzido por contaminantes de células sanguíneas. A adição de imunocoloração de antemão, com combinações de anticorpos variáveis, distingue CTCs das células sanguíneas e até permite identificar subgrupos de CTC com perfis distintos de expressão de marcadores de superfície. Este procedimento altamente personalizável pode ser posteriormente combinado com aplicações específicas a jusante.

Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho que comece de um produto CTC-enriquecido (obtido com toda a tecnologia do enriquecimento do CTC da escolha) e combine diversas aproximações para ganhar a introspecção na biologia do CTC na definição da único-pilha. Em poucas palavras, nosso fluxo de trabalho possibilita a identificação de CTCs simples, clusters CTC e clusters CTC-WBC por imunocoloração ao vivo, seguidos de micromanipulação de células simples e análise a jusante usando protocolos de cultivo ex vivo , uma única célula sequenciamento e ensaios in vivo de metástases.

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Protocol

Todos os procedimentos envolvendo amostras de sangue dos pacientes foram realizados mediante consentimento informado assinado dos participantes. Os procedimentos foram executados de acordo com os protocolos EKNZ BASEC 2016-00067 e EK 321/10, aprovados pelo Conselho de ética e institucional de revisão (Comitê de éticas noroeste/central Suíça [EKNZ]), e em conformidade com a declaração de Helsínquia.

Todos os procedimentos relativos aos animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e cantonais (protocolo de mouse aprovado #2781, escritório veterinário Cantonal de Basileia-Cidade).

1. preparação da amostra do paciente

  1. Antes de começar, assegure-se de trabalhar com soluções assépticas e materiais para manter a esterilidade durante todo o procedimento.
  2. Retire 7,5 mL de sangue periférico de um paciente com câncer de mama em um tubo de coleta de sangue EDTA de 10 mL.
  3. Incubar os tubos contendo sangue por um curto período de tempo (até 1 h) à temperatura ambiente (RT) em um agitador de balanço em 40 de oscilação por minuto (OSC/min).
  4. Enriqueça para únicos CTCs e clusters CTC usando um método de isolamento de CTC de escolha21,22,23,25. Libere CTCs em uma solução de 1x DPBS.
    Nota: dependendo da tecnologia de enriquecimento CTC escolhida, os glóbulos brancos remanescentes e os glóbulos vermelhos podem estar presentes. Ajuste a pressão de liberação a fim preservar as estruturas do conjunto CTC.
  5. Prossiga imediatamente para o passo seguinte na secção 3.

2. preparação da amostra do rato

  1. Antes de iniciar, prepare uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha de 25G, solução filtrada EDTA de 5 mM e tubos de coleta de sangue EDTA de 2 mL.
  2. Assegure-se de trabalhar com soluções assépticas e materiais para manter a esterilidade durante todo o procedimento.
  3. Pré-lave a seringa com solução de EDTA de 5 mM.
  4. Coloque a seringa com 100 μL de EDTA de 5 mM e retire as bolhas.
  5. Eutanizar o mouse usando 80% CO2 /20% o2 inalação de gás e prosseguir imediatamente para o próximo passo.
    Nota: uma alternativa ao método da inalação do co2 é a anestesia do isoflurano (3 Vol% isoflurano e oxigênio (gás do portador) na taxa de fluxo de 600 ml/min) seguida pela deslocação cervical, ou pela injeção de overdose da solução do Ketamine/xylazine. O método específico de eutanásia pode variar dependendo do protocolo de mouse aprovado.
  6. Confirme a morte do animal pela ausência de atividade respiratória, reflexo corneano ausente e micção sem estímulos externos.
  7. Realize uma punção cardíaca introduzindo cuidadosamente a agulha da seringa pré-carregada de EDTA com um ângulo de 30 ° no tórax do esterno para o coração.
    Nota: para experimentadores inexperientes, recomenda-se abrir a cavidade torácica primeiro, antes de realizar a punção cardíaca, para melhor Visualizar o coração.
  8. Recupere até 1 mL de sangue. Sem soltar o êmbolo, retire a seringa do peito animal, retire com segurança a agulha, abra a tampa do tubo de coleta de sangue EDTA de 2 mL e dispense o sangue diretamente para dentro. Feche a tampa e inverta o tubo 10x.
  9. Incubar os tubos contendo sangue por um curto período de tempo (até 1 h) em RT em um agitador de balanço em 40 OSC/min.
    PRECAUÇÃO: a agulha deve ser eliminada em eliminação de perigos biológicos com segurança acentuada.
    Nota: são possíveis perfurações múltiplas para aumentar o volume sanguíneo total. Use seringas separadas pré-carregadas com EDTA para diferentes levantamentos para evitar aspirar sangue coagulado presente na agulha anterior.
  10. Enriqueça para os únicos CTCs e os clusters CTC usando o método de isolação CTCs da escolha21,22,23,25. Libere CTCs em uma solução de 1x DPBS.
    Nota: dependendo da tecnologia de enriquecimento CTC escolhida, os glóbulos brancos remanescentes e os glóbulos vermelhos podem estar presentes. Ajuste a pressão de liberação a fim preservar as estruturas do conjunto CTC.
  11. Prossiga imediatamente para o passo seguinte na secção 3.
    Nota: para todos os procedimentos seguintes, assegure-se de que o sangue unfixed e recentemente isolado esteja usado.

3. imunocoloração ao vivo CTCs

  1. Centrifugue a suspensão da pilha CTC-enriquecida em 72 x g por 4 minutos.
    Nota: 72 x g corresponde a 800 rpm se o rotor tiver um diâmetro de 100 mm. converta o número de g-force de acordo com o rotor.
  2. Ressuspender suavemente o pellet em 1% de solução de BSA em 1x DPBS e adicionar 2 μg/mL de anticorpo AF488 e 1 μg/mL de anticorpo antihumano CD45-BV605 ou 2 μg/mL anticorpo CD45-BV605 em um volume total de 500 μL.
    Nota: para os CTCs derivados do cancro da mama, o EGFR-FITC antihumano e o anti-humano HER2-AF488 podem ser adicionados adicionalmente ao anti-EpCAM e ao anti-CD45. Isto permite identificar melhor os CTCs que estão expressando níveis mais baixos de EpCAM.
  3. Incubar por 30 min em RT e proteger da luz.
  4. Lave CTCs suspensão usando 1 mL de 1% BSA em 1x DPBS solução e centrifugação em 72 x g por 4 min. Repita esta lavagem duas vezes.
  5. Resuspend pilhas manchadas em 2 mL de 1% BSA na solução de 1x DPBS e transfira o volume total em 1 poço de uma placa ultra-low do acessório de 6 poços.
  6. Incubar a placa por 10-15 min a 4 ° c protegidos da luz para permitir a sedimentação de CTCs e células sanguíneas residuais.

4. micromanipulação de CTCs e separação da único-pilha

Nota: antes de começar, esteja ciente de que o micromanipulador requer até 45 min para a configuração completa. Uma vez configurado, o procedimento de identificação e micromanipulação de CTC requer até 2 minutos por célula (ou cluster).

  1. Certifique-se terminar o procedimento da colheita do CTC dentro de 2 h da extremidade da mancha.
  2. Inicie o software micromanipulador e ligue o micromanipulador. Conecte o micromanipulador ao computador e inicialize o braço robótico assim como o estágio do microscópio pressionando o botão de conexão seguido pelo dispositivo de int.
  3. Feche o armário de protecção após cada manipulação da máquina para poder manobrar através do computador.
  4. Limpe as superfícies da poeira e derrames pulverizando o etanol e limpando as superfícies internas do armário. Um ambiente limpo assegurará a esterilidade do processo.
  5. Instale um novo capilar de vidro no braço robótico. Para a separação da único-pilha, use 20-30 o capilar do μm quando 30-50 μm for preferível para a colheita do conjunto do CTC.
  6. Retire todas as bolhas presentes no tubo, dispensando ou aspirando o óleo do sistema.
    Cuidado: o capilar de vidro é afiado e frágil. Manuseie com cautela.
  7. Encha o tanque de esterilização 1 com 70% de etanol, o tanque de esterilização 2 com H2o estéril sem nuclease e o tanque tampão com 1x dpbs estéreis.
    Atenção: não feche as tampas dos tanques, uma vez que, durante os próximos passos, o capilar terá de aceder livremente aos tanques.
  8. Esterilize o capilar duas vezes com 70% de etanol.
  9. Substitua o tanque de esterilização 1 com o tanque 2 e lave o capilar em H2o pelo menos três vezes usando a função de esterilização.
  10. Usando o software micromanipulador, inicie um novo experimento e escolha o tipo de experimento de picking entre os modos de seleção automática e manual.
    Observação: escolha o tipo de experimento com base no ponto final da manipulação. O modo manual permite manobrar um braço robótico depois que o capilar entra na suspensão celular. Esta etapa é necessária para a dissociação de clusters CTC em células individuais. É possível alterar o tipo de picking durante o experimento.
  11. Configurar a bandeja do deck especificando a posição do tanque de esterilização (líquido 1), tanque tampão (líquido 2) e bandeja de depósito (alvo 1 ou 2). O alvo 1 reserva depositar em placas, alvo 2 reserva depositar em tubos do PCR ou em placas do PCR.
  12. Definir a temperatura dos tanques líquidos e bandeja de depósito escolhido para 4 ° c.
    Observação: o processo de separação pode ser demorado. O resfriamento dos tanques líquidos e da bandeja de depósito é, portanto, aconselhado
  13. Posicione a placa de fixação Ultrabaixa contendo a solução de CTCs liberada o microscópio dentro do armário do micromanipulador. Retire a tampa da chapa e feche o armário. Mantenha a placa em RT para o resto da configuração e durante o procedimento de picking.
  14. Selecione manualmente o objetivo do microscópio para picking (10-20x) e o tempo de exposição de todos os canais necessários (canais brightfield, FITC e TRITC).
  15. Selecione Mostrar navegador bem da barra de ferramentas para visualizar e selecionar o tipo de placa de captação (placa de 6 poços).
    Nota: qualquer placa ou bem formato pode ser instalado pelo fabricante apenas.
  16. Calibre a posição de captação no meio do poço que contém a solução CTCs, mas sem células no centro do campo de visão. A calibração executada nas bordas dos poços pode conduzir à calibração defeituosa devido à superfície bem desigual.
  17. Use o sensor para tocar suavemente a parte inferior da placa com o capilar (velocidade 0, 1 mm/passo e 1% de velocidade).
  18. Ajuste a posição do coletor 0, 5 mm acima da parte inferior da chapa.
    Nota: Certifique-se de abrir e remover as tampas de placas e tanques antes de prosseguir. O capilar pode quebrar em uma tampa fechada ou não removida.
    Cuidado: se o capilar quebra em cima do contato com tampas, o vidro quebrado pode ser encontrado nos arredors ou nas soluções.
  19. Selecione o tipo de célula e parâmetros de picking. O parâmetro picking pode ser configurado e carregado em cada inicialização. Para picking de célula única, selecione o modo manual.
  20. Dentro das configurações de preparação de picking :
    1. Definir o volume do entreferro entre o óleo do sistema e a amostra para 1 μl
    2. Ajuste o volume líquido do amortecedor para tomar acima antes de cada colheita para 0,5 μL.
      Nota: o volume líquido do tampão é ajustado ao volume máximo total da captação. Pequenos volumes não afetam a eficiência de picking ou depósito.
    3. Definir a velocidade de aspiração do líquido tampão entre 1-6%.
    4. Ajuste o tempo de espera após a aspiração do amortecedor a 1 s.
      Nota: a opção de tomar o tampão do alvo bem em vez do tanque líquido do amortecedor pode ser usada se necessário
    5. Ajuste para reutilizar capilares de vidro e nenhuma esterilização entre picaretas.
      Nota: a esterilização entre picaretas pode ser executada manualmente se requerido. Executar várias lavagens em H2o entre picaretas ou dois esterilização em etanol seguido por várias lavagens em h2o.
  21. Dentro das configurações de picking :
    1. Altere as configurações da câmera ao escolher e tempo de exposição o microscópio para 7.500 μs.
    2. Selecione altura de picking fixa.
      Nota: o sensor de ferramenta ou autofocus pode ser escolhido em vez disso. No entanto, pequenas imperfeições da placa pode perturbar a sensibilidade do sensor ou o autofocus que pode causar um impacto do capilar na placa.
    3. Ajuste a velocidade da aspiração do capilar que entra na placa da fonte a 7-15%.
    4. Ative a separação interativa.
    5. Definir o volume de aspiração em μl para 0-0,05.
    6. Defina a velocidade de aspiração para 5%.
    7. Ajuste o tempo de espera após a aspiração em s a 0-1.
    8. Defina o número de partículas colhidas por capilar para 1.
    9. Não defina nenhuma separação múltipla na mesma posição e sem funções de raspagem . As propriedades de aspiração devem ser ajustadas de acordo com o tipo de experimento (por exemplo, o modo de picking automático pode exigir maiores volumes de aspiração).
  22. Dentro das configurações de depósito :
    Nota: as configurações de depósito dependem estritamente da placa/tubo de depósito.
    1. Para a separação da único-pilha, defina a velocidade do capilar que entra na placa de alvo a 25%.
    2. Ajuste a velocidade de dispensar a 6%.
    3. Ajuste o tempo de espera após dispensar em s a 0.
    4. Defina a quantidade de entreferro dispensada no alvo bem para 100%.
    5. Sem enxaguar após o depósito.
      Nota: a esterilização pode ser realizada após o depósito para limpar o capilar.
    6. Definir a quantidade máxima de partículas depósito por poço e o número de alvos para distribuir partículas para 1.
    7. Calibrar a altura do depósito na posição a1 do alvo 1 para as placas ou na posição a1 do alvo 2 para os tubos. Coloque um tubo aberto ou uma placa sem tampa para a calibração e use o sensor para tocar suavemente o poço de depósito (velocidade 0, 1 mm/passo e 1% de velocidade). Definir a altura de depósito 1 mm acima da parte inferior da chapa.
  23. Dentro das configurações:
    1. Defina a velocidade do palco durante a separação para 5-10%.
      Nota: os movimentos rápidos da placa podem conduzir ao movimento das pilhas na suspensão e às dificuldades na colheita múltipla da pilha devido ao desposicionamento.
    2. Defina as Propriedades de esterilização usando o volume de enxaguamento para 1 μl, 3 loops de enxaguamento e 2 s de tempo de espera por rodada de esterilização.
    3. Aplique as alterações antes de fechar.
  24. Navegue o capilar de vidro usando o joystick no poço e coloque-o no topo da única célula de interesse. Escolha pegar posições a uma distância segura da borda do poço (1 mm) como o capilar pode quebrar na borda do poço.
  25. Adicione manualmente partículas usando o botão do joystick ou selecionando manualmente a partir do menu.
  26. Selecione escolher partículas ativadas para iniciar a separação.
  27. O capilar parará 0, 5 mm acima da parte inferior da placa e no topo da posição de captação selecionada por causa da separação interativa (modo manual). Rode suavemente o manípulo do joystick para a direita para aspirar manualmente a partícula e a solução DPBS circundante. O volume máximo não é fixo quando o modo manual está ligado. No entanto, o volume máximo permitido na seringa será de 25 μL.
  28. Dispense o excesso de solução DPBS ou partículas indesejadas, girando suavemente o manípulo do joystick no sentido anti-horário. Demasiada dispensação liberará o entreferro da seringa que dá forma a bolhas em sua solução e a visibilidade comprometedora.
  29. Pressione Next para prosseguir com o depósito.
  30. Observar o capilar entrando no tubo PCR de depósito ou na placa PCR, liberando o volume e voltando à posição inicial com um capilar vazio.
    Nota: se houver volume deixado no capilar, proceder com a esterilização. Em seguida, verifique novamente as configurações, o nível de óleo e a altura do óleo antes de executar uma nova separação.
  31. Prossiga do ponto 26 da seção 4 para iniciar uma nova separação de célula única. Durante a colheita pode ser necessário substituir o capilar. Após a instalação, uma nova calibração da posição de coleta deve ser realizada. No final da calibração, selecione a função aplicar alterações calibradas na altura Z para depositar a altura, a fim de corrigir a altura do depósito para a nova calibração capilar e para pular a calibração da altura do depósito (seção 4,16).
    Observação: as etapas descritas na seção 1-4 se aplicam à maioria dos métodos de enriquecimento e isolamento CTCs. Aqui nós relatamos etapas opcionais para a análise específica do CTCs.

5. separação e semeadura da único-pilha para a análise da sobrevivência e da proliferação

  1. Assegure-se de trabalhar com soluções assépticas e materiais para manter a esterilidade durante todo o procedimento.
  2. Prepare uma placa de poço 384 para conter os CTCs únicos escolhidos para a cultura com 20 μL de meios de cultivo CTC31. Assegure-se de que os CTCs sejam semeados em pequenos volumes do meio após a manipulação (por exemplo, 10-20 μL para uma placa de 384 poços).
  3. Gire para baixo a solução para a parte inferior da placa. Coloque 384 placa de poço no alvo 1 e mantenha a 4 ° c.
  4. Execute todas as etapas com o micromanipulador descrito na seção 4 para configurar o micromanipulador e iniciar uma nova separação.
    Observação: várias seleções das células únicas causará a formação de uma lista de picking. As partículas serão colhidas e depositadas uma a uma em poços consecutivos (ver secção 4.22.6). No entanto, o modo interativo (modo manual) vai parar o direito capilar antes da aspiração, permitindo assim que o experimentador para controlar este passo crítico e para garantir a colheita bem sucedida. Os movimentos rápidos da placa podem conduzir ao movimento das pilhas na suspensão e às dificuldades na colheita múltipla da pilha.
  5. Após o depósito, repita a etapa 4 para iniciar uma nova separação.
  6. No final do picking, centrifugue a placa em 72 x g por 4 min para garantir que as células colhidas sejam colocadas na parte inferior do poço.

ruptura do conjunto 6. CTC e separação da único-pilha para arranjar em seqüência

  1. Assegure-se de trabalhar com soluções assépticas e materiais para manter a esterilidade durante todo o procedimento.
  2. Prepare tubos de PCR únicos ou uma placa de PCR que conterá as células únicas do aglomerado quebrado com o total 2,5 μL de solução de lisagem celular compreendendo 1 U/μL de inibidor de RNA.
  3. Gire rapidamente para baixo a solução à parte inferior do tubo. Coloque os recipientes de depósito no alvo 2 e mantenha-os a 4 ° c.
  4. Realize todas as etapas descritas na seção 4 com o micromanipulador para configurar o micromanipulador.
  5. Comece uma nova colheita. O capilar parará 0, 5 mm acima da parte inferior da placa e na parte superior do cluster CTC selecionado por causa da separação interativa (modo manual).
  6. Rode suavemente o manípulo do joystick para a direita para aspirar manualmente o aglomerado e a solução DPBS circundante. Dispense o volume aspirado, incluindo o cluster CTC, girando suavemente o manípulo do joystick no sentido anti-horário.
  7. Repita a aspiração/descarte do cluster CTC descrito na etapa 6 até que as células únicas que formam o cluster se separem.
    Nota: demasiada dispensação liberará o entreferro da seringa que dá forma a bolhas em sua solução e em comprometer a visibilidade.
  8. Siga por olho a posição das únicas células. Adicione manualmente as partículas usando o botão do joystick ou selecionando manualmente a partir do menu.
    Observação: várias seleções das células únicas causará a formação de uma lista de picking. As partículas serão colhidas e depositadas uma a uma em tubos/poços consecutivos de PCR (ver secção 4.22.6). No entanto, o modo interativo (modo manual) vai parar o direito capilar antes da aspiração, portanto, permitindo que o experimentador para controlar este passo crítico e para garantir a colheita bem sucedida.
  9. Selecione escolher partículas ativadas para iniciar a separação.
    Nota: a quantidade de solução de lisagem de células permitirá que uma única célula para lyse completamente. Entretanto, a exposição longa do índice lisado ao agente lising pode degradar o ADN ou o mRNA. Portanto, prossiga imediatamente para a próxima etapa.
  10. Feche imediatamente o tubo que contem a única pilha escolhida e transfira-o no gelo seco para a congelação instantânea.
  11. Gire rapidamente o tubo e verific para ver se há a ausência de gotas nos lados do tubo para assegurar uma lyse apropriada da pilha depositada.
  12. Repita a partir do passo 5 para iniciar um novo picking.
    Nota: o estágio do microscópio mover-se-á de uma partícula adicionada a outra na velocidade descrita na seção 4.23.1. A suspensão CTCs na placa de fixação Ultrabaixa pode mover-se, causando a separação defeituosa devido ao posicionamento incorreto.

7. isolação de CTCs para a injeção do rato

  1. Assegure-se de trabalhar com soluções assépticas e materiais para manter a esterilidade durante todo o procedimento.
  2. Prepare um tubo de PCR com 5 μL de 1x DPBS estéril.
  3. Gire rapidamente para baixo a solução à parte inferior do tubo. Coloque os recipientes de depósito no alvo 2 e mantenha-os a 4 ° c.
  4. Dentro das configurações de depósito aplicar uma alteração na etapa 4.22.6: defina a quantidade máxima de partículas depósito por poço para 1.000 e o número de alvos para distribuir partículas para 1. Esta etapa garante que as células escolhidas serão depositadas no mesmo tubo por 1.000 vezes.
  5. Use apenas o modo interativo (modo manual) para controlar com precisão a etapa de picking e manter a solução escolhida livre de células contaminantes.
    Observação: se mais de 1.000 células são necessárias, aumente o número de alvos para distribuir partículas para evitar a perda de amostra após 1.000 células.
  6. Continue as etapas da seção 4,26 para iniciar uma nova separação. Repita a etapa 6 para executar várias Pickings. Anote o número de células coletadas em cada separação para manter o controle do número de células disponíveis para a injeção do mouse.
  7. No final da colheita, centrifugue o tubo a 72 x g durante 4 min (ver secção 3,1.) e aspirado a sobrenadante.
  8. Resuspend os CTCs coletados no amortecedor da escolha, apropriado para a injeção do rato. Para a injeção gorda mamária da almofada, Ressuspender os CTCs coletados em uma relação 1 a 1 de 1x DPBS e a membrana reconstituída do porão extraída, e mantem-se em 4 ° c até a injeção. Para a injecção intravenosa, suspender apenas os CTCs recolhidos em DPBS.
    Nota: o volume da solução depende estritamente do número de CTCs que serão injetados. Aconselha-se injetar na almofada de gordura mamária ou intravenosamente um máximo de 100 μL por rato. Ao calcular o volume, considere sempre o volume inoperante para a manipulação e o carregamento da seringa.

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Representative Results

O fluxo de trabalho apresentado permite a preparação de CTCs individuais, seja de CTCs simples ou separados de clusters CTC. Os CTCs dos pacientes ou dos ratos tumor-tendo são enriquecidos do sangue inteiro com métodos disponíveis do CTC-enriquecimento e manchados então com os anticorpos de encontro aos marcadores Cancer-associados (por exemplo, EpCAM, verde) e marcadores WBC-específicos (por exemplo, CD45, vermelho) (Figura 1a ). O produto de CTC manchado é transferido então à estação da micromanipulação era as pilhas individuais são colhidas, depositadas em tubos do PCR ou em placas do multiwell e preparadas para a análise a jusante, incluindo arranjar em seqüência da único-pilha, in vitro a cultura ou ensaios in vivo (Figura 1b).

A confiabilidade desse método é baseada em uma distinção de célula-alvo adequada durante a separação manual de células. A imunocoloração ao vivo com anticorpos anti-EpCAM visualiza as células cancerosas na suspensão e permite uma distinção exata de eventos CD45-positivos (mais prováveis, WBCs) (Figura 2a). Quando devidamente calibrado e mantido, CellCelector fornece manipulação de células bem controlada. O isolamento preciso da CTC caracteriza-se pela aspiração apenas do alvo desejado sem células contaminantes (RBCs ou WBCs), como mostrado nas fotos tiradas antes e após a aspiração do grupo CTC (Figura 2b, C).

Como descrito previamente, os clusters de CTC indicam um phenotype mais metastático quando comparados aos únicos CTCs19combinados. No entanto, se a presença de células vizinhas é suficiente para aumentar a taxa de proliferação de células dentro de clusters é desconhecida. A fim endereçar esta pergunta, 1009 o único CTC e 1008 os clusters CTC que variam entre 2-17 pilhas (com os 89,5% deles que são 2-5 clusters de pilha) derivados da linha de pilha BR16 derivada CTC20 foram micromanipulados em poços individuais de 384-poço placas de fixação Ultrabaixa. O número de células vivas em cada poço foi contado manualmente o microscópio e gravado semanalmente. Todas as análises foram realizadas após a normalização do número de células (i.e., o agrupamento de três células foi analisado como três células individuais). Colônias não sucedidas foram caracterizadas pela falta de células vivas no poço no final do experimento. Como suspeitamos, os clusters de CTC apresentaram sobrevida aumentada em comparação com CTCs simples e deram origem a colônias de células dentro de 56 dias de cultivo in vitro (Figura 3a, 3B). Notavelmente, os clusters de CTC também apresentaram maior taxa de proliferação e, assim, alcançaram maiores números de células finais (Figura 3C), indicando que o contato direto com outras células tumorais tem impacto tanto na sua viabilidade quanto na taxa de proliferação.

Por último, fornecemos dados de sequenciamento de RNA de célula única de CTCs diretamente isolados de pacientes com câncer de mama. Particularmente, nós mostramos uma incorporação de vizinho estocástico t-distribuído (tSNE) das únicas pilhas derivadas dos únicos CTCs, dos clusters CTC ou dos clusters CTC-WBC (Figura 4). Esta aproximação permite a identificação das pilhas com perfil similar da expressão de Gene, assim como a distinção de populações da pilha que diferem baseadas na expressão de genes particulares.

Figure 1
Figura 1 . Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. (A) CTCs são obtidos a partir do sangue de pacientes com câncer ou modelos de câncer de rato, enriquecido usando métodos disponíveis e rotulados com anticorpos para discriminar células tumorais (verde) a partir de glóbulos brancos (vermelho). (B) a micromanipulação precisa dos CTCs facilita vários procedimentos e aplicações, por exemplo, sequenciamento de células únicas, cultura CTC ou experimentos de transplante in vivo . Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Retratos representativos dos CTCs antes e depois do micromanipulation. (A) imagens representativas de CTCs derivadas de um Xenoenxerto derivado de CTC (NSG-CDX-BR16) e coradas com anticorpos Antiepcam (verde) e CD45 (vermelho) para possibilitar a visualização de CTCs e glóbulos brancos, respectivamente. A ampliação 40x é mostrada. (B, C) A micromanipulação permite a separação precisa de CTCs de células indesejadas, como mostrado nas imagens antes (esquerda) e após (direita) procedimento de aspiração celular. Ampliação 10x. O campo de visão maior (B) e o campo de visão mais estreito (C) são mostrados, respectivamente. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 3
Figura 3 . Análise da sobrevivência e da proliferação de únicos CTCs e clusters CTC. As pilhas individuais dos únicos CTCs ou dos clusters CTC das pilhas CTC-derivadas cultivadas de BR16 foram micromanipulados em placas do 384-poço. (A) gráfico de Kaplan-Meier mostrando a probabilidade de sobrevivência de células individuais semeadas versus clusters de células. P< 0,0001 por pares log-rank teste. (B) gráfico de barras representando a proporção de colônias que consistiam de células vivas no final do experimento (dia 56). P< 0,0001 pelo teste qui-quadrado. (C) Heatmaps visualizando distribuição de números de células normalizadas ao longo do experimento (dia 0, 8, 32, 56). Cada bloco representa uma célula inicial e o mapa de calor mostra o número de células por poço em um determinado timepoint. d = dia. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Sequenciamento de RNA de célula única. Visualização de dados da expressão do RNA de CTC usando a incorporação estocástica t-distribuída do vizinho (tSNE). Cada ponto representa uma única célula derivada de um único CTC, de um cluster CTC ou de um cluster CTC-WBC. As cores dos pontos correspondem ao ID do doador. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A caracterização molecular dos CTCs tem a promessa de melhorar nossa compreensão do processo metastático e orientar o desenvolvimento de novas terapias antimetástases. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada daqueles protocolos que permitem a micromanipulação de CTC e a análise a jusante, incluindo ensaios funcionais de uma única pilha-baseada, análise da expressão de gene e in vivo transplantação para o potencial metastático avaliação20.

Entre os passos mais críticos do nosso protocolo, a micromanipulação de produtos enriquecidos com CTC visa obter uma resolução única de células de suspensões celulares relativamente heterogêneas, ou seja, permitindo atingir os mais altos níveis de pureza e melhorar a qualidade da análises funcionais ou moleculares subsequentes. Por exemplo, a separação de células simples de CTCs permitiu que nós e outras pessoas investigassem a heterogeneidade de CTC (por exemplo, diferenças entre CTCs simples, clusters CTC e clusters CTC-WBC), tanto do ponto de vista molecular quanto da perspectiva de poder avaliar capacidade da metástase-iniciação. Enquanto nós geralmente favorecem os protocolos de separação de células que permitem que o experimentador Isole manualmente CTCs (ou seja, permitindo um maior grau de flexibilidade dependendo das características dos alvos individuais), soluções automatizadas estão agora disponíveis para facilitar separação de células e acelerar o processo de isolamento de CTC em experimentos bem controlados.

Ao considerar a micromanipulação de uma única célula no contexto da análise de CTC, o tempo é um fator limitante muito crítico. Como o nosso protocolo se destina a ser conduzido em células vivas, é imperativo proceder o mais rápido possível para minimizar as mudanças devidas ao ambiente ex vivo, como o upregulation ou downregulation de genes que são dependentes do contexto. Quando comparados às técnicas existentes para a análise de CTC, a micromanipulação da única pilha de CTCs vivos oferece uma flexibilidade mais elevada para a análise a jusante da escolha, variando do único sequenciamento da pilha aos ensaios funcionais diretos.

Neste manuscrito, também fornecemos novos dados que destacam diferenças importantes entre CTCs simples e clusterizadas por micromanipulação e semeadura de mais de mil CTCs individuais ou clusters CTC (com um tamanho claramente definido) de uma linha celular derivada de CTC em poços individuais de uma placa de microtitulação. Em primeiro lugar, observamos que os clusters de CTC (i.e., a presença de células vizinhas) são suficientes para alcançar melhores taxas de sobrevida das células semeadas, apoiando nossos dados in vivo sugerindo menores taxas de apoptose de clusters de CTC ao semear em um local distante 19. Além disso, mesmo após a normalização para o número de células semeadas, as células cancerosas cultivadas como clusters exibem taxas de proliferação muito mais elevadas, reforçando ainda mais o conceito de que os CTCs agrupados são contribuintes de metástase altamente eficientes.

Juntos, apresentamos protocolos específicos para análise de CTC com o objetivo de promover investigações relacionadas a células únicas no campo CTC. No futuro, antecipamos que esses protocolos podem ser úteis para investigações relacionadas à CTC, visando uma melhor compreensão da biologia que caracteriza a metástase transmitida pelo sangue em vários tipos de câncer.

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Disclosures

N.A. e BMS são alistados como inventores em aplicações da patente que se relacionam às pilhas de circulação do tumor e ao tratamento do cancro. N.A. é um consultor pago para empresas farmacêuticas e seguradoras com interesse em biópsia líquida.

Acknowledgments

Agradecemos a todos os pacientes que doaram sangue para o nosso estudo, assim como todos os clínicos envolvidos e enfermeiros de estudo. Agradecemos Jens Eberhardt, Uwe Birke, e Dr. Katharina Uhlig da ALS Automated Lab Solutions GmbH para suporte contínuo. Agradecemos a todos os membros do laboratório aceto por feedback e discussões. A investigação no laboratório aceto é apoiada pelo Conselho Europeu de investigação, pela União Europeia, pela Swiss National Science Foundation, pela Swiss Cancer League, pela Basel Cancer League, pelos dois cantons de Basileia através da ETH Zürich e pela Universidade de Basileia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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