قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد قدر ة نشاط نظام يوبيكويتين بروتياسوم (UPS) بكفاءة في مقصورات خلوية مختلفة من الدماغ القوارض. ويتمكن المستخدمون من فحص أداء شركة UPS في الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابكة في نفس الحيوان، مما يقلل من مقدار الوقت وعدد الحيوانات اللازمة لإجراء هذه التحليلات المعقدة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نظام فيوكويتين بروتياسوم هو منظم رئيسي لتدهور البروتين ومجموعة متنوعة من العمليات الخلوية الأخرى في eukaryotes. في الدماغ، ترتبط الزيادات في النشاط في يوبيكويتين بروتياسوم حاسمة للدونة متشابك وتكوين الذاكرة والتغيرات الشاذة في هذا النظام مع مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية والعصبية والنفسية. واحدة من القضايا في دراسة العمل في كل مكان بروتيسوم في الدماغ هو أنه موجود في جميع المقصورات الخلوية, التي أهداف البروتين, دور وظيفي وآليات التنظيم يمكن أن تختلف على نطاق واسع. ونتيجة لذلك، فإن القدرة على المقارنة المباشرة لاستهداف بروتين في وبيكوتين الدماغ والنشاط الحفاز البروتياسوم في مقصورات تحت الخلية المختلفة داخل نفس الحيوان أمر بالغ الأهمية لفهم كامل كيف يساهم UPS في اللدونة متشابك، الذاكرة والمرض. الطريقة الموصوفة هنا تسمح بجمع الكسور النووية والسيتوبلازمية والخام متشابك من نفس القوارض (الفئران) الدماغ، تليها القياس الكمي في وقت واحد من النشاط الحفاز بروتياسوم (بشكل غير مباشر، وتوفير نشاط من جوهر بروتياسوم فقط) والربط محددة في كل من يوبيكويتين وضع العلامات البروتين. وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة لمقارنة مباشرة التغيرات دون الخلوية في النشاط في يوبيكويتين بروتياسوم في مناطق الدماغ المختلفة في نفس الحيوان خلال اللدونة متشابك، وتشكيل الذاكرة وحالات المرض المختلفة. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتقييم التوزيع دون الخلوي ووظيفة البروتينات الأخرى داخل نفس الحيوان.

Introduction

نظام ubiquitin-proteasome (UPS) هو شبكة معقدة من هياكل البروتين المترابطة والأربطة التي تتحكم في تدهور معظم البروتينات قصيرة الأجل في الخلايا1. في هذا النظام، يتم وضع علامة على البروتينات للتحلل أو غيرها من العمليات الخلوية / مصائر من قبل فيوكويتين المعدل الصغيرة. يمكن للبروتين المستهدف الحصول على 1-7 تعديلات يوبيكويتين، والتي يمكن أن تربط معا في واحد من سبعة مواقع يسين (K) (K6، K11، K27، K29، K33، K48 و K63) أو ميثيونين N-الطرفية (M1؛ كما هو معروف باسم الخطي) في ubiquitin السابقة2. بعض من هذه العلامات polyubiquitin هي تدهور محددة (K48)3, في حين أن البعض الآخر مستقلة إلى حد كبير عن عملية تدهور البروتين (M1)4,5,6. وهكذا، فإن عملية انتشار البروتين معقدة بشكل لا يصدق والقدرة على قياس التغيرات في علامة بوليوبيكتين محددة أمر بالغ الأهمية لفهم دور ذلك التعديل في الأداء الخلوي في نهاية المطاف. زيادة تعقيد دراسة هذا النظام، وبروتياسوم، وهو الهيكل الحفاز للUPS7، على حد سواء يتحلل البروتينات ولكن يمكن أيضا أن تشارك في عمليات أخرى غير بروتيوليتيك8،9. ليس من المستغرب بعد ذلك، منذ اكتشافه الأولي، وقد تورط النشاط العادي والشاذ في ubiquitin-proteasome في تكوين الذاكرة على المدى الطويل ومجموعة متنوعة من حالات المرض، بما في ذلك العديد من العصبية، العصبية والنفسية اضطرابات10,11. ونتيجة لذلك، فإن الأساليب التي يمكن أن تحدد بشكل فعال وفعال نشاط UPS في الدماغ حاسمة لفهم في نهاية المطاف كيف يتم تنظيم هذا النظام في حالات المرض والتطوير النهائي لخيارات العلاج التي تستهدف في كل مكان و / أو أداء بروتياسوم.

هناك عدد من القضايا في قياس النشاط في كل مكان بروتيسوم في أنسجة الدماغ من الفئران والفئران، والتي هي النظم النموذجية الأكثر شيوعا المستخدمة لدراسة وظيفة يو بي سي، بما في ذلك 1) تنوع التعديلات ubiquitin، و 2) توزيع و التنظيم التفاضلي لUPS يعمل عبر المقصورات دون الخلوية12،13،14. على سبيل المثال، العديد من المظاهرات المبكرة من وظيفة ubiquitin-بروتياسوم في الدماغ أثناء تكوين الذاكرة تستخدم lysates الخلية بأكملها وأشار إلى زيادات تعتمد على الوقت في كل من البروتين في كل مكان والنشاط بروتياسوم15، 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20.ومع ذلك، وجدنا مؤخرا أن النشاط ubiquitin-proteasome تختلف على نطاق واسع عبر المقصورات دون الخلوية استجابة للتعلم، مع زيادات متزامنة في بعض المناطق والانخفاض في مناطق أخرى، وهو نمط يختلف اختلافا كبيرا من ما تم الإبلاغ عنه سابقا في خلية كاملة lysates21. وهذا يتسق مع الحد من نهج الخلية بأكملها، كما أنه لا يمكن فصل مساهمة التغييرات في نشاط UPS عبر مقصورات دون الخلوية المختلفة. على الرغم من أن الدراسات الحديثة قد استخدمت بروتوكولات الكسور متشابك لدراسة UPS على وجه التحديد في نقاط الاشتباك العصبي استجابة للتعلم22،23،24، والأساليب المستخدمة occlude القدرة على قياس النووية والسيتوبلازمية في كل مكان بروتياسوم التغيرات في نفس الحيوان. وهذا يؤدي إلى حاجة لا لزوم لها لتكرار التجارب عدة مرات، وجمع كسر دون الخلوية مختلفة في كل. وهذا لا يؤدي فقط إلى خسارة أكبر في الأرواح الحيوانية، ولكنه يلغي القدرة على مقارنة نشاط يو بي سي مباشرة عبر مقصورات دون خلوية مختلفة استجابة لحدث معين أو أثناء حالة مرض معين. وبالنظر إلى أن أهداف البروتين من ubiquitin وبروتياسوم تختلف على نطاق واسع في جميع أنحاء الخلية، وفهم كيف يختلف الإشارات ubiquitin-proteasome في مقصورات دون الخلوية متميزة أمر بالغ الأهمية لتحديد الدور الوظيفي للUPS في الدماغ أثناء تكوين الذاكرة والاضطرابات العصبية والعصبية والنفسية.

لتلبية هذه الحاجة، قمنا مؤخرا بتطوير إجراء حيث يمكن جمع الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك لمنطقة الدماغ معينة من نفس الحيوان21. بالإضافة إلى ذلك، لحساب كمية محدودة من البروتين التي يمكن الحصول عليها من جمع كسور دون الخلوية متعددة من نفس العينة، ونحن الأمثل البروتوكولات المنشأة سابقا لفحص في المختبر نشاط بروتياسوم والربط محددة البروتين في كل مكان في الخلايا اللمعة التي تم جمعها من أنسجة الدماغ القوارض. باستخدام هذا البروتوكول، تمكنا من جمع ومقارنة مباشرة التغيرات تعتمد على التعلم في النشاط بروتياسوم، K48، K63، M1 ومستويات تعدد النقاط البروتينية الشاملة في النواة والسيتوبلازم وفي نقاط الاشتباك العصبي في اللوزة الجانبية للفئران. هنا، ونحن نصف بالتفصيل إجراءنا ( الشكل1)،والتي يمكن أن تحسن بشكل كبير فهمنا لكيفية مشاركة UPS في تشكيل الذاكرة على المدى الطويل ومختلف حالات المرض. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن النشاط البروتياسوم في المختبر التي نوقشت في بروتوكولنا، على الرغم من استخدامها على نطاق واسع، لا يقيس مباشرة نشاط المجمعات بروتياسوم 26S كاملة. بدلا من ذلك، يقيس هذا الفحص نشاط جوهر 20S، وهذا يعني أنه يمكن أن يكون فقط بمثابة وكيل لفهم نشاط الأساسية نفسها بدلا من مجمع 26S بروتياسوم بأكمله.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات بما في ذلك المواضيع الحيوانية من قبل معهد فرجينيا للفنون التطبيقية وجامعة الولاية المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC).

1. جمع وتشريح أنسجة الدماغ القوارض

ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ واستخدامها مع إجراءات جمع الأنسجة المختلفة. وفيما يلي الإجراء المستخدم في مختبرنا لشبه الخلوية من أنسجة الدماغ الفئران، وذلك باستخدام 8-9 أسابيع من الذكور الذكور Sprague Dawley الفئران. من أجل معالجة جميع المقصورات الخلوية في نفس الحيوان، القسم 1.3. يجب اتباعها بغض النظر عن إجراء جمع الأنسجة المستخدمة.

  1. استخراج الدماغ الفئران ومكان في كوب المبردة قبل المبردة على الجليد الجاف. فلاش تجميد الدماغ على الجليد الجاف، أو استخدام النيتروجين السائل إذا كان متوفرا، ونقل إلى -80 درجة مئوية الفريزر. يمكن تشريح العقول في نفس اليوم أو في وقت لاحق.
  2. إزالة الدماغ المجمدة من كوب المبردة ووضعها في مصفوفة الدماغ الفئران المبردة مع الجليد الجاف. وتتطابق كل فتحة على المصفوفة مع 0.5 مم، ويمكن استخدامها لتحديد الموقع التقريبي لمنطقة الاهتمام.
    1. باستخدام أطلس الدماغ الفئران، إدراج شفرة الحلاقة في المصفوفة مباشرة أمام (الأمامي) من بداية المتوقعة من عائد الاستثمار. بعد ذلك، أدخل شفرة حلاقة على الفور في النهاية المتوقعة (الخلفية) لعائد الاستثمار.
    2. إزالة شريحة بين شفرات الحلاقة باستخدام مشرط ووضعها على شريحة المجهر المبردة على الجليد الجاف. عادةً ما تكون المقاطع سمكها 2-3 مم ولكن هذا يختلف استنادًا إلى عائد الاستثمار.
  3. باستخدام مشرط، تشريح العائد على الاستثمار نصف الكرة في نصف الكرة في وقت واحد. ضع كل نصف نصف الكرة في أنابيب منفصلة للطاردة الدقيقة بـ 1.5 مل قبل تبريدها على الجليد الجاف. يمكن استخدام الأنسجة المجمدة على الفور للتجزئة دون الخلوية أو معالجتها في وقت لاحق إذا تم تخزينها في -80 درجة مئوية.

2 - الاستخراج النووي والسيتوبلازمي

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول حلول مخزون مسبقة الصنع من المواد الكيميائية الشائعةفي المختبر، بما في ذلك 0.1 م HEPES، 1 M MgCl 2، 1 M Dithiothreitol (DTT)، 0.5 M حمض إيثيلينديامينيتراسيتيك (EDTA)، 5 M كلوريد الصوديوم، 10٪ NP-40 (IGEPAL) و 50٪ الجلسرين. إذا تم استخدام نقطة النهاية في اختبار النشاط بروتياسوم, يمكن إضافة الجلسرين وATP إلى جميع المخازن المؤقتة للمساعدة في منع تفكيك المجمعات بروتياسوم أثناء تحلل.

  1. إعداد العازلة اللمعة. إضافة 8.63 مل من المياه فائقة النقاء (منزوع ة المقطر والمقطر) إلى أنبوب مخروطي معقمة 15 مل.
    1. إلى الأنبوب المخروطي، إضافة 1000 درجة مئوية من 0.1 م HEPES، 15 ميكرولتر من 1 م كل، 100 ميكرولتر من 1 M DTT و 50 درجة مئوية من 10٪ NP-40.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات البروتياز و 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز. دوامة لفترة وجيزة الحل لخلط ووضعها على الجليد الرطب للبرد. لاحظ أن الحل قد يكون لون أصفر من مثبطات الفوسفاتيز.
      ملاحظة: استخدام مثبطات البروتياز ضروري للحفاظ على البروتين وضمان خصوصية في المختبر البروتياسوم تحليل النشاط. ومع ذلك، قد تؤدي هذه المثبطات أيضا إلى انخفاض طفيف في النشاط البروتياسوم، وهذا يعني أن النشاط الذي يقاس على الاختبار في المختبر قد يكون أقل من مستويات النشاط الفعلي.
  2. تحضير المخزن المؤقت للاستخراج. أضف 5.925 مل من الماء فائق النقاء (منزوع الأيونات والمقطر) إلى أنبوب مخروطي معقم بسعة 15 مل.
    1. إلى الأنبوب المخروطي، إضافة 2000 ميكرولتر من 0.1 م HEPES، 1250 ميكرولتر من 50٪الجلسرين، 15 ميكرولتر من 1 م كل 2، 5 ميكرولتر من 1 M DTT، 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA و 600 ميكرولتر من 5 M NaCl.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات البروتياز و 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز. دوامة لفترة وجيزة الحل لخلط ووضعها على الجليد الرطب للبرد. لاحظ أن الحل قد يكون لون أصفر من مثبطات الفوسفاتيز.
  3. قم بإزالة الأنبوب الصغير للطرد المركزي سعة 1.5 مل الذي يحتوي على نصف الكرة من عائد الاستثمار من الفريزر -80 درجة مئوية. تأكد من موازنة نصف الكرة الأرضية المستخدمة عبر ظروف الاستخراج لكل مجموعة تجريبية. على سبيل المثال، في تجربة من مجموعتين، استخدم نصف الكرة الأيسر لأول اثنين من الحيوانات في كل مجموعة ونصف الكرة الأيمن للعينتين التاليتين، إلخ.
  4. باستخدام مشرط، نقل أنسجة الدماغ المجمدة إلى 2 مل الزجاج تفلون الخالط. إضافة 500 درجة مئوية من العازلة Lysis إلى أنبوب تفلون.
    1. باستخدام pestle B، تجانس نفس الأنسجة باستخدام 15 السكتات الدماغية حتى لا توجد كمية مرئية من المواد الصلبة. استخدم حركة الدوران (في اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة) أثناء كل ضربة.
  5. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، نقل العينة المتجانسة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الصغير 1.5 مل. وضع الأنبوب على الجليد الرطب وحضانة لمدة 30 دقيقة.
  6. وضع أنبوب في الطاردة للأجهزة المركزية الدقيقة وتدور لمدة 10 دقائق في 845 × ز و 4 درجة مئوية. بعد الانتهاء، وإزالة بعناية supernatant عن طريق الأنابيب ووضعها في أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge؛ هذا هو كسر السيتوبلازم، والتي يمكن تخزينها على الجليد أو في 4 درجة مئوية حتى القسم 2.9.
  7. إضافة 50 درجة مئوية من العازلة استخراج إلى بيليه الناتجة وإعادة تعليق عن طريق الأنابيب. لا دوامة بيليه. ضع الأنبوب الذي يحتوي على بيليه المعلق على الجليد وحضانة لمدة 30 دقيقة.
  8. وضع الأنبوب في الطاردة للأجهزة المركزية الدقيقة وتدور لمدة 20 دقيقة في 21,456 × ز,4 °C. بعد الانتهاء، وإزالة بعناية supernatant عن طريق الأنابيب ووضعها في أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge؛ هذا هو الكسر النووي. ويمكن الآن التخلص من بيليه.
  9. قياس تركيز البروتين من السيتوبلازمية واستخراج النووية باستخدام فحص البروتين العاصمة (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة)، أو أي فحص مماثل للعينات التي تم جمعها باستخدام المنظفات غير الأيونية. انتقل على الفور إلى إجراء عملية التمور البروتياسوم (القسم 4) أو النشاف الغربي (القسم 5). بدلا من ذلك، يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الحاجة.

3. مجموعة الكسور متشابك

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول حلول مخزون مسبقة الصنع من المواد الكيميائية المختبرية الشائعة، بما في ذلك 1 M Tris (pH 7.5)، 0.5 M EDTA، 5 M NaCl و 10٪ SDS. إذا تم استخدام نقطة النهاية في اختبار النشاط بروتياسوم، يمكن إضافة الجلسرين وATP إلى جميع المخازن المؤقتة للمساعدة في منع تفكيك المجمعات بروتياسوم أثناء تحلل

  1. إعداد المخزن المؤقت TEVP مع السكروز 320 mM. أضف 60 مل من الماء النقي (منزوع الأيونات والمقطر) إلى كوب نظيف بسعة 100 مل.
    1. إلى الكأس، إضافة 1300 ميكرولتر من 1 M تريس (درجة الحموضة 7.5)، 260 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات البروتياز، 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز و 10.944 غرام من السكروز. يُمزج المزيج مع شريط التحريك حتى يذوب السكروز تمامًا.
    2. جلب الحموضة إلى ~ 7.4 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) قطرة إلى الحل باستخدام ماصة.
    3. نقل الحل إلى قارورة حجمية 100 مل. جلب حجم إلى 100 مل عن طريق إضافة المياه فائقة النقية. قم بتبريد الحل النهائي على الجليد حتى الحاجة.
  2. إعداد المخزن المؤقت التجانس. أضف 60 مل من الماء النقي (منزوع الأيونات والمقطر) إلى كوب نظيف بسعة 100 مل.
    1. إلى الكأس، إضافة 5000 ميكرولتر من 1 M تريس (درجة الحموضة 7.5)، 3000 ميكرولتر من 5 M NaCl، 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات البروتياز، 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز و 2000 ميكرولتر من 10٪ SDS. يُمزج المزيج مع بار التحريك.
      ملاحظة: المنظفات الأيونية يمكن أن تتداخل مع اختبار النشاط بروتياسوم من خلال ما أدى إلى إزالة الناطور من مجمع بروتياسوم. يمكن خفض حجم SDS للمساعدة في الحفاظ على وظيفة بروتياسوم إذا رغبت في ذلك.
    2. جلب الحموضة إلى ~ 7.4 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك قطرة إلى الحل باستخدام ماصة.
    3. نقل الحل إلى قارورة حجمية 100 مل. جلب حجم إلى 100 مل عن طريق إضافة المياه فائقة النقية. تخزين الحل النهائي في درجة حرارة الغرفة؛ لا تبرد كما SDS سوف يعجل من الحل.
  3. قم بإزالة الطرد المركزي سعة 1.5 مل الذي يحتوي على نصف الكرة من عائد الاستثمار من الفريزر -80 درجة مئوية. تأكد من موازنة نصف الكرة الأرضية المستخدمة عبر ظروف الاستخراج لكل مجموعة تجريبية. على سبيل المثال، في تجربة من مجموعتين، استخدم نصف الكرة الأيسر لأول اثنين من الحيوانات في كل مجموعة ونصف الكرة الأيمن للعينتين التاليتين، إلخ.
  4. باستخدام مشرط، نقل أنسجة الدماغ المجمدة إلى 2 مل الزجاج تفلون الخالط. إضافة 500 درجة مئوية من المخزن المؤقت TEVP إلى أنبوب تفلون.
    1. باستخدام pestle B، تجانس نفس الأنسجة باستخدام 15 السكتات الدماغية حتى لا توجد عمليات نقل مرئية من المواد الصلبة. استخدم حركة الدوران (في اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة) أثناء كل ضربة.
  5. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، نقل العينة المتجانسة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الصغير 1.5 مل. الطرد المركزي العينة في 1000 × ز لمدة 10 دقائق، 4 درجة مئوية.
  6. جمع supernatant ونقلإلى أنبوب جديد 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة باستخدام ماصة 1000 درجة مئوية. الطرد المركزي العينة في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة، 4 درجة مئوية. بيليه الأصلي (P1) يحتوي على النوى والحطام الكبير ويمكن التخلص منها.
  7. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. هذا كسر دوري. إضافة 50 درجة مئوية من العازلة التجانس إلى بيليه (P2) وإعادة تعليق عن طريق الأنابيب حتى لا تكون هناك مادة صلبة مرئية.
  8. الطرد المركزي العينة في 20،000 × ز لمدة 10 دقائق، 4 درجة مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة؛ هذا هو الغشاء متشابك الخام (متشابك) كسر. يمكن التخلص من بيليه.
  9. قياس تركيز البروتين من كسر متشابك باستخدام فحص البروتين Dc (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة)، أو أي فحص مماثل للعينات التي تم جمعها باستخدام المنظفات الأيونية. انتقل على الفور إلى إجراء عملية التمور البروتياسوم (القسم 4) أو النشاف الغربي (القسم 5). بدلا من ذلك، يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الحاجة.

4. البروتياسوم النشاط التبيّاسي

ملاحظة: يمكن قياس نشاط بروتياسوم في أنسجة الدماغ المتجانسة باستخدام نسخة معدلة قليلا من 20S بروتياسوم النشاط كيت. هذا التحليل لا يقيس مباشرة نشاط المجمعات بروتياسوم 26S كاملة. بدلا من ذلك، فإنه يقيس نشاط 20S الأساسية، وهذا يعني أنه يمكن أن تكون فقط كوكيل لفهم نشاط الأساسية نفسها بدلا من مجمع 26S بروتياسوم بأكمله. ينخفض النجاح من هذا اختبار مع يكرّس [فريز-ثبو] دورات [وبوووووو/ور] يزيد مستويات المنظفات, بشكل خاصّ أيّوية, ويستعمل الإستعمال من لوحة قارئة مع 360/460 (إثارة/إذاعة) مرشح مجموعة وتدفئة قدرات [أوب تو] 37 [ك.].

  1. إعدادات قارئ اللوحة: ما قبل الدافئة إلى 37 درجة مئوية وعقد من خلال تشغيل.
    1. تعيين الإثارة إلى 360 والانبعاثات إلى 460. إذا كان لوحة الآبار 96 المستخدمة واضحة، تعيين موقف البصريات إلى أسفل. إذا تم استخدام لوحة سوداء / سوداء 96 جيدا، تعيين موقف البصريات إلى الأعلى.
    2. تعيين نماذج قارئ لوحة القديمة إلى السيارات كسب تحت خيارات القراءة الفلورسنت; نماذج أحدث هي مسبقا لهذا. برنامج تشغيل الحركية مع وقت 2 ساعة، والمسح الضوئي (القراءة) كل 30 دقيقة.
  2. إعادة تشكيل المخزن المؤقت اختبار 10X المقدمة في مجموعة مع 13.5 مل من المياه فائقة النقية. إضافة 14 μL من ATP 100 m M إلى المخزن المؤقت 1x الآن; وهذا يعزز بشكل كبير النشاط بروتياسوم في العينات ويحسن موثوقية الفحص. يمكن تخزين المخزن المؤقت 20S الفحص النهائي على الجليد أو في 4 درجة مئوية حتى الحاجة ومستقرة لعدة أشهر.
  3. إعادة تشكيل معيار AMC المقدمة في مجموعة مع 100 ميكرولتر من DMSO. تنفيذ هذه الخطوة في الظلام أو في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة، كما معيار حساسة للضوء.
  4. إنشاء منحنى حامل AMC باستخدام المعيار المعاد تشكيله، في الظلام أو في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة.
    1. في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل منفصلة، إضافة 16، 8، 6.4، 3.2، 1.6، 0.8، 0.4 و 0 ميكرولتر من معيار AMC، الذي يتوافق مع 20، 10، 8، 4، 2، 1، 0.5 و 0 ميكرومتر تركيز AMC.
    2. إلى هذه الأنابيب، في نفس الترتيب، إضافة 84، 92، 93.6، 96.8، 98.4، 99.2، 99.6 و 100 درجة مئوية من المخزن المؤقت 20S Assay. وهذا يخلق سلسلة من تركيزات AMC عالية إلى منخفضة، والتي سيتم استخدامها لمعايرة قارئ لوحة وتحليل النشاط بروتياسوم في العينات المتجانسة.
    3. تخزين جميع المعايير المخففة على الجليد في الظلام حتى الحاجة.
  5. إعادة تشكيل الركيزة بروتياسوم (Suc-LLVY-AMC) المقدمة في مجموعة مع 65 ميكرولتر من DMSO. تنفيذ هذه الخطوة في الظلام أو في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة، كما الركيزة حساسة للضوء. إنشاء تخفيف 1:20 من الركيزة بروتياسوم في أنبوب جديد 1.5 مل الطرد المركزي باستخدام 20S مخزن العازل. تخزين الركيزة المخففة على الجليد في الظلام حتى الحاجة.
    ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان لوحة سيكون 10 عينات و1 فارغة، وسوف تحتاج ما يكفي من الركيزة المخففة ل 22 الآبار (مع التكرارات) في 10 درجة مئوية لكل بئر. وهذا يعادل 220 درجة مئوية من الحاجة + 30 ميكرولتر لأخطاء الأنابيب، مما يتطلب 12.5 ميكرولتر من الركيزة و 237.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 20S Assay.
  6. إذابة العينات المطلوبة (إذا المجمدة) وإضافة كمية طبيعية إلى لوحة بئر 96. تشغيل كل عينة في التكرارات. تختلف كمية العينة المطلوبة استنادًا إلى إعداد الأنسجة. عموما، 10-20 ميكروغرام يكفي لأي كسر دون الخلوية.
  7. جلب حجم البئر عينة إلى 80 درجة مئوية مع المياه فائقة النقاء. يعتمد المبلغ المضاف على حجم العينة المضافة. على سبيل المثال، إذا كانت العينة 1 4.5 ميكرولتر من البروتين وكانت العينة 2 8.7 ميكرولتر، فإن كمية المياه اللازمة ستكون 75.5 ميكرولتر و71.3 ميكرولتر على التوالي. في بئرين منفصلين، إضافة 80 درجة مئوية من الماء وحدها. هذه ستكون الفراغات في الساي.
    ملاحظة: من أجل الحد من التغيرات في حجم البروتين بسبب أخطاء الأنابيب، يمكن تطبيع تركيزات البروتين إلى عينة أقل تركيزا. سيسمح هذا باستخدام نفس وحدة تخزين العينة في كافة الشروط.
  8. إضافة 10 ميكرولتر من 20S مسح العازلة إلى كل بئر، بما في ذلك الفراغات في أسي. ويوصى هنا بجهاز إعادة إرسال/ماصة آلية لضمان اتساق حجم التصاق عبر الآبار.
  9. اختياري: في هذه المرحلة، وإدخال التلاعب في المختبر إذا رغبت في ذلك. وهذا يتطلب أن كل عينة لديها 2 الآبار إضافية لكل علاج، بما في ذلك السيارة. إذا كان الأمر كذلك، إضافة 5-10 درجة مئوية من المخدرات / مركب من الفائدة إلى 2 من الآبار عينة وحجم مكافئ من السيطرة / مركبة إلى بئرين آخرين. ضع اللوحة على قارئ الصفيحة المُسخّن مسبقاً أو في حاضنة بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. أطفئ الأضواء أو أدخل غرفة مظلمة. إضافة جميع 100 درجة مئوية من معايير AMC المخففة إلى بئر جديد. كل معيار سيكون لها بئر واحد.
  11. في الظلام، إضافة 10 درجة مئوية من الركيزة بروتياسوم المخففة إلى الآبار التي تحتوي على عينة وعينات الفراغات، ولكن ليس إلى معيار AMC. ويوصى هنا بجهاز إعادة إرسال/ماصة آلية لضمان اتساق حجم التصاق عبر الآبار.
  12. ضع اللوحة في قارئ اللوحة وابدأ تشغيل الحركة.
    ملاحظة: لوحة لا تحتاج إلى أن تكون تحت التحريض المستمر خلال تشغيل الحركية، ومع ذلك، يمكن للمستخدم اختيار إذا رغبت في ذلك
  13. في نهاية التشغيل الحركي تصدير القيم الفلورية 360/460 الخام إلى Microsoft Excel.
    1. متوسط معا الآبار المكررة لكل معيار، كل عينة والفحص فارغة لجميع 5 عمليات المسح الضوئي. يجب أن تزيد قيم الفلورسنت الخام عبر عمليات المسح الضوئي للعينات ولكنها تظل مستقرة (أو تنخفض قليلاً) للمعايير وعينات الفراغات.
    2. خذ أعلى متوسط AMC جيدا والقسمة على التركيز المعروف (20 درجة مئوية). تقسيم هذه القيمة على تركيز العينة المستخدمة في اختبار للحصول على قيمة AMC موحدة. لكل عينة ومتوسط اختبار فارغ، قسمة على قيمة AMC القياسية.
    3. خذ هذه القيمة النهائية وقسمة على تركيز العينة المستخدمة في النموذج للحصول على القيمة الطبيعية لكل عينة ونموذج فارغ. قم بذلك من أجل جميع عمليات المسح 5.
    4. طرح قيمة الفحص الفارغة التي تمت تسويتها من كل قيمة عينة تمت تسويتها لكافة عمليات المسح الضوئي 5.

5. القياس الكمي للبروتين الخاص بالروابط في كل مكان

  1. وينبغي أن يتم التحديد الكمي للعلامات متعددة الموجات في مختلف الكسور دون الخلوية التي تم جمعها من أنسجة الدماغ القوارض باستخدام مجموعة متنوعة من بروتوكولات النشاف الغربية القياسية في تركيبة مع فريدة من نوعها، والأجسام المضادة متعددة النقاط محددة الربط.
    1. لإزالة الناطور، مزيج العينات تطبيع مع حجم متساو من المخزن المؤقت عينة Laemmli تستكمل مع β-mercaptoethanol إلى نسبة مئوية من 5٪ من حيث الحجم، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. للكم من جميع التعديلات أحادية ومتعددة الشبه بغض النظر عن الربط، استخدم جسم مضاد عموم فيوكويتين.
    3. للتعرف على جميع البروتينات متعددة الموبيكيتينات، استخدم جسم مضاد في يوبيكويتين لا يتفاعل مع أحادية الشبه.
    4. للحصول على تعدد الخصائص الخاصة بالربط، استخدم الأجسام المضادة التي يمكنها الكشف عن يسين-27، ليسين-48، ليسين-63 والخطي (M1) تعدد البول.
  2. لمنع التلوث المتبادل بين التطورات، والتي يمكن أن تؤدي إلى إيجابية كاذبة أو تتداخل مع تصوير تعديل أوبيككويتين مختلفة، والأغشية الشريط بين التطورات باستخدام 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 10 دقائق.
    1. غسل الأغشية في TBS مع 0.1٪ توين مرتين لمدة 10 دقيقة وإعادة حظر (باستخدام أي عامل حجب يفضل في بروتوكول وصمة عار الغربية المستخدمة).
    2. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية وإعادة تطوير من أجل التأكد من أن الغشاء تم تجريده من الأجسام المضادة الأولية والثانوية بشكل صحيح.
    3. موصى به: من أجل التطوير الناجح لمختلف الأجسام المضادة في يوبيكويتين دون تلوث، استخدم أنظمة التصوير الفلورية أو شبه بالأشعة تحت الحمراء. هذا في كثير من الأحيان يمكن أن تمنع ترحيل بين الأجسام المضادة.
  3. بعض الصور لطخة في يوبيكويتين الغربية سوف توفر أعمدة من العصابات متميزة (مثل M1) في حين أن البعض الآخر إنتاج نمط مثل مسحة مع خطوط واضحة قليلة أو معدومة (مشتركة مع K48). للحصول على كمية من البقع الغربية في كل مكان، رسم مربع حول العمود الذي يمتد سلم المعايير الجزيئية بأكملها.
    1. ضبط مربع أعلى (أو أسفل) إذا بقع ubiquitin لا تمتد من خلال سلم كامل. هذا أمر شائع لتعديلات يسين-48 ويختلف على نطاق واسع عبر المقصورات دون الخلوية.
    2. طرح الخلفية، والتي يتم حسابها على أنها متوسط الكثافة البصرية للخلفية المحيطة مباشرة العمود على جميع الجوانب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام الإجراء الموضح هنا، تم جمع الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك من اللوزة الجانبية لدماغ الفئران (الشكل 1). تم تأكيد نقاء الكسور الفردية عن طريق النشاف الغربي، والتحقيق مع الأجسام المضادة ضد البروتينات التي ينبغي إثراؤها أو استنفادها في lysate. في نصف الكرة الأرضية الأول حيث تم جمع جزء متشابك الخام، كان البروتين الكثافة الpostsynaptic 95 (PSD95) موجودة في متشابك، ولكن ليس النووية، جزء، مع مستويات أقل في السيتوبلازم (الشكل2A). وهذا يتسق مع العمل السابق مما يدل على أن إعداد كسر متشابك يعزل كل من المكونات presynaptic وpostsynaptic25. وعلى العكس من ذلك، كان الهيستون البروتين النووي H3 موجودا في النووية، ولكن ليس متشابك، كسر، مع مستويات أقل في السيتوبلازم (الشكل2B). وجود PSD95 وH3 في السيتوبلازم يتسق مع ترجمتها السيتوبلازمية. كان البروتين السيتوبلازمي بيتا-توبولين موجودة في جزء السيتوبلازمية لدينا، ولكن كان غائبا إلى حد كبير من lysate النووية (الشكل2C)،مع مستويات أقل في منطقة متشابك. وهذا يشير إلى أننا كنا قادرين على إنتاج جزء نووي كان غائبا إلى حد كبير من البروتينات السيتوبلازمية. وجود توبولين في منطقة متشابك يتسق مع الدراسات السابقة26. وأظهرت جميع الكسور الثلاثة مستويات مماثلة من الإسكان حفظ البروتين β-أكتين (الشكل 2D)، الذي كان يستخدم كتحكم التحميل. بشكل جماعي، تؤكد هذه النتائج أن نقاء الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك التي تم جمعها من amygdala الفئران الجانبية واحدة.

بعد ذلك، تم تأكيد جميع lysates للنشاط البروتياسوم الوظيفي باستخدام النسخة المعدلة الموصوفة من في المختبر 20S الاختبار النشاط بروتياسوم. في جميع lysates، تم تعريف نجاح الفحص على أنه زيادة في وحدات الفلورسنت الخام (RFU) التي تم الكشف عنها من المسح الأول (0 دقيقة) إلى المسح الخامس /النهائي (120 دقيقة). وبالنسبة لجميع هذه التحليلات، استُخدمت 10 ميكرومتر من الـ AMC كأعلى معيار لتطبيع وحدات الفلورسنت الخام(RFU). في الكسر متشابك الخام، بلغت RFU ذروتها في المسح الضوئي 5 (الشكل3A)،مما أدى إلى RFU تطبيع أقل قليلا من 0.1 (الشكل3B). في الكسر السيتوبلازمي، زادت RFU عبر المسح الضوئي (الشكل3C)مع RFU تطبيع النهائي من ~ 1.6 (الشكل3D). كما أظهر الجزء النووي تغييرات تعتمد على الوقت في RFU (الشكل3E)،مع RFU تطبيع النهائي من 0.3 (الشكل3F). الاختلافات في النشاط بروتياسوم عبر المقصورات من المرجح أن يعكس توافر بروتياسومفي الكسر، والتي هي عموما الأكثر وفرة في السيتوبلازم ونواة27، والمقصورات التي لديها أعلى مستوى من النشاط في منطقتنا اعداد. أدنى مستوى من النشاط في منطقة متشابك يتسق مع كونها lysate الوحيد الذي تم جمعه باستخدام المنظفات الأيونية، والتي يمكن أن تقلل من النشاط البروتياسوم بسبب حالة الإزالة أقسى. الأهم من ذلك، لم يزيد RFU عبر الزمن في الفراغات الاختبارأو في lysates (متشابك) احتضنت مع مثبطات بروتياسوم محددة للغاية وقوية clasto-lactacystin-β-lactone (الشكل3G، β-lac) ، وعرض مستويات RFU النهائية الطبيعية من 0.01 و 0.001 على التوالي (الشكل3H). وهذا يشير إلى أن التغيير الذي لوحظ في RFU كان يرجع على وجه التحديد إلى نشاط بروتياسوم وليس البروتياز الأخرى. وعلاوة على ذلك، عند تحليلها عبر الظروف التجريبية، كان هناك زيادة في النشاط النووي، ولكن ليس السيتوبلازمية، البروتياسوم في اللوزة الجانبية بعد التعلم، والتي وقعت في وقت واحد مع انخفاض في النشاط البروتياسوم متشابك في مقارنة للسيطرةعلى الحيوانات (الشكل 4). بشكل جماعي، تؤكد هذه النتائج أن النشاط البروتياسوم يمكن قياسه بدقة في جميع الكسور دون الخلوية الثلاثة التي تم جمعها من amygdala الفئران الجانبية واحدة.

واحدة من مزايا اختبار النشاط بروتياسوم هو أنه يمكن إدخال التلاعب في المختبر إلى العينات مباشرة قبل إضافة الركيزة بروتياسوم، والذي يسمح بتحديد جزيئات محددة التي يمكن أن تنظم بروتياسوم في هذا الكسر الفرعي الخاص. وكمثال على ذلك، تم تقييم دور CaMKII (الكالسيوم / كالمودولين البروتين تعتمد على كيناز الثاني) في كسر متشابك، وأقسى lysate مشوهجمعها، منذ CaMKII ويعتقد أن تنظيم وظيفة بروتياسوم في نقاط الاشتباك العصبي. و30 دقيقة حضانة مع مثبطCaMKII myr-AIP (myristolayted autocamtide-2 الببتيد المثبطة ذات الصلة) أدى إلى زيادة كبيرة في النشاط بروتياسوم على الفحص، والتي وصلت فقط إلى المستويات التي كانت ~ 61٪ من غير المعالجة الضوابط (الشكل5A). وعلى العكس من ذلك، فإن نفس التلاعب المطبق على السيتوبلازميك لم يسفر عن تغيير في النشاط البروتستانتي من الآبار المعالجة بالمركبات (الشكل5B). وتؤكد هذه النتائج أن النشاط البروتستانتي يمكن التلاعب به أكثر في المختبر وأن هذا التلاعب يمكن أن يكون لها آثار مختلفة اعتمادا على كسر subcellular التي تم جمعها.

بالإضافة إلى قياس النشاط البروتياسوم، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لقياس الاختلافات دون الخلوية في التعديلات المتنوعة في يوبيكويتين باستخدام إجراءات اللطخة الغربية. من المهم ملاحظة أن علامات ubiquitin التي يمكن الكشف عنها محدودة بتوفر الأجسام المضادة الخاصة بالروابط، والتي تشمل حاليًا K48 وK63 وM1 للفئران (ملاحظة: يتوفر جسم مضاد K27، على الرغم من أنه لم ينتج صورة قابلة للكشف في أي كسر اللوزة الجانبية أو الخلية الكاملة lysates تحت مجموعة متنوعة من الظروف). وقد تم الكشف عن تعدد الحالات الكلي، والخطي المستقل للتحلل/M1، وK63 في كل مكان، وK48 في كل مكان في جميع الكسور شبه الخلوية. الأهم من ذلك، عند تحليلها عبر ظروف تجريبية مختلفة، كانت هناك زيادة في إجمالي (الشكل6A)،الخطي (الشكل6B)،K63 (الشكل6C)و K48 (الشكل6D)تعدد الحوالة في اللوزة الجانبية الكسر النووي بعد التعلم بالمقارنة مع السيطرة على الحيوانات. في الوقت نفسه، في منطقة السيتوبلازمية، انخفض تعدد النقاط الكلي وK48 في كل مكان بعد التعلم، في حين تم تخفيض K63 متشابك في كل مكان. وتشير هذه النتائج مجتمعة إلى أنه يمكن الكشف بدقة عن الاختلافات داخل نفس الخلايا الحيوانية في كل مكان من البروتين الخاص بالروابط.

Figure 1
الشكل 1 مخطط للتجزئة دون الخلوية من أنسجة الدماغ الفئران. يتم استخراج الدماغ القوارض، تشريح منطقة الدماغ وتقسيم نصف الكرة الأرضية. وباستخدام سلسلة من الحواجز العازلة وخطوات الطرد المركزي، يتم جمع الكسور النووية والسيتوبلازمية من نصف الكرة الأرضية بينما يتم جمع جزء متشابك خام من الآخر. ثم يتم استخدام كلا الكسور لتجارب النشاط بروتياسوم والنشاف الغربية، لدراسة مستويات بوليوبينتيفيشن البروتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تأكيد نقاء الكسر الكلوبي والنووي والسيتوبلازمي: (أ) البروتين متلازم يُحتسب الكثافة 95 (PSD95; 1:1,000) كان موجوداً في متشابك، ولكن ليس الكسر النووي مع مستويات أقل في السيتوبلازم. (ب) كانت هيستون H3 (1:500) موجودة في النووية، ولكن ليس متشابك، وكسر مع التعبير أقل في السيتوبلازم. (C) β-Tubulin (1:1,000) كان موجودا في السيتوبلازمية، ولكن غائبة إلى حد كبير من النووية، وكسر مع التعبير أقل في lysate متشابك. (د) بروتين التدبير المنزلي β-actin (1:1,000) كان موجودا في جميع المقصورات دون الخلوية. تشير المناطق إلى الحجم المتوقع للبروتين المستهدف. تم تعديل هذا الرقم من Orsi, S.A. et al.21. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 قياس كمية النشاط البروتياسوم في الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك التي تم جمعها من اللوزة الجانبية لنفس الحيوان. خلال فحص النشاط البروتياسوم في المختبر، زادت وحدات الفلورسنت النسبية (RFU) التي تم اكتشافها من البداية (المسحالضوئي 1) إلى النهاية (المسح الضوئي 5) من الفحص في متشابك (A)، السيتوبلازمية (C) والنووية (E) الكسور. يشير التحديد الكمي لهذا التغيير من خط الأساس إلى قيمة RFU طبيعية (نسبة إلى 10ميكرومتر AMC) من 0.1 في متشابك (B)، 1.6 في السيتوبلازمية (D) و 0.3 في الكسور النووية(F). منع مثبط اتواسوم βlac RFUs من التغير خلال الدورة(G-H). تم تعديل هذا الرقم من Orsi, S.A. et al.21. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 الاختلافات شبه الخلوية في النشاط البروتياسوم في اللوزة الجانبية لنفس الحيوان. تم الكشف عن زيادة في النشاط البروتياسوم النووي في الحيوانات المدربة (شرط الخوف) بالنسبة للضوابط، والتي تتوافق مع انخفاض في النشاط داخل الكسر متشابك. وظل النشاط البروتيوباسي السيتوبلازمي عند خط الأساس. *P < 0.05 من التحكم. تم تعديل هذا الرقم من Orsi, S.A. et al.21. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 في المختبر التلاعب من النشاط بروتياسوم في الكسور متشابك والسيتوبلازمية التي تم جمعها. في المختبر التلاعب من CaMKII الإشارات عن طريق مثبط AIP خفض النشاط البروتياسوم في متشابك (A)، ولكن ليس السيتوبلازم (B)، جزء من amygdala الفئران الجانبية. وقد تم تعديل هذا الرقم من Jarome, T.J. et al.23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 الاختلافات تحت الخلية في كل مكان البروتين ربط محددة في اللوزة الجانبية لنفس الحيوان بعد التعلم. (أ) كانت هناك زيادة في الانتشار الكلي في الكسر النووي بعد التعلم، والتي ترتبط بانخفاض في الكسر السيتوبلازمي. (ب) كانت هناك زيادة في كل شيء خطي في النووية، ولكن ليس السيتوبلازمية أو متشابك، وكسر بعد التعلم. (ج) كانت هناك زيادة في K63 في كل مكان في الكسر النووي بعد التعلم، والتي ترتبط مع انخفاض في الكسر متشابك. (د) K48 في كل مكان زيادة في النووية والسيتوبلازمية، ولكن ليس متشابك، وكسر بعد التعلم. *P < 0.05 من التحكم. تم تطبيع جميع الكثافات البصرية التي تم الحصول عليها في يوبيكويتين إلى مستويات β-actin (الصور اللطخة الغربية أقل تمثيلا في A)، والتي كانت تستخدم كتحكم في التحميل. تم تعديل هذا الرقم من Orsi, S.A. et al.21. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نقوم بتوضيح طريقة فعالة لتحديد التغيرات في النشاط في كل مكان-بروتياسوم عبر مقصورات تحت الخلوية المختلفة في نفس الحيوان. وفي الوقت الراهن، اقتصرت معظم المحاولات الرامية إلى قياس التغيرات دون الخلوية في نشاط النظام البروتيسوم في كل من يوبيكويتين على مقصورة واحدة لكل عينة، مما أدى إلى الحاجة إلى تكرار التجارب. وهذا يؤدي إلى تكاليف كبيرة وفقدان الحياة الحيوانية. بروتوكولنا يخفف من هذه المشكلة عن طريق تقسيم نصف الكرة الأرضية، مما يسمح الكسور الخلوية المختلفة التي يتم جمعها من كل نصف الكرة الأرضية من نفس الحيوان. باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على إظهار لأول مرة أنه في نفس النشاط الحيواني في كل مكان-بروتياسوم يتغير بشكل تفاضلي في الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك ردا على تعلم21.

الحد الرئيسي للبروتوكول الموضح هنا هو أنه يعتمد على كمية أنسجة الدماغ (عينة) التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال، كما هو مبين أعلاه، يتطلب هذا البروتوكول تقسيم نصفي منطقة الدماغ معينة. غير أن ذلك قد لا يكون ممكنا دائما، كما هو الحال في بعض المناطق الموجودة فقط في نصف الكرة الأرضية الواحد. في هذه الحالات، يمكن تعديل البروتوكول عن طريق التجانس أولاً منطقة الدماغ بأكملها في المخزن المؤقت TEVP المستخدمة في خطوة الكسر متشابك (القسم 3.1)، لأن هذا المخزن المؤقت خال من جميع عوامل denaturing. ثم يمكن تقسيم العينة إلى جزأين متساويين حسب الحجم. يمكن استخدام الجزء الأول للكسر متشابك، بعد البروتوكول كما هو موضح. وبالنسبة للنصف الثاني من العينة، يمكن إضافة المنظفات غير الأيونية NP-40 إلى تركيز نهائي قدره 0.05 في المائة، يليه الطرد المركزي على النحو المبين في القسم 2-6. وسيسمح ذلك بفصل البروتينات السيتوبلازمية إلى البروتينات الفائقة والنووية في بيليه، والتي يمكن عزلها أكثر بعد الخطوات المتبقية في القسم 2. مصدر قلق آخر في كمية الأنسجة هو أن بعض مناطق الدماغ صغيرة جدا في الحجم، مثل القشرة قبل الأطراف. ومع ذلك، في هذه الحالات، لا يزال يمكن استخدام البروتوكول أعلاه عن طريق الحد من أحجام المخازن المؤقتة المستخدمة، والتي يجب أن تحدد تجريبيا على أساس حجم منطقة الدماغ التي تم جمعها. وبالتالي، يمكن تعديل هذا البروتوكول حتى مناطق الدماغ الأكثر صعوبة التي تتوفر فيها أنسجة أقل.

ومن المزايا الرئيسية للبروتوكول الذي نأوجزه هنا أنه يستخدم معدات مختبرية وكواشف مشتركة يمكن العثور عليها في معظم المرافق، مما يسمح بتعديل هذه المنهجية حتى تلك التي تكون ذات ميزانية محدودة أو ذات موارد محدودة. وعلاوة على ذلك، في حين أننا الخطوط العريضة لهذا البروتوكول كوسيلة لقياس التغيرات دون الخلوية في إشارات ubiquitin-proteasome، يمكن أيضا تطبيق هذه المنهجية على أي بروتين آخر أو عملية خلوية فيها فهم توطين الخلايا ووظيفتها هو مهم. وهكذا، يمكن أن يكون لهذا البروتوكول تطبيقات واسعة لفهم الوظائف دون الخلوية لبروتينات أو مجمعات محددة أثناء التعلم والذاكرة أو حالات المرض المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل صناديق بدء التشغيل من كلية العلوم الزراعية والحياة وكلية العلوم في فرجينيا للتكنولوجيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129, (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3, (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15, (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38, (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169, (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45, (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13, (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30, (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54, (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48, (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17, (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6, (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14, (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24, (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319, (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21, (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79, (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16, (20), 6331-6341 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics