Elektrofysiologiska utredningar av Retinogeniculate och Kortikogeniculate Synapsefunktion

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi protokoll för beredning av akuta hjärn skivor som innehåller den laterala geniculate kärnan och Elektrofysiologisk undersökning av retinogeniculate och kortikogeniculate synapser funktion. Detta protokoll ger ett effektivt sätt att studera synapser med hög frisättning och låg frisättning sannolikhet i samma akuta hjärn skivor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von Engelhardt, J. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function. J. Vis. Exp. (150), e59680, doi:10.3791/59680 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den laterala geniculate kärnan är den första relästation för visuell information. Relä nervceller i denna thalamic Nucleus integrera input från retinal ganglion celler och projicera den till syn barken. Dessutom relä nervceller får uppifrån och ned excitation från cortex. De två huvudsakliga excitatoriska ingångar till relä nervceller skiljer sig i flera aspekter. Varje relä neuron får input från endast ett fåtal retinogeniculate synapser, som är stora terminaler med många release platser. Detta återspeglas av jämförbar stark excitation, reläet nervceller får, från retinal ganglion celler. Kortikogeniculate synapser, däremot, är enklare med få release platser och svagare synaptisk styrka. De två synapserna skiljer sig också i deras synaptiska kortsiktiga plasticitet. Retinogeniculate synapser har en hög release sannolikhet och därmed visa en kortsiktig depression. Däremot har kortikogeniculate synapser en låg frisättning sannolikhet. Kortikogeniculate fibrer korsa retikulära thalamic kärnor innan du anger den laterala geniculate kärnan. De olika platserna i retikulära thalamic kärnan (rostrally från den laterala geniculate kärnan) och optiska tarmkanalen (Ventro-lateralt från den laterala geniculate Nucleus) tillåter stimulerande kortikogeniculate eller retinogeniculate synapser separat med extracellulära stimuleringelektroder. Detta gör den laterala geniculate kärnan ett idealiskt hjärnområde där två excitatoriska synapser med mycket olika egenskaper som inkräkta på samma celltyp, kan studeras samtidigt. Här beskriver vi en metod för att undersöka inspelningen från relä neuroner och utföra en detaljerad analys av retinogeniculate och kortikogeniculate synapsefunktionen i akuta hjärn skivor. Artikeln innehåller ett steg-för-steg-protokoll för generering av akuta hjärn skivor av den laterala geniculate kärnan och steg för inspelning aktivitet från relä nervceller genom att stimulera optiska tarmkanalen och kortikogeniculate fibrer separat.

Introduction

Relä neuroner av den laterala geniculate Nucleus integrera och vidarebefordra visuell information till syn barken. Dessa nervceller får excitatoriska input från ganglionceller via retinogeniculate synapser, som ger den huvudsakliga excitatoriska enheten för relä nervceller. Dessutom, relä nervceller får excitatoriska ingångar från kortikala neuroner via kortikogeniculate synapser. Dessutom, relä nervceller får hämmande ingångar från lokala interneuroner och GABAergic nervceller i kärnan retikularis thalami1. Kärnan retikularis thalami är närvarande som en sköld mellan thalamus och cortex så att fibrerna projicerar från cortex till thalamus och i motsatt riktning måste gå igenom kärnan retikularis thalami2.

Retinogeniculate ingångar och kortikogeniculate ingångar Visa distinkta synaptiska egenskaper3,4,5,6,7,8. Retinogeniculate ingångar bildar stora terminaler med flera release platser9,10. I motsats till detta visar kortikogeniculate ingångar små terminaler med Single release Sites7. Dessutom, retinogeniculate synapser effektivt driva actionpotentialer av relä neuroner trots utgör endast 5 − 10% av alla synapser på relä nervceller3,8,11. Kortikogeniculate synapser, å andra sidan, fungera som en modulator av retinogeniculate överföringar genom att kontrollera membranet potential relä nervceller12,13.

Dessa två huvudsakliga excitatoriska ingångar till relä nervceller är också funktionellt olika. En framträdande skillnad är kortsiktig depression av retinogeniculate synapser och kortsiktig underlättande av kortikogeniculate synapser3,5,8. Kortsiktig plasticitet hänvisar till ett fenomen där synaptisk styrka förändras när synapsen är upprepade gånger aktiv inom en tidsperiod på några millisekunder till flera sekunder. Synaptisk frisättning sannolikhet är en viktig faktor som ligger bakom kortsiktig plasticitet. Synapser, med en låg initial release sannolikhet, Visa kortsiktig underlättande på grund av uppbyggnaden av ca2 + i presynapsen och därmed en ökning av release sannolikheten observeras vid upprepad aktivitet. I motsats, synapser med hög release sannolikhet visar vanligtvis kortsiktig depression på grund av utarmning av Ready-releasable blåsor14. I tillägg bidrar Desensibilisering av postsynaptiska receptors till den kortfristiga plasticityen i några kick-frigör probabilitysynapses8,15. Hög release sannolikhet och Desensibilisering av α-amino-3-hydroxy-5-metyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) receptorer bidrar till den framträdande kortsiktiga depressionen av retinogeniculate synapser. Däremot låg-release sannolikhet ligger till grund för kortsiktig underlättande av kortikogeniculate synapser.

I möss, den optiska tarmkanalen in i dorsala laterala geniculate Nucleus (dLGN) från caudolateral plats, medan kortikogeniculate fibrer in i dLGN rostroventrally. Avståndet mellan de två ingångarna möjliggör utredning av de enskilda egenskaperna hos två mycket olika excitatoriska ingångar inkräkta på samma cell. Här bygger vi vidare på och förbättrar en tidigare beskriven dissekeringsmetod där retinogeniculate och kortikogeniculate fibrer bevaras i akuta hjärn skivor3. Vi beskriver sedan den elektrofysiologiska utredningen av relä neuroner och stimulering av retinogeniculate och kortikogeniculate fibrer med extracellulär stimulering elektroder. Slutligen, vi tillhandahåller ett protokoll för fyllning av relä nervceller med biocytin och efterföljande anatomiska analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment godkändes av den statliga tillsyns panelen på djurförsök av Rhineland-Palatinate.

1. lösningar

  1. Dissektion lösning
    1. För att minska excitotoxicitet, förbereda en kolinbaserad lösning som ska användas under dissektion som presenteras här (i mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 kolinklorid, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2Po4, 0,5 CaCl2, 7 mgcl2, och 25 glukos. Förbered dissektionslösningen mindre än 1 vecka före experimentet.
  2. Inspelningslösning
    1. Förbered en konstgjord cerebral spinal Fluid (ACSF) lösning som innehåller (i mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCL, 2 CaCl2, 1 mgcl2, och 25 glukos. Tillsätt 50 μM D-APV och 10 μM SR 95531 hydrobromid att blockera N-metyl-D-asparat (NMDA) och GABAA -receptorer, respektive.
  3. Intracellulär lösning
    1. Förbered en intracellulär lösning som innehåller (i mM): 35 CS-glukonat, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, och 0,1 D-600 (methoxyverapamil hydroklorid). Justera pH till 7,3 med CsOH. Filter, alikvot, och förvara stamlösningen vid-20 ° c fram till användning.

2. dissektion

  1. Förbered två segment kammare, varav en är fylld med 100 mL av dissekera lösning och den andra med 100 mL inspelningslösning. Placera de två bägare i ett vattenbad (37 ° c) och bubbla lösningarna med carbogen i minst 15 min före dissektion.
  2. Fyll en Plastbägare med 250 mL av nära iskall (men inte fryst) dissekera lösning. Bubbla med carbogen minst 15 min före användning.
  3. Fyll en petriskål av plast (100 mm x 20 mm), där hjärnan dissektion kommer att utföras, med kallt dissekera lösning. Placera en bit filterpapper i locket på petriskål.
  4. Kyl ner dissektion kammaren av vibratome.
  5. Anesthetize en mus med 2,5% isofluran, e.g., i musen bur. Så snart musen inte svarar på en svans nypa, halshugga musen nära livmoderhalsen medulla och sänk huvudet i den iskalla dissektion lösning i basen av petriskål.
  6. Skär huden på huvudet från caudal till nasalt och hålla den i sidled med fingrarna för att exponera skallen. För att ta ut framhjärnan, först klippa skallen tillsammans med den bakre-främre mittlinjen, och sedan skära två gånger genom den koronala suturen och lambdoid suturen (figur 1a).
  7. Ta bort skallen mellan koronala suturen och lambdoid suturen så att storhjärnan exponeras. Skär luktbulben och separera förhjärnan från mellanhjärnan med ett fint blad (figur 1b). Ta bort hjärnan från skallen med en tunn spatel och placera den på filtrerpapper i locket på petriskål.
    Anmärkning: steg 2,6 och 2,7 ska utföras så snabbt som möjligt för att minska celldöd.
  8. För att bevara integriteten hos den sensoriska och kortikala ingångar till dLGN i hjärnan slice, separera de två hjärnhalvorna med en parasagittal snitt med en vinkel på 3 − 5 ° (figur 1c,D). Torka de mediolaterala planen för de två hjärnhalvorna genom att placera dem på filterpapperet och limma dem på skär stadiet med en vinkel på 10 − 25 ° från horisontalplanet (figur 1e).
  9. Placera scenen i mitten av metall buffertbrickan och häll försiktigt resten av den iskalla dissekera lösningen i buffertbrickan. Utför detta steg noggrant eftersom en stark Häll kan ta bort den inklistrade hjärnan (figur 1f).
  10. Placera buffertbrickan i det isfyllda facket, vilket hjälper till att bibehålla den låga temperaturen under dissektion. Skär 250 μm skivor med ett rakblad med en hastighet av 0,1 mm/s och en amplitud på 1 mm.
  11. Håll skivor i jordbrukskammaren fylld med syrat dissektion lösning vid 34 ° c i ca 30 min och låt skivorna återhämta sig i inspelnings lösningen vid 34 ° c i ytterligare 30 min.
  12. Efter återhämtning, ta bort segmentet håller kammaren från vattenbadet och hålla skivor i rumstemperatur (RT) tills används i experiment.

3. elektrofysiologi

  1. Dra pipetter med borosilikatglas kapillärer och en glöd tråds avdragare. Behåll resistansen hos inspelningpipetter vid 3 − 4 MΩ. Dra stimulerande pipetter med samma protokoll men Bryt spetsen något efter att du dragit för att öka diametern. Fyll på inspelningpipetter med den intracellulära lösningen och biocytin, medan du fyller stimulerande pipetter med inspelnings lösningen.
  2. Placera skivorna i inspelnings kammaren och parfymera skivorna med oxygenerad inspelningslösning vid RT. Kontrollera alla skivor och välj de som visar en intakt optiska tarmkanalen.
  3. Visualisera slice och celler med ett upprätt Mikroskop utrustad med infraröd differential interferens kontrast (IR-DIC) videomikroskopi.
    Obs: relä nervceller skiljer sig från interneuroner av deras större Soma storlek och mer primära dendriter (grenar framväxande från Soma). Interneuron Visa bipolär morfologi med en mindre Soma.
  4. Placera den stimulerande pipetten på segmentet innan du korrigerar cellen med inspelningspipett. För att undersöka retinogeniculate synapser, placera stimulerande pipett direkt på synnerven tarmkanalen, där Axon fibrer från retinal ganglion celler är paketerade (figur 2A). För att analysera kortikogeniculate synapser, placera den stimulerande elektroden på kärnan retikularis thalami, som är rostroventrally intill dLGN (figur 2b).
  5. När inspelningspipten är nedsänkt i inspelnings lösningen ska du använda ett 5 mV-spänningssteg för att övervaka pipettmotståndet. Ställ in hållningspotentialen på 0 mV och Avbryt offsetpotentialen så att hållströmmen är 0 pA.
  6. Närma sig cellen med inspelningspipett medan du applicerar ett positivt tryck. När pipetten är i direkt kontakt med cellmembranet, frigör det positiva trycket och Ställ in hållpotentialen till-70 mV. Applicera ett svagt minus tryck så att cellmembranet kan fästas på glaspipetten så att en gigaohms tätnings form (resistens > 1 GΩ). Kompensera pipettkapacitansen och öppna cellen genom att tillämpa negativa tryck pulser.
  7. För att undersöka synaptisk funktion, applicera 0,1 MS aktuella pulser (ca. 30 μA) via stimuleringspipetten. Om inga synaptiska svar observeras kan de stimulerande pipetter behöva bytas ut. Var försiktig när du placerar de stimulerande pipetter i en annan position så att den inspelade cellen inte förloras.
    Anmärkning: i exemplet inspelningar som visas i figur 2, Synaptic kortsiktig plasticitet undersöktes genom att stimulera optiska tarmkanalen eller kortikogeniculate fibrer två gånger med 30 MS Inter-stimulus intervall. Det Parade puls förhållandet (PPR) beräknades genom att dividera amplituden för den andra excitatoriska postsynaptiska strömmen (EPSC) med den första EPSC-kvoten (EPSC2/EPSC1). Varje stimuleringsprotokoll upprepades 20 gånger. EPSC-amplituden mättes från de 20 sweeps genomsnittliga strömmar. Tidsintervallet mellan varje upprepning var minst 5 s för att undvika kortsiktig plasticitet inducerad av repetitioner.
  8. Övervaka serie motståndet kontinuerligt genom att använda ett 5-mV spännings steg. Använd endast cellerna med serie motståndet mindre än 20 MΩ för analys.

4. biocytin märkning

  1. Bibehålla hela cellen konfiguration för minst 5 min att tillåta diffusion av biocytin i distala dendriter.
  2. Efter inspelningen, ta försiktigt bort pipetten från cellen så att Soma inte förstörs.
    ANMÄRKNINGAR: om mer än en cell är inspelad på en skiva bör deras Somas vara tillräckligt borta från sina angränsande celler. Se till att dendriter från olika celler inte stör varandra under avbildning.
  3. Förbered en 24-brunn cellkultur tallrik. Fyll varje brunn med 300 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Var noga med att inte förorta något med PFA som kommer att vara i kontakt med de skivor som ska registreras.
  4. Överför skivorna från inspelnings kammaren till den PFA-innehållande plattan med en gummipipett och fixera skivorna över natten. Kontrollera att pipetten alltid förhindras från kontaminering med PFA.
    FÖRSIKTIGHET: bär alltid handskar och Använd en kemisk huva när du manipulerar PFA.
  5. Efter att ha fixerat skivor över natten i PFA, Ersätt PFA med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förvara skivorna i PBS vid 4 ° c för framtida bearbetning (mindre än 2 veckor).
  6. Tvätta skivorna med färsk PBS 3 gånger (10 min varje tvätt).
  7. Blockera icke-specifika bindningsställen genom att ruinera skivorna i den blockerande lösningen (0,2% nonjontensid och 5% bovint serumalbumin i PBS) för 2 timmar vid RT i orbitalskak.
  8. Kassera den blockerande lösningen. Inkubera skivorna med streptavidin-Alexa 568 utspädd i den blockerande lösningen (1:1000) vid 4 ° c över natten i orbitalskak.
  9. Kassera antikroppslösningen och tvätta skivorna 3 gånger med PBS i 10 minuter vid RT i orbitalskak. Tvätta skivorna med kranvatten före monteringen.
  10. Lägg skivorna från en mus på en glas bild. Se till att de färgade cellerna är närvarande på den övre ytan av skivorna. Absorbera vattnet runt skivorna med vävnader och sedan lämna skivorna att torka i ca 15 min.
  11. Applicera två droppar monteringsmedel på varje skiva. Montera en täckslip på bilden utan att producera luftbubblor.
  12. Förvara de märkta skivorna vid 4 ° c efter visualisering med ett konfokalmikroskop.

5. cellulär avbildning och återuppbyggnad

  1. Skanna skivor med ett konfokal Mikroskop och använda den tillhörande programvaran för analys.
  2. Excitera fluorescensen vid 561 nm.
  3. Bild skivorna med 0,7 numerisk bländare (NA), oljeimmersion mål.
  4. Justera målcellen i mitten av vyn och tillämpa en 2,5 gånger förstoring.
  5. Återge Z-stack datauppsättningar för att skanna hela neuron med följande parametrar: format = 2 550 x 2 550 pixlar, skanningsfrekvens = 400 Hz, Z antal = 40. Voxel storlek var runt 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 μm3.
  6. Semi-automatiskt spåra nervceller med hjälp av en neuronala återuppbyggnad programvara (t. ex., NeuronStudio). Ett exempel på en 3D spåras relä neuron visas i figur 3b.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Segmentet beredning av dLGN som innehåller retinogeniculate och kortikogeniculate vägar visas under en 4x mål (figur 2). Axoner av retinala ganglionceller bunt tillsammans i optiska tarmkanalen (figur 2). Den stimulerande pipetten placerades på syn-tarmkanalen för att inducera retinogeniculate Synapse-medierad ström (figur 2A) och på Nucleus retikularis thalami att inducera kortikogeniculate synapses-medierad ström (figur 2b), respektive. Notera, axoner från kortikala nervceller att LGN neuroner projekt från cortex till thalamus korsa kärnan retikularis thalami. Kortikogenicluate synapser kan därför aktiveras genom stimulering i kärnan retikularis thalami.

Den Parade puls förhållandet av AMPA receptor-medierad EPSCs är under 1 när stimulera optiska tarmkanalen med 30 MS Inter-stimulus intervall, men ovan 1 när stimulera kortikogeniculate fibrer med samma Inter-stimulus intervall (figur 2C,D) . Den Parade-Pulse depression av retinogeniculate synapser beror på en hög vesikel release sannolikhet och Desensibilisering av postsynaptiska AMPA-receptorer. Den Parade puls underlättande av kortikogeniculate synapser är förenlig med en låg vesikel release sannolikhet16.

Figur 3a visar IR-DIC bild som visar Soma av en dlgn Relay neuron tillsammans med spetsen på plåstret pipetten. Biocytin färgning gör att vi kan få en bild av den inspelade neuron. Skiljer från interneuroner, som har bipolär morfologi, relä nervceller har multipolär dendritiska arbors (figur 3b) som innehåller mer än 3 primära dendriter8,17. Tredimensionell (3D) rekonstruktion av en biocytin-märkt relä neuron sedan genereras som visar en radiellt symmetrisk dendritiska arkitektur (figur 3c).

Figure 1
Figur 1 : Scheman som representerar dissekeringsprotokollet. (A) horisontell bild av mus skallen, som visar positionen för de ursprungliga styckningsdelarna. Det första snittet utfördes tillsammans med sagittal suturen, följt av ytterligare två nedskärningar tillsammans med koronala suturen och lambdoid suturen, respektive. Streckade linjer representerar snitt. (B) sagittal syn på hela hjärnan. Streckade linjer indikerar att storhjärnan är isolerad från luktbulben och mitthjärnan. (C-D) Dessa paneler visar den första skärvinkeln för att separera de två halvkloten från horisontell (C) och Koronal (D) vy. EKoronal syn på ett halvklot på skär stadiet. Streckade linjer indikerar skivning. l, m, d, och v representerar de laterala, mediala, dorsala och ventrala aspekter, respektive, för halvklotet i paneler D och E. (F) diagram över dissektion kammare med två halvklot på skär stadiet. Den streckade pilen indikerar skär bladets rörliga riktning. a, p, och d representerar främre, bakre, och rygg aspekter av vänster hjärnhalva, respektive. Gsystem som representerar en korrekt skuren skiva med en relativt stor del av dlgn och intakt konservering av optiska tarmkanalen. dLGN, dorsala laterala geniculate Nucleus; vLGN, ventrala laterala kärnan; OT, luktbulben; NRT, Nucleus retikularis thalami. Panelerna C, D och G har modifierats från figur 1 i Turner och salt3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Skiva beredning av dLGN som innehåller retinogeniculate och kortikogeniculate vägar och exempel inspelningar. (a-B) Dessa paneler visar en dLGN slice med bevarande av retinogeniculate och kortikogeniculate ingångar. Stimuleringen elektroden placerades på syn-tarmkanalen för att aktivera retinogeniculate synapser (a) och på kärnan retikularis thalami att aktivera kortikogeniculate synapser (B). C) AMPA-receptormedierad epscs som svar på stimulering av optiska tarmkanalen två gånger med 30 MS Inter-stimulus intervall. D) kortikogeniculate synapsemedierade strömmar med 30 MS Inter-stimulus-intervall. Stimulans artefakterna togs bort för tydlighetens skull. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Morfologisk analys av en relä neuron. (A) IR-DIC bild som visar Soma av en dlgn relä neuron med spetsen på plåstret pipett. (B) konfokal bild av ett relä neuron märkt med biocytin och visualiseras med streptavidin-Alexa 568. (C) tredimensionell (3D) rekonstruktion av samma neuron, som visar en radiellt symmetrisk dendritiska arkitektur. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver ett förbättrat protokoll baserat på en tidigare publicerad metod3, som gör det möjligt för utredning av den höga sannolikheten för frisättning retinogeniculate synapser och låg sannolikhet för frisättning kortikogeniculate synapser från samma segment. Detta är av stor betydelse eftersom dessa två ingångar samverkar med varandra för att modulera den visuella signalen överföring: retinogeniculate ingångar är de viktigaste excitatoriska enhet av relä nervceller, medan kortikothalamic ingångar fungerar som en modulator, som påverkar vinsten av retinogeniculate överföring genom att påverka tillståndet av relä nervceller. Som förväntat, vi observerade att retinogeniculate och kortikogeniculate synapser Visa olika kortsiktiga plasticitet på grund av skillnaden i deras release sannolikheter. Dessutom, AMPA receptor desensibilisering bidrar också till den starka depressionen i retinogeniculate synapser9,15,16. Vi har nyligen visat att kortsiktig depression moduleras av CKAMP4416, en AMPA receptor hjälp protein i ckamp familj som saktar återhämtningen från Desensibilisering av AMPA-receptorer18,19, 20. vidare, retinogeniculate Synapse-medierade nuvarande amplituder är högre än de kortikogeniculate Synapse-medierade strömmar under samma stimulerande styrka, i överensstämmelse med de stora retinogeniculate synapser med flera frigöra platser, och relativt små kortikogeniculate synapser7,21.

Skivning protokollet är i huvudsak densamma som den som utvecklats av Turner och salt3. Vissa modifieringar som byggde på vår erfarenhet förbättrade segmentkvaliteten. Liknar Hauser et al.22, vi använde en kolin-baserade i stället för en sackaros-baserade dissektion lösning. Återhämtning efter dissektion gjordes vid 34 ° c i skär lösningen i 30 min och sedan i inspelnings lösningen i ytterligare 30 min och inte i rumstemperatur. Skivorna var något tunnare (250 μm istället för 400 μm). Vi dissekerade hjärnor med en kil med en vinkel på 10 − 25 °, vilket underlättar och ökar tillförlitligheten i skivning förfarande.

Inspelning och stimulering villkor för utredning av relä neuron synaps funktion är i huvudsak samma som tidigare beskrivits av Chen och Regehr8. Aktivering av optiska tarmkanalen fibrer vanligtvis framkallar stora strömmar och kan vara i intervallet flera nA när alla retinogeniculate synapser på en relä nervceller aktiveras23. För att förhindra serie resistens fel, särskilt när man undersöker den maximala strömmen genom att aktivera alla retinogeniculate synapser på en relä neuroner, Chen och Regehr används inspelning låg motstånd pipetter (< 2 MΩ). Emellertid, för att undersöka synaptisk kortsiktig plasticitet, det räcker att aktivera en eller några retinal ganglion cell axoner, som framkallar strömmar som är i intervallet 34 − 579 pA (opublicerade resultat, Chen et al.). Mindre pipetter med en resistans mellan 3 − 4 MΩ kan därför användas vid undersökning av retinogeniculate synapsefunktion med svag stimulering av synnerven tarmkanalen. Aktivering av kortikogeniculate synapser framkallar relativt små strömmar16. Serie resistens fel är därför ett mindre problem vid utredning kortikogeniculate synaps funktion.

Vi visar här att stimulering av retinogeniculate och kortikogeniculate synapser kan användas för att undersöka kortsiktig plasticitet av AMPA receptor-medierade strömmar. Samma protokoll kan tillämpas för att registrera NMDA receptor-medierad nuvarande24. I själva verket, en av de första indikationerna att AMPA receptor desensibilisering bidrar till den kortsiktiga plasticitet i retinogeniculate synapser kom från experiment där Parade-pulstal av AMPA receptor-medierade strömmar jämfördes med Parade-pulstal av NMDA-receptormedierade strömmar. Kortikogeniculate synapser stimulerades genom att positionera stimuleringspipetten i kärnan retikularis thalami eftersom axoner av kortikala nervceller som excitera dLGN relä nervceller färdas över denna thalamic kärna. Samma stimulering position kan användas för att studera hämmande synaptiska strömmar i dLGN som visas till exempel av Govindaiah och Cox25.

Relä nervceller uttrycka GABAA och GABAB -receptorer. Frisläppandet av GABA aktiverar Synaptic GABAA -receptorer. GABAB -receptorer, som är extrasynaptically lokaliserade, aktiveras när Nucleus reticularis thalami är starkt aktiverad till exempel under burst bränning26,27,28. Spridningseffekter av GABA, som är vanligtvis begränsad på grund av GABA upptag av astrocyter, kan aktivera under intensiv synaps aktivering av extrasynaptic GABAB -receptorer27,28. Vi har inte blockera GABAB -receptorer eftersom stimulering intensitet och frekvens var jämförbar låg. Emellertid, när undersöka kortikogeniculate synaps funktion med hjälp av intensiva stimulering protokoll det kan vara bättre att lägga till GABAB -receptorer.

Inspelningar av dLGN relä nervceller kan lätt utföras när du använder skivor som är cirka 2 mm medial från den laterala ytan av hjärnan (börja samla cirka 8: e av 250 μm skivor under skär förfarandet). I vissa skivor, inte båda ingångarna till en given relä neuron kan upptäckas eftersom en av de två vägarna är avbrutit nära reläet neuron. I detta fall är det oftast fortfarande möjligt att undersöka retinogeniculate och kortikogeniculate synapser i samma skiva genom att välja olika relä nervceller för varje ingång. För att spela in retinogeniculate synaps medierad ström, ventralt ligger relä neuroner väljs eftersom optiska tarmkanalen fibrer till dessa celler är mer sannolikt bevaras än i dorsalt ligger relä nervceller. I motsats, kortikogeniculate ingångar är mer sannolikt bevaras på relä nervceller som ligger dorsalt i dlgn.

Segmentkvaliteten avgör tillförlitligheten hos data. Utifrån vår erfarenhet är följande parametrar nödvändiga för att säkerställa en bra segment kvalitet. Kylning och syresättning är viktiga faktorer under dissekeringsproceduren. Musens huvud måste förvaras i kall lösning omedelbart efter att musen har halshuggning. När du tar hjärnan ur skallen, det bör vara nedsänkt i iskall lösning varje 3 till 4 s för att minska celldöd. På samma sätt bör skivning utföras vid cirka 4 ° c. Dessutom måste dissektion lösning och inspelningslösning syresatt minst 15 min före användning för att bibehålla tillräcklig syrekoncentration. Dessutom, blockerar natriumkanaler kan effektivt minska neuron aktivitet. Därför, en dissektion lösning som innehåller 37,5 mmol kolin användes.

Relä neuroner Visa låg tröskel spikar, som genereras av övergående ca2 + nuvarande29. För att blockera spännings gated ca2 +-kanaler, vi La D-600 (methoxyverapamil) till den intracellulära lösningen. D-600 bör inte användas om syftet med studien är att undersöka låg tröskel toppar i relä neuroner. Precisionen i hel cells spänningen klämma inspelningar påverkas av utrymme klämma fel. Detta tekniska problem är mer relevant för ingångar som är långt borta från inspelnings elektrod (alltså för distala synapser)30,31. För att minimera effekten av utrymmet klämma fel, vi använde en cs+-baserade i stället för en K+-baserad intracellulär lösning. Kanaler som är K+ genomsläpplig (t. ex. läckagekanaler) är vanligtvis cs+ ogenomtränglig32. Sålunda, användningen av en cs+-baserad intracellulär lösning ökar impedansen i cellen.

Stabil patch klämma inspelning beror på valet av friska celler. Nervceller med rund Soma form, mörk färg eller svullen Soma bör undvikas. Vidare, relä nervceller skiljer sig från den lokala interneuronen genom deras större Soma storlek och mer avancerade primära dendritiska arbors. Därför valde vi celler som har större Soma storlek (större än 15 μm i diameter) och icke-bipolär morfologi. Exempel cellen som visas i figur 3b har en symmetrisk dendritisk arkitektur och kan därför klassificeras som relä neuron som liknar Y-neuroner som till exempel återfinns i Cat LGN17.

Serie motståndet bör vara så liten som möjligt och underhållas konstant. Dessutom, eftersom indata från två riktningar bevaras i en sektor, är det viktigt att bli av med störningen mellan de två ingångarna. För att undvika att aktivera kortikogeniculate fibrer vid inspelning retinogeniculate synapsemedierade strömmar eller tvärtom, bör den stimulerande pipetten inte placeras i dLGN och avståndet mellan stimulerande och inspelningspipett bör vara så långt Möjligt. Dessutom kräver det långa avståndet mellan stimulerande och inspelningpipetter relativt intakt Axon-konservering. Därför måste en lämplig skärvinkel väljas för dissektion. I allmänhet kan endast en eller två skivor med bevarande av två ingångar erhållas från varje halvklotet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av den tyska Research Foundation (DFG) inom Collaborative Research Center (SFB) 1134 "funktionella ensembler" (J.v.E. och X.C.) och forskningsbidrag EN948/1-2 (J.v.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier  HEKA Elektronik EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG
CaCl2 EMSURE 1.02382.1000
choline chloride Sigma-Aldrich C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope Leica Microsystems TCS SP5
CsCl EMSURE 1.02038.0100
Cs-gluconate Self-prepared Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600  Sigma-Aldrich M5644-50MG methoxyverapamil hydrochloride
D-APV  Biotrend  BN0085-100 NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope Olympus XM10
EGTA SERVA 11290.02
Forene Abbvie 2594.00.00 isoflurane
Glucose Sigma-Aldrich 49159-1KG
HEPES ROTH 9105.2
High Current Stimulus Isolator World Precision Instruments A385
KCl EMSURE 1.04936.1000
MgCl2 EMSURE 1.05833.0250
Micromanipulators Luigs & Neumann SM7
Miroscope Olympus BX51
mounting medium  ThermoFisher Scientific P36930 Prolong Gold Invitrogen
NaCl ROTH 3957.1
NaH2PO4 EMSURE 1.06346.1000
NaHCO3 EMSURE 1.06329.1000
Pipette Hilgenberg 1807502
Puller Sutter  P-1000
razor blade  Personna  60-0138
Semiautomatic Vibratome Leica  Biosystems VT1200S
SR 95531 hydrobromide  Biotrend  AOB5680-10 GABAA-receptor antagonist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
  2. Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
  3. Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510, (3), 829-843 (1998).
  4. Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
  5. Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
  6. Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
  7. Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
  8. Chen, C., Regehr, W. G. Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 28, 955-966 (2000).
  9. Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
  10. Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
  11. Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
  12. Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. Thalamus. (1997).
  13. Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
  14. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Review of Physiology. 64, 355-405 (2002).
  15. Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
  16. Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
  17. Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
  18. von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
  19. Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
  20. Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
  21. Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
  22. Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
  23. Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
  24. Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
  25. Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
  26. Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
  27. Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
  28. Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
  29. Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
  30. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  31. White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
  32. Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics