مقايسة معياريه وقابله للتطوير لدراسة الخلايا الغشائية ثلاثية الابعاد المشتقة من iPSC في المختبر

Bioengineering
 

Summary

يصف هذا الأسلوب ثقافة الخلايا البطانية المشتقة من iPSC كالاوعيه المجهرية ثلاثية الابعاد 40 perfused في منصة ميكروفلويدريك القياسية. تمكن هذه المنصة دراسة الانحدار الموجه للاوعيه الدموية في 3D ، بما في ذلك الانسمام وتثبيت براعم الاوعيه الدموية بطريقه قابله للتطوير وعاليه الانتاجيه.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

van Duinen, V., Stam, W., Borgdorff, V., Reijerkerk, A., Orlova, V., Vulto, P., Hankemeier, T., van Zonneveld, A. J. Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (153), e59678, doi:10.3791/59678 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البحوث الدوائية قبل السريرية للامراض الوعائية يتطلب في المختبر نماذج من الاوعيه الدموية التي هي القابلة للتعديل لفحص عاليه الانتاجيه. ومع ذلك ، فان نماذج الفرز الحالية في المختبر التي لديها إنتاجيه كافيه لا تكون لها سوي اهميه فسيولوجية محدوده ، مما يعوق ترجمه النتائج من المختبر إلى الجسم المجري. من ناحية أخرى, وقد أظهرت منصات ثقافة الخلايا ميكروفلويدريك صله فسيولوجية لا مثيل لها في المختبر, ولكن في كثير من الأحيان تفتقر إلى الانتاجيه المطلوبة, قابليه التحجيم والتوحيد. ونحن نظهر منصة قويه لدراسة الاوعيه الدموية من الخلايا البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان المستحثة (iPSC-ECs) في البيئة الخلوية ذات الصلة الفسيولوجية ، بما في ذلك الانصهار والتدرجات. يتم استزراع iPSC-ECs كما 40 الاوعيه الدقيقة 3D المجهرية ضد الكولاجين منقوشة-1 سقالة. عند تطبيق التدرج من العوامل الوعائية ، يمكن دراسة السمات الهامه لتولد الاوعيه ، بما في ذلك التمايز في الخلية الطرف والساق وتشكيل التجويف القابل للاستخدام. Perfusion مع الاصباغ التتبع الفلورسنت تمكن دراسة نفاذيه اثناء وبعد الانسمام من براعم الاوعيه. في الختام ، يظهر هذا الأسلوب جدوى ECs المستمدة من iPSC في اختبار الوعائية ثلاثية الابعاد موحده وقابله للتطوير التي تجمع بين الظروف الثقافية ذات الصلة الفسيولوجية في منصة التي لديها المتانة المطلوبة والقابلية لدمجها داخل البنية التحتية لفحص المخدرات.

Introduction

في نماذج المختبر تلعب دورا أساسيا في اكتشاف والتحقق من صحة أهداف جديده من المخدرات من امراض الاوعيه الدموية. ومع ذلك ، الحالية في المختبر نماذج الفرز التي لديها الانتاجيه الكافية فقط لها صله فسيولوجية محدوده1، مما يعوق ترجمه النتائج من المختبر إلى المجرية. التالي ، للمضي قدما في أبحاث المخدرات الوعائية قبل السريرية ، وتحسين في نماذج المختبر من الاوعيه الدموية اللازمة التي تجمع بين الفحص عاليه الانتاجيه مع البيئة الدقيقة الخلوية ثلاثية الابعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

وخلال العقد الماضي ، أحرز تقدم كبير في زيادة الاهميه الفسيولوجية لنماذج الاوعيه الدموية في المختبر. بدلا من زراعه الخلايا البطانية علي الأسطح المسطحة مثل البلاستيك الانسجه الثقافة ، يمكن ان تكون جزءا لا يتجزا من الخلايا البطانية في السقالات 3D ، مثل الليفيبين والكولاجين الهلام2. داخل هذه المصفوفات ، تظهر الخلايا البطانية النمط الظاهري ذات الصلة الفسيولوجية أكثر المرتبطة بتحلل المصفوفة وتشكيل التجويف. ومع ذلك ، هذه النماذج فقط إظهار مجموعه فرعيه من العديد من العمليات التي تحدث اثناء الموجات الوعائية كما العظة الهامه من البيئة الخلوية الدقيقة لا تزال تفتقر.

المنصات الثقافية الخلوية microfluidic هي مناسبه بشكل فريد لزيادة الاهميه الفسيولوجية للنماذج في المختبر من الاوعيه الدموية. علي سبيل المثال ، يمكن ان تتعرض الخلايا البطانية للإجهاد القص ، وهو محفز نشاط هام للاوعيه الدموية. أيضا ، وامكانيه التحكم في السوائل مكانيا داخل ميكروفلويديكس يسمح لتشكيل التدرجات الجزيئية الحيوية3،4،5،6. هذه التدرجات تلعب دورا هاما في الجسم الخارجي اثناء تشكيل وزخرفه اثناء الاوعيه. ومع ذلك ، في حين أظهرت منصات ثقافة الخلايا ميكروفلويديك الصلة الفسيولوجية لا مثيل لها علي التقليدية 2d و 3d أساليب ثقافة الخلية ، وانها غالبا ما تفتقر إلى الانتاجيه اللازمة ، والتدرجية والتوحيد القياسي المطلوب للكشف عن المخدرات 7. أيضا ، العديد من هذه المنصات ليست متاحه تجاريا وتتطلب المستخدمين النهائيين لتصنيع أجهزتهم قبل استخدام8. هذا لا يتطلب فقط جهاز التصنيع والمعرفة التقنية ، ولكن أيضا يحد من مستوي مراقبه الجودة ويؤثر سلبا علي استنساخ9.

حتى الآن ، تظل الخلايا البطانية البشرية الاوليه هي مصدر الخلايا الأكثر استخداما علي نطاق واسع لنموذج تولد الاوعيه في المختبر10. ومع ذلك ، فان الخلايا البشرية الاوليه لديها عدد من القيود التي تعيق تطبيقها الروتيني في نهج الفرز. أولا ، هناك امكانيه محدوده لزيادة وتوسيع الثقافات المشتقة من الخلايا الاوليه. التالي ، بالنسبة للتجربة الواسعة النطاق ، يلزم استخدام دفعات من جات مانحه مختلفه ، مما ينتج عنه اختلافات جينيه واختلافات بين الدفعات والدفعات. ثانيا ، بعد بضع مقاطع ، تفقد الخلايا البطانية الاساسيه عموما الخصائص ذات الصلة عند استزراعها في المختبر11،12.

الخلايا البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان المستحثة (iPSC) هي بديل واعد: انها تشبه الخلايا الاوليه ، ولكن مع النمط الجيني أكثر استقرارا التي هي أيضا قابله للتحرير الجينوم دقيقه. وعلاوة علي ذلك ، فان iPSCs قادره علي التجديد الذاتي ، التالي يمكن توسيعها بكميات غير محدوده تقريبا ، مما يجعل الخلايا المشتقة من Ipscs بديلا جذابا للخلايا الاوليه للاستخدام داخل نماذج الفحص الأنبوبي13.

هنا ، ونحن وصف طريقه للثقافة الخلايا البطانية كما الاوعيه المجهرية 3D القابلة للاستخدام في نظام موحد ، وارتفاع الانتاجيه ميكروفلويدريك خليه ثقافة. يتم تطبيق perfusion عن طريق وضع الجهاز علي منصة الروك ، والذي يضمن عمليه قويه ويزيد من قابليه الفحص. كما يتم باستمرار perfused أوعيه الدقيقة ويتعرض لتدرج من العوامل الوعائية ، يتم دراسة تنتشر وعائي في البيئة الدقيقة الخلوية ذات الصلة أكثر الفسيولوجية. في حين ان البروتوكول متوافق مع العديد من مصادر مختلفه من (الابتدائية) الخلايا البطانية14,15, ركزنا علي استخدام الإنسان المشتقة ipsc ECs من أجل زيادة توحيد هذا الفحص وتسهيل اندماجها داخل البحوث المخدرات الاوعيه الدموية.

Protocol

1. اعداد الجهاز

  1. نقل الصفيحة ال384ه ميكروفلويديك إلى غطاء المحرك المعقم العقيم.
  2. أزاله الغطاء وأضافه 50 μL من المياه أو الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة في كل من ابار المراقبة 40 (الشكل 1b، جيدا B2) باستخدام ماصه متعددة القناات أو تكرار.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. اترك اللوحة مع الغطاء في خزانه الثقافة المعقمة في درجه حرارة الغرفة (RT).

2. اعداد هلام وطلاء

  1. اعداد 2.5 مل من 10 ميكروغرام/مل الفيبرونكتين جنيني (FN) طلاء الحل. تمييع 25 μl من 1 ملغ/مل الفيبرونكتين جنيني حل الأسهم في 2.5 مل من الخدمات التلفزيونية دولبيكو (dpbs ، الكالسيوم والمغنيسيوم الحرة). وضع الحل في حمام المياه في 37 درجه مئوية حتى الاستخدام.
  2. اعداد 100 μL من الكولاجين-1 الحل. أضافه 10 μL من HEPES (1 M) إلى 10 μL من ناهكو3 (37 g/L) وتخلط بواسطة الأنابيب. وضع أنبوب علي الجليد وأضافه 80 μL من الكولاجين-1 (5 ملغ/مل) لإنتاج الكولاجين تحييد-1 تركيز 4 ملغ/مل. استخدام ماصه لخلط بعناية وتجنب تشكيل فقاعات.
  3. أضافه 1.5 μL من الكولاجين-1 الحل (4 ملغ/مل) إلى مدخل هلام كل وحده ميكروفلويدريك (الشكل 1b، وكذلك B1). تاكد من وضع قطره من هلام في منتصف كل بئر من أجل هلام لدخول القناة (انظر الشكل 2a).
    ملاحظه: فاسيارشيل منع ملء القناات المجاورة وتمكن هلام زخرفه. يمكن تاكيد تحميل الهلام الصحيح تحت مجهر برايت فيلد عن طريق مراقبه تشكيل الغضروف المفصلي من خلال "نافذه المراقبة" (جيدا B2) أو عن طريق التقليب لوحه راسا علي عقب. إذا لم الهلام تماما ملء القناة ، يمكن أضافه قطره اضافيه من 1 μL.
  4. وضع لوحه ميكروفلويديك في حاضنه (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2) لمده 10 دقيقه لتتبلمر الكولاجين-1.
    ملاحظه: توقيت البلمره أمر حاسم; بسبب الاحجام المنخفضة المستخدمة في ميكروفلويديكس ، ويمكن بالفعل ان يلاحظ التبخر بعد 15 دقيقه من الحضانة ، مما يؤدي إلى انهيار هلام أو انكماش.
  5. تاخذ لوحه من الحاضنة ونقل إلى غطاء المحرك العقيم التدفق.
  6. أضافه 50 μl من 10 ميكروغرام/مل الحل طلاء الجبهة الكهربائية الخاصة إلى مخرج جيدا من قناه ترويه الأعلى من كل وحده ميكروفلويدريك (الشكل 1b، وكذلك A3). اضغط علي طرف الماصة علي جانب البئر لملء البئر بشكل صحيح بدون تراكب فقاعات الهواء (انظر الشكل 2 ب). يجب ان تملا القناة ، وينبغي ان السائل دبوس علي منفذ (جيد C1) دون ملء منفذ جيدا.
  7. ضع الطبق في الحاضنة (37 درجه مئوية ، 5% CO2) لمده يومين علي الأقل.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ، حيث ان جل الكولاجين-1 مع خليط الطلاء مستقر لمده 5 أيام علي الأقل في الحاضنة. إذا تم تحديث خليط الطلاء ، يمكن ان تكون فترات أطول ممكنة ، ولكن لم يتم اختبار هذا. الحاسم هو مستوي طلاء FN ، لان هذا يمنع الجفاف من هلام الكولاجين 1.

3. الخلية البذر/الثقافة المجهرية

  1. أضف 5 مل من مصل العجل الجنيني و 2.5 مل من القلم/العقديات إلى 500 مل من الخلايا البطانية القاعدية المتوسطة وتعقيم الفلتر باستخدام فلتر اعلي للزجاجة بحجم مسامي 0.22 μm. يشار إلى هذه الوسيطة الآن كوسيط قاعدي.
  2. اعداد متوسط نمو الاوعيه الدموية: أضافه 3 μL من 50 ميكروغرام/مل عامل نمو بطانة الاوعيه الدموية (VEGF) و 2 μL من 20 ميكروغرام/مل عوامل النمو الليفية الاساسيه (bFGF) إلى 5 مل من المتوسطة القاعدية.
  3. ذوبان iPSC-ECs المجمدة بسرعة (< 1 دقيقه) في 37 ° Cwater حمام ونقل إلى أنبوب 15 مل وتمييع في 10 مل من المتوسطة القاعدية.
  4. عد الخلايا.
    ملاحظه: قارورة واحده تحتوي علي 1,000,000 الخلايا في 0.5 mL مع > 90% القدرة علي البقاء.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 100 x g لمده 5 دقائق يستنشق ماده طافي دون إزعاج الخلية بيليه وأعاده التعليق في المتوسطة القاعدية لتسفر عن تركيز 2 × 107 خلايا/مل.
  6. نقل الصفيحة ال384ه ميكروفلويديك من الحاضنة إلى غطاء المحرك المعقم العقيم.
  7. الشفط الجبهة التي طلاء الحل من مدخل ترويه (بئر A1). أضافه 25 μL من المتوسطة القاعدية في الآبار مدخل (جيدا A1).
  8. أضافه قطره 1 μl من تعليق الخلية إلى كل مدخل ترويه اعلي جيدا (الشكل 1b، جيدا A1). يجب ان تتمدد القطرة في بضع ثوان (انظر الشكل 3 ا ، ب لتوضيح طريقه "الضخ السلبي").
    ملاحظه: الاختيار تحت المجهر ما إذا كان البذر متجانسة. إذا لم يكن كذلك ، أضافه 1 μL آخر في ماخذ والانتظار حتى التسطيح الحبريه.
  9. احتضان ميكروفلويديك لوحه بئر ل 1 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2. بعد ذلك ، يجب ان تكون الخلايا التمسك. إذا لم يكن كذلك ، انتظر 30 دقيقه أخرى.
  10. أزاله المتوسطة القاعدية من الآبار منفذ ترويه الأعلى (الشكل 1b، جيدا A3). أضافه الدافئة ثقافة السفينة المتوسطة في مدخل ترويه الأعلى ومخرج (الشكل 1b، الآبار A1 و A3). وضع لوحه علي منصة الروك (تعيين علي 7 درجه زاوية ، 8 دقائق هزاز الفاصل الزمني) في الحاضنة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2).
  11. صوره لوحه باستخدام المجهر برايلد مع المرحلة الألى في اليوم 1 و 2 بعد البذر لتاكيد سلامه الخلية. بعد يومين ، يجب ان يكون متموج أحادي الطبقة ضد سقالة الكولاجين-1.
    ملاحظه: إذا كانت القناات لا يبدو ان متموج علي قدم المساواة ، يمكن استزراع الاوعيه الدقيقة لمده 24 ساعة اضافيه.

4. دراسة التوجيه الوعائي بما في ذلك تلميح-والساق-تشكيل الخلية

  1. اعداد 4.5 mL من المتوسطة الوعائية تنتشر عن طريق المكمل المتوسط القاعدي مع 4.5 μl من vegf (50 ميكروغرام/مل الأسهم) ، 4.5 μl من phorbol 12-myristate-13-خلات (نقدا) (2 ميكروغرام/مل الأسهم) ، و 2.25 μl من سفينغوزين-1-فوسفات (S1P)
  2. اعداد 8.5 مل من متوسط نمو السفينة (المتوسطة القاعدية تستكمل مع 30 ng/mL VEGF و 20 نانوغرام/مل bFGF).
  3. يستنشق المتوسطة من الآبار وأضافه 50 μl من المتوسطة ثقافة السفينة الطازجة في مدخل ترويه الأعلى والآبار منفذ وهلام مدخل ومنفذ الآبار (الشكل 1b، الآبار A1 ، A3 ، B1 و B3).
  4. أضافه 50 μL من خليط تنبت في الاوعيه لكل من مدخل القناة السفلية والآبار منفذ (الشكل 1b، الآبار C1 و C3).
  5. وضع الجهاز مره أخرى في الحاضنة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2) علي منصة الروك من أجل تشكيل التدرج من عوامل النمو الوعائية.
  6. صوره 1 يوم و 2 أيام بعد أضافه عوامل النمو الوعائية باستخدام مجهر برايلد مع المرحلة المؤتمتة.
    ملاحظه: مواصله زراعه الاوعيه الدقيقة لدراسة الانسمام (انتقل إلى القسم 5) أو إصلاح ووصمه عار الاوعيه الدقيقة لقياس طول التوجيه والمورفولوجية في اليوم 2 واليوم 6 (انتقل إلى القسم 6).

5. دراسة اناستاوسيس والاستقرار برعم

  1. صوره باستخدام مجهر برايلد مع المرحلة المؤتمتة.
  2. أضافه 1 μl من فلوريسسينتلي المسمية الزلال (0.5 ملغ/مل) إلى مدخل ترويه الأعلى (الشكل 1b، وكذلك A1) وتخلط باستخدام ماصه 50 μl.
  3. نقل لوحه إلى المجهر الفلورسنت مع المرحلة المؤتمتة ومجموعه حاضنه في 37 درجه مئوية. تعيين المجهر في 10x الهدف والتصحيح إعدادات التعرض (علي سبيل المثال ، tetramايثيل الروامين [TRITC]-قناه ، 20 ms التعرض). احصل علي صور بفواصل زمنيه كل دقيقه لمده 10 دقائق.
  4. أزاله لوحه من المجهر ونقل لوحه إلى غطاء المحرك العقيم التدفق.
  5. أزاله كل المتوسطة من الآبار واستبدال كل من المتوسطة ثقافة السفينة والمتوسطة الموجهة الوعائية في الآبار المناظرة (انظر الخطوات 4.3 و 4.4).
  6. وضع الجهاز مره أخرى في الحاضنة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2) لمواصله sprouting وعائي.
  7. كرر الخطوات 5.1 − 5.6 لدراسة نفاذيه في اليوم 6.

6. التثبيت ، تلطيخ ، والتصوير

  1. يستنشق جميع وسائل الاعلام الثقافة من جميع الآبار.
    ملاحظه: لا يؤثر المتوسط المتبقي أو السوائل الموجودة في القناات الصغيرة علي التثبيت نظرا لحجمه المنخفض من 1 − 2 μL.
  2. أضافه 25 μl من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الاذاعه التلفزيونية لجميع مدخل ترويه (الشكل 1b، A1 و C1) والآبار منفذ (الشكل 1b، A3 و C3). احتضان لمده 10 دقيقه في RT. ضع الجهاز تحت زاوية طفيفه (± 5 درجه) للحث علي التدفق (علي سبيل المثال ، عن طريق وضع جانب واحد من لوحه علي غطاء).
  3. الشفط PFA من الآبار. اغسل جميع مداخل ومنافذ الانصهار مرتين مع 50 μL من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS). يستنشق HBSS من الآبار.
  4. بيركابايز في RT لمده 10 دقيقه عن طريق أضافه 50 μl من 0.2% السطحي غير الايونيه لجميع مداخل ومنافذ ترويه.
  5. يستنشق السطحي غير أيوني من الآبار. اغسل قنوات الانصهار مرتين عن طريق أضافه 50 μL من HBSS إلى جميع الآبار المدخلة ومنافذ المخارج. يستنشق HBSS من الآبار.
  6. وصمه عار النوى باستخدام Hoechst (1:2000) و F-actin باستخدام phسبائك (1:200) في HBSS. اعداد 2.2 mL لوحدات 40 ، وأضافه 25 μl لكل مدخل ترويه ومخرج جيدا. وضع لوحه تحت زاوية طفيفه واحتضان في RT لمده 30 دقيقه علي الأقل.
  7. يغسل مرتين مع 50 μl من hbss في جميع مداخل ومنافذ ترويه.
  8. صوره مباشره باستخدام المجهر الفلورسنت مع المرحلة المؤتمتة أو تخزين لوحه محمية من الضوء في 4 درجه مئوية للاستخدام في وقت لاحق.

Representative Results

تتكون منصة ثقافة الخلية الثلاثية الابعاد ميكروفلويديك من 40 وحده ميكروفلويدريك المجهرية (الشكل 1a ، b) ، والتي تستخدم لدراسة القسطرة الوعائية للاوعيه المجهرية المستخدمة ضد الكولاجين المنقوش-1 هلام (الشكل 1a). وتستخدم هذه الاوعيه الدقيقة باستمرار وتتعرض لتدرج عوامل النمو الوعائية (الشكل 3a-d). يمكن ان تكون اما براعم وعائية درس 2 أيام بعد التعرض التدرج أو مثقف لأكثر من 5 أيام بعد التعرض التدرج لدراسة اناستاوسيس وتنبت الاستقرار (انظر الجدول الزمني ، الشكل 1d).

البذر iPSC-ECs باستخدام طريقه الضخ السلبية ينبغي ان يؤدي إلى كثافة البذر متجانسة (الشكل 4a ، b). الثقافة تحت التروية المستمرة أسفرت في متموج الاوعيه الدقيقة في 2 أيام ، مع الخلايا بطانة تماما محيط قناه ميكروفلويدريك وتشكيل أحاديه المتموج ضد هلام منقوشة الكولاجين-1.

وقد ادي التعرض لتدرج من عوامل الاوعيه الدموية إلى التوجيه الوعائي الاتجاهي للاوعيه المجهرية داخل هلام الكولاجين المنقوش-1 (الشكل 5a-g). واضحة تشكيل الخلية غيض والغزو في هلام الكولاجين-1 كان مرئيا 24 ح بعد أضافه التدرج الوعائي ، في حين كانت الخلايا ساق بما في ذلك تشكيل التجويف مرئية بعد 48 h (الشكل 5a).

بعد التثبيت وتلطيخ ، يمكن تصور الشبكة الشعرية باستخدام phalloidin وصمه عار F-actin واستخدام Hoechst 33342 لوصمه عار النواة (الشكل 5b ، c). ويمكن تحديد هذه البراعم كميا (علي سبيل المثال ، الشكل والطول14). دون أضافه عوامل النمو ، لا ينبغي ملاحظه اي غزو في هلام الكولاجين-1 (الشكل 5d). تم استخدام التصوير البؤري لتحديد قطر البرعم ولتاكيد تشكيل التجويف (الشكل 5e-g).

البراعم تستمر في النمو نحو اتجاه الانحدار والوصول إلى قناه ترويه المعاكس في غضون 3 − 4 أيام بعد أضافه عوامل النمو الوعائية. وهذا يؤدي إلى أعاده تشكيل شبكه الاوعيه الدموية ، مع انخفاض واضح في عدد براعم الاوعيه (الشكل 6a). تم تقييم تشكيل التجويف عن طريق الانصهار من شبكه الاوعيه الدموية مع الجزيئات المسمية فلوريسسينتلي (علي سبيل المثال ، الزلال أو dextrans). Perfusing الاوعيه الدقيقة مع 0.5 ملغ/مل ألبومين المسمي قبل وبعد اناستاموسيس كشفت عن وجود فرق واضح في تنبت نفاذيه بعد 10 دقيقه (الشكل 6b-e) ، مما يوحي بان الشعيرات الدموية استقرار وتنضج بعد اناستاموسيس.

Figure 1
الشكل 1: بروتوكول الاستزراع الخلوي المجهري للاوعيه المجهرية المشتقة من iPSC. (ا) يظهر الجزء السفلي من جهاز ثقافة الخلية ميكروفلويديك عرض الوحدات ميكروفلويديك 40 التي تتكامل تحت لوحه 384-حسنا. عرض أكبر يعرض واحده من وحدات ميكروفلويديك 40. (ب) توضع كل وحده ميكروفلوريك تحت 9 ابار بثلاثه ابار مدخل و 3 ابار منفذه. يتم فصل القناات ميكروفلويدريك بواسطة التلال (' فاسيارشيد ') ، والتي تمكن زخرفه من الهلام المائي في القناة المركزية (' قناه هلام ') في حين لا يزال هناك اتصال مع القناات المجاورة (' قنوات perfusion '). (ج) طريقه إلى الثقافة المجهرية perfused مستخدمه داخل الجهاز ميكروفلويديك ، والذي يستخدم لدراسة المتدرج يحركها الاوعيه الدموية من خلال مصفوفة الكولاجين-1 منقوشة. (د) الجدول الزمني لدراسة التوجيه الوعائي و/أو الانسمام. وقد عدل هذا الرقم من فان دوينين وآخرون14. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إجراءات التحميل لهلام والمتوسطة. (ا) أمثله علي ترسب الهلام الصحيح وغير الصحيح. نتائج الإيداع الصحيحة في هلام منقوشة الكولاجين-1 في القناة الوسطي ، والتي هي في وقت لاحق بلمره. (ب) أمثله علي الملء الصحيح وغير الصحيح لآبار الحفر. تمتلئ الآبار بالترتيب من 1 − 4 لمنع محاصره الفقاعات الهوائية داخل القناات الصغيرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تدفق الضغط الهيدروستاتيكي المستمر واستقرار التدرج. (ا) تؤدي الاختلافات في الضغط الهيدروستاتيكي بين الآبار إلى التسوية السلبية والتدفق داخل القناات الصغيرة. (ب) وضع الجهاز علي منصة الروك المحددة في 7 ° و 8 دقائق دوره الوقت نتائج في المستمر ، ثنائي الاتجاه ترويه داخل القناات ميكروفلويديك. (ج) يتم تشكيل التدرجات عن طريق إدخال تركيزين مختلفين داخل الآبار ، والتي يتم تحديثها باستمرار عن طريق التسوية السلبية. (د) التصور المتدرج باستخدام فلوريسئين ايزوثيسيانات (fitc)-ديكدكان. تدفق ثنائي الاتجاه يستقر التدرج حتى 3 أيام. شريط مقياس = 200 μm. وقد عدل هذا الرقم من فان دوينين وآخرون14. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: طريقه الضخ السلبية لبذر الخلايا. (ا) الضخ السلبي مدفوع باختلافات الضغط الناجمة عن الاختلافات في التوتر السطحي. وينتج عن ذلك تدفق القطرات (الضغط الداخلي المرتفع) نحو المكمن (الضغط الداخلي المنخفض). (ب) الفاصل الزمني لقطره (مخطط رمادي) يوضع علي راس المدخل (المخطط الأبيض) للقناه الصغريه (المخطط الأزرق). الحق بعد الاضافه (الشكل 4b ، i) ، وقطره علي راس يتقلص مدخل (الشكل 4b ، ii: 1 s بعد الاضافه ؛ iv: 2 ثانيه بعد الاضافه) ، مما يؤدي إلى تدفق نحو منفذ. ويستمر هذا حتى يتم تثبيت الغضروف الهلالي التجميعي بواسطة المدخل (الشكل 4b ، iv). شريط مقياس = 400 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التوجيه القوي ثلاثي الابعاد للاوعيه المجهرية iPSC-EC. (ا) التوجيه الخاص بالرابطة مع مرور الوقت. وقد نمت الاوعيه الدقيقة ل 48 h (الحق) ومن ثم حفز مع كوكتيل وعائية تحتوي علي 50 ng/mL VEGF ، 500 nM S1P ، و 2 نانوغرام/مل نقدا. الطرف الأول-الخلايا التي تغزو الكولاجين-1 سقالة (الأوسط) مرئية 24 ساعة بعد التعرض. الشمعات الاولي مرئية (الأسهم) 48 h بعد التعرض (الحق) في حين ان الخلايا غيض قد هاجرت أكثر في اتجاه التدرج. (ب) مجموعه من 15 من الاوعيه الدقيقة التي تم تحفيزها باستخدام VEGF و S1P ونقدا لمده يومين وملطخه ب f-actin (اصفر) ونوى (ازرق). شريط مقياس = 200 μm. (ج) حفز الاوعيه المجهرية (السيطرة الايجابيه). (د) الاوعيه المجهرية غير المحفزة (السيطرة السلبية). (ه) الحد الأقصى للإسقاط الشعرية واحده داخل الهلام. (و) نفس الشيء (ز) ولكنه يركز علي الوسط. يشير الخط المنقط إلى موضع العرض المتعامد في اللوحة g. قضبان المقياس (ا-د: 200 ميكرومتر ؛ البريد الكتروني: 20 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تصور نفاذيه الشعيرات قبل وبعد الانسمام. (ا) انسموسيس مع القناة القاعدية المشغلات تقليم ونضوج براعم الاوعيه. المقربة من السرير الشعرية في 2, 4, 6 و 7 أيام بعد التحفيز مع عوامل النمو الوعائي. (ب) البراعم الوعائية بعد يومين من أضافه عوامل النمو الوعائية. تتشكل براعم الاوعيه داخل هلام ، ولكن لم يتم توصيلها حتى الآن إلى القناة السفلية ترويه. (c) perfusion من الوعاء الصغير مع 0.5 ملغ/مل الزلال-اليكسا 555 الحل. الصور الفلورية التي تم الحصول عليها في 0 و 10 دقيقه (د ، ه) نفس كما في لوحات b و c ، ولكن بعد 7 أيام من التحفيز. يتم توصيل براعم إلى الجانب الآخر وشكلت ميكرومتموج في قناه ترويه القاعدية. قضبان المقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

المشكله يسبب حل
الكولاجين-1 لا يدخل أو يملا القناة تماما لا يتم وضع الكولاجين-1 قطره علي راس المدخل وضع بعناية قطره علي راس مدخل من قناه هلام
حجم الكولاجين-1 منخفض جدا استخدام 1.5 μL من هلام لملء القناة تماما
الكولاجين-1 لزج جدا استخدام دفعه أخرى من الكولاجين-1
الكولاجين-1 يتدفق إلى قنوات ترويه الكولاجين-1 هو الأنابيب مباشره في مدخل قناه هلام وضع بعناية قطره علي راس مدخل من قناه هلام
الكولاجين-1 ليست واضحة/تشكيل ألياف لا يتم تخزين الكولاجين-1 بشكل صحيح تخزين الكولاجين-1 في 4 درجه مئوية ، لا تجمد
نحكو3 و hepes ليست مختلطة جيدا قبل أضافه الكولاجين-1 اخلطي المزيج بعناية مع3 و hepes من خلال التنضيد قبل أضافه الكولاجين-1
لا يتقلص الحبريه باستخدام طريقه الضخ السلبي قطرات تلتصق بجانب البئر يستنشق قطره وأضافه قطره جديده علي راس مدخل
تاكد من ان المخرج ممتلئ بما لا يقل عن 20 μL متوسطه
لم يتم ملاحظه اي تنتشر لا يتم أضافه عوامل النمو أو لا يتم تخزين قسامات بشكل صحيح اعداد الوسط الجديد للاوعيه الدموية
فقاعات الهواء كتل الانصهار/تشكيل التدرج أزاله فقاعات الهواء باستخدام ماصه P20 أو P200
فروق الحجم بين الآبار يجب ان تكون وحدات التخزين في جميع الآبار متساوية من أجل تشكيل تدرج خطي
الخلايا غير قابله للاستمرار لوحه لم توضع علي منصة الروك/منصة الروك تحولت قباله تاكد من منصة الروك علي ولها دوره الحق الوقت/زاوية (8 دقيقه/7 درجه)
لا يمكن الانصهار بسبب وجود فقاعات الهواء أزاله فقاعات الهواء باستخدام ماصه P20 أو P200
لا يتم تشكيل شمعه ، تهاجر الخلايا كخلايا واحده تمت أضافه خليط القسطرة الوعائية قبل تشكيل أحادي الطبقة انتظر 24 ساعة اضافيه قبل أضافه عوامل النمو الوعائية
التباين الرئيسي في كثافة تنتشر الاختلافات في كثافة الخلايا بعد البذر تحقق مما إذا كانت كثافة الخلايا متجانسة وقابله للمقارنة بين وحدات ميكروفلويدريك. أضافه قطره أخرى من تعليق الخلية إذا لزم الأمر

الجدول 1: استكشاف أخطاء شائعه وإصلاحها.

Discussion

يصف هذا الأسلوب ثقافة الاوعيه المجهرية البطانية القابلة للاستخدام بال40 داخل منصة ثقافة خلايا ميكروفلويدريك قويه وقابله للتطوير. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية لاستزراع الخلايا ثنائيه الابعاد وثلاثية الابعاد ، فان هذه الطريقة تبين كيف يمكن الجمع بين البيئة الخلوية ذات الصلة الفسيولوجية التي تشمل التدرجات والتروية المستمرة مع ثقافة الخلايا ثلاثية الابعاد مع إنتاجيه كافيه للفحص اغراض.

واحده من المزايا الرئيسية علي مقارنه المقايسات ميكروفلوريك هو ان هذه الطريقة لا تعتمد علي مضخات للبيروفيوجن ولكن يستخدم منصة الروك للحث علي التروية المستمرة في جميع وحدات ميكروفلويدريك في وقت واحد. وهذا يضمن ان المقايسة قويه وقابله للتطوير: يمكن ان تكون الصفائح مكدسه علي منصة الروك. والاهم من ذلك ، تظل جميع الوحدات المجهرية قابله للتوجيه بشكل فردي ، وهو ما يسمح بتنفيذ هذه الطريقة ضمن فحص المخدرات بما في ذلك توليد منحني الجرعة والاستجابة. وعلاوة علي ذلك ، بدون مضخة ، والتصوير والاستبدال المتوسط هو ابسط بكثير مع مخاطر اقل من (الصليب)-التلوث.

ومن المزايا الأخرى لهذه الطريقة استخدام منصة موحده سابقه التصنيع ، بينما تحتاج منصات ثقافة الخلايا المجهرية القابلة للمقارنة إلى ان تكون ملفقه من قبل المستخدمين النهائيين. وييسر هذا التوافر اعتماد هذا الفحص بين مجموعات البحوث الاكاديميه والصيدلانية الأخرى ، مما يؤدي إلى التوحيد القياسي. أيضا ، علي عكس النماذج ميكروفلويديك ، واجهه لوحه 384 البئر يضمن التوافق مع المعدات المختبرية الحالية (علي سبيل المثال ، الطامحين ، معالجات لوحه والأنابيب متعددة القناات) ، وتسهيل التكامل داخل البنية التحتية الحالية الفرز .

هناك العديد من الخطوات الهامه في تنفيذ هذا الفحص. هلام الكولاجين-1 يجب ان تملا تماما قناه هلام. خلال التحميل هلام ، ويمكن ملاحظه هذا الحشو عن طريق التفتيش علي قنوات ميكروفلويدريك اما من خلال نافذه المراقبة (الشكل 2a) أو عن طريق التقليب لوحه راسا علي عقب (كما هو مبين في الشكل 1a). اثناء التعبئة ، يجب ان يبقي جل الكولاجين في القناة المركزية ، دون التدفق إلى القناات المتاخمة. لاحظنا ان نوعيه هلام الكولاجين-1 أمر حاسم لأداء الفحص السليم. الكولاجين-1 دفعات مع اللزوجة عاليه جدا سوف يؤدي إلى ملء غير مكتملة من قناه هلام. بعد 10 دقيقه من البلمره في 37 درجه مئوية ، يجب ان يكون هلام متجانسة وواضحة. إذا لم يتم تخزين الكولاجين-1 بشكل صحيح (علي سبيل المثال ، بسبب تقلب درجات الحرارة في الثلاجة) ، فان الكولاجين سوف تتبلمر داخل القناات مع تشكيل ألياف مرئية بوضوح. هذا يستطيع نتجت في غزوه من ال [اكس] داخل الهلام دون أضافه من عاملات وعائية, غير ان دون مناسبه تجويف تطوير.

عندما يتم البذر الخلايا ، يتم أزاله محلول طلاء الفيبرونكتين من الآبار ، وترك فقط القناات ميكروفلويديك مليئه محلول الطلاء. يمكن ان يسبب طموح محلول الطلاء من القناات ميكروفلويدريك الهلام اضطراب أو هلام الطموح. تعليق الخلية يحتاج إلى استبدال/أزاحه هذا الحل طلاء. هذا يعمل بشكل أفضل عندما يتم المصنفة تعليق الخلية باستخدام طريقه الضخ السلبي ، كما الماصات مباشره تعليق الخلية في القناات تظهر كثافة البذر اقل استنساخه.

وبما ان الاوعيه المجهرية تشكل طبقه أحاديه مستقره ضد الهلام ، فان هذه الاختلافات الصغيرة تؤدي فقط في أوقات مختلفه لازمه للوصول إلى كونفلوينسي. التالي ، يتم تحديد نقطه بداية الفحص بواسطة كونفلوينسي بدلا من وقت الثقافة. إذا لزم الأمر ، يمكن تمديد وقت الخياطة حتى يتم تشكيل أحاديه واضحة ضد الهلام.

داخل الآبار ، يمكن ان تكون المحاصرين فقاعات الهواء عن طريق ملء غير صحيح من الآبار (انظر الشكل 2b). هذه فقاعات الهواء سوف تحد من تدفق المتوسطة ، حتى عندما يتم وضع الجهاز علي منصة الروك ، ويؤدي إلى انهيار الاوعيه الدقيقة وتشكيل التدرج غير لائق. سيؤدي الضغط علي طرف الماصة ضد الجدار الجانبي للآبار إلى زيادة نجاح ملء البئر تماما. إذا كانت فقاعه الهواء محصورة داخل الآبار ، فيمكن ازالتها عن طريق إدخال طرف ماصه معقم برفق في أسفل الزجاج. فقاعات الهواء يمكن ان تحدث أيضا داخل القناات ميكروفلويديك. عندما تمت أزاله المتوسطة من الآبار ، وتبخر المتوسطة ملحوظ من القناات ميكروفلويديك بعد 30 دقيقه (بسبب احجام ميكروليتر داخل القناات). التالي ، يفضل اجراء التغييرات المتوسطة في أسرع ما يمكن. عندما يتم أضافه المتوسطة في قناه مع المتوسطة تبخرت ، سيتم المحاصرين فقاعات الهواء داخل القناات ميكروفلويديك. ويمكن أزاله هذه الفقاعات الهواء داخل القناات ميكروفلويديك يدويا عن طريق وضع ماصه P20 مباشره علي مدخل أو منفذ وإجبار المتوسطة من خلال ميكروفلويديك من البئر المعاكس. النجاح في أزاله فقاعات الهواء يؤدي إلى انخفاض صغير ولكن ملحوظ في حجم في البئر الأخرى. يسرد الجدول 1 الأخطاء الشائعة وكيفيه استكشافها.

عدم وجود مضخة هو الحد عند التصوير المستمر هو مطلوب ، ومنصة الروك يحد من المستخدم إلى الصورة في فترات زمنيه متسلسلة. وعلاوة علي ذلك ، فان الانصهار من المتوسطة في هذه المنصة يتكون من تدفق ثنائي الاتجاه مع مستويات منخفضه من الإجهاد القص ، في حين يتعرض الاوعيه الدموية في الجسم المجري إلى تدفق أحادي الجانب مع مستويات اعلي من الإجهاد القص. في حين اننا لا نلاحظ الآثار السلبية للتدفق ثنائي الاتجاه فيما يتعلق بالموجات الوعائية, تدفق هو التحفيز نشاط الهامه ويفضل التحكم فيها. ومع ذلك ، في حين ان هناك الاجهزه مضخة المتاحة تجاريا ، والتواصل مع لوحه 384 البئر لا تزال صعبه ومضخة الاجهزه تعيق بشده قابليه هذا الفحص.

امكانيه استخدام ipsc-ECs لدراسة تنتشر الوعائية يفتح فرصا جديده في نمذجة الامراض والبحوث المخدرات. وعلي النقيض من ECs الاوليه ، يمكن ان تتولد هذه الخلايا في كميات لا حدود لها تقريبا مع النمط الجيني مستقره وباستخدام تقنيات تحرير الجينوم ، يمكن توليد الخلايا التي بما في ذلك الضربات القاضية الجينات والطرق الاضافيه. ومع ذلك ، كما البروتوكولات للتمييز ECs من iPSC هي جديده نسبيا ، فانه لا يزال من غير الواضح ما يؤدي إلى iPSC-ECs التي تعكس أفضل ECs الاساسيه والأنواع الفرعية من EC هي أو يمكن ان تتولد. أيضا ، لا تزال هناك اسئله متبقية بشان صلتها. علي سبيل المثال ، هل لا يزال يحمل iPSC-ECs اللدونة التي هي نموذجيه للخلايا البطانية ؟ والي اي درجه الخلايا المشتقة iPSC الاستجابة والتفاعل مع بيئتهم الخلوية الصغيرة ؟ ويمكن استخدام المنصة الموحدة المعروضة هنا للرد علي بعض هذه الاسئله من أجل المزيد من التحقق من صحة استخدام ECs المشتقة من iPSC في المختبر.

سيكون الاتجاه المستقبلي الأكثر استقامة لهذا الفحص هو تكامل أنواع الخلايا الأخرى التي تلعب دورا هاما اثناء تولد الاوعيه ، مثل العجانات والضامة. وهذا سوف يسهل القدرة علي دراسة دور الضامة اثناء الانسمام بين براعم أو التزام pericytes بعد تشكيل الشعرية. أيضا ، فمن الممكن للثقافة مختلف أنواع الخلايا الأخرى داخل أو ضد مصفوفة خارج الخلية (علي سبيل المثال ، لقد أظهرنا ثقافة الخلايا العصبية والهياكل الظهاريه المختلفة مثل الأنابيب القريبة والأمعاء الصغيرة) ، والتي يمكن الجمع بينها وبين الاوعيه الدموية أسره التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة. وأخيرا ، سيكون من المثير للاهتمام لدراسة تنتشر الوعائية في الهلام المائي الاصطناعية ، كما تكوينها المحدد يزيد من توحيد المقايسة ويسمح توليف صلابة والدوافع ملزمه التي تؤثر علي التفاعلات الخلية مصفوفة.

في الختام ، يظهر هذا الأسلوب جدوى ECs المستمدة من iPSC في اختبار الوعائية ثلاثية الابعاد موحده وقابله للتطوير التي تجمع بين الظروف الثقافية ذات الصلة الفسيولوجية في منصة التي لديها المتانة المطلوبة والقابلية لدمجها داخل البنية التحتية لفحص المخدرات.

Disclosures

P. فولتو و t. Hankemeier هم مساهمون في ميتاس BV. ف. بورغدورف و ا. ريجريرك هم موظفو نكارديا BV. V. van Duinen, w. Stam, v. v. Orlova و A.J. van Zonneveld ليس لديهم اي إفصاحات.

Acknowledgments

وهذا العمل مدعوم جزئيا بمنحه بحثيه من برنامج "مير كيننيس" (المشروع رقم 114022501) الذي أعدته المنظمة الهولندية للبحوث والتنمية في مجال الصحة (ZonMw) ومنحه مؤسسه القلب الهولندية (CVON). اعاده.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-10 μL Electronic repeater pipette Sigma Z654566-1EA
1 M HEPES Gibco 15630-056
3-lane OrganoPlate Mimetas 4003-400B
4% PFA in PBS Alfa Aesar J61899
Basal culture medium NCardia
Collagen-1 Cultrex 3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL VWR 613-2071
dPBS Gibco 14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte VWR 613-2890
Fibronectin Sigma-Aldrich F4759-1MG 1 mg/mL in milliQ water
HBSS Gibco 14025-050
Hoechst Molecular Probes H3569 10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells NCardia
NaHCO3 Sigma S5761 37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini Mimetas Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep Sigma P4333
Phalloidin Sigma P1951 1 mg/mL in DMSO
PMA Focus-Biomolecules 10-2165 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P Ecehelon Biosciences S-2000 1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin Invitrogen A34786
VEGF Peprotech 450-32-10 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, (3), 211-224 (2006).
  2. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. 17-28 (2013).
  3. Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro. Biomaterials. 78, 115-128 (2016).
  4. Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs. Lab Chip. 15, (1), 301-310 (2015).
  5. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10, (7), e0133880 (2015).
  6. Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature. Experimental biology and medicine. 239, (9), 1264-1271 (2014).
  7. Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).
  8. Pagano, G., et al. Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions. Biomicrofluidics. 8, (4), 046503 (2014).
  9. Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, (7), 1224-1237 (2012).
  10. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21, (3), 425 (2018).
  11. Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8, 14361 (2017).
  12. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 111, (6), 1021-1046 (2014).
  13. Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs. Cell Stem Cell. 18, (3), 309-321 (2016).
  14. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22, (1), 157-165 (2019).
  15. Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids Barriers CNS. 15, (1), 23 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics