量化龙脑中的亚细胞泛基蛋白-蛋白酶体活性

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

该协议旨在有效地量化啮齿动物大脑不同细胞舱中的泛泛蛋白-蛋白酶体系统(UPS)活性。用户能够检查UPS在同一动物中核、细胞质和突触分数的功能,从而减少执行这些复杂分析所需的时间和动物数量。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

泛素蛋白体系统是真核生物中蛋白质降解和各种其他细胞过程的关键调节器。在大脑中,泛英蛋白酶体活性的增加对突触可塑性至关重要,记忆形成和本系统中的异常变化与各种神经、神经退行性和精神障碍有关。研究大脑中泛泛蛋白蛋白酶功能的一个问题是,它存在于所有细胞隔间中,其中蛋白质靶点、功能作用和调节机制可能有很大差异。因此,能够直接比较同一动物内不同亚细胞室中大脑泛性蛋白靶向和蛋白酶体催化活性的能力,对于充分理解UPS如何促进突触可塑性至关重要,记忆和疾病。此处描述的方法允许从同一啮齿动物(大鼠)大脑中收集核、细胞质和粗突触分数,然后同时定量蛋白酶体催化活性(间接提供蛋白酶体核心的活性)仅)和连杆特异性泛基蛋白标记。因此,该方法可用于直接比较同一动物在突触可塑性、记忆形成和不同疾病状态期间不同大脑区域泛性蛋白酶体活性的亚细胞变化。该方法还可用于评估同一动物中其他蛋白质的亚细胞分布和功能。

Introduction

泛性蛋白-蛋白酶体系统(UPS)是一个复杂的网络,由相互连接的蛋白质结构和气体组成,控制着细胞1中大多数短寿命蛋白质的降解。在这个系统中,蛋白质被小修饰剂泛性蛋白标记为降解或其他细胞过程/命运。靶蛋白可以获得1-7种泛基质修饰,它可以在7个流氨酸(K11、K27、K29、K33、K48和K63)或N端蛋氨酸(M1;称为线性)中的七个基氨酸(K)位点之一连接在起。其中一些多维他金标记是降解特异性(K48)3,而其他基本上与蛋白质降解过程(M1)4,5,6无关。因此,蛋白质泛化过程极其复杂,量化特定多聚素标记的变化的能力对于最终理解这种给定修饰在细胞功能中的作用至关重要。进一步复杂化的研究这个系统,蛋白酶体,这是UPS7的催化结构,既降解蛋白质,但也可以参与其他非蛋白酶过程8,9。毫不奇怪,自最初发现以来,正常和异常的泛性蛋白-蛋白酶体活动一直与长期记忆形成和各种疾病状态有关,包括许多神经、神经退行性和精神病紊乱10,11。因此,能够有效和高效地量化UPS在大脑中的活动的方法对于最终理解这个系统在疾病状态下是如何调节不良以及最终开发针对泛基丁和/或的治疗方案至关重要。蛋白酶体功能。

在量化大鼠和小鼠脑组织中泛基蛋白酶体活性方面存在许多问题,这是用于研究UPS功能的最常见模型系统,包括1)泛基蛋白修饰的多样性,以及2)分布和UPS在亚细胞舱12、13、14之间运作的差分调节。例如,在记忆形成过程中大脑中泛素蛋白酶体功能的许多早期演示使用全细胞赖沙,并表明蛋白质泛化和蛋白酶体活性15的时间依赖性增加,16,17,18,19,20.然而,我们最近发现,泛基蛋白-蛋白酶体活性在亚细胞间中因学习而差异很大,有些区域同时增加,另一些区域减少,这一模式差异很大从之前报告在整个细胞莱沙21。这与整个细胞方法的限制是一致的,因为它不能分离不同亚细胞隔间UPS活动的变化。虽然最近的研究已经使用突触分数协议,以研究UPS专门在突触响应学习22,23,24,使用的方法遮挡了测量的能力同一动物的核质和细胞质泛素蛋白体变化。这导致不必要的需要重复实验多次,收集不同的亚细胞分数在每个。这不仅会导致动物生命损失,而且消除了直接比较不同亚细胞间的UPS活动以响应给定事件或特定疾病状态的能力。考虑到泛素蛋白和蛋白酶体的蛋白质靶点在整个细胞中差异很大,了解泛素蛋白-蛋白酶体信号在不同亚细胞室中如何不同,对于确定UPS在细胞中的功能作用至关重要。大脑在记忆形成和神经,神经退行性和精神障碍。

为了满足这一需求,我们最近开发了一个程序,其中核,细胞质和突触分数可以收集从同一动物21的给定大脑区域。此外,为了考虑从同一样品中收集多个亚细胞分数可以获得的有限蛋白质量,我们优化了先前建立的协议,以检测体外蛋白酶体活性和联动特异性从啮齿动物脑组织收集的分片细胞中的蛋白质普遍化。使用该协议,我们能够收集和直接比较蛋白酶体活性、K48、K63、M1和细胞质中整体蛋白多聚体化水平以及大鼠侧杏仁核的突合体中学习相关变化。在这里,我们详细介绍了我们的程序(图1),这可以显著提高我们对UPS如何参与长期记忆形成和各种疾病状态的理解。然而,应该指出的是,我们的协议中讨论的体外蛋白酶体活性虽然被广泛使用,但并不能直接测量完整的26S蛋白酶体复合物的活性。相反,此检测测量 20S 内核的活动,这意味着它只能作为代理来了解内核本身的活动,而不是整个 26S 蛋白酶体复合体。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

所有程序,包括动物科目,都已获得弗吉尼亚理工学院和州立大学动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

1. 啮齿动物脑组织的收集和解剖

注:该协议可应用于各种大脑区域,并用于各种组织采集程序。以下是我们实验室使用8-9周大雄性斯普拉格道利大鼠的鼠脑组织亚细胞程序。为了处理同一动物中的所有细胞隔间,第 1.3 节。无论使用何种组织采集程序,都必须遵循。

  1. 提取大鼠大脑,放入一个低温杯中,预冷冻在干冰上。将大脑冷冻在干冰上,或使用液氮(如有),并转移到-80°C冷冻室。大脑可以在同一天或以后解剖。
  2. 从低温杯中取出冷冻的大脑,放入用干冰冷却的老鼠大脑基质中。矩阵上的每个插槽对应于 0.5 mm,可用于确定感兴趣区域 (ROI) 的大致位置。
    1. 使用大鼠大脑地图集,在预期 ROI 开始的前面(前部)将剃刀刀片插入矩阵中。接下来,立即在 ROI 的预测末尾(后)插入剃刀刀片。
    2. 使用手术刀取出剃须刀刀片之间的切片,放在干冰上冷藏的显微镜幻灯片上。通常,部分厚度为 2-3 毫米,但根据 ROI 的不同而有所不同。
  3. 使用手术刀,一次解剖一个半球的投资回报率。将每个半球放入单独的1.5 mL微离心管中,预冷冻在干冰上。冷冻组织可立即用于亚细胞分馏,如果储存在-80°C,可在以后处理。

2. 核质和细胞质提取

注:该协议使用常见实验室化学品的预造库存溶液,包括 0.1 M HePES、1 MM MgCl 2、1 M 二硫二醇 (DTT)、0.5 M 乙烯二甲酸 (EDTA)、5 M NaCl、10% NP-40 (IGEPAL) 和 50% 甘油。如果在蛋白酶体活性测定中使用端点,甘油和ATP可以添加到所有缓冲液中,以帮助防止在溶解过程中分解蛋白酶体复合物。

  1. 准备莱西斯缓冲器。将8.63 mL超纯(脱离子和蒸馏)水加入无菌15 mL锥形管中。
    1. 在锥形管中,加入1,000μL的0.1M HEPES,15μL的1MMgCl,100μL的1M DTT和50μL的10%NP-40。
    2. 加入100μL蛋白酶抑制剂鸡尾酒和100μL磷酸酶抑制剂鸡尾酒。短暂涡旋溶液混合并放置在湿冰上冷却。请注意,溶液可能具有磷酸酶抑制剂的黄色色调。
      注:蛋白酶抑制剂的使用对于保存蛋白质和确保体外蛋白酶体活性测定的特异性至关重要。然而,这些抑制剂也可能导致蛋白酶体活性的轻微减少,这意味着在体外测定中测量的活性可能低估了实际活性水平。
  2. 准备提取缓冲区。将 5.925 mL 的超纯(去离子和蒸馏)水添加到无菌的 15 mL 锥形管中。
    1. 在锥形管中,加入 2,000 μL 的 0.1 M HEPES、1250 μL 的 50% 甘油、15 μL 的 1 M MgCl 2、5 μL 的 1 M DTT、5 μL 的 0.5 M EDTA 和 600 μL 的 5 M NaCl。
    2. 加入100μL蛋白酶抑制剂鸡尾酒和100μL磷酸酶抑制剂鸡尾酒。短暂涡旋溶液混合并放置在湿冰上冷却。请注意,溶液可能具有磷酸酶抑制剂的黄色色调。
  3. 从 -80 °C 冰柜中取出含有一半 ROI 的 1.5 mL 离心机微管。确保所使用的半球在每个实验组的提取条件中进行平衡。例如,在两组实验中,对每组前两个动物使用左半球,对后两个样本使用右半球,等等。
  4. 使用手术刀,将冷冻脑组织转移到2 mL玻璃铁氟龙均质器中。将 500 μL 的利西斯缓冲液添加到特氟龙管中。
    1. 使用虫子B,使用15个笔画使同一组织均匀化,直到没有可见的固体物质量。每次描边时,使用车削运动(顺时针或逆时针)。
  5. 使用 1,000 μL 移液器,将均质样品转移到新的 1.5 mL 微离心管中。将管子放在湿冰上,孵育30分钟。
  6. 将管子放在微离心机中,在 845 x g和 4 °C 下旋转 10 分钟。完成后,通过移液小心地去除上清液,并放入新的1.5 mL微离心管中;这是细胞质分数,可以储存在冰上或4°C,直到第2.9节。
  7. 将 50 μL 的萃取缓冲液添加到生成的颗粒中,并通过移液重新悬浮。不要涡旋颗粒。将含有悬浮颗粒的管子放在冰上,孵育30分钟。
  8. 将管子置于微离心机中,在21,456 x g,4°C下旋转20分钟。 完成后,通过移液小心地去除上清液,并放入新的1.5 mL微离心管中;这是核分数。颗粒现在可以丢弃。
  9. 使用Dc蛋白测定法(根据制造商的说明)或使用非离子洗涤剂采集的样品测量细胞质和核提取的蛋白质浓度。立即进行蛋白酶体活动测定(第 4 节)或西方印迹(第 5 节)。或者,样品可以储存在-80°C,直到需要为止。

3. 突触分数集合

注:该协议使用常见实验室化学品的预造库存解决方案,包括 1 M Tris (pH 7.5)、0.5 M EDTA、5 M NaCl 和 10% SDS。如果在蛋白酶体活性测定中使用端点,甘油和ATP可以添加到所有缓冲液中,以帮助防止在溶解过程中分解蛋白酶体复合物

  1. 使用 320 mM 蔗糖准备 TEVP 缓冲液。将 60 mL 的超纯(去离子和蒸馏)水添加到干净的 100 mL 烧杯中。
    1. 在烧杯中,加入1,300μL的1M Tris(pH 7.5),260μL的0.5M EDTA,100μL的蛋白酶抑制剂鸡尾酒,100μL磷酸酶抑制剂鸡尾酒和10.944克蔗糖。与搅拌棒混合,直到蔗糖完全溶解。
    2. 使用移液器将盐酸 (HCl) 滴到溶液中,使 pH 含量降至 +7.4。
    3. 将溶液转移到 100 mL 体积烧瓶。加入超纯水,将音量调至 100 mL。在冰上冷却最终溶液,直到需要。
  2. 准备同质化缓冲区。将 60 mL 的超纯(去离子和蒸馏)水添加到干净的 100 mL 烧杯中。
    1. 在烧杯中,加入 5,000 μL 的 1 M Tris (pH 7.5),3,000 μL 的 5 M NaCl,100 μL 蛋白酶抑制剂鸡尾酒,100 μL 磷酸酶抑制剂鸡尾酒和 2,000 μL 的 10% SDS。与搅拌棒混合。
      注:离子洗涤剂可以干扰蛋白酶体活性测定,导致蛋白酶体复合物变性。如果需要,可以降低 SDS 的体积,以帮助保留蛋白酶体功能。
    2. 使用移液器将 HCl 滴滴添加到溶液中,将 pHH 降至 +7.4。
    3. 将溶液转移到 100 mL 体积烧瓶。加入超纯水,将音量调至100 mL。将最终溶液储存在室温下;不要冷却,因为 SDS 会沉淀出解决方案。
  3. 从 -80 °C 冷冻箱中取出含有一半 ROI 的 1.5 mL 离心机。确保所使用的半球在每个实验组的提取条件中进行平衡。例如,在两组实验中,对每组前两个动物使用左半球,对后两个样本使用右半球,等等。
  4. 使用手术刀,将冷冻脑组织转移到2 mL玻璃铁氟龙均质器中。将 500 μL 的 TEVP 缓冲液添加到铁氟龙管中。
    1. 使用害虫B,使用15个笔画使同一组织均匀化,直到不存在固体物质的可见转移。每次描边时,使用车削运动(顺时针或逆时针)。
  5. 使用 1,000 μL 移液器,将均质样品转移到新的 1.5 mL 微离心管中。将样品在1,000 x g下离心10分钟,4°C。
  6. 收集上清液,并使用 1,000 μL 移液器转移到新的 1.5 mL 微离心管中。将样品在10,000 x g下离心10分钟,4°C。原始颗粒 (P1) 包含核和大碎屑,可以丢弃。
  7. 将上清液转移到新的1.5 mL微离心管中。这是一个细胞分数。向颗粒 (P2) 中加入 50 μL 的均质缓冲液,并通过移液重新悬浮,直到看不到固体材料。
  8. 在 20,000 x g下离心样品 10 分钟,4 °C。将上清液转移到新的1.5 mL微离心管中;这是粗突生膜(合成)分数。颗粒可以丢弃。
  9. 使用 Dc 蛋白测定法(根据制造商的说明)或使用离子洗涤剂收集的样品测量合成部分的蛋白质浓度。立即进行蛋白酶体活动测定(第 4 节)或西方印迹(第 5 节)。或者,样品可以储存在-80°C,直到需要为止。

4. 蛋白酶活性测定

注:蛋白酶体活性可以用20S蛋白酶体活动套件的稍改版本在均质脑组织中测量。这种测定不直接测量完整的26S蛋白酶体复合物的活性。相反,它测量 20S 内核的活动,这意味着它只能作为代理来了解内核本身的活动,而不是整个 26S 蛋白酶体复合体。这种测定的成功与反复的冻融周期和/或增加洗涤剂水平(尤其是离子)一样下降,并且需要使用具有 360/460(激励/发射)滤光片和加热能力高达 37°C 的板式读卡器。

  1. 板式读卡器设置:预热至 37 °C 并按住整个运行。
    1. 将激励设置为 360,将排放设置为 460。如果使用的 96 孔板清晰,则将光学位置设置为底部。如果使用深色/黑色 96 孔板,则将光学位置设置为顶部
    2. 将旧版读卡器型号设置为荧光读取选项下的自动增益;较新的型号是预设的。以 2 小时的时间对动能运行进行编程,每 30 分钟扫描(读取一次)。
  2. 用13.5 mL的超纯水重组套件中提供的10x测定缓冲液。将 14 μL 的 100 mM ATP 添加到现在的 1x 缓冲液中;这大大提高了样品中的蛋白酶体活性,提高了测定的可靠性。最后的20S测定缓冲液可以储存在冰上或4°C,直到需要,并稳定几个月。
  3. 使用 100 μL DMSO 的套件中提供的 AMC 标准重新构成 AMC 标准。在黑暗或低光照条件下执行此步骤,因为标准是光敏的。
  4. 在黑暗中或低光照条件下,使用重组标准创建 AMC 的支架曲线。
    1. 在单独的 0.5 mL 微离心管中,添加 AMC 标准的 16、8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4 和 0 μL,对应于 20、10、8、4、2、1、0.5 和 0 μM AMC 浓度。
    2. 在这些管中,按相同的顺序添加 84、92、93.6、96.8、98.4、99.2、99.6 和 100 μL 的 20S Assay 缓冲液。这将创建一系列高到低AMC浓度,用于板片读取器校准和分析同质样品中的蛋白酶体活性。
    3. 将所有稀释的标准储存在黑暗中的冰上,直到需要为止。
  5. 用65μL DMSO的试剂盒中提供的蛋白酶体基板(Suc-LLVY-AMC)重新构成。由于基板对光敏感,在黑暗或低光照条件下执行此步骤。使用 20S Asay 缓冲液在新的 1.5 mL 微离心管中,对蛋白酶基质进行 1:20 稀释。将稀释的基材储存在黑暗中的冰上,直到需要为止。
    注:例如,如果板具有 10 个样本和 1 个空白,则需要足够稀释的基板,以每孔 10 μL 的速度为 22 口孔(带重复的)。这相当于移液误差需要 220 μL = 30 μL,需要 12.5 μL 的基板和 237.5 μL 的 20S 分析缓冲液。
  6. 解冻所需样品(如果冻结),并将归一化量添加到 96 孔板。以重复项运行每个示例。所需样本量因组织制备而异。一般来说,10-20 μg足以满足任何亚细胞分数。
  7. 使用超纯水将样品井体积调至 80 μL。添加量取决于添加的样本量。例如,如果样品1为4.5 μL的蛋白质,样品2为8.7μL,则所需的水量分别为75.5μL和71.3μL。在两口单独的井中,单独加入80μL的水;这些将是Assay空白。
    注:为了限制由于移液错误而导致的蛋白质体积变化,蛋白质浓度可以归化为最小浓缩样品。这将允许在所有条件下使用相同的样本体积。
  8. 在每个井中添加 10 μL 的 20S 测定缓冲液,包括测定空白。此处推荐使用中继器/自动移液器,以确保油井的测定体积一致。
  9. 可选:在此阶段,如果需要,引入体外操作;这将要求每个样品每个处理有额外的2口井,包括车辆。如果是这样,在2个样品井中加入5-10 μ0μL的感兴趣的药物/化合物,在另外2口井中加入同等数量的控制/车辆。将板放在预加热板读取器上或放入 37°C 培养箱中 30 分钟。
  10. 关灯或进入暗室。将所有 100 μL 的稀释 AMC 标准添加到新井中;每个标准将有一个单一的井。
  11. 在黑暗中,向含有样品和测定空白的井中加入10μL的稀释蛋白酶基板,但不加入AMC标准。此处推荐使用中继器/自动移液器,以确保油井的测定体积一致。
  12. 将板放入板读取器中,然后启动动力学运行。
    注:在动力学运行期间,板不需要持续搅拌,但是,用户可以根据需要选择
  13. 在动能运行结束时,将原始 360/460 荧光值导出到 Microsoft Excel。
    1. 所有 5 次扫描的每个标准、每个样本和"检测空白"的重复井的平均值。在样品扫描中,原始荧光值应增加,但标准值和检测空白值应保持稳定(或略有下降)。
    2. 以最高的AMC标准井平均值,除以已知浓度(20 μM)。此值除以测定中使用的样品浓度,以获得标准化的 AMC 值。对于每个样本和 Assay 空白平均值,除以标准化 AMC 值。
    3. 取此最终值,除以测定中使用的样品浓度,以获得每个样本的归一化值和测定空白。对所有 5 次扫描执行此操作。
    4. 从所有 5 次扫描的每个规范化采样值中减去规范化的"Assay 空白"值。

5. 链接特异性蛋白质的定量

  1. 从啮齿动物脑组织收集的不同亚细胞分体的多种多聚二苯基金标记的定量,应使用各种标准的西方印迹方案与独特的连杆特异性多聚二苯基丁抗体结合使用。
    1. 对于变性,根据制造商的说明,将标准化样品与相同体积的Laemmli样品缓冲液混合,并辅以β-美尔卡托乙醇,按体积百分比进行。
    2. 对于所有单体化和多聚体化修饰的定量,无论连结如何,使用泛泛泛基体抗体。
    3. 要识别所有多聚基化蛋白,请使用不与单一泛化交叉反应的泛基蛋白抗体。
    4. 对于连杆特异性多聚体化,使用抗体,可以检测以酶-27、莱辛-48、莱辛-63和线性(M1)多聚体化。
  2. 为了防止开发之间的交叉污染,这可能导致误报或干扰不同泛基物修饰的成像,使用0.1 M NaOH在开发之间剥离膜10分钟。
    1. 用 0.1% 补间洗涤 TBS 中的膜,10 分钟,然后重新封堵(使用西方防雷协议中首选的任何阻滞剂)。
    2. 用二级抗体孵育膜并重新发育,以确认膜正确剥离初级和次级抗体。
    3. 推荐:为了成功开发不同无污染的泛性抗体,请使用荧光或近红外成像系统。这通常可以防止抗体之间的结转。
  3. 一些泛于西方的斑点图像将提供不同波段的列(如 M1),而其他则产生一个像涂抹一样的图案,很少或没有清晰的线条(与 K48 相同)。为了量化图像中泛泛的西血化,在柱周围画一个盒子,延伸整个分子标准阶梯。
    1. 如果泛化染色确实延伸到整个梯子上,则向上(或向下)调整盒子;这在流酶-48修饰中很常见,在亚细胞间之间差异很大。
    2. 减去背景,该背景计算为紧邻所有侧柱的背景的平均光学密度。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

使用此处描述的程序,从大鼠大脑的侧杏仁核中收集核、细胞质和突触分数(图1)。单个馏分的纯度通过西方印迹得到确认,用抗体对应富于或耗尽的莱沙中的蛋白质进行抗体探测。在收集粗突触分数的第一个半球,突触密度蛋白95(PSD95)存在于突触中,但不是核,细胞质水平较低(图2A)。这与先前的工作一致,表明突触分数制剂分离了前突触和午睡组分25。相反,核蛋白组蛋白H3存在于核中,而不是突触,在细胞质中具有较低水平(图2B)。PSD95和H3在细胞质中的存在与其细胞质翻译一致。细胞质蛋白β-图布林存在于我们的细胞质部分中,但核溶酶(图2C)中基本不存在,突触区域水平较低。这表明我们能够产生一个核分数,基本上不存在细胞质蛋白。突触区域中图布林的存在与以前的研究26一致。所有三个分数都显示了类似的外壳保持蛋白β-actin(图2D),这是用作载荷控制。这些结果共同证实,从单个大鼠侧杏仁核中收集的核、细胞质和突触部分的纯度。

接下来,使用所述的体外20S蛋白酶体活性测定的改性版本,确认所有解酶为功能性蛋白酶体活性。在所有莱萨中,测定的成功被定义为从第一次扫描(0分钟)到第五次/最终扫描(120分钟)检测到的原始荧光单位(RFU)的增加。对于所有这些分析,10 μM AMC 被用作原始荧光单元 (RFU) 正常化的最高标准。在粗突触分数中,RFU 在扫描 5 时达到峰值(图 3A),导致归一化 RFU 略低于 0.1(图 3B)。在细胞质分数中,RFU在扫描(图3C)之间增加,最终归一化RFU为±1.6(图3D)。核分数还显示了RFU(图3E)中与时间相关的变化,最终归一化RFU为0.3(图3F)。跨隔间蛋白酶体活性的差异可能反映了该部分中蛋白酶体的可用性,这些部分通常最丰富的细胞质和核27,这些腔室的活性水平在我们制备。突触区域的最低活性水平与使用离子洗涤剂收集的唯一溶酶一致,由于变性条件更严,可减少蛋白酶体活性。重要的是,RFU没有在测定空白或解酶(突触)中随时间增加,用高度特异性和强效蛋白酶体抑制剂clasto-lactacyin-β-乳酮(图3G,β-乳胶),显示最终标准化的RFU水平分别为 0.01 和 0.001 (图 3H)。这表明,观察到的RFU变化是专门由于蛋白酶的活性,而不是其他蛋白酶。此外,在实验条件下分析时,在学习后,横向杏仁核中的核体(但不是细胞质)蛋白酶体活性增加,这与突触蛋白酶体活性下降同时发生。对照动物的比较(图4)。总体而言,这些结果证实蛋白酶体活性可以准确地测量从单个大鼠侧杏仁核收集的所有三个亚细胞分数。

蛋白酶体活性测定的优点之一是,在添加蛋白酶体基质之前,可以在样品中引入体外操作,从而能够识别能够调节蛋白酶体的特定分子。特定的亚细胞分数。作为这方面的一个例子,CaMKII(钙/镇静素依赖蛋白激酶II)的作用被评估在突触部分,这是收集的最苛刻的变性赖糖,因为CaMKII被认为调节突触的蛋白酶功能。使用CaMKII抑制剂myr-AIP(myistotoedautocamtide-2相关抑制肽)孵育30分钟,导致测定蛋白酶体活性显著减少,仅达到未治疗水平+61%的水平控件 (图 5A)。相反,对细胞质应用的相同操作并没有导致车辆处理井的蛋白酶体活性发生变化(图5B)。这些结果证实蛋白酶体活性可以在体外进一步操作,并且这种操作可以有不同的效果,具体取决于收集的亚细胞分数。

除了量化蛋白酶体活性外,所述协议还可用于利用西方斑点程序测量各种泛性修饰中的亚细胞差异。需要注意的是,可检测到的泛基体标记受到联动特异性抗体的可用性的限制,目前这些抗体包括大鼠的K48、K63和M1(注意:K27抗体可用,但未在任何在各种条件下,侧杏仁核部分或整个细胞分量)。在所有亚细胞分数中检测到整体多聚体化、无降解线性/M1和K63泛化和降解特异性K48多聚化。重要的是,当分析不同的实验条件时,整体(图6A)、线性(图6B)、K63(图6C)和K48(图6D)侧杏仁核中的多聚体素化增加核分数后学习相比控制动物。同时,在细胞质区,整体多聚体化减少,K48通血性增加,同时突触K63通血减少。总体而言,这些结果表明,在同一动物亚细胞差异中,链接特异性蛋白质的泛化可以准确检测。

Figure 1
图 1:大鼠脑组织亚细胞分馏的原理图。提取啮齿动物大脑,解剖大脑区域,分割半球。使用一系列缓冲液和离心步骤,从一个半球收集核和细胞质分数,而从另一个半球收集粗突触分数。然后,这两个馏分用于蛋白酶体活性测定和西方印迹,以测定蛋白质多脂化水平。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:确认粗突触、核质和细胞质分数纯度。(A) 突触蛋白后突触密度蛋白 95 (PSD95; 1:1,000) 存在于突触中,但细胞质中水平较低的核分数。(B) 组蛋白 H3 (1:500) 存在于核体中,但不出现在突触中,在细胞质中表达较低。(C) β-图布林 (1:1,000) 存在于细胞质中,但基本上不存在于核中,在突触解结中表达较低的分数。(D) 所有亚细胞间均存在管家蛋白β-actin (1:1,000)。区域指示目标蛋白的预期大小。这个数字已由Orsi,S.A.等人21修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:从同一动物的侧杏仁核中收集的核体、细胞质和突触部分中的蛋白酶体活性的定量。在体外蛋白酶体活性测定期间,检测到的相对荧光单位(RFU)从突触(A)、细胞质(C)和核(E)分数的测定开始(扫描1)到末端(扫描5)增加。从基线的这种变化的量化表明,突触(B)中的归一化RFU值(相对于10μM AMC)为0.1,细胞质(D)为1.6,核(F)分数为0.3。蛋白酶体抑制剂βlac阻止RfUs在整个会话中改变 (G-H).这个数字已由Orsi,S.A.等人21修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:同一动物侧杏仁核中蛋白酶体活性的亚细胞差异。与对照组相比,在训练(恐惧条件)动物身上检测到核蛋白酶体活性增加,这与突触分数内活动的减少相对应。细胞质蛋白原体活性保持在基线。•P < 0.05 从控制。这个数字已由Orsi,S.A.等人21修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:在体外操作收集的突触和细胞质部分中的蛋白酶体活性。通过抑制剂AIP的CaMKII信号的体外操作减少了突触(A)中的蛋白酶体活性,但不是细胞质(B),从大鼠侧杏仁核中分馏。这个数字已由Jarome,T.J.等人23修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图 6:学习后同一动物侧杏仁核中连杆特异性蛋白的亚细胞差异。(A) 学习后核分数的整体泛化增加,这与细胞质分数的减少有关。(B) 在核中线性泛化增加,但不是细胞质或突触,在学习后的分数。(C) 学习后,核分数中的 K63 泛化增加,这与突触分数的减少有关。(D) K48在核质和细胞质中增加,但不突触,在学习后分数增加.•P < 0.05 从控制。所有获得的泛基蛋白光密度均归一化为β-actin水平(A中低代表性的西方斑点图像),用作载荷控制。这个数字已由Orsi,S.A.等人21修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

在这里,我们演示了一种有效的方法,用于量化同一动物中不同亚细胞腔中泛基蛋白酶体活性的变化。目前,测量泛基蛋白蛋白酶体系统活性亚细胞变化的大多数尝试被限制在每个样品的单个隔间内,因此需要重复实验。这会导致动物生命的巨大成本和损失。我们的协议通过分裂半球来缓解这个问题,允许从同一动物的每个半球收集不同的细胞分数。使用这个协议,我们能够首次证明,在同一动物泛素-蛋白酶体活性差异变化的核,细胞质和突触分数响应学习21。

此处描述的协议的主要限制是它依赖于获得的脑组织(样本)量。例如,如上所述,该协议要求分割给定大脑区域的半球。然而,这可能并不总是可能的,例如,在某些区域,只有一个半球存在。在这些情况下,可以通过首先使突触分数步段中使用的 TEVP 缓冲区中的整个大脑区域进行同质化来修改该协议,因为此缓冲液不含所有变性剂。然后,样品可以按体积分成两个相等的部分。第一部分可用于突触分数,遵循所述协议。在样品的后半部分,非离子洗涤剂NP-40可添加到0.05%的最终浓度中,然后按照第2.6节所述离心。这将允许将细胞质蛋白分离到上清和核蛋白中,从而在第2节中的剩余步骤之后进一步分离。组织数量的另一个担忧是,一些大脑区域的大小非常小,如前皮层。然而,在这些情况下,仍可以通过减少使用的缓冲器的体积来使用上述协议,而缓冲器的体积必须根据收集的大脑区域的大小进行经验确定。因此,该协议可以修改到甚至更困难的大脑区域,其中的组织较少可用。

我们在此概述的协议的主要优点之一是,它使用可在大多数设施中找到的通用实验室设备和试剂,使这种方法即使在预算有限或资源有限时也能修改。此外,虽然我们概述了此协议作为测量泛基蛋白-蛋白酶体信号传递中的亚细胞变化的方法,但这种方法也可以应用于了解细胞定位和功能的任何其他蛋白质或细胞过程是重要的。因此,该协议可以有广泛的应用,了解特定蛋白质或复合物在学习和记忆或不同疾病状态期间的亚细胞功能。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了农业和生命科学学院和弗吉尼亚理工大学科学学院的启动基金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129, (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3, (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15, (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38, (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169, (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45, (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13, (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30, (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54, (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48, (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17, (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6, (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14, (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24, (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319, (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21, (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79, (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16, (20), 6331-6341 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics