Investigations électrophysiologiques de la fonction de synapse de rétinogeniculate et de Corticogeniculate

Neuroscience

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Summary

Ici, nous présentons des protocoles pour la préparation des tranches aigues de cerveau contenant le noyau génuulé latéral et l'investigation électrophysiologique de la fonction de synapses de rétinogeniculate et de corticogeniculate. Ce protocole fournit un moyen efficace d'étudier les synapses avec la probabilité de libération élevée et faible dans les mêmes tranches de cerveau aigus.

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Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von Engelhardt, J. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function. J. Vis. Exp. (150), e59680, doi:10.3791/59680 (2019).

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Abstract

Le noyau génuulé latéral est la première station de relais pour l'information visuelle. Les neurones relais de ce noyau thalamique intègrent l'entrée des cellules ganglionnaires rétiniennes et la projettent vers le cortex visuel. En outre, les neurones relais reçoivent l'excitation descendante du cortex. Les deux entrées excitatrices principales des neurones relais diffèrent à plusieurs égards. Chaque neurone de relais reçoit l'entrée de seulement quelques synapses de rétinogégénique, qui sont de grands terminaux avec beaucoup de sites de dégagement. Ceci est reflété par l'excitation relativement forte, les neurones de relais reçoivent, des cellules de ganglion rétinien. Les synapses corticogeniculate, en revanche, sont plus simples avec peu de sites de libération et une force synaptique plus faible. Les deux synapses diffèrent également dans leur plasticité synaptique à court terme. Les synapses rétinogeniculate ont une probabilité de libération élevée et par conséquent affichent une dépression à court terme. En revanche, les synapses corticogeniculate ont une faible probabilité de libération. Les fibres corticogeniculate traversent les noyaux thalamic réticulaires avant d'entrer dans le noyau génuulé latéral. Les différents emplacements du noyau thalamique réticulaire (rostoral du noyau génuulé latéral) et du tractus optique (ventro-lancé du noyau génuulé latéral) permettent de stimuler séparément les synapses de corticogeniculate ou de rétinogeniculate avec des électrodes de stimulation extracellulaires. Cela fait du noyau génique latéral une zone idéale du cerveau où deux synapses excitatrices avec des propriétés très différentes empiéchant sur le même type de cellule, peuvent être étudiées simultanément. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier l'enregistrement des neurones de relais et pour effectuer l'analyse détaillée de la fonction de synapse de retinogeniculate et de corticogeniculate dans les tranches aigues de cerveau. L'article contient un protocole étape par étape pour la génération de tranches de cerveau aigus du noyau latéral de géonulate et des étapes pour enregistrer l'activité des neurones de relais en stimulant le tractus optique et les fibres corticogeniculate séparément.

Introduction

Les neurones relais du noyau génuulé latéral intègrent et transmettent l'information visuelle au cortex visuel. Ces neurones reçoivent l'entrée excitatrice des cellules de ganglion par l'intermédiaire des synapses de rétinogeniculate, qui fournissent le disque excitateur principal pour des neurones de relais. En outre, les neurones de relais reçoivent des entrées excitatrices des neurones corticaux par l'intermédiaire des synapses corticogeniculate. En outre, les neurones relais reçoivent des entrées inhibitrices des interneurones locaux et des neurones GABAergic du noyau reticularis thalami1. Le noyau reticularis thalami est présent comme un bouclier entre le thalamus et le cortex de telle sorte que les fibres se projetant du cortex au thalamus et dans la direction opposée doivent passer par le noyau reticularis thalami2.

Les entrées de rétinogeniculate et les entrées de corticogeniculate affichent des propriétés synaptiques distinctes3,4,5,6,7,8. Les entrées de rétinogénomié forment de grands terminaux avec des sites de libération multiples9,10. En revanche, les entrées de corticogeniculate affichent de petits terminaux avec des sites de libération unique7. En outre, les synapses rétinogéniques conduisent efficacement les potentiels d'action des neurones relais, bien qu'ils ne constituent que 5 à 10 % de toutes les synapses sur les neurones relais3,8,11. Les synapses corticogeniculate, d'autre part, servent de modulateur des transmissions rétinogeniculate en contrôlant le potentiel de membrane des neurones de relais12,13.

Ces deux entrées excitatrices principales pour relayer les neurones sont également fonctionnellement différentes. Une différence importante est la dépression à court terme des synapses rétinogeniculate et la facilitation à court terme des synapses de corticogeniculate3,5,8. La plasticité à court terme se réfère à un phénomène dans lequel la force synaptique change lorsque la synapse est active à plusieurs reprises dans un délai de quelques millisecondes à plusieurs secondes. La probabilité de libération synaptique est un facteur important sous-jacent à la plasticité à court terme. Les synapses, avec une faible probabilité initiale de libération, présentent une facilitation à court terme en raison de l'accumulation de Ca2 dans la presynapse et, par conséquent, une augmentation de la probabilité de libération est observée lors d'activités répétées. En revanche, les synapses avec la probabilité élevée de libération montrent habituellement la dépression à court terme due à l'épuisement des vésicules prêtes-releasable14. En outre, la désensibilisation des récepteurs postsynaptiques contribue à la plasticité à court terme dans certaines synapses de probabilité à libération élevée8,15. La probabilité et la désensibilisation élevées de dégagement des récepteurs d'acide et de dégagement élevés de 'amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic d'acide (AMPA) contribuent à la dépression à court terme en avant des synapses de rétinogeniculate. En revanche, la probabilité de faible libération sous-tend la facilitation à court terme des synapses de corticogeniculate.

Chez la souris, le tractus optique pénètre dans le noyau de geniculate latéral dorsal (dLGN) du site caudolatéral, tandis que les fibres corticogeniculate pénètrent dans le rostroventrally dLGN. La distance entre les deux entrées permet d'enquêter sur les propriétés individuelles de deux entrées excitatrices très différentes empiéchant sur la même cellule. Ici, nous construisons et améliorons une méthode précédemment décrite de dissection dans laquelle les fibres derétinogeniculate et de corticogeniculate sont préservées dans les tranches aigues de cerveau 3. Nous décrivons alors l'investigation électrophysiologique des neurones de relais et la stimulation des fibres de rétinogeniculate et de corticogenicuulate avec des électrodes de stimulation extracellulaires. Enfin, nous fournissons un protocole pour le remplissage des neurones relais avec la biocytine et l'analyse anatomique ultérieure.

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Protocol

Toutes les expériences ont été approuvées par le Groupe de surveillance gouvernemental sur les expériences animales de Rhénanie-Palatinat.

1. Solutions

  1. Solution de dissection
    1. Pour réduire l'excitotoxicité, préparez une solution à base de choline à utiliser lors de la dissection telle qu'elle est présentée ici (en mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 chlorure de choline, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, et 25 glucose. Préparer la solution de dissection moins d'une semaine avant l'expérience.
  2. Solution d'enregistrement
    1. Préparer une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant (en mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, et 25 glucose. Ajouter 50 M D-APV et 10 m DR 95531 hydrobromide pour bloquer les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et GABAA, respectivement.
  3. Solution intracellulaire
    1. Préparer une solution intracellulaire contenant (en mM) : 35 Cs-gluconate, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA et 0,1 D-600 (hydrochlorure de méthoxyverapamil). Ajuster le pH à 7,3 avec CsOH. Filtrer, aliquot, et stocker la solution de stock à -20 oC jusqu'à l'utilisation.

2. Dissection

  1. Préparer deux chambres de tranche, dont l'une est remplie de 100 ml de la solution de dissection et l'autre avec 100 ml de solution d'enregistrement. Placer les deux béchers dans un bain d'eau (37 oC) et faire une bulle avec des carbogen pendant au moins 15 minutes avant la dissection.
  2. Remplissez un bécher en plastique de 250 ml de solution de dissection proche de glace (mais non congelée). Bulle avec carbogen au moins 15 min avant utilisation.
  3. Remplissez un plat Petri en plastique (100 mm x 20 mm), dans lequel la dissection du cerveau sera effectuée, avec la solution de dissection à froid. Placer un morceau de papier filtre dans le couvercle du plat Petri.
  4. Refroidir la chambre de dissection du vibratome.
  5. Anesthésiez une souris avec 2,5% d'isoflurane, par exemple, dans la cage de souris. Dès que la souris ne répond pas à un pincement de queue, décapiter la souris près de la médulle cervicale et plonger la tête dans la solution de dissection glacée à la base du plat Petri.
  6. Couper la peau de la tête de caudal à nasal et le garder latéralement avec les doigts pour exposer le crâne. Pour éliminer le cerveau antérieur, coupez d'abord le crâne avec la ligne médiane postérieure-antérieure, puis coupez deux fois de plus à travers la suture coronale et la suture lambdoid (Figure 1A).
  7. Enlever le crâne entre la suture coronale et la suture lambdoid de telle sorte que le cerveau est exposé. Couper l'ampoule olfactive et séparer le cerveau avant du cerveau moyen avec une lame fine (Figure 1B). Retirez le cerveau du crâne à l'air d'une fine spatule et placez-le sur le papier filtre dans le couvercle du plat Petri.
    REMARQUE : Les étapes 2.6 et 2.7 doivent être exécutées aussi rapidement que possible pour réduire la mort cellulaire.
  8. Pour préserver l'intégrité des entrées sensorielles et corticales du dLGN dans la tranche de cerveau, séparez les deux hémisphères avec une coupe parasagittal avec un angle de 3 à 5 degrés (figure1C,D). Séchez les plans médiolatéral des deux hémisphères en les plaçant sur le papier filtre, puis collez-les sur la scène de coupe avec un angle de 10 à 25 degrés du plan horizontal (Figure 1E).
  9. Placez la scène au centre du bac tampon métallique et versez doucement le reste de la solution de dissection glacée dans le bac tampon. Effectuez cette étape avec soin puisqu'une forte coulée pourrait enlever le cerveau collé (Figure 1F).
  10. Placez le plateau tampon dans le plateau rempli de glace, ce qui aide à maintenir la basse température pendant la dissection. Couper des tranches de 250 m avec une lame de rasoir à une vitesse de 0,1 mm/s et une amplitude de 1 mm.
  11. Garder les tranches dans la chambre d'attente remplies d'une solution de dissection oxygénée à 34 oC pendant environ 30 min, puis laisser les tranches récupérer dans la solution d'enregistrement à 34 oC pendant 30 min de plus.
  12. Après la récupération, retirer la chambre de fixation de la tranche du bain d'eau et les conserver à température ambiante (RT) jusqu'à ce qu'elles soient utilisées dans des expériences.

3. Électrophysiologie

  1. Tirez les pipettes à l'aide de capillaires en verre borosilicate et d'un tire-filament. Maintenir la résistance des pipettes d'enregistrement à 3 à 4 M. Tirez des pipettes stimulantes en utilisant le même protocole, mais cassez légèrement la pointe après avoir tiré pour augmenter le diamètre. Remplissez les pipettes d'enregistrement avec la solution intracellulaire et la biocytine, tout en remplissant les pipettes stimulantes avec la solution d'enregistrement.
  2. Placez les tranches dans la chambre d'enregistrement et perfillez continuellement les tranches avec une solution d'enregistrement oxygénée à RT. Vérifiez toutes les tranches et sélectionnez ceux qui affichent un tractus optique intact.
  3. Visualisez la tranche et les cellules avec un microscope droit équipé d'une microscopie vidéo de contraste d'interférence différentiell infrarouge (IR-DIC).
    REMARQUE : Les neurones du relais sont différenciés des interneurones par leur plus grande taille de soma et leurs dendrites plus primaires (branches émergeant du soma). Les interneurones présentent une morphologie bipolaire avec un soma plus petit.
  4. Placer la pipette stimulante sur la tranche avant de patcher la cellule avec la pipette d'enregistrement. Pour étudier les synapses rétinogéniques, placez la pipette stimulante directement sur le tractus optique, où les fibres d'axone des cellules ganglionnaires rétiniennes sont regroupées (Figure 2A). Pour analyser les synapses de corticogeniculate, placez l'électrode stimulante sur le noyau reticularis thalami, qui est rostroventrally adjacent à la dLGN (Figure 2B).
  5. Une fois que la pipette d'enregistrement est immergée dans la solution d'enregistrement, appliquez une étape de tension de 5 mV pour surveiller la résistance de pipette. Définir le potentiel de détention à 0 mV et annuler le potentiel de compensation de sorte que le courant de détention est de 0 pA.
  6. Approchez la cellule avec la pipette d'enregistrement tout en appliquant une pression positive. Lorsque la pipette est en contact direct avec la membrane cellulaire, relâchez la pression positive et fixez le potentiel de retenue à -70 mV. Appliquer une légère pression négative pour permettre à la membrane cellulaire de se fixer à la pipette en verre de telle sorte qu'un joint gigaohm se forme (résistance à 1 G). Compenser la capacité de pipette et ouvrir la cellule par l'application de légumineuses à pression négative.
  7. Pour étudier la fonction synaptique, appliquez 0,1 ms d'impulsions actuelles (vers 30 aA) par l'intermédiaire de la pipette de stimulation. Si aucune réponse synaptique n'est observée, les pipettes stimulantes peuvent devoir être remplacées. Soyez prudent lors de la mise en place des pipettes stimulantes à une position différente de sorte que la cellule enregistrée n'est pas perdue.
    REMARQUE : Dans l'exemple des enregistrements montrés dans la figure2, la plasticité synaptique à court terme a été étudiée en stimulant le tractus optique ou les fibres corticogeniculate deux fois avec 30 ms intervalles inter-stimulus. Le rapport appariement-impulsion (PPR) a été calculé en divisant l'amplitude du deuxième courant postynaptique excitateur (EPSC) par celui du premier EPSC (EPSC2/EPSC1). Chaque protocole de stimulation a été répété 20 fois. L'amplitude EPSC a été mesurée à partir des courants moyens des 20 balayages. L'intervalle de temps entre chaque répétition était au moins 5 s pour éviter la plasticité à court terme induite par les répétitions.
  8. Surveillez la résistance de la série en permanence en appliquant une étape de tension de 5 mV. N'utilisez que les cellules avec la résistance de série de moins de 20 M pour l'analyse.

4. Étiquetage Biocytin

  1. Maintenir la configuration de l'ensemble des cellules pendant au moins 5 min pour permettre la diffusion de la biocytine dans les dendrites distales.
  2. Après l'enregistrement, retirez délicatement la pipette de la cellule afin que le soma ne soit pas détruit.
    REMARQUE : Si plus d'une cellule est enregistrée sur une tranche, leurs somas devraient être suffisamment éloignés de leurs cellules voisines. Assurez-vous que les dendrites de différentes cellules ne interfèrent pas les uns avec les autres pendant l'imagerie.
  3. Préparer une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Remplissez chaque puits de 300 l de paraformaldéhyde (PFA) de 4 %. Veillez à ne pas contaminer quoi que ce soit avec PFA qui sera en contact avec les tranches à enregistrer.
  4. Transférer les tranches de la chambre d'enregistrement dans la plaque contenant de la PFA à l'' insu d'une pipette en caoutchouc et fixer les tranches pendant la nuit. Assurez-vous que la pipette est toujours empêchée de la contamination par PFA.
    CAUTION: Toujours porter des gants et utiliser une hotte chimique lors de la manipulation PFA.
  5. Après avoir fixé les tranches pendant la nuit en PFA, remplacez la PFA par de la saline tamponnée par le phosphate (PBS). Conserver les tranches de PBS à 4 oC pour un traitement futur (moins de 2 semaines).
  6. Laver les tranches avec du PBS frais 3 fois (10 min par lavage).
  7. Bloquer les sites de liaison non spécifiques en couvant les tranches dans la solution de blocage (0,2% de surfactant non ionique et 5% d'albumine de sérum bovin en PBS) pendant 2 h à RT sur un shaker orbital.
  8. Jetez la solution de blocage. Incuber les tranches avec streptavidin-Alexa 568 diluée dans la solution de blocage (1:1,000) à 4 oC pendant la nuit sur un shaker orbital.
  9. Jeter la solution d'anticorps et laver les tranches 3 fois avec PBS pendant 10 min à RT sur un shaker orbital. Laver les tranches avec de l'eau du robinet avant de monter.
  10. Placez les tranches d'une souris sur une lame de verre. Assurez-vous que les cellules tachées sont présentes sur la surface supérieure des tranches. Absorber l'eau autour des tranches avec des mouchoirs, puis laisser sécher les tranches pendant environ 15 min.
  11. Appliquer deux gouttes de milieu de montage sur chaque tranche. Montez un bordereau sur la glissière sans produire de bulles d'air.
  12. Conserver les tranches étiquetées à 4 oC après la visualisation à l'aide d'un microscope confocal.

5. Imagerie et reconstruction cellulaires

  1. Scanner les tranches à l'utilisation d'un microscope confocal et utiliser le logiciel associé pour l'analyse.
  2. Exciter la fluorescence à 561 nm.
  3. Imageles avec 0,7 ouverture numérique (NA), objectif d'immersion en huile.
  4. Ajustez la cellule ciblée au milieu de la vue et appliquez un grossissement 2,5 fois.
  5. Rendre les jeux de données Z-pile pour scanner l'ensemble du neurone avec les paramètres suivants: format 2 550 x 2 550 pixels, fréquence d'analyse 400 Hz, z numéro 40.Voxel taille était d'environ 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 m3.
  6. Tracer semi-automatiquement les neurones à l'aide d'un logiciel de reconstruction neuronale (par exemple, NeuronStudio). Un exemple de neurone relais tracé en 3D est montré dans la figure 3B.

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Representative Results

La préparation de tranches de dLGN contenant les voies de rétinogénine et de corticogenicuulate est montrée sous un objectif 4x (figure 2). Les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes se regroupent dans le tractus optique (Figure 2). La pipette stimulante a été placée sur le tractus optique pour induire le courant rétinogeniculate synapse-mediated (Figure 2A) et sur le noyau reticularis thalami pour induire le courant de synapses de synapses de corticogeniculate (figure2B),respectivement. Il convient de noter que les axones des neurones corticaux aux neurones LGN se projettent du cortex au thalamus traversant le noyau reticularis thalami. Les synapses de corticogenicluate peuvent, par conséquent, être activées par stimulation dans le noyau reticularis thalami.

Le rapport appariement-impulsion des EPSCs médiés par les récepteurs AMPA est inférieur à 1 lors de la stimulation du tractus optique avec un intervalle interstimulus de 30 ms, mais au-dessus de 1 lors de la stimulation des fibres corticogeniculate avec le même intervalle interstimulus (Figure 2C,D) . La dépression appariée-impulsion des synapses de rétinogeniculate est due à une probabilité élevée de dégagement de vésicule et à la désensibilisation des récepteurs postynaptiques d'AMPA. La facilitation appariée-impulsion des synapses de corticogeniculate est compatible à une faible probabilité de dégagement de vésicule16.

La figure 3A montre l'image IR-DIC montrant le soma d'un neurone relais dLGN avec la pointe de la pipette patch. La coloration de la biocytine nous permet d'avoir une vue du neurone enregistré. Différents des interneurones, qui ont une morphologie bipolaire, les neurones relais ont des arborescences dendritiques multipolaires (Figure 3B) contenant plus de 3 dendrites primaires8,17. La reconstruction tridimensionnelle (3D) d'un neurone relais étiqueté biocytine a ensuite été générée, ce qui montre une architecture dendritique radialesymétrique (figure3C).

Figure 1
Figure 1 : Schémas représentant le protocole de dissection. (A) Vue horizontale du crâne de la souris, montrant la position des coupes initiales. La première coupe a été exécutée avec la suture sagittale, suivie de deux autres coupures avec la suture coronale et la suture lambdoid, respectivement. Les lignes pointillées représentent les incisions. (B) Vue sagittale de tout le cerveau. Les lignes en pointillés indiquent que le cerveau est isolé de l'ampoule olfactive et du cerveau moyen. (C-D) Ces panneaux montrent le premier angle de coupe pour séparer les deux hémisphères de la vue horizontale (C) et coronale (D), respectivement. (E) Vue coronale d'un hémisphère sur la scène de coupe. Les lignes en pointillés indiquent la direction de tranchage. l, m, d, et v représentent les aspects latéraux, médials, dorsaux et ventrals, respectivement, pour l'hémisphère dans les panneaux D et E. (F) Diagramme de la chambre de dissection avec deux hémisphères sur l'étape de coupe. La flèche pointillée indique la direction en mouvement de la lame de coupe. a, p, et d représentent les aspects antérieurs, postérieurs et dorsaux de l'hémisphère gauche, respectivement. (G) Schéma représentant une tranche correctement coupée avec une partie relativement grande du dLGN et la conservation intacte du tractus optique. dLGN, noyau latéral dorsal de géonulate ; vLGN, noyau latéral ventral; OT, ampoule olfactive; TrN, noyau reticularis thalami. Les panneaux C, D et G ont été modifiés à partir de la figure 1 de Turner et Salt3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Préparation de tranche de dLGN contenant les voies de rétinogeniculate et de corticogenicuulate et les enregistrements d'exemple. (A-B) Ces panneaux montrent une tranche dLGN avec la préservation des entrées de rétinogénine et de corticogeniculate. L'électrode de stimulation a été placée sur le tractus optique pour activer les synapses rétinogéniques (A) et sur le noyau reticularis thalami pour activer les synapses de corticogeniculate (B). (C) EPSCs à médiation réceptrice DE l'AMPA en réponse à la stimulation du tractus optique deux fois avec un intervalle interstimulus de 30 ms. (D) Corticogeniculate synapse-mediated currents with 30 ms inter-stimulus interval. Les artefacts de stimulation ont été enlevés pour plus de clarté. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse morphologique d'un neurone relais. (A) Image IR-DIC montrant le soma d'un neurone relais dLGN avec la pointe de la pipette patch. (B) Image confocale d'un neurone de relais étiqueté avec la biocytine et visualisé avec streptavidin-Alexa 568. (C) Reconstruction tridimensionnelle (3D) du même neurone, montrant une architecture dendritique radiale symétrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous décrivons un protocole amélioré basé sur une méthode précédemment éditée3, qui permet l'étude de la probabilité élevée des synapses de rétinogeniculate de dégagement et de la faible probabilité des synapses de corticogeniculate de libération de la même tranche. Ceci est d'une grande importance puisque ces deux entrées interagissent les unes avec les autres pour moduler la transmission du signal visuel : les entrées rétinogéniques sont le principal moteur excitateur des neurones relais, tandis que les entrées corticothalamiques fonctionnent comme un modulateur, qui influence le gain de la transmission rétinogénique en affectant l'état des neurones relais. Comme prévu, nous avons observé que les synapses de rétinogeniculate et de corticogenicuulate présentent la plasticité à court terme différente due à la différence dans leurs probabilités de libération. En outre, la désensibilisation des récepteurs AMPA contribue également à la forte dépression dans les synapses rétinogeniculate9,15,16. Nous avons récemment montré que la dépression à court terme est modulée par CKAMP4416, une protéine auxiliaire de récepteur D'AMPA de la famille de CKAMP qui ralentit la récupération de la désensibilisation des récepteurs d'AMPA18,19, 20. En outre, les amplitudes actuelles de synapse rétinogéniques sont plus élevées que celles des courants synapse corticogéniques sous la même force stimulante, compatibles avec les grandes synapses rétinogéniques sites de libération, et relativement petites synapses de corticogeniculate7,21.

Le protocole de tranchage est essentiellement le même que celui développé par Turner et Salt3. Certaines modifications qui ont été basées sur notre expérience a amélioré la qualité des tranches. Semblable à Hauser et autres22,nous avons utilisé une solution de dissection à base de choline au lieu d'une solution de dissection à base de saccharose. Récupération après dissection a été faite à 34 oC dans la solution de coupe pendant 30 min, puis dans la solution d'enregistrement pendant 30 min et non à température ambiante. Les tranches étaient légèrement plus minces (250 m au lieu de 400 m). Nous avons disséqué les cerveaux à l'aide d'un coin avec un angle de 10 à 25 degrés, ce qui facilite et augmente la fiabilité de la procédure de tranchage.

Les conditions d'enregistrement et de stimulation pour l'étude de la fonction desynapse de neurone de relais sont essentiellement les mêmes que précédemment décrites par Chen et Regehr 8. L'activation des fibres de tracts optiques suscite habituellement de grands courants et peut être dans la gamme de plusieurs nA lorsque toutes les synapses rétinogeniculate sur un relais neurones sont activés23. Pour éviter les erreurs de résistance en série, en particulier lors de l'étude du courant maximal en activant toutes les synapses rétinogeniculate sur un relais neurones, Chen et Regehr utilisé l'enregistrement de pipettes à faible résistance (lt; 2 M ). Cependant, pour étudier la plasticité synaptique à court terme, il suffit d'activer un ou quelques axones de cellules de ganglion rétinien, qui suscitent des courants qui sont dans la gamme de 34-579 pA (résultats non publiés, Chen et autres). De plus petites pipettes avec une résistance entre 3 et 4 M peuvent, par conséquent, être employées en étudiant la fonction de synapse de rétinogeniculate utilisant la stimulation faible du tractus optique. L'activation des synapses de corticogeniculate suscite des courants relativement petits16. Les erreurs de résistance de série sont, par conséquent, un plus petit problème en étudiant la fonction de synapse de corticogenicuulate.

Nous montrons ici que la stimulation des synapses de rétinogeniculate et de corticogenicuulate peut être employée pour étudier la plasticité à court terme des courants récepteurs-négociés d'AMPA. Le même protocole peut être appliqué pour enregistrer le courant médié par les récepteurs NMDA24. En fait, l'une des premières indications que la désensibilisation des récepteurs DE l'AMPA contribue à la plasticité à court terme des synapses rétinogeniculate provenaient d'expériences dans lesquelles les rapports d'impulsions jumelées de courants médiés par les récepteurs DE l'AMPA ont été comparés à rapports d'impulsion sapparieuses des courants récepteurs-négociés nMDA. Les synapses corticogeniculate ont été stimulées en positionnant la pipette de stimulation dans le noyau reticularis thalami parce que les axones des neurones corticaux qui excitent les neurones relais dLGN voyagent à travers ce noyau thalamic. La même position de stimulation peut être utilisée pour étudier les courants synaptiques inhibiteurs dans le dLGN comme le montrent par exemple Govindaiah et Cox25.

Les neurones du relais expriment les récepteurs GABAA et GABAB. La libération de GABA active les récepteurs synaptiques GABA A. Les récepteurs GABA B, qui sont localisés de façon extrasynaptique, sont activés lorsque le noyau reticularis thalami est fortement activé par exemple lors d'une rafale de tir26,27,28. Spillover de GABA, qui est généralement limitée en raison de l'apport de GABA par les astrocytes, peut activer lors de l'activation intense synapse les récepteurs gabAB extrasynaptiques27,28. Nous n'avons pas bloqué les récepteurs GABAB parce que l'intensité et la fréquence de stimulation étaient comparativement faibles. Cependant, en étudiant la fonction de synapse de corticogeniculate utilisant des protocoles intenses de stimulation il pourrait être préférable d'ajouter des récepteurs de GABA B.

Les enregistrements des neurones relais dLGN peuvent facilement être effectués lors de l'utilisation de tranches qui sont approximativement 2 mm médiane de la surface latérale du cerveau (commencer à recueillir environ le 8e des tranches de 250 m au cours de la procédure de coupe). Dans certaines tranches, les deux entrées d'un neurone relais donné ne peuvent pas être détectées parce que l'une des deux voies est sectionnée près du neurone de relais. Dans ce cas, il est généralement encore possible d'étudier les synapses de rétinogénice et de corticogeniculate dans la même tranche en sélectionnant différents neurones de relais pour chaque entrée. Pour enregistrer le courant médié de la synapse rétinogénique, les neurones de relais ventralement situés sont choisis puisque les fibres du tractus optique vers ces cellules sont plus susceptibles d'être préservées que dans les neurones relais localisés doratiquement. En revanche, les entrées de corticogeniculate sont plus probablement préservées sur les neurones de relais qui sont situés dorsally dans le dLGN.

La qualité des tranches détermine la fiabilité des données. Sur la base de notre expérience, les paramètres suivants sont essentiels pour assurer une bonne qualité de tranche. Le refroidissement et l'oxygénation sont des facteurs importants pendant la procédure de dissection. La tête de la souris doit être maintenue en solution froide immédiatement après la décapitation de la souris. Lors de la prise du cerveau hors du crâne, il doit être immergé dans la solution de glace-froid tous les 3 à 4 s afin de réduire la mort cellulaire. De la même façon, la procédure de tranchage doit être effectuée à environ 4 oC. En outre, la solution de dissection et la solution d'enregistrement doivent être oxygénés au moins 15 min avant utilisation pour maintenir une concentration suffisante en oxygène. En outre, le blocage des canaux de sodium peut réduire efficacement l'activité neuronale. Par conséquent, une solution de dissection contenant la choline de mmol 37.5 a été employée.

Les neurones relais affichent des pointes à faible seuil, qui sont générées par le courant ca2 de 29 . Pour bloquer la tension fermée Ca2-canaux, nous avons ajouté D-600 (methoxyverapamil) à la solution intracellulaire. Le D-600 ne devrait pas être utilisé si le but de l'étude est d'étudier les pics à faible seuil dans les neurones relais. La précision des enregistrements de pinces de tension à cellules entières est affectée par des erreurs de pince de l'espace. Ce problème technique est plus pertinent pour les entrées qui sont loin de l'électrode d'enregistrement (donc pour les synapses distales)30,31. Pour minimiser l'impact de l'erreur de pince de l'espace, nous avons utilisé une solution intracellulaire basée sur leCsau lieu d'une solution intracellulaire basée surK. Les canaux qui sont K perméables (p. ex., les canaux de fuite) sont généralement Cset imperméables32. Ainsi, l'utilisation d'une solution intracellulaire basée surCs-basé augmente l'impédance de la cellule.

L'enregistrement stable de pince de correction dépend de la sélection des cellules saines. Les neurones à forme de soma ronde, de couleur foncée ou de soma gonflé doivent être évités. En outre, les neurones de relais sont distingués des interneurons locaux par leur plus grande taille de soma et les arborescences dendritiques primaires plus élaborées. Par conséquent, nous avons sélectionné des cellules qui ont une plus grande taille de soma (plus grand que 15 m de diamètre) et une morphologie non bipolaire. La cellule d'exemple montrée dans la figure 3B a une architecture dendritique symétrique et peut, par conséquent, être classifiée comme neurone de relais ressemblant à des Y-neurones qui sont par exemple trouvées dans le chat LGN17.

La résistance de série doit être aussi petite que possible et maintenue constante. En outre, puisque les entrées de deux directions sont conservées en une seule tranche, il est important de se débarrasser de l'interférence entre les deux entrées. Pour éviter d'activer les fibres corticogeniculate lors de l'enregistrement des courants synapse rétinogéniques ou vice versa, la pipette stimulante ne doit pas être placée dans le dLGN et la distance entre stimuler et enregistrer pipette doit être aussi loin que possible. En outre, la longue distance entre stimuler et enregistrer des pipettes nécessite une conservation relativement intacte des axones. Par conséquent, un angle de coupe approprié doit être sélectionné pour la dissection. En général, seulement une ou deux tranches avec la conservation de deux entrées peuvent être obtenues à partir de chaque hémisphère.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par la Fondation allemande de recherche (DFG) au sein du Collaborative Research Center (SFB) 1134 "Ensembles fonctionnels" (J.v.E. et X.C.) et la Subvention de recherche EN948/1-2 (J.v.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier  HEKA Elektronik EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG
CaCl2 EMSURE 1.02382.1000
choline chloride Sigma-Aldrich C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope Leica Microsystems TCS SP5
CsCl EMSURE 1.02038.0100
Cs-gluconate Self-prepared Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600  Sigma-Aldrich M5644-50MG methoxyverapamil hydrochloride
D-APV  Biotrend  BN0085-100 NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope Olympus XM10
EGTA SERVA 11290.02
Forene Abbvie 2594.00.00 isoflurane
Glucose Sigma-Aldrich 49159-1KG
HEPES ROTH 9105.2
High Current Stimulus Isolator World Precision Instruments A385
KCl EMSURE 1.04936.1000
MgCl2 EMSURE 1.05833.0250
Micromanipulators Luigs & Neumann SM7
Miroscope Olympus BX51
mounting medium  ThermoFisher Scientific P36930 Prolong Gold Invitrogen
NaCl ROTH 3957.1
NaH2PO4 EMSURE 1.06346.1000
NaHCO3 EMSURE 1.06329.1000
Pipette Hilgenberg 1807502
Puller Sutter  P-1000
razor blade  Personna  60-0138
Semiautomatic Vibratome Leica  Biosystems VT1200S
SR 95531 hydrobromide  Biotrend  AOB5680-10 GABAA-receptor antagonist 

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