Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

Neuroscience

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Summary

Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.

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McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

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Abstract

El sistema de ubiquitina-proteasoma es un regulador clave de la degradación de proteínas y una variedad de otros procesos celulares en eucariotas. En el cerebro, los aumentos en la actividad ubiquitina-proteasoma son críticos para la plasticidad sináptica y la formación de la memoria y los cambios aberrantes en este sistema se asocian con una variedad de trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos. Uno de los problemas en el estudio de la ubiquitina-proteosoma funcionamiento en el cerebro es que está presente en todos los compartimentos celulares, en el que las dianas de la proteína, el papel funcional y los mecanismos de regulación pueden variar ampliamente. Como resultado, la capacidad de comparar directamente la orientación a la proteína ubiquitina cerebral y la actividad catalítica proteasoma en diferentes compartimentos subcelulares dentro del mismo animal es fundamental para comprender completamente cómo el SAI contribuye a la plasticidad sináptica, memoria y enfermedades. El método descrito aquí permite la recolección de fracciones sinápticas nucleares, citoflásmáticas y brutas del mismo cerebro de roedor (rata), seguida de la cuantificación simultánea de la actividad catalítica proteasome (indirectamente, proporcionando actividad del núcleo de proteasoma únicamente) y el etiquetado de proteína de ubiquitina específica para varillajes. Por lo tanto, el método se puede utilizar para comparar directamente los cambios subcelulares en la actividad ubiquitina-proteosoma en diferentes regiones cerebrales en el mismo animal durante la plasticidad sináptica, la formación de la memoria y diferentes estados de enfermedad. Este método también se puede utilizar para evaluar la distribución subcelular y la función de otras proteínas dentro del mismo animal.

Introduction

El sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) es una compleja red de estructuras y ligasas de proteínas interconectadas que controla la degradación de la mayoría de las proteínas de corta duración en las células1. En este sistema, las proteínas se marcan para la degradación u otros procesos/fates celulares por el pequeño modificador ubiquitina. Una proteína diana puede adquirir 1-7 modificaciones de ubiquitina, que pueden unirse en uno de los siete sitios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48y K63) o la N-terminal metionina (M1; como se conoce como lineal) en la ubiquitina 2 anterior. Algunas de estas etiquetas de poliubiquitina son específicas de la degradación (K48)3, mientras que otras son en gran parte independientes del proceso de degradación de proteínas (M1)4,5,6. Por lo tanto, el proceso de ubiquitinación de proteínas es increíblemente complejo y la capacidad de cuantificar los cambios en una etiqueta de poliubiquitina específica es fundamental para entender en última instancia el papel de esa modificación dada en el funcionamiento celular. Complicando aún más el estudio de este sistema, el proteosoma,que es la estructura catalítica del SAI 7, ambos degradan las proteínas pero también pueden participar en otros procesos no proteolíticos8,9. No es de extrañar entonces, desde su descubrimiento inicial, la actividad ubiquitina-proteasoma normal y aberrante se ha implicado en la formación de la memoria a largo plazo y una variedad de estados de la enfermedad, incluyendo muchos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos trastornos10,11. Como resultado, los métodos que pueden cuantificar de manera efectiva y eficiente la actividad del SAI en el cerebro son fundamentales para entender en última instancia cómo se desreglamenta este sistema en los estados de la enfermedad y el desarrollo final de opciones de tratamiento dirigidas a la ubiquitina y/o proteosoma.

Hay una serie de problemas en la cuantificación de la actividad ubiquitina-proteasoma en el tejido cerebral de ratas y ratones, que son los sistemas modelo más comunes utilizados para estudiar la función del SAI, incluyendo 1) la diversidad de modificaciones de ubiquitina, y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) y regulación diferencial del funcionamiento del SAI en los compartimentos subcelulares12,13,14. Por ejemplo, muchas de las primeras demostraciones de la función ubiquitina-proteasoma en el cerebro durante la formación de la memoria utilizaron lisatos de células enteras e indicaron aumentos dependientes del tiempo tanto en la ubiquitinación de proteínas como en la actividad de proteasoma15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Sin embargo, recientemente encontramos que la actividad ubiquitina-proteasoma varió ampliamente entre los compartimentos subcelulares en respuesta al aprendizaje, con aumentos simultáneos en algunas regiones y disminuciones en otras, un patrón que difiere significativamente de lo que se informó anteriormente en las lisades de células enteras21. Esto es consistente con la limitación de un enfoque de células enteras, ya que no puede disociar la contribución de los cambios en la actividad de UPS en diferentes compartimentos subcelulares. Aunque estudios más recientes han empleado protocolos de fracción sináptica para estudiar el SAI específicamente en sinapsis en respuesta al aprendizaje22,23,24, los métodos utilizados ocluy la capacidad de medir nuclear y citoplasma ubiquitina-proteosoma cambios en el mismo animal. Esto resulta en una necesidad innecesaria de repetir experimentos varias veces, recopilando una fracción subcelular diferente en cada uno. Esto no sólo resulta en una mayor pérdida de vidas de animales, sino que elimina la capacidad de comparar directamente la actividad de UPS en diferentes compartimentos subcelulares en respuesta a un evento dado o durante un estado específico de la enfermedad. Teniendo en cuenta que las dianas proteicas de la ubiquitina y el proteosoma varían ampliamente a lo largo de la célula, entender cómo la señalización ubiquitina-proteosoma difiere en distintos compartimentos subcelulares es fundamental para identificar el papel funcional del SAI en el SAI cerebro durante la formación de la memoria y trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos.

Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado recientemente un procedimiento en el que se podrían recolectar fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas para una región cerebral determinada del mismo animal21. Además, para tener en cuenta la cantidad limitada de proteína que se puede obtener de la recolección de múltiples fracciones subcelulares de la misma muestra, optimizamos protocolos previamente establecidos para analizar la actividad de proteasoma in vitro y la actividad específica de la vinculación ubiquitinación de proteínas en células lysed recogidas del tejido cerebral de roedores. Usando este protocolo, pudimos recopilar y comparar directamente los cambios dependientes del aprendizaje en la actividad del proteasoma, K48, K63, M1 y los niveles generales de poliubiquitinación de proteínas en el núcleo y el citoplasma y en las sinapsis en la amígdala lateral de ratas. Aquí, describimos en detalle nuestro procedimiento (Figura1), que podría mejorar significativamente nuestra comprensión de cómo el SAI está involucrado en la formación de la memoria a largo plazo y varios estados de la enfermedad. Sin embargo, cabe señalar que la actividad de proteasoma in vitro discutida en nuestro protocolo, aunque ampliamente utilizado, no mide directamente la actividad de los complejos completos de proteasoma 26S. Más bien, este ensayo mide la actividad del núcleo 20S, lo que significa que sólo puede servir como un apoderado para entender la actividad del núcleo en sí en lugar de todo el complejo de proteasoma 26S.

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Protocol

Todos los procedimientos, incluidos los sujetos animales, han sido aprobados por el Instituto Politécnico de Virginia y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal (IACUC).

1. Recolección y disección de tejido cerebral de roedores

NOTA: Este protocolo se puede aplicar a una variedad de regiones cerebrales y se utiliza con varios procedimientos de recolección de tejido. A continuación se muestra el procedimiento utilizado en nuestro laboratorio para subcelulares de tejido cerebral de rata, utilizando 8-9 semanas de edad macho Ratas Sprague Dawley. Para procesar todos los compartimentos celulares en el mismo animal, sección 1.3. debe seguirse independientemente del procedimiento de recolección de tejido utilizado.

  1. Extrae el cerebro de la rata y colócalo en una taza criogénica pre-enfriada en hielo seco. Congele el cerebro con hielo seco, o use nitrógeno líquido si está disponible, y transfiera a un congelador de -80 oC. Los cerebros se pueden diseccionar el mismo día o en un momento posterior.
  2. Retire el cerebro congelado de la copa criogénica y colóquelo en una matriz cerebral de rata enfriada con hielo seco. Cada ranura de la matriz corresponde a 0,5 mm, que se puede utilizar para determinar la ubicación aproximada de la región de interés (ROI).
    1. Usando un Atlas de Cerebro de Rata, inserte una cuchilla de afeitar en la matriz inmediatamente delante (anterior) del inicio previsto del ROI. A continuación, inserte una cuchilla de afeitar inmediatamente en el extremo previsto (posterior) del ROI.
    2. Retire la rebanada entre las cuchillas de afeitar usando un bisturí y colóquela sobre un portaobjetos de microscopio refrigerado sobre hielo seco. Normalmente, las secciones tienen un grosor de 2-3 mm, pero esto varía en función del ROI.
  3. Usando un bisturí, disecciona el ROI un hemisferio a la vez. Coloque cada hemisferio en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 ml pre-enfriados sobre hielo seco. El tejido congelado se puede utilizar inmediatamente para el fraccionamiento subcelular o procesarse en un momento posterior si se almacena a -80 oC.

2. Extracción nuclear y citoplasma

NOTA: Este protocolo utiliza soluciones de stock prefabricadas de productos químicos de laboratorio comunes, incluyendo 0.1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 M Dithiothreitol (TDT), 0.5 M ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) y 50% glicerol. Si el punto final se utiliza en ensayos de actividad de proteasoma, el glicerol y el ATP se pueden agregar a todos los búferes para ayudar a evitar el desmontaje de complejos de proteasoma durante la lisis.

  1. Prepare el búfer de Lisis. Añadir 8,63 ml de agua ultrapura (desionizada y destilada) a un tubo cónico estéril de 15 ml.
    1. Al tubo cónico, añadir 1.000 ml de HEPES de 0,1 M, 15 ml de MgCl, 100 ml de 1 M de TDT y 50 ml de 10% NP-40.
    2. Añadir 100 l de cóctel inhibidor de proteasa y 100 l de cóctel inhibidor de fosfatasa. Reórtice brevemente la solución para mezclar y colocar sobre hielo húmedo para enfriar. Tenga en cuenta que la solución puede tener un tinte amarillo del inhibidor de la fosfatasa.
      NOTA: El uso de inhibidores de la proteasa es esencial para preservar las proteínas y garantizar la especificidad del ensayo de actividad proteasoma in vitro. Sin embargo, estos inhibidores también pueden resultar en una ligera reducción de la actividad de proteasoma, lo que significa que la actividad medida en el ensayo in vitro puede ser una subestimación de los niveles reales de actividad.
  2. Prepare el búfer de extracción. Añadir 5.925 ml de agua ultrapura (desionizada y destilada) a un tubo cónico estéril de 15 ml.
    1. Al tubo cónico, añadir 2.000 ml de 0,1 M DE HEPES, 1250 ml de 50% de glicerol, 15 ml de 1 M MgCl2, 5 ml de TDT de 1 M, 5 ml de EDTA de 0,5 M y 600 ml de 5 M DeNaCl.
    2. Añadir 100 l de cóctel inhibidor de proteasa y 100 l de cóctel inhibidor de fosfatasa. Reórtice brevemente la solución para mezclar y colocar sobre hielo húmedo para enfriar. Tenga en cuenta que la solución puede tener un tinte amarillo del inhibidor de la fosfatasa.
  3. Retire el microtubo centrífugo de 1,5 ml que contiene un hemisferio del ROI del congelador de -80 oC. Asegúrese de que el hemisferio utilizado esté contrarreequilibrado a través de las condiciones de extracción para cada grupo experimental. Por ejemplo, en un experimento de dos grupos, utilice el hemisferio izquierdo para los dos primeros animales de cada grupo y el hemisferio derecho para las dos muestras siguientes, etc.
  4. Con un bisturí, transfiera el tejido cerebral congelado a un homogeneizador de teflón de vidrio de 2 ml. Añadir 500 l de tampón de lysis al tubo de teflón.
    1. Usando el pestillo B, homogeneizar el mismo tejido usando 15 golpes hasta que no haya ninguna cantidad visible de material sólido. Utilice un movimiento de giro (en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj) durante cada carrera.
  5. Con una pipeta de 1.000 ml, transfiera la muestra homogeneizada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque el tubo sobre hielo húmedo e incubar durante 30 minutos.
  6. Colocar el tubo en microcentrífuga y girar durante 10 min a 845 x g y 4 oC. Después de la finalización, retire cuidadosamente el sobrenadante pipeteando y colóquelo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml; se trata de la Fracción Citoplasmática, que se puede almacenar en hielo o a 4oC hasta la Sección 2.9.
  7. Añadir 50 l de tampón de extracción al pellet resultante y resuspender mediante pipeteo. No vórtice el pellet. Coloque el tubo que contiene el pellet resuspendido sobre hielo e incubar durante 30 minutos.
  8. Colocar el tubo en microcentrífuga y girar durante 20 min a 21.456 x g, 4 oC. Después de la finalización, retire cuidadosamente el sobrenadante pipeteando y colóquelo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml; esta es la Fracción Nuclear. El pellet ahora se puede desechar.
  9. Mida la concentración proteica de las extracciones citóflasmáticas y nucleares utilizando el ensayo de proteínas Dc (de acuerdo con las instrucciones del fabricante), o cualquier ensayo equivalente para muestras recogidas con detergentes no iónicos. Proceder inmediatamente al ensayo de actividad de proteasoma (Sección 4) o hincha occidental (Sección 5). Alternativamente, las muestras se pueden almacenar a -80 oC hasta que sea necesario.

3. Colección de fracciones sinápticas

NOTA: Este protocolo utiliza soluciones de stock prefabricadas de productos químicos de laboratorio comunes, incluyendo 1 M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA, 5 M NaCl y 10% SDS. Si el punto final se utiliza en ensayos de actividad de proteasoma, el glicerol y el ATP se pueden agregar a todos los búferes para ayudar a prevenir el desmontaje de complejos de proteasoma durante la lisis

  1. Prepare el búfer TEVP con sacarosa de 320 mM. Añadir 60 ml de agua ultrapura (desionizada y destilada) a un vaso limpio de 100 ml.
    1. Al vaso de precipitados, añadir 1.300 ml de 1 M Tris (pH 7,5), 260 ml de 0,5 M DE EDTA, 100 ml de cóctel inhibidor de la proteasa, 100 ml de cóctel inhibidor de fosfatasa y 10,944 g de sacarosa. Mezclar con una barra de agitación hasta que la sacarosa se disuelva por completo.
    2. Lleve el pH a 7,4 mediante la adición de ácido clorhídrico (HCl) en forma de gota a la solución utilizando una pipeta.
    3. Transfiera la solución a un matraz volumétrico de 100 ml. Lleve el volumen a 100 ml añadiendo agua ultrapura. Enfríe la solución final sobre hielo hasta que sea necesario.
  2. Prepare el búfer de homogeneización. Añadir 60 ml de agua ultrapura (desionizada y destilada) a un vaso limpio de 100 ml.
    1. A el vaso de precipitados, añadir 5.000 ml de 1 M Tris (pH 7,5), 3.000 ml de 5 M de NaCl, 100 ml de cóctel inhibidor de proteasa, 100 ml de cóctel inhibidor de fosfatasa y 2.000 ml de 10% de SDS. Mezclar con una barra de agitación.
      NOTA: Los detergentes iónicos pueden interferir con los ensayos de actividad de proteasoma al resultar en la desnaturalización del complejo de proteasoma. El volumen de SDS podría reducirse para ayudar a preservar la función de proteasoma si se desea.
    2. Lleve el pH a 7,4 mm agregando HCl en sentido de gota a la solución utilizando una pipeta.
    3. Transfiera la solución a un matraz volumétrico de 100 ml. Lleve el volumen a 100 ml añadiendo agua ultrapura. Almacene la solución final a temperatura ambiente; no se enfríe, ya que SDS se precipitará fuera de la solución.
  3. Retire la centrífuga de 1,5 ml que contiene un hemisferio del ROI del congelador de -80 oC. Asegúrese de que el hemisferio utilizado esté contrarreequilibrado a través de las condiciones de extracción para cada grupo experimental. Por ejemplo, en un experimento de dos grupos, utilice el hemisferio izquierdo para los dos primeros animales de cada grupo y el hemisferio derecho para las dos muestras siguientes, etc.
  4. Con un bisturí, transfiera el tejido cerebral congelado a un homogeneizador de teflón de vidrio de 2 ml. Añadir 500 l de tampón TEVP al tubo de teflón.
    1. Usando el pestillo B, homogeneizar el mismo tejido usando 15 golpes hasta que no haya transferencias visibles de material sólido. Utilice un movimiento de giro (en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj) durante cada carrera.
  5. Con una pipeta de 1.000 ml, transfiera la muestra homogeneizada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar la muestra a 1.000 x g durante 10 min, 4oC.
  6. Recoja el sobrenadante y transfiera a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una pipeta de 1.000 ml. Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 10 min, 4oC. El pellet original (P1) contiene núcleos y los desechos grandes y se puede desechar.
  7. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta es una fracción citosólica. Añadir 50 s de tampón de homogeneización al pellet (P2) y resuspender mediante pipeteo hasta que no haya material sólido visible.
  8. Centrifugar la muestra a 20.000 x g durante 10 min, 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml; esta es la Fracción de Membrana Sinaptosomal Bruta (Sináptica). El pellet se puede desechar.
  9. Mida la concentración proteica de la fracción sináptica utilizando el ensayo de proteínadc (de acuerdo con las instrucciones del fabricante), o cualquier ensayo equivalente para las muestras recogidas con detergentes iónicos. Proceder inmediatamente al ensayo de actividad de proteasoma (Sección 4) o hincha occidental (Sección 5). Alternativamente, las muestras se pueden almacenar a -80 oC hasta que sea necesario.

4. Ensayo de actividad proteasoma

NOTA: La actividad de proteasoma se puede medir en el tejido cerebral homogeneizado utilizando una versión ligeramente modificada del kit de actividad de proteasoma 20S. Este ensayo no mide directamente la actividad de los complejos de proteasoma 26S completos. Más bien, mide la actividad del núcleo 20S, lo que significa que sólo puede servir como un proxy para entender la actividad del núcleo en sí en lugar de todo el complejo de proteasoma 26S. El éxito de este ensayo disminuye con ciclos repetidos de congelación y/o aumento de los niveles de detergentes, particularmente iónicos, y requiere el uso de un lector de placas con un conjunto de filtros 360/460 (excitación/emisión) y capacidades de calentamiento de hasta 37 oC.

  1. Ajustes del lector de placas: Precalentar a 37 oC y mantener a través de la ejecución.
    1. Ajuste la excitación a 360 y la emisión a 460. Si la placa de 96 pocillos utilizada es transparente, ajuste la posición de la óptica en Inferior. Si se utiliza una placa de pozo 96 oscura/negra, ajuste la posición de la óptica en Superior.
    2. Establezca los modelos de lector esanterior en Auto-Gain bajo las opciones de lectura fluorescente; modelos más nuevos están preestablecidos para esto. Programe una carrera cinética con un tiempo de 2 h, escaneando (leyendo) cada 30 minutos.
  2. Reconstituir el tampón de ensayo 10x suministrado en el kit con 13,5 ml de agua ultrapura. Agregue 14 l de 100 mM de ATP al búfer ahora 1x; esto mejora significativamente la actividad de proteasoma en las muestras y mejora la fiabilidad del ensayo. El tampón final del ensayo 20S se puede almacenar en hielo o a 4 oC hasta que sea necesario y es estable durante varios meses.
  3. Reconstituir el estándar AMC suministrado en el kit con 100 l de DMSO. Realice este paso en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el estándar es sensible a la luz.
  4. Cree una curva de soporte de AMC utilizando el estándar reconstituido, en la oscuridad o en condiciones de poca luz.
    1. En tubos de microcentrífuga separados de 0,5 ml, añada 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 y 0 ml de la norma AMC, que corresponde a la concentración de AMC de 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 y 0 M.
    2. A estos tubos, en el mismo orden, agregue 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 y 100 l de búfer de ensayo 20S. Esto crea una serie de concentraciones de AMC altas a bajas, que se utilizarán para la calibración del lector de placas y el análisis de la actividad proteosoma en las muestras homogeneizadas.
    3. Almacene todos los estándares diluidos en hielo en la oscuridad hasta que sea necesario.
  5. Reconstituir el sustrato de proteosoma (Suc-LLVY-AMC) suministrado en el kit con 65 l de DMSO. Realice este paso en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el sustrato es sensible a la luz. Cree una dilución 1:20 del sustrato de proteosoma en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando un tampón de ensayo 20S. Almacene el sustrato diluido en hielo en la oscuridad hasta que sea necesario.
    NOTA: Por ejemplo, si la placa tendrá 10 muestras y 1 en blanco, necesitará suficiente sustrato diluido para 22 pocillos (con duplicados) a 10 ol por pocillo. Esto equivale a una necesidad de 220 l + 30 l para errores de pipeteo, que requieren 12,5 ml de sustrato y 237,5 l de tampón de ensayo de 20S.
  6. Descongelar las muestras deseadas (si están congeladas) y añadir una cantidad normalizada a una placa de 96 pocillos. Ejecute cada ejemplo en duplicados. La cantidad de muestra necesaria varía en función de la preparación del tejido. Por lo general, 10-20 g es suficiente para cualquier fracción subcelular.
  7. Lleve el volumen del pozo de muestra a 80 l con agua ultrapura. La cantidad agregada depende del volumen de la muestra agregada. Por ejemplo, si la muestra 1 fue de 4,5 ml de proteína y la muestra 2 fue de 8,7 l, la cantidad de agua necesaria será de 75,5 ml y 71,3 l, respectivamente. En dos pozos separados, agregue 80 s de agua solo; estos serán los Assay Blanks.
    NOTA: Con el fin de limitar los cambios en el volumen de proteínas debido a errores de pipeteo, las concentraciones de proteínas se pueden normalizar a la muestra menos concentrada. Esto permitirá el uso del mismo volumen de muestra en todas las condiciones.
  8. Agregue 10 s de búfer de ensayo de 20S a cada poca, incluidos los espacios en blanco de ensayo. Aquí se recomienda una pipeta de repetidor/automatizada para garantizar un volumen de ensayo constante en los pozos.
  9. Opcional: En esta etapa, introducir manipulaciones in vitro si se desea; esto requerirá que cada muestra tenga 2 pozos adicionales por tratamiento, incluido el vehículo. Si es así, añada 5-10 l de fármaco/compuesto de interés a 2 de los pozos de muestra y un volumen equivalente de control/vehículo a otros 2 pozos. Coloque la placa en el lector de placas precalentado o en una incubadora de 37 oC durante 30 minutos.
  10. Apague las luces o entre en una habitación oscura. Añadir todos los 100 s de estándares AMC diluidos a un nuevo pozo; cada estándar tendrá un solo pozo.
  11. En la oscuridad, añadir 10 l de sustrato de proteosoma diluido a los pozos que contengan muestras y espacios en blanco de ensayo, pero no al estándar AMC. Aquí se recomienda una pipeta de repetidor/automatizada para garantizar un volumen de ensayo constante en los pozos.
  12. Coloque la placa en el lector de placas e inicie el funcionamiento cinético.
    NOTA: La placa no necesita estar bajo agitación constante durante la carrera cinética, sin embargo, el usuario puede elegir si lo desea
  13. Al final de la ejecución cinética, exporte valores fluorescentes sin procesar 360/460 a Microsoft Excel.
    1. Promedio de pozos duplicados para cada estándar, cada muestra y el ensayo en blanco para los 5 escaneos. Los valores fluorescentes sin procesar deben aumentar en todas las exploraciones de las muestras, pero se mantienen estables (o disminuyen ligeramente) para los estándares y las espacios en blanco de ensayo.
    2. Tome el estándar de AMC más alto promedio de pozo y dividir por la concentración conocida (20 M). Divida este valor por la concentración de muestra utilizada en el ensayo para obtener el valor AMC estandarizado. Para cada muestra y el promedio de Ensayo en blanco, divida por el valor de AMC estandarizado.
    3. Tome este valor final y divida por la concentración de muestra utilizada en el ensayo para obtener el valor normalizado para cada muestra y el ensayo en blanco. Haga esto para los 5 escaneos.
    4. Reste el valor normalizado de Ensayo en blanco de cada valor de muestra normalizado para los 5 exámenes.

5. Cuantificación de la ubiquitinación de proteínas específicas de la vinculación

  1. La cuantificación de diversas etiquetas de poliubiquitina en diferentes fracciones subcelulares recogidas del tejido cerebral de roedores debe realizarse utilizando una variedad de protocolos de hinchazón occidentalestándar en combinación con anticuerpos únicos de poliubiquitina específicos de enlace.
    1. Para la desnaturalización, mezcle las muestras normalizadas con un volumen igual de tampón de muestra de Laemmli complementado con mercaptoetanol a un porcentaje del 5% en volumen, según las instrucciones del fabricante.
    2. Para la cuantificación de todas las modificaciones de monoubiquitinación y poliubiquitinación independientemente del enlace, utilice un anticuerpo pan-ubiquitina.
    3. Para reconocer todas las proteínas poliubiquitinadas, utilice un anticuerpo de ubiquitina que no reaccione cruzadamente con la monoubiquitinación.
    4. Para la poliubiquitinación específica del enlace, utilice anticuerpos que puedan detectar lisina-27, lisina-48, lisina-63 y poliubiquitinación lineal (M1).
  2. Para evitar la contaminación cruzada entre desarrollos, lo que podría dar lugar a un falso positivo o interferir con la toma de imágenes de una modificación de ubiquitina diferente, desmonte las membranas entre los desarrollos utilizando 0,1 M NaOH durante 10 minutos.
    1. Lave las membranas en TBS con 0.1% preadolescente dos veces durante 10 min y vuelva a bloquear (usando cualquier agente bloqueador que se prefiera en el protocolo Western blot utilizado).
    2. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario y volver a desarrollarla para confirmar que la membrana fue despojada de anticuerpos primarios y secundarios correctamente.
    3. Recomendado: Para el desarrollo exitoso de diferentes anticuerpos de ubiquitina sin contaminación, utilice sistemas de imágenes fluorescentes o de infrarrojo cercano. A menudo, esto puede impedir el arrastre entre anticuerpos.
  3. Algunas imágenes de manchas occidentales de ubiquitina proporcionarán columnas de bandas distintas (como M1) mientras que otras producen un patrón similar a un frotis con pocas o ninguna línea clara (común con K48). Para la cuantificación de manchas occidentales de ubiquitina con imágenes, dibuje una caja alrededor de la columna que extienda toda la escalera de los estándares moleculares.
    1. Ajuste la caja hacia arriba (o hacia abajo) si la tinción de ubiquitina se extiende a través de toda la escalera; esto es común para las modificaciones de lisina-48 y varía ampliamente entre los compartimentos subcelulares.
    2. Restar el fondo, que se calcula como la densidad óptica media del fondo inmediatamente rodeando la columna en todos los lados.

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Representative Results

Utilizando el procedimiento descrito aquí, se recogieron fracciones nucleares, citoflásmáticas y sinápticas de la amígdala lateral del cerebro de la rata (Figura1). La pureza de las fracciones individuales se confirmó a través de la hincha occidental, sondeando con anticuerpos contra proteínas que deben ser enriquecidas o agotadas en el lisado. En el primer hemisferio donde se recogió una fracción sináptica bruta, la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD95) estaba presente en la fracción sináptica, pero no nuclear, con niveles más bajos en el citoplasma (Figura2A). Esto es consistente con el trabajo anterior que demuestra que la preparación de la fracción sináptica aísla los componentes presinápticos y postsinápticos25. Por el contrario, la histona de la proteína nuclear H3 estaba presente en la central nuclear, pero no la fracción sináptica, con niveles más bajos en el citoplasma (Figura2B). La presencia de PSD95 y H3 en el citoplasma es consistente con su traducción citoplasmática. La proteína citoflásmica-tubulina estaba presente en nuestra fracción citoplasmática, pero estaba ausente en gran medida del lisado nuclear (Figura2C),con niveles más bajos en la región sináptica. Esto sugiere que pudimos producir una fracción nuclear que estaba ausente en gran medida de proteínas ciflasmáticas. La presencia de tubulina en la región sináptica es consistente con estudios anteriores26. Las tres fracciones mostraron niveles similares de la proteína de mantenimiento de la carcasa (Figura2D),que se utilizó como control de carga. En conjunto, estos resultados confirman que la pureza de las fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas recogidas de una sola amígdala lateral de rata.

A continuación, se confirmaron todos los lysaatoparas para la actividad de proteasoma funcional utilizando la versión modificada descrita del ensayo de actividad de proteasoma in vitro 20S. En todos los isatos, el éxito del ensayo se definió como un aumento de las unidades fluorescentes brutas (RFU) detectadas desde el primer escaneo (0 min) hasta el quinto/último escaneo (120 min). Para todos estos análisis, se utilizó AMC de 10 m como el estándar más alto para la normalización de las unidades fluorescentes en bruto (RFU). En la fracción sináptica bruta, RFU alcanzó el pico 5 (Figura3A),lo que resultó en una RFU normalizada de poco menos de 0,1 (Figura3B). En la fracción citoplasmática, rFU aumentó a través de los escaneos (Figura3C)con una RFU normalizada final de 1,6 (Figura 3D). La fracción nuclear también muestra cambios dependientes del tiempo en RFU (Figura3E),con una RFU normalizada final de 0,3 (Figura3F). Las diferencias en la actividad proteosoma entre compartimentos probablemente reflejan la disponibilidad de proteasomas en la fracción, que son generalmente más abundantes en el citoplasma y el núcleo27,compartimentos que tienen el nivel más alto de actividad en nuestra Preparación. El nivel más bajo de actividad en la región sináptica es consistente con que es el único lisato que se recogió utilizando detergentes iónicos, lo que puede reducir la actividad de proteasoma debido a la condición de desnaturalización más dura. Es importante destacar que la RFU no aumentó con el tiempo en los espacios en blanco de ensayo o en los lysates (sinápticos) incubados con el inhibidor de proteasoma altamente específico y potente clasto-lactacctina-lactona (Figura3G, 0,01 y 0,001, respectivamente (Figura3H). Esto sugiere que el cambio observado en la RFU se debió específicamente a la actividad del proteasoma y no a otras proteasas. Además, cuando se analizó en todas las condiciones experimentales, hubo un aumento de la actividad nuclear, pero no citoplasmática, proteosoma en la amígdala lateral después del aprendizaje, que ocurrió simultáneamente con una disminución de la actividad de proteasoma sináptica en comparación con los animales de control (Figura4). Colectivamente, estos resultados confirman que la actividad de proteasoma podría medirse con precisión en las tres fracciones subcelulares recogidas de una sola amígdala lateral de rata.

Una de las ventajas del ensayo de actividad proteosoma es que las manipulaciones in vitro pueden introducirse en las muestras inmediatamente antes de la adición del sustrato de proteosoma, lo que permite la identificación de moléculas específicas que pueden regular el proteosoma en esa fracción subcelular en particular. Como ejemplo de esto, el papel de CaMKII (proteína quinasa dependiente de calcio/calmodulina II) se evaluó en la fracción sináptica, el iscaso desnaturalizado más duro recogido, ya que se cree que CaMKII regula la función del proteasoma en las sinapsis. Una incubación de 30 minutos con el inhibidor de CaMKII myr-AIP (péptido inhibitorio relacionado con autocamtida-2 miristoyyed) dio lugar a un aumento significativamente menor en la actividad de proteasoma en el ensayo, que sólo alcanzó niveles que fueron el 61% de los no tratados controles(Figura 5A). Por el contrario, la misma manipulación aplicada a la citoplasma no dio lugar a un cambio en la actividad de proteasoma de los pozos tratados por vehículos (Figura5B). Estos resultados confirman que la actividad del proteasoma puede ser manipulada in vitro y que esta manipulación puede tener diferentes efectos dependiendo de la fracción subcelular recogida.

Además de cuantificar la actividad de proteasoma, el protocolo descrito se puede utilizar para medir las diferencias subcelulares en diversas modificaciones de ubiquitina utilizando procedimientos de manchas occidentales. Es importante tener en cuenta que las etiquetas de ubiquitina que se pueden detectar están limitadas por la disponibilidad de anticuerpos específicos de enlace, que actualmente incluyen K48, K63 y M1 para ratas (nota: un anticuerpo K27 está disponible, aunque no produjo una imagen detectable en ninguna fracción lateral de amígdala o lisados de células enteras bajo una variedad de condiciones). En todas las fracciones subcelulares se detectó poliubiquitinación general, ubiquitinación lineal/M1 y K63 independiente de la degradación y ubiquitinación K48 específica de la degradación. Es importante destacar que, cuando se analizó en diferentes condiciones experimentales, hubo un aumento en general (Figura6A),lineal (Figura6B),K63 (Figura6C)y K48 (Figura6D) poliubiquitinación en la amígdala lateral fracción nuclear después del aprendizaje en comparación con el control de los animales. Al mismo tiempo, en la región citoplasmática, la poliubiquitinación general disminuyó y la ubiquitinación de K48 aumentó después del aprendizaje, mientras que la ubiquitinación sináptica de K63 se redujo. En conjunto, estos resultados indican que dentro del mismo animal las diferencias subcelulares en la ubiquitinación de proteínas específicas de la vinculación se pueden detectar con precisión.

Figure 1
Figura 1 : Esquema para fraccionamiento subcelular del tejido cerebral de rata. Se extrae el cerebro de los roedores, se disecciona la región del cerebro y se dividen los hemisferios. Utilizando una serie de tampones y pasos centrifugadores, las fracciones nucleares y citoplasmáticas se recogen de un hemisferio, mientras que una fracción sináptica bruta se recoge del otro. Ambas fracciones se utilizan para ensayos de actividad proteasoma y hinchamiento occidental, para probar los niveles de poliubiquitinación de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Confirmación de la pureza de la fracción sináptica, nuclear y citoplasmática bruta. (A) La proteína de densidad postsináptica de proteína sináptica 95 (PSD95; 1:1,000) estaba presente en la fracción sináptica, pero no nuclear con niveles más bajos en el citoplasma. (B) Histone H3 (1:500) estaba presente en la fracción nuclear, pero no sináptica, con menor expresión en el citoplasma. (C) -Tubulina (1:1.000) estaba presente en el citoplasma, pero en gran parte ausente de la central nuclear, fracción con menor expresión en el sistema sináptico. (D) La proteína de limpieza -actina (1:1.000) estuvo presente en todos los compartimentos subcelulares. Las áreas indican el tamaño esperado de la proteína objetivo. Esta cifra ha sido modificada de Orsi, S.A. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Cuantificación de la actividad de proteasoma en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas recogidas de la amígdala lateral del mismo animal. Durante el ensayo de actividad de proteasoma in vitro, las unidades fluorescentes relativas (RFU) detectadas aumentaron desde el principio (Scan 1) hasta el final (Scan 5) del ensayo en las fracciones sinápticas (A), citlasmáticas (C) y nuclear (E). La cuantificación de este cambio desde la línea de base indicó un valor de RFU normalizado (en relación con 10 OM AMC) de 0,1 en la sináptica (B), 1,6 en las citoplasmas (D ) y 0,3 en las fracciones nucleares (F). El inhibidor del proteasoma álac impidió que las RRF cambiaran a lo largo de la sesión (G-H). Esta cifra ha sido modificada de Orsi, S.A. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Diferencias subcelulares en la actividad de proteasoma en la amígdala lateral del mismo animal. Se detectó un aumento de la actividad de proteasoma nuclear en animales entrenados (condicionados por el miedo) en relación con los controles, que correspondieron a una disminución de la actividad dentro de la fracción sináptica. La actividad del proteosoma citoplasma se mantuvo en el nivel basal. *P < 0.05 de Control. Esta cifra ha sido modificada de Orsi, S.A. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Manipulación in vitro de la actividad del proteasoma en fracciones sinápticas y citoplasmáticas recogidas. La manipulación in vitro de la señalización CaMKII a través del inhibidor AIP redujo la actividad del proteasoma en la sináptica (A), pero no la fracción citoplasmática (B), de la amígdala lateral de la rata. Esta cifra ha sido modificada de Jarome, T.J. et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Diferencias subcelulares en la ubiquitinación de proteínas específicas de la vinculación en la amígdala lateral del mismo animal después del aprendizaje. (A) Hubo un aumento en la ubiquitinación general en la fracción nuclear después del aprendizaje, que se correlacionó con una disminución de la fracción citoplasmática. (B) Hubo un aumento en la ubiquitinación lineal en la fracción nuclear, pero no citoplasmática o sináptica, después del aprendizaje. (C) Hubo un aumento de la ubiquitinación de K63 en la fracción nuclear después del aprendizaje, que se correlacionó con una disminución de la fracción sináptica. (D) La ubiquitinación K48 aumentó en la fracción nuclear y citoplasmática, pero no sináptica, después del aprendizaje. *P < 0.05 de Control. Todas las densidades ópticas de ubiquitina obtenidas se normalizaron a niveles de actina (imágenes de manchas occidentales representativas más bajas en A), que se utilizaba como control de carga. Esta cifra ha sido modificada de Orsi, S.A. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, demostramos un método eficiente para cuantificar los cambios en la actividad ubiquitina-proteosoma en diferentes compartimentos subcelulares en el mismo animal. Actualmente, la mayoría de los intentos de medir los cambios subcelulares en la actividad del sistema de ubiquitina-proteosoma se han limitado a un solo compartimento por muestra, lo que resulta en la necesidad de repetir los experimentos. Esto conduce a costos significativos y pérdida de vida animal. Nuestro protocolo alivia este problema dividiendo hemisferios, permitiendo que se recojan diferentes fracciones celulares de cada hemisferio del mismo animal. Utilizando este protocolo, pudimos demostrar por primera vez que en el mismo animal ubiquitina-proteasoma actividad cambia diferencialmente en las fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en respuesta al aprendizaje21.

La principal limitación del protocolo descrito aquí es que depende de la cantidad de tejido cerebral (muestra) obtenida. Por ejemplo, como se describió anteriormente, este protocolo requiere la división de hemisferios de una región cerebral determinada. Sin embargo, esto puede no ser siempre posible, como en el caso de ciertas áreas que sólo están presentes en un hemisferio. En estos casos, el protocolo podría modificarse homogeneizando primero toda la región cerebral en el búfer TEVP utilizado en el paso de fracción sináptica (Sección 3.1), ya que este buffer está libre de todos los agentes desnaturalizantes. A continuación, la muestra se puede dividir en dos partes iguales por volumen. La primera parte se puede utilizar para la fracción sináptica, siguiendo el protocolo como se describe. Para la segunda mitad de la muestra, el detergente no iónico NP-40 puede añadirse a una concentración final del 0,05%, seguida de una centrifugación como se describe en la sección 2.6. Esto permitirá la separación de proteínas citoplasmáticas en el sobrenadante y las proteínas nucleares en el pellet, que se pueden aislar aún más siguiendo los pasos restantes de la Sección 2. Otra preocupación en la cantidad de tejido es que algunas regiones cerebrales son muy pequeñas en tamaño, como la corteza prelímbica. Sin embargo, en estos casos, el protocolo anterior todavía se puede utilizar reduciendo los volúmenes de los búferes utilizados, que tendrían que determinarse empíricamente en función del tamaño de la región cerebral recopilada. Por lo tanto, este protocolo se puede modificar incluso a las regiones cerebrales más difíciles en las que hay menos tejido disponible.

Una de las principales ventajas del protocolo que aquí describimos es que utiliza equipos y reactivos de laboratorio comunes que se pueden encontrar en la mayoría de las instalaciones, lo que permite que esta metodología sea modificable para aquellos incluso con un presupuesto restringido o con recursos limitados. Además, si bien delineamos este protocolo como una forma de medir los cambios subcelulares en la señalización ubiquitina-proteosoma, esta metodología también se puede aplicar a cualquier otro proceso proteico o celular en el que comprender la localización celular y la función es importante. Por lo tanto, este protocolo podría tener amplias aplicaciones para entender las funciones subcelulares de proteínas o complejos específicos durante el aprendizaje y la memoria o diferentes estados de enfermedad.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos de startups de la Facultad de Ciencias Agrícolas y de la Vida y la Facultad de Ciencias de Virginia Tech. T.M. cuenta con el apoyo del Programa George Washington Carver en Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

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References

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