Mikromanipulering av sirkulerende tumor celler for nedstrøms molekylær analyse og metastatisk potensiell vurdering

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Her presenterer vi en integrert arbeidsflyt for å identifisere fenotypiske og molekylære funksjoner som karakteriserer sirkulerende tumorceller (CTC). Vi kombinerer Live immunostaining og Robotic mikromanipulering av singel og gruppert CTC med én celle-baserte teknikker for nedstrøms analyse og vurdering av metastasering-seeding evne.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Blood-borne metastasering står for de fleste kreft-relaterte dødsfall og innebærer sirkulerende tumorceller (CTC) som lykkes i å etablere nye svulster på fjerne steder. CTC er funnet i blodet av pasienter som enkeltceller (enkelt CTC) eller som flercellede aggregater (CTC klynger og CTC-hvite blodlegemer klynger), med sistnevnte viser en høyere metastatisk evne. Utover opplisting, fenotypiske og molekylær analyse er usedvanlig viktig å analysere CTC biologi og å identifisere praktiske sårbarheter. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en arbeidsflyt som inkluderer CTC-immunostaining og mikromanipulering, ex vivo -kultur for å vurdere proliferativ-og overlevelses muligheter for enkeltceller, og in vivo metastasering-formasjon. I tillegg gir vi en protokoll for å oppnå dissosiasjon av CTC-klynger i individuelle celler og etterforskningen av intra-Cluster heterogenitet. Med disse tilnærmingene, for eksempel, vi nøyaktig kvantifisere overlevelse og proliferativ potensialet i enkelt CTC og individuelle celler innen CTC-klynger, som fører oss til observasjon at cellene i klynger vise bedre overlevelse og spredning i ex vivo kulturer sammenlignet med enslige CTC. total, vår arbeidsflyt tilbyr en plattform for å analysere egenskapene til CTC på enkelt cellenivå, satsing mot identifisering av metastasering-relevante trasé og en bedre forståelse av CTC biologi.

Introduction

Den kliniske manifestasjon av metastasering i fjerne organer representerer den siste fasen av kreft progresjon og står for mer enn 90% av kreft-relaterte dødsfall1. Overgangen fra lokaliserte til metastatisk sykdom er en multi-trinns prosess, ofte formidlet av sirkulerende tumorceller (CTC)2,3,4. Disse cellene er utgytt fra den primære svulst i blodsirkulasjonen og transporteres til fjerntliggende organer, hvor de kan extravasate og etablere metastatisk lesjoner5,6. Selv om solide svulster kan frigi et relativt høyt antall CTC, de fleste CTC er skjebnebestemt til å dø, på grunn av høye skjærkrefter i omløp, anoikis-mediert celle død, immun angrep eller begrensede evner til å tilpasse seg en utenlandsk mikromiljøet7. Derfor er det avgjørende å etablere verktøy som gjør det mulig for Disseksjon av de molekylære funksjonene til de CTC som er utstyrt med metastasering-seeding evne. Nyere prekliniske og kliniske studier tyder på at tilstedeværelsen og mengden av enkelt CTC og CTC klynger er forbundet med et dårligere utfall hos pasienter med ulike typer solide svulster8,9,10 , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser . CTC-klynger er grupper på to eller flere CTC knyttet til hverandre under sirkulasjon og er mer effektive i forming metastasering sammenlignet med én CTC3,15,16. Celler i en klynge opprettholder en sterk celle vedheft gjennom desmosomes og adherens veikryss, som kan bidra til å overkomme anoikis17,18. Nylig observerte vi at Clustering av CTC er knyttet til hypometylering av bindende områder for stemness-og spredning-assosiert transkripsjon faktorer, fører til en økt evne til å lykkes initiere metastasering19. CTC-klynge dissosiasjon resulterer i ombygging av nøkkel bindings steder, og følgelig undertrykkelse av deres metastatisk potensial19. I tillegg til klynger av kreftceller, CTC kan også knyttes til hvite blodlegemer (oftest nøytrofile) for å opprettholde høy spredning nivåer i omløp og øke sin metastatisk evne20. Men biologi av CTC forstås bare delvis og flere spørsmål forblir åpne, inkludert de underliggende molekylære funksjoner og sårbarheter av enkelt og gruppert celler.

I de senere årene har flere strategier er fastslått at utnytte Cell-overflaten uttrykk mønstre samt fysiske egenskaper CTC for deres isolasjon21,22,23,24, 25. antigen-avhengige isolasjons metoder stole hovedsakelig på uttrykk for celleoverflaten epitel Cell vedheft molekyl (EpCAM)26. Den mest brukte og (i dag) den eneste FDA-godkjente plattformen for CTC-opplisting, er CellSearch-systemet, som er basert på en to-trinns prosedyre for å isolere CTC21. I det første trinnet, er plasma komponenter fjernet av sentrifugering, mens CTC er fanget med magnetisk ferrofluids koplet til anti-EpCAM antistoffer. I det andre trinnet er CTC-beriket løsning beiset for kjerne (DAPI-positive) celler uttrykker cytokeratin (ck)8,18,19, mens hvite blodlegemer (WBCs) identifiseres ved hjelp av Pan-leukocytter markør CD45. Endelig er fanget celler plassert på en integrert screening plattform og CTC er identifisert gjennom uttrykk for EpCAM, CKs og DAPI samtidig som negative for CD45. Selv om dette anses å være gullstandarden for CTC-opplisting, er nedstrøms molekyl analyse utfordrende med denne teknologien på grunn av iboende begrensninger i CTC-henting. I tillegg gitt sin isolasjon prosedyre, CellSearch mai favorisere berikelse av CTC med høyere EpCAM nivåer i forhold til CTC med lavere EpCAM uttrykk, skyldes for eksempel til kreft heterogenitet27 eller downregulation av epitel markører 28,29. For å overvinne disse begrensningene, har antigen-uavhengige teknologier for berikelse av CTC dukket opp. For eksempel integrerer CTC-iChip hydrodynamisk separasjon av kjerne celler, inkludert CTC og WBCs fra gjenværende blodkomponenter, etterfulgt av en immunomagnetisk Innfanging forringelse av antistoff-merket WBCs, slik at rensing av umerkede og levedyktige CTC i løsning25. I tillegg er det faktum at de fleste CTC er litt større enn røde blodlegemer (RBC) eller WBCs førte til utvikling av størrelse-baserte CTC berikelse teknologier23,30 (f. eks Parsortix system (vinkel)) som gjør bruk av en mikrovæskebasert-basert teknologi, bestående av en innsnevring kanal på tvers av separasjon kassetten, ledende celler til en Terminal gap på enten 10, 8, 6,5 eller 4,5 μm (forskjellige størrelser er tilgjengelige avhengig av forventet diameter på målet kreftceller). De fleste av blodcellene passerer gjennom det smale gapet, mens CTC blir fanget på grunn av deres størrelse (men også på grunn av deres lavere fleksibilitet) og er derfor beholdt i kassetten. Hvis du tilbakestiller flytretningen, kan du frigi fanget CTC, som er i en levedyktig tilstand og egner seg for nedstrøms analyse. Uavhengig av den valgte protokollen for CTC-isolasjon, men typisk post-berikelse prosedyrer fortsatt gi CTC som er blandet med et relativt lite antall RBC og WBCs, noe som gjør analysen av ren enkelt eller bulk CTC utfordrende. For å løse dette problemet, etablerte vi en arbeidsflyt som gjør at CTC manipulasjon uten potensiell skjevhet innført av blodlegemer forurensninger. Tilsetning av immunostaining på forhånd, med variable antistoff kombinasjoner, skiller CTC fra blodlegemer og gjør det også mulig å identifisere CTC-undergrupper med distinkte uttrykks profiler for overflate markør. Denne svært tilpassbare prosedyren kan deretter videre kombineres med spesifikke nedstrøms applikasjoner.

Her beskriver vi en arbeidsflyt som starter fra et CTC-beriket produkt (innhentet med en hvilken som helst CTC-berikelse teknologi) og kombinerer flere tilnærminger for å få innsikt i CTC-biologi på en enkelt celle oppløsning. I et nøtteskall, vår arbeidsflyt muliggjør identifisering av enkelt CTC, CTC klynger og CTC-WBC klynger av Live immunostaining, etterfulgt av én celle mikromanipulering og nedstrøms analyse ved hjelp av ex vivo dyrking protokoller, enkelt celle sekvenser og in vivo metastasering-analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer blodprøver fra pasientene ble utført ved signert informert samtykke fra deltakerne. Prosedyrer ble kjørt i henhold til protokollene EKNZ BASEC 2016-00067 og EK 321/10, godkjent av etisk og institusjonell gjennomgang styret (etikk Committee nordvest/sentral Sveits [EKNZ]), og i samsvar med erklæringen av Helsingfors.

Alle prosedyrer om dyr ble utført i samsvar med institusjonelle og kantonale retningslinjer (godkjent muse protokoll #2781, kantonale veterinary Office Basel-City).

1. forberedelse av pasientprøver

  1. Før du starter, må du sørge for å arbeide med aseptisk løsninger og materialer for å opprettholde sterilitet under hele prosedyren.
  2. Ta ut 7,5 mL av perifert blod fra en brystkreft pasient til en 10 mL EDTA blodprøvetakingsrør.
  3. Ruge rør i blod som inneholder en kort tidsperiode (opptil 1 h) ved romtemperatur (RT) på en rocking shaker ved 40 pendling per minutt (OSC/min).
  4. Beriker enkelt CTC-og CTC-klynger ved hjelp av en CTC-isolasjons metode for valg21,22,23,25. Frigjør CTC i en 1x DPBS-løsning.
    Merk: avhengig av valgt CTC-berikelse teknologi, gjenværende hvite blodlegemer og røde blodlegemer kan være til stede. Juster trykket for å bevare CTC-klynge strukturene.
  5. Fortsett umiddelbart til neste trinn i del 3.

2. forberedelse til mus prøve

  1. Før du starter, forberede en 1 mL insulinsprøyte med en 25G nål, 5 mM EDTA filtrert løsning, og 2 mL EDTA blodprøvetakingsrør.
  2. Sørg for å arbeide med aseptisk løsninger og materialer for å opprettholde sterilitet under hele prosedyren.
  3. Forhånds vask sprøyten med 5 mM EDTA-løsning.
  4. Legg i sprøyten med 100 μL av 5 mM EDTA og fjern bobler.
  5. Euthanize musa med 80% CO2 /20% O2 gass inhalasjon og Fortsett umiddelbart til neste trinn.
    Merk: et alternativ til CO2 inhalasjons metoden er isoflurane anestesi (3 Vol% isoflurane og oksygen (carrier gass) ved strømningshastighet på 600 ml/min) etterfulgt av cervical forvridning, eller overdosering injeksjon av ketamin/xylazine løsning. Spesifikk aktiv døds metode kan variere avhengig av godkjent mus protokoll.
  6. Bekrefte dyrets død ved fravær av pusteaktivitet, manglende hornhinnen refleks, og vannlating uten eksterne stimuli.
  7. Utfør en hjerte punktering ved å nøye innføre nålen på EDTA pre-Loaded sprøyten med en 30 ° vinkel i thorax fra brystbenet mot hjertet.
    Merk: for uerfarne forskere, anbefales det å åpne brystet hulrom først, før du utfører CARDIAC punktering, for å bedre visualisere hjertet.
  8. Hente opp til 1 mL blod. Uten å slippe stempelet, trekke ut sprøyten fra dyret brystet, trygt fjerne nålen, åpne lokket på 2 mL EDTA blodprøvetakingsrør og dispensere blodet direkte inne. Lukk lokket og snu røret 10x.
  9. Ruge den blod-inneholdende rør for en kort tidsperiode (opp til 1 t) på RT på en rocking shaker på 40 OSC/min.
    FORSIKTIG: nålen må avhendes i skarp sikker biologisk risiko avhending.
    Merk: flere punktering er mulig for å øke det totale blod volumet. Bruk separate sprøyter pre-lastet med EDTA for ulike trekker for å unngå aspirating clotted blod til stede i forrige nål.
  10. Beriker enkelt CTC-og CTC-klynger ved hjelp av CTC isolasjons metode21,22,23,25. Frigjør CTC i en 1x DPBS-løsning.
    Merk: avhengig av valgt CTC-berikelse teknologi, gjenværende hvite blodlegemer og røde blodlegemer, kan være til stede. Juster trykket for å bevare CTC-klynge strukturene.
  11. Fortsett umiddelbart til neste trinn i del 3.
    Merk: for alle de følgende prosedyrene må du sørge for at unfixed og ferskt isolert blod brukes.

3. CTC leve immunostaining

  1. Sentrifuge CTC-beriket celle fjæring ved 72 x g i 4 min.
    Merk: 72 x g tilsvarer 800 RPM hvis rotoren har en diameter på 100 mm. Konverter g-force-nummeret i henhold til rotoren.
  2. Resuspend forsiktig pellet i 1% BSA-oppløsning i 1x DPBS og tilsett 2 μg/mL anti-humant EpCAM-AF488-antistoff og 1 μg/mL anti-humant CD45-BV605-antistoff eller 2 μg/mL anti-mus CD45-BV605-antistoff i et total volum på 500 μL.
    Merk: for brystkreft pasient-avledet CTC, anti-menneskelige EGFR-FITC, og anti-menneskelige HER2-AF488 kan legges i tillegg til anti-EpCAM og anti-CD45. Dette gjør det mulig å bedre identifisere CTC som uttrykker lavere EpCAM nivåer.
  3. Ruge i 30 minutter ved RT og Beskytt mot lys.
  4. Vask CTC-oppheng med 1 mL 1% BSA i 1x DPBS-oppløsning og sentrifugering ved 72 x g i 4 min. Gjenta denne vasken to ganger.
  5. Resuspend fargede celler i 2 mL 1% BSA i 1x DPBS-løsning og Overfør det totale volumet i 1 brønn av en 6-brønner ultra-lav festeplate.
  6. Ruge platen for 10-15 min ved 4 ° c beskyttet mot lys for å tillate sedimentering av CTC og gjenværende blodceller.

4. mikromanipulering av CTC og enkelt celle plukking

Merk: før du starter, Vær oppmerksom på at micromanipulator krever opptil 45 min for fullstendig oppsett. Når oppsettet er angitt, krever prosedyren for CTC-identifisering og mikromanipulering opptil 2 minutter per celle (eller klynge).

  1. Sørg for å avslutte CTC plukke prosedyren innen 2 h fra slutten av farging.
  2. Start opp micromanipulator programvare og slå på micromanipulator. Koble micromanipulator til datamaskinen, og Initialiser robotarmen og mikroskopet ved å trykke på tilkoblings knappen etterfulgt av int-enhet.
  3. Lukk beskyttelses skapet etter hver manipulering av maskinen for å kunne manøvrere det gjennom datamaskinen.
  4. Rengjør overflatene fra støv og søl ved å sprøyte etanol og tørke de innvendige overflatene i skapet. Et rent miljø vil sikre sterilitet av prosessen.
  5. Monter en ny glass kapillær på robotarmen. For enkelt celle plukking, bruk 20-30 μm kapillær mens 30-50 μm er å foretrekke for CTC klynge plukking.
  6. Fjern alle boblene som finnes i slangen ved å ta ut eller aspirating system oljen.
    FORSIKTIG: glass kapillær er skarp og skjør. Håndter med forsiktighet.
  7. Fyll steriliserings tanken 1 med 70% etanol, steriliserings tanken 2 med steril nuklease-fri H2O og buffer tanken med STERIL 1x DPBS.
    FORSIKTIG: ikke Lukk lokkene på tankene, siden i løpet av de neste trinnene vil kapillær behovet for å fritt få tilgang til tankene.
  8. Sterilisere kapillær to ganger med 70% etanol.
  9. Sett inn steriliserings tanken 1 med tank 2 og vask kapillær i H2O minst tre ganger med steriliserings funksjonen.
  10. Start et nytt eksperiment ved hjelp av micromanipulator programvare, og velg hvilken type Plukk eksperiment mellom automatisk og manuell valgmodus.
    Merk: Velg typen eksperiment basert på sluttpunktet for manipulering. Manuell modus muliggjør manøvrering av en robot arm etter kapillær kommer inn i cellen suspensjonen. Dette trinnet er nødvendig for dissosiasjon av CTC-klynger i individuelle celler. Det er mulig å endre typen plukking under eksperimentet.
  11. Konfigurer dekks skuffen som spesifiserer posisjonen til steriliserings tanken (væske 1), buffer tank (væske 2) og innskudds skuff (mål 1 eller 2). Mål 1 gjør det mulig å sette inn plater, mål 2 gjør det mulig å sette inn PCR-rør eller PCR-plater.
  12. Still inn temperaturen på væske tankene og innskudds brettet valgt til 4 ° c.
    Merk: plukkprosessen kan være tidkrevende. Kjøling av væske tanker og innskudds brett er derfor anbefalt
  13. Plasser den svært lave festeplaten som inneholder den frigitte CTC-løsningen under mikroskopet i micromanipulator skapet. Fjern lokket fra platen og Lukk kabinettet. Hold platen på RT for resten av oppsettet og under Plukk prosedyren.
  14. Velg målsettingen for mikroskopet manuelt for plukking (10 – 20x) og eksponeringstiden for alle nødvendige kanaler (Brightfield, FITC og TRITC-kanaler).
  15. Velg Vis brønn navigatør fra verktøylinjen for å visualisere og velge typen hente plate (6-brønn plate).
    Merk: enhver plate eller brønn format kan bare installeres av produsenten.
  16. Kalibrer hente posisjonen midt i brønnen som inneholder CTC-løsningen, men uten celler i midten av synsfeltet. Kalibrering utført ved kantene av brønnene kan resultere i feil kalibrering på grunn av ujevn brønn overflate.
  17. Bruk sensoren til å berøre bunnen av platen forsiktig med kapillær (hastighet 0,01 mm/trinn og 1% hastighet).
  18. Sett hente posisjonen 0,05 mm over bunnen av platen.
    Merk: Sørg for å åpne og fjerne lokk av tallerkener og tanker før du fortsetter. Kapillær kan brekke på et lukket eller unremoved lokk.
    FORSIKTIG: Hvis kapillær pausene ved kontakt med lokk, kan knust glass finnes i omgivelsene eller i løsningene.
  19. Velg celle type og Plukk parametere. Plukk parameter kan settes opp og lastes ved hver oppstart. For enkelt celle plukking velger du manuell modus.
  20. Innenfor innstillingene for klargjøring av plukking :
    1. Still inn Airgap-volumet mellom system oljen og prøven til 1 μL
    2. Sett buffer væskevolumet til å ta opp før hver plukking til 0,5 μL.
      Merk: buffer væskevolumet justeres til det totale maksimale hente volumet. Små volumer påvirker ikke plukking eller innskudds effektivitet.
    3. Sett hastigheten på aspirasjon av buffer væsken mellom 1-6%.
    4. Still ventetiden etter aspirasjon av bufferen til 1 s.
      Merk: muligheten til å ta opp bufferen fra målet godt i stedet for buffer væske tank kan brukes hvis nødvendig
    5. Sett til gjenbruk glass blod og ingen sterilisering mellom plukker.
      Merk: sterilisering mellom plukker kan utføres manuelt hvis nødvendig. Utfør flere vasker i H2o mellom plukker eller to sterilisering i etanol etterfulgt av flere vasker i h2O.
  21. Innenfor Plukk innstillingene:
    1. Endre kamerainnstillingene mens du plukker og eksponeringstid under mikroskopet til 7 500 μs.
    2. Velg fast Plukk høyde.
      Merk: verktøy sensor eller autofokus kan velges i stedet. Men små ufullkommenheter av platen kan forstyrre følsomheten til sensoren eller autofokus som kan føre til en påvirkning av kapillær inn i platen.
    3. Sett aspirasjon hastighet av kapillær inn kildeplaten til 7-15%.
    4. Aktiver interaktiv plukking.
    5. Still inn aspirasjon-volumet i μL til 0-0,05.
    6. Sett hastigheten på aspirasjon til 5%.
    7. Still inn ventetiden etter aspirasjon i s til 0-1.
    8. Angi antall plukkede partikler per kapillær til 1.
    9. Sett Ingen flere plukking på samme posisjon og ingen skraping funksjoner. Aspirasjon egenskaper må angis i henhold til type eksperiment (for eksempel, automatisk plukking modus kan kreve større aspirasjon volumer).
  22. Innenfor innskudds innstillingene:
    Merk: innskudds-innstillinger er strengt avhengig av innskudds platen/-slangen.
    1. For enkelt celle plukking definerer du hastigheten på kapillær angivelse av mål platen til 25%.
    2. Sett hastigheten på uttaket til 6%.
    3. Still inn ventetiden etter uttaket i s til 0.
    4. Sett mengden Airgap som føres ut i mål brønnen til 100%.
    5. Sett ingen skylling etter deponering.
      Merk: sterilisering kan utføres etter deponering for å rengjøre kapillær.
    6. Sett maksimalt antall partikler innskudd per brønn og antall mål å fordele partikler til 1.
    7. Kalibrer innskudds høyde på posisjon a1 i mål 1 for plater eller på posisjon a1 i mål 2 for rør. Plasser et åpent rør eller en plate uten lokk til kalibreringen, og bruk sensoren til forsiktig å berøre innskudds brønnen (hastighet 0,01 mm/trinn og 1% hastighet). Sett innskudds høyde 1 mm over bunnen av platen.
  23. Innenfor innstillingene:
    1. Angi etappe hastighet under plukking til 5-10%.
      Merk: raske bevegelser av platen kan føre til bevegelse av celler i suspensjon og vanskeligheter i flere celle plukking på grunn av mispositioning.
    2. Angi steriliserings egenskaper ved hjelp av skylle volum til 1 μL, 3 skylle løkker og 2 s ventetid per sterilisering runde.
    3. Bruk endringene før du lukker.
  24. Naviger i glass kapillær ved hjelp av joysticken i brønnen og plasser den på toppen av den ene cellen av interesse. Velg å plukke opp posisjoner på en trygg avstand fra brønnen grensen (1 mm) som kapillær kan bryte på kanten av brønnen.
  25. Legg til partikler manuelt ved hjelp av knappen på styrespaken eller manuelt velge fra menyen.
  26. Velg Plukk aktiverte partikler for å starte plukkingen.
  27. Kapillær vil stoppe 0,05 mm over bunnen av platen og på toppen av den valgte pickup posisjon på grunn av den interaktive plukking (manuell modus). Drei forsiktig knotten på joysticken med urviseren for å manuelt aspirer partikkel og den omkringliggende DPBS-løsningen. Det maksimale volumet er ikke fast når manuell modus er på. Maksimums volumet som er tillatt i sprøyten vil imidlertid være 25 μL.
  28. Dispensere overflødig DPBS-oppløsning eller uønskede partikler ved forsiktig å dreie knotten på styrespaken mot urviseren. For mye dosering vil løsne Airgap av sprøyten som danner bobler i løsningen og kompromittere synligheten.
  29. Trykk neste for å fortsette med innskuddet.
  30. Observer kapillær inn deponering PCR tube eller PCR plate, slippe volumet og gå tilbake til startposisjon med en tom kapillær.
    Merk: Hvis det er volum igjen i kapillær, Fortsett med sterilisering. Deretter sjekker du innstillingene, oljenivået og olje høyden på nytt før du utfører en ny plukking.
  31. Fortsett fra punkt 26 i del 4 for å starte en ny enkelt celle plukking. Under plukking kan det være nødvendig å erstatte kapillær. Etter installasjonen må en ny kalibrering av hente posisjonen utføres. På slutten av kalibreringen, Velg funksjonen Påfør kalibrert endringer i Z-høyden for å sette inn høyde for å korrigere innskudds høyden til den nye kapillær kalibreringen og for å hoppe over innskudds høyde kalibreringen (seksjon 4,16).
    Merk: trinnene som er beskrevet i avsnitt 1-4 gjelder for de fleste av CTC berikelse og isolasjon metoder. Her rapporterer vi valgfrie trinn for spesifikke CTC analyse.

5. single-celle plukking og seeding for overlevelse og spredning analyse

  1. Sørg for å arbeide med aseptisk løsninger og materialer for å opprettholde sterilitet under hele prosedyren.
  2. Klargjør en 384 brønn plate slik at den inneholder den plukkede singelen CTC for dyrking med 20 μL CTC dyrking Media31. Sørg for at CTC er sådd i små volumer av mediet etter manipulering (f.eks. 10-20 μL for en 384 brønn plate).
  3. Snurr ned løsningen til bunnen av platen. Plasser 384 brønn plate i mål 1 og hold ved 4 ° c.
  4. Utfør alle trinnene med micromanipulator som er beskrevet i avsnitt 4, for å sette opp micromanipulator og starte en ny plukking.
    Merk: flere valg av enkeltceller vil føre til dannelsen av en plukkliste. Partiklene vil bli plukket og avsatt en etter en i etterfølgende brønner (se Seksjon 4.22.6). Interaktiv modus (manuell modus) vil imidlertid stoppe kapillær rett før aspirasjon, derfor slik at eksperimentator å kontrollere dette kritiske trinnet og for å sikre vellykket plukking. Raske bevegelser av platen kan føre til bevegelse av cellene i suspensjon og vanskeligheter i flere celle plukking.
  5. Etter at du har innskudds, gjentar du trinn 4 for å starte en ny plukking.
  6. På slutten av plukking, sentrifuger platen på 72 x g for 4 min for å sikre at de plukkede cellene er plassert på bunnen av brønnen.

6. CTC klynge bryte og enkelt celle plukking for sekvensering

  1. Sørg for å arbeide med aseptisk løsninger og materialer for å opprettholde sterilitet under hele prosedyren.
  2. Klargjør enkelt PCR-rør eller en PCR-plate som skal inneholde enkeltcellene i den ødelagte klyngen med den totale 2,5 μL celle lysering oppløsning som består av 1 U/μL av RNA-hemmer.
  3. Raskt spinne ned løsningen til bunnen av røret. Plasser innskudds beholderne i mål 2 og hold ved 4 ° c.
  4. Utfør alle trinnene som er beskrevet i avsnitt 4 med micromanipulator for å sette opp micromanipulator.
  5. Start en ny plukking. Kapillær vil stoppe 0,05 mm over bunnen av platen og på toppen av den valgte CTC-klyngen på grunn av den interaktive plukking (manuell modus).
  6. Drei forsiktig knotten på joysticken med urviseren for å manuelt aspirer klyngen og den omgivende DPBS-løsningen. Dispensere pustende volum inkludert CTC-klynge ved forsiktig å dreie knotten på styrespaken mot klokken.
  7. Gjenta aspirasjon/avhending av CTC-klyngen beskrevet i trinn 6 til de enkelte cellene som danner klyngen, brytes fra hverandre.
    Merk: for mye dosering vil utløse Airgap av sprøyten som danner bobler i løsningen og kompromittere synligheten.
  8. Følg etter øyet plasseringen av enkeltceller. Legg partiklene manuelt ved hjelp av knappen på styrespaken eller manuelt velge fra menyen.
    Merk: flere valg av enkeltceller vil føre til dannelsen av en plukkliste. Partiklene vil bli plukket og avsatt en etter en i påfølgende PCR rør/brønner (se Seksjon 4.22.6). Interaktiv modus (manuell modus) vil imidlertid stoppe kapillær rett før aspirasjon, derfor, slik at eksperimentator å kontrollere dette kritiske trinnet og for å sikre vellykket plukking.
  9. Velg Plukk aktiverte partikler for å starte plukkingen.
    Merk: mengden av celle lysering løsning vil tillate en enkelt celle til helt lyse. Men lang eksponering av lysert innhold til lysering agent kan svekke DNA eller mRNA. Derfor gå umiddelbart til neste trinn.
  10. Umiddelbart lukke røret som inneholder den plukkede enkelt celle og overføre på tørr is for snap frysing.
  11. Raskt spinne røret og se etter fravær av dråper på sidene av røret for å sikre en riktig lyse av avsatt celle.
  12. Gjenta fra trinn 5 for å starte en ny plukking.
    Merk: mikroskop fasen vil bevege seg fra en tilsatt partikkel til en annen ved den hastigheten som er beskrevet i avsnitt 4.23.1. CTC suspensjon i ultra-lav festeplate kan bevege seg, forårsaker feil plukking på grunn av mispositioning.

7. CTC isolasjon for mus injeksjon

  1. Sørg for å arbeide med aseptisk løsninger og materialer for å opprettholde sterilitet under hele prosedyren.
  2. Klargjør et PCR-rør med 5 μL steril 1x DPBS.
  3. Raskt spinne ned løsningen til bunnen av røret. Plasser innskudds beholderne i mål 2 og hold ved 4 ° c.
  4. Innenfor innskudds innstillingene gjelder en endring på trinnet 4.22.6: sett maksimalt antall partikler innskudd per brønn til 1 000 og antall mål å fordele partikler til 1. Dette trinnet sikrer at de plukkede cellene vil bli deponert i samme rør for 1 000 ganger.
  5. Bruk bare den interaktive modusen (manuell modus) til å kontrollere Plukk trinnet nøyaktig og holde den plukkede løsningen fri for forurensende celler.
    Merk: Hvis det er behov for mer enn 1 000 celler, kan du øke antall mål for å fordele partikler for å unngå tap av prøve etter 1 000 celler.
  6. Fortsett trinnene i del 4,26 for å starte en ny plukking. Gjenta trinn 6 for å utføre flere pickings. Kommenter antall celler som samles ved hver plukking, for å holde oversikt over antall celler som er tilgjengelige for muse injeksjonen.
  7. På slutten av plukkingen, sentrifuger røret ved 72 x g for 4 min (se pkt. 3,1.) og aspirer supernatanten.
  8. Resuspend de innsamlede CTC inn i buffer av valget, egnet for mus injeksjon. For bryst fett pad injeksjon, resuspend de innsamlede CTC i 1 til 1 ratio av 1x DPBS og rekonstituert kjeller membran ekstrahert, og holde på 4 ° c til injeksjon. For intravenøs injeksjon, resuspend kun de innsamlede CTC i DPBS.
    Merk: volumet av løsningen avhenger strengt av antall CTC som vil bli injisert. Det anbefales å injisere i bryst fett puten eller intravenøst maksimalt 100 μL per mus. Når du beregner volumet, bør du alltid vurdere det døde volumet for manipulering og sprøyte lasting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterte arbeidsflyten tillater utarbeidelse av individuelle CTC, enten fra enkelt CTC eller separert fra CTC-klynger. CTC fra pasienter eller tumor-bærende mus er beriket av hele blod med tilgjengelige CTC-berikelse metoder og deretter farget med antistoffer mot kreft-assosiert markører (f. eks, EpCAM, grønn) og WBC-spesifikke markører (f. eks, CD45, rød) (figur 1a ). Beiset CTC produktet blir deretter overført til mikromanipulering stasjon var individuelle celler er plukket, avsatt i PCR rør eller multiwell plater og forberedt for nedstrøms analyse, inkludert single-celle sekvensering, in vitro kultur eller in vivo -analyser (figur 1B).

Påliteligheten til denne metoden er basert på riktig mål celle skille under manuell celle plukking. Live immunostaining med anti-EpCAM antistoffer visualiserer kreftceller i suspensjonen og muliggjør et nøyaktig skille fra CD45-positive hendelser (mest sannsynlig, WBCs) (figur 2a). Når riktig kalibrert og vedlikeholdt, CellCelector gir godt kontrollert celle manipulasjon. Presis CTC-isolering kjennetegnes ved aspirasjon av bare ønsket mål uten omgivende forurensende celler (RBC eller WBCs), som vist på bildene som er tatt før og etter at CTC-klynge aspirasjon (figur 2b, C).

Som beskrevet tidligere, viser CTC-klynger en mer metastatisk fenotype sammenlignet med matchet single CTC19. Likevel, om tilstedeværelsen av nærliggende celler er tilstrekkelig til å øke spredning rate av celler i klynger er ukjent. For å løse dette spørsmålet, 1009 enkelt CTC og 1008 CTC-klynger som spenner mellom 2-17 celler (med 89,5% av dem blir 2-5 celle klynger) avledet fra CTC-avledet BR16 cellelinje20 ble micromanipulated i individuelle brønner av 384-brønn ultra-lav festeplater. Antall aktive celler i hver brønn ble telt manuelt under mikroskopet og innspilt ukentlig. Alle analysene ble utført etter normalisering av celle tall (dvs. tre celle klyngen ble analysert som tre individuelle celler). Mislykkede kolonier var preget av mangelen på levende celler i brønnen på slutten av eksperimentet. Som mistenkt viste CTC-klynger økt overlevelse sammenlignet med enkelt CTC og gav opphav til celle kolonier innen 56 dager etter in vitro dyrking (figur 3a, 3b). Spesielt, CTC klynger viste også høyere spredning rate og dermed nådde høyere endelige celle tall (figur 3c), som indikerer at direkte kontakt med andre tumorceller har en innvirkning på både levedyktighet og spredning rate.

Til slutt gir vi enkelt celle RNA sekvensering data fra CTC direkte isolert fra brystkreftpasienter. Spesielt viser vi en t-distribuert Stokastisk nabo embedding (tSNE) av enkeltceller avledet fra enten enkelt CTC, CTC klynger eller CTC-WBC klynger (Figur 4). Denne tilnærmingen gjør det mulig å identifisere celler med lignende genuttrykk profil, samt skillet mellom celle populasjoner som avviker basert på uttrykk for bestemte gener.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av den eksperimentelle arbeidsflyten. (A) CTC er innhentet fra blodet av kreftpasienter eller mus kreft modeller, beriket ved hjelp av tilgjengelige metoder og merket med antistoffer for å diskriminere tumorceller (grønn) fra hvite blodlegemer (rød). (B) presis Mikromanipulering av CTC muliggjør flere prosedyrer og applikasjoner, for eksempel enkelt celle SEKVENSER, CTC-kultur eller in vivo -transplantasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Representative bilder av CTC før og etter mikromanipulering. (A) representative bilder av CTC avledet fra en CTC-avledet XENOGRAFT (NSG-CDX-BR16) og beiset med antistoffer anti-EpCAM (grønn) og anti-CD45 (rød) for å muliggjøre visualisering av CTC og hvite blodlegemer, henholdsvis. Forstørrelse 40x vises. (B, C) Mikromanipulering gir mulighet for nøyaktig separasjon av CTC fra uønskede celler som vist på bildene før (venstre) og etter (høyre) celle aspirasjon prosedyre. Forstørrelse 10x. Jo større synsfelt (B) og smalere synsfelt (C) vises henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 . Overlevelse og sprednings analyse av enkelt CTC-og CTC-klynger. Individuelle celler fra enkelt CTC eller CTC-klynger fra kultivert CTC-avledet BR16-celler ble micromanipulated inn i 384-brønn plater. (A) Kaplan-Meier plot som viser overlevelse sannsynligheten for seeded enkeltceller versus celle klynger. P< 0.0001 av parvis log-Rank test. (B) søylediagram som representerer andelen av koloniene som besto av levende celler på slutten av eksperimentet (dag 56). P< 0.0001 av chi-kvadrat test. (C) heatmaps visualisere normalisert celle nummer distribusjon i løpet av eksperimentet (dag 0, 8, 32, 56). Hver blokk representerer én Start celle, og heatmap viser antall celler per brønn ved en gitt timepoint. d = dag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . RNA-sekvenser med én celle. Visualisering av CTC RNA uttrykks data ved hjelp av t-Distributed Stokastisk nabo embedding (tSNE). Hver prikk representerer en enkelt celle avledet fra en enkelt CTC, en CTC-klynge eller en CTC-WBC-klynge. Fargene på prikkene tilsvarer giver-ID-en. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den molekylære karakterisering av CTC holder løftet om å forbedre vår forståelse av metastatisk prosess og veilede utviklingen av nye anti-metastasering terapier. Her gir vi en detaljert beskrivelse av protokollene som muliggjør CTC-mikromanipulering og nedstrøms analyse, inkludert både enkelt cellebasert funksjonelle analyser, gen uttrykks analyse og in vivo -transplantasjon for metastatisk potensial vurdering20.

Blant de mest kritiske trinnene i vår protokoll, mikromanipulering av CTC-beriket produkter som mål å få en enkelt celle oppløsning fra relativt heterogene celle suspensjoner, dvs tillater å nå de høyeste nivåene av renhet og for å forbedre kvaliteten på påfølgende funksjonelle eller molekylære analyser. En enkelt celle plukking av CTC har for eksempel gjort det mulig for oss og andre å undersøke CTC-heterogenitet (f.eks. forskjeller mellom enkelt CTC, CTC-klynger og CTC-WBC-klynger), både fra et molekyl synspunkt og fra perspektivet om å kunne vurdere metastasering-initiering evne. Mens vi generelt favoriserer celle plukking protokoller som tillater eksperimentator å manuelt isolere CTC (dvs. tillater for en høyere grad av fleksibilitet avhengig av egenskapene til individuelle mål), automatiserte løsninger er nå tilgjengelig for å lette celle plukking og for å akselerere CTC isolasjons prosessen i godt kontrollerte eksperimenter.

Når man vurderer enkelt celle mikromanipulering i forbindelse med CTC-analyse, er tiden en svært kritisk begrensende faktor. Siden vår protokoll er ment å bli gjennomført på levende celler, er det viktig å fortsette så raskt som mulig for å minimere endringer på grunn av den ex vivo miljøet, slik som oppregulering eller downregulation av gener som er kontekstavhengig. Sammenlignet med de eksisterende teknikkene for CTC-analyse, gir én celle mikromanipulering av levende CTC høyere fleksibilitet for nedstrøms analyse av valg, alt fra enkelt celle sekvenser til direkte funksjonelle analyser.

I dette manuskriptet tilbyr vi også nye data som fremhever viktige forskjeller mellom enkle og grupperte CTC ved micromanipulating og seeding mer enn tusen enkelt CTC-eller CTC-klynger (med en klart definert størrelse) fra en CTC-avledet cellelinje i individuelle brønner av en mikrotiterbrønnene plate. Først observerer vi at CTC klynger (dvs. tilstedeværelsen av nærliggende celler) er tilstrekkelig for å oppnå bedre overlevelse av seeded celler, støtter våre in vivo data antyder lavere apoptotisk UTBREDELSEN av CTC klynger på seeding på et fjerntliggende område 19. videre, selv ved normalisering for antall seeded celler, kreftceller dyrket som klynger vise mye høyere spredning priser, ytterligere forsterke konseptet som klynger CTC er svært effektiv metastasering bidragsytere.

Sammen presenterer vi spesifikke protokoller for CTC-analyse med det formål å fremme enkelt celle relaterte undersøkelser i CTC-feltet. I fremtiden forventer vi at disse protokollene kan være nyttig for CTC-relaterte undersøkelser, satsing mot en bedre forståelse av biologi som karakteriserer blod-borne metastasering i ulike krefttyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

N.A. og B.M.S. er oppført som oppfinnere i patentsøknader som er knyttet til sirkulerende tumorceller og behandling av kreft. N.A. er en betalt konsulent for farmasøytiske og forsikringsselskaper med en interesse i flytende biopsi.

Acknowledgments

Vi takker alle pasienter som donerte blod for våre studier, samt alle involverte klinikere og studere sykepleiere. Vi takker Jens Eberhardt, Uwe Birke og Dr. Katharina Uhlig fra ALS Automated Lab Solutions GmbH for kontinuerlig støtte. Vi takker alle medlemmer av Aceto laboratoriet for tilbakemeldinger og diskusjoner. Forskning i Aceto laboratoriet er støttet av European Research Council, EU, Swiss National Science Foundation, den sveitsiske kreft ligaen, Basel Cancer League, de to Cantons i Basel gjennom ETH Zürich, og Universitetet i Basel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70, (14), 5649-5669 (2010).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168, (4), 670-691 (2017).
  3. Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1, (1), 44-52 (2015).
  4. Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49, (6), 2206-2216 (2016).
  5. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9, (4), 274-284 (2009).
  6. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147, (2), 275-292 (2011).
  7. Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35, (10), 1216-1224 (2016).
  8. Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30, (5), 525-532 (2012).
  9. Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5, (6), 1022-1030 (2016).
  10. Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161, (1), 83-94 (2017).
  11. Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154, (3), 563-571 (2015).
  12. Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
  13. Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10, (3), 431-441 (2017).
  14. Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62, (3), 505-513 (2016).
  15. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158, (5), 1110-1122 (2014).
  16. Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (7), E854-E863 (2016).
  17. Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Cancer Research. 78, (4), 845-852 (2018).
  18. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
  19. Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176, (1-2), 98-112 (2019).
  20. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. (2019).
  21. Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment? Cancer Treatment Reviews. 41, (2), 144-150 (2015).
  22. Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12, (7), 685-691 (2015).
  23. Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, (9), e0138032 (2015).
  24. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (43), 18392-18397 (2010).
  25. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5, (179), 179ra147 (2013).
  26. Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35, (1), 122-128 (2004).
  27. Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108, (7), 1480-1487 (2013).
  28. Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339, (6119), 580-584 (2013).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, (4), 704-715 (2008).
  30. Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162, (2), 154-161 (2007).
  31. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, (6193), 216-220 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics