Rodent मस्तिष्क में Subcellular Ubicuitin-proteasome गतिविधि की मात्रा

Neuroscience

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Summary

इस प्रोटोकॉल को कृंतक मस्तिष्क के विभिन्न सेलुलर डिब्बों में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम सिस्टम (यूपीएस) गतिविधि को कुशलतापूर्वक परिमाणित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। उपयोगकर्ताओं को एक ही जानवर में परमाणु, साइटोप्लाज्मिक और synaptic भिन्न में यूपीएस कार्य की जांच करने में सक्षम हैं, समय और इन जटिल विश्लेषण करने के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या की मात्रा को कम करने.

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McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

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Abstract

सर्वव्यापक प्रणाली प्रोटीन अवक्रमण का एक प्रमुख नियामक है और यूकैरियोट में विभिन्न प्रकार की अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं है। मस्तिष्क में, सर्वव्यापक गतिविधि में वृद्धि synaptic प्लास्टिक और स्मृति गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं और इस प्रणाली में aberant परिवर्तन तंत्रिका संबंधी, neurodegenerative और मनोरोग विकारों की एक किस्म के साथ जुड़े रहे हैं. मस्तिष्क में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम कामकाज के अध्ययन में मुद्दों में से एक यह है कि यह सभी सेलुलर डिब्बों में मौजूद है, जिसमें प्रोटीन लक्ष्य, कार्यात्मक भूमिका और विनियमन के तंत्र व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं। एक परिणाम के रूप में, सीधे एक ही जानवर के भीतर विभिन्न subcellular डिब्बों में मस्तिष्क सर्वव्यापक प्रोटीन लक्ष्यीकरण और proteasome उत्प्रेरक गतिविधि की तुलना करने की क्षमता पूरी तरह से समझ कैसे यूपीएस synaptic प्लास्टिक के लिए योगदान देता है के लिए महत्वपूर्ण है, स्मृति और रोग. यहाँ वर्णित विधि एक ही कृंतक (राट) मस्तिष्क से परमाणु, साइटोप्लाज्मिक और कच्चे synaptic भिन्नों के संग्रह की अनुमति देता है, proteasome उत्प्रेरक गतिविधि के एक साथ परिमाणीकरण के बाद (अप्रत्यक्ष रूप से, proteasome कोर की गतिविधि प्रदान केवल) और लिंकेज-विशिष्ट सर्वव्यापक प्रोटीन टैगिंग। इस प्रकार, विधि synaptic प्लास्टिक, स्मृति गठन और विभिन्न रोग राज्यों के दौरान एक ही जानवर में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम गतिविधि में subcellular परिवर्तन की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि का उपयोग एक ही जानवर के भीतर अन्य प्रोटीनों के उपकोशिकीय वितरण और कार्य का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

सर्वव्यापक प्रणाली (यूपीएस) परस्पर प्रोटीन संरचनाओं और ligases का एक जटिल नेटवर्क है कि कोशिकाओं1में सबसे कम रहते प्रोटीन की गिरावट को नियंत्रित करता है. इस प्रणाली में, प्रोटीन गिरावट या अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए चिह्नित कर रहे हैं / एक लक्ष्य प्रोटीन 1-7 सबबीक्विटिन संशोधन प्राप्त कर सकते हैं, जो सात लाइसिन (K) साइटों में से एक पर एक साथ लिंक कर सकते हैं (K6, K11, K27, K29, K33, K48 और K63) या N-terminal methionine (M1; रैखिक के रूप में जाना जाता है) पिछले सर्वव्यापकमें से2. इनमें से कुछ पॉलीयूबिक्विटिन टैग निम्नीकरण-विशिष्ट (K48)3हैं, जबकि अन्य प्रोटीन अवक्रमण प्रक्रिया (एम 1) 4,5,6से काफी हद तक स्वतंत्र हैं। इस प्रकार, प्रोटीन सर्वव्यापकता प्रक्रिया अविश्वसनीय रूप से जटिल है और एक विशिष्ट पॉलीयुबिक्विटिन टैग में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता अंततः सेलुलर कामकाज में दिए गए संशोधन की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रणाली के अध्ययन को और जटिल बनाते हुए, प्रोटीसोम, जो यूपीएस7की उत्प्रेरक संरचना है, दोनों प्रोटीन को कम कर देते हैं लेकिन अन्य गैर-प्रोटीओलिटिक प्रक्रियाओं8,9में भी शामिल किए जा सकते हैं। आश्चर्य की बात नहीं है तो, अपनी प्रारंभिक खोज के बाद से, सामान्य और aberant सर्वव्यापक-प्रोटीसम गतिविधि दीर्घकालिक स्मृति गठन और रोग राज्यों की एक किस्म में फंसाया गया है, कई न्यूरोलॉजिकल सहित, neurodegenerative और मनोरोग विकार10,11. एक परिणाम के रूप में, तरीकों जो प्रभावी ढंग से और कुशलता से मस्तिष्क में यूपीएस गतिविधि की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं अंततः समझ कैसे इस प्रणाली रोग राज्यों में disregulated है और उपचार विकल्प सर्वव्यापकता को लक्षित करने के अंतिम विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं और / प्रोटीसोम कामकाज।

चूहों और चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों में सर्वव्यापकता-प्रोटेसोम गतिविधि को परिमाणित करने में कई मुद्दे हैं, जो यूपीएस फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए सबसे आम मॉडल सिस्टम हैं, जिसमें 1) सर्वव्यापक संशोधनों की विविधता, और 2) वितरण और उपकोशिकीय डिब्बों में कार्यरत यूपीएस का विभेदक विनियमन12,13,14. उदाहरण के लिए, स्मृति निर्माण के दौरान मस्तिष्क में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम समारोह के प्रारंभिक प्रदर्शनों में से कई ने पूरे सेल lysates का उपयोग किया और संकेत दिया कि प्रोटीन सर्वव्यापकता और प्रोटीसोम गतिविधि15, दोनों में समय पर निर्भर वृद्धि हुई है, 16 , 17 , 18 , 19 , 20.तथापि, हमने हाल ही में पाया कि सबबाक्विटिन-प्रोटीसोम गतिविधि सीखने के जवाब में उपकोशिकीय डिब्बों में व्यापक रूप से भिन्न होती है, कुछ क्षेत्रों में एक साथ वृद्धि होती है और दूसरों में घटती है, एक पैटर्न जो काफी अलग होता है से क्या पहले पूरे सेल lysates21में बताया गया था . यह एक पूरे सेल दृष्टिकोण की सीमा के अनुरूप है, क्योंकि यह विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में यूपीएस गतिविधि में परिवर्तन के योगदान को अलग नहीं कर सकता। हालांकि हाल के अध्ययनों ने22,23,24, 24 को सीखने के जवाब में विशेष रूप से यूपीएस में यूपीएस का अध्ययन करने के लिए synaptic भिन्न प्रोटोकॉल का प्रयोग किया है , तरीकों को मापने की क्षमता का इस्तेमाल किया नाभिकीय और कोशिकाद्रव्यी सर्वव्यापकता एक ही जानवर में परिवर्तन। यह एक अनावश्यक प्रयोगों को दोहराने के लिए कई बार की जरूरत में परिणाम, प्रत्येक में एक अलग subcellular अंश इकट्ठा. न केवल पशु जीवन का एक बड़ा नुकसान में इस परिणाम है, लेकिन यह सीधे किसी दिए गए घटना के जवाब में या एक विशिष्ट रोग राज्य के दौरान विभिन्न subcellular डिब्बों में यूपीएस गतिविधि की तुलना करने की क्षमता समाप्त. यह देखते हुए कि सबबक्विटीन के प्रोटीन लक्ष्य और प्रोटीसोम पूरे सेल में व्यापक रूप से भिन्न होते हैं, यह समझते हुए कि कैसे सबबाक्विटिन-प्रोटेसोम संकेतन अलग-अलग उपकोशिकीय डिब्बों में अलग-अलग है, यूपीएस की कार्यात्मक भूमिका की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है स्मृति गठन और तंत्रिका विज्ञान, neurodegenerative और मनोरोग विकारों के दौरान मस्तिष्क.

इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए हमने हाल ही में एक प्रक्रिया विकसित की है जिसमें एक ही पशु21से दिए गए मस्तिष्क क्षेत्र के लिए परमाणु, कोशिकाद्रव्यी और synaptic भिन्न एकत्र किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटीन की सीमित मात्रा है कि एक ही नमूना से कई subcellular अंश इकट्ठा करने से प्राप्त किया जा सकता है के लिए खाते में, हम पहले से स्थापित प्रोटोकॉल अनुकूलित इन विट्रो proteasome गतिविधि और लिंकेज-विशिष्ट में परख करने के लिए कृंतक मस्तिष्क ऊतक से एकत्र lysed कोशिकाओं में प्रोटीन सर्वव्यापकन. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम इकट्ठा करने और सीधे proteasome गतिविधि में सीखने पर निर्भर परिवर्तन की तुलना करने में सक्षम थे, K48, K63, M1 और समग्र प्रोटीन polyubicuitination स्तर नाभिक और कोशिका द्रव्य में और चूहों के पार्श्व amygdala में synapses में. यहाँ, हम विस्तार से हमारी प्रक्रिया का वर्णन (चित्र1), जो काफी यूपीएस दीर्घकालिक स्मृति गठन और विभिन्न रोग राज्यों में शामिल है की हमारी समझ में सुधार सकता है. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन विट्रो proteasome गतिविधि हमारे प्रोटोकॉल में चर्चा की, जबकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, सीधे पूरा 26S proteasome परिसरों की गतिविधि को मापने नहीं है. बल्कि, इस परख 20S कोर की गतिविधि के उपाय, जिसका अर्थ यह केवल एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा करने के लिए कोर ही की गतिविधि को समझने के रूप में पूरे 26S proteasome परिसर का विरोध कर सकते हैं.

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Protocol

वर्जीनिया पॉलिटेक्निक संस्थान और राज्य विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी गई है.

1. Rodent मस्तिष्क ऊतक का संग्रह और विच्छेदन

नोट: इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क क्षेत्रों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है और विभिन्न ऊतक संग्रह प्रक्रियाओं के साथ इस्तेमाल किया. नीचे चूहे मस्तिष्क के ऊतकों के subcellular के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता प्रक्रिया है, 8-9 सप्ताह पुराने पुरुष Sprague Dawley चूहों का उपयोग कर. आदेश में एक ही जानवर में सभी सेलुलर डिब्बों को संसाधित करने के लिए, अनुभाग 1.3. ऊतक संग्रह प्रक्रिया का इस्तेमाल किया की परवाह किए बिना पालन किया जाना चाहिए.

  1. सूखी बर्फ पर पहले ठंडा एक क्रायोजेनिक कप में चूहे मस्तिष्क और जगह निकालें। फ्लैश सूखी बर्फ पर मस्तिष्क फ्रीज, या तरल नाइट्रोजन का उपयोग करें यदि उपलब्ध हो, और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरण. दिमाग को उसी दिन या बाद में अलग किया जा सकता है।
  2. क्रायोजेनिक कप से जमे हुए मस्तिष्क निकालें और सूखी बर्फ के साथ ठंडा एक चूहा मस्तिष्क मैट्रिक्स में जगह है। मैट्रिक्स पर प्रत्येक स्लॉट ब्याज के क्षेत्र के अनुमानित स्थान निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो 0.5 मिमी से मेल खाती है (आरओआई).
    1. एक चूहा मस्तिष्क एटलस का उपयोग करना, तुरंत सामने मैट्रिक्स में एक उस्तरा ब्लेड डालने (पूर्व) ROI की भविष्यवाणी की शुरुआत की. इसके बाद, ROI के अनुमानित अंत (पोस्टर) पर तुरंत एक रेजर ब्लेड डालें।
    2. एक स्केलपेल का उपयोग कर उस्तरा ब्लेड के बीच टुकड़ा निकालें और सूखी बर्फ पर ठंडा एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जगह है। आमतौर पर, अनुभाग 2-3 मिमी मोटी होते हैं, लेकिन यह ROI के आधार पर भिन्न होता है।
  3. एक स्केलपेल का उपयोग करके, एक समय में ROI एक गोलार्द्ध को अलग करें। प्रत्येक गोलार्द्ध को सूखी बर्फ पर पहले से ठंडा करने वाली 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें। जमे हुए ऊतक तुरंत subcellular fractionation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक बाद में समय पर संसाधित अगर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.

2. परमाणु और साइटोप्लाज्मिक निष्कर्षण

नोट: इस प्रोटोकॉल में सामान्य प्रयोगशाला रसायनों के पूर्वनिर्मित स्टॉक समाधानों का उपयोग किया गया है, जिनमें 0.1 एम हेप्स, 1 एम एमजीसीएल2, 1 एम डिथियोथ्रेटोल (डीटीटी), 0.5 एम एथिलीनडिमिनेटेरेएटिक एसिड (ईडीटीए), 5 एम नैक्ल, 10% एनपी-40 (IGEPAL) और 50% ग्लियरोल शामिल हैं। यदि एंडपॉइंट प्रोटीसोम गतिविधि परख में प्रयोग किया जाता है, ग्लिसरॉल और एटीपी lysis के दौरान proteasome परिसरों के disassembly को रोकने में मदद करने के लिए सभी बफ़र्स के लिए जोड़ा जा सकता है.

  1. Lysis बफ़र तैयार करें। एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली में अल्ट्राप्यूर (डिओनिएड और आसुत) पानी के 8.63 एमएल जोड़ें।
    1. शंकु नली में 0ण्1 एम एचईपीएस का 1,000 डिग्री सेल्सियस, 1 एम एमजीसीएल का 15 डिग्री सेल्सियस, 1 एम डीटीटी का 100 डिग्री सेल्सियस और 10% एनपी-40 का 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. प्रोटीज़ इनहिबिटर कॉकटेल के 100 जेडएल और फॉस्फेटेज अवरोधक कॉकटेल के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। थोड़ा ठंडा करने के लिए गीला बर्फ पर मिश्रण और जगह के लिए समाधान भंवर। ध्यान दें कि समाधान में फॉस्फेटेज अवरोधक से एक पीला रंग हो सकता है।
      नोट: प्रोटीन को संरक्षित करने और इन विट्रो प्रोटेसोम गतिविधि परख की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीज़ अवरोधकों का उपयोग आवश्यक है। हालांकि, इन inhibitors भी proteasome गतिविधि में एक मामूली कमी में परिणाम हो सकता है, जिसका अर्थ है कि इन विट्रो परख पर मापा गतिविधि वास्तविक गतिविधि के स्तर का एक कम करके आंका जा सकता है.
  2. निष्कर्षण बफ़र तैयार करें। एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली में अल्ट्रापुरे (डिओनिएड और आसुत) पानी के 5.925 एमएल जोड़ें।
    1. शंकु नली में, 0.1 एम एचईपी, 1250 डिग्री सेल्सियस के 2,000 डिग्री सेल्सियस, ग्लिसरॉल का 15 डिग्री सेल्सियस, 1 एम एमजीसीएल2का 15 डिग्री सेल्सियस, 1 एम डीटीटी का 5 डिग्री एल, 0.5 एम एडीटीए का 5 डिग्री एल और 5 एम एन सीएल का 600 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. प्रोटीज़ इनहिबिटर कॉकटेल के 100 जेडएल और फॉस्फेटेज अवरोधक कॉकटेल के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। थोड़ा ठंडा करने के लिए गीला बर्फ पर मिश्रण और जगह के लिए समाधान भंवर। ध्यान दें कि समाधान में फॉस्फेटेज अवरोधक से एक पीला रंग हो सकता है।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ROI के एक गोलार्द्ध युक्त 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज माइक्रोट्यूब निकालें। सुनिश्चित करें कि उपयोग किया गया गोलार्द्ध प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए निष्कर्षण स्थितियों में प्रतिसंतुलित है। उदाहरण के लिए, दो समूह प्रयोग में, अगले दो नमूनों आदि के लिए प्रत्येक समूह में पहले दो जंतुओं के लिए बाएँ गोलार्द्ध और दाएँ गोलार्द्ध का उपयोग करें।
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक 2 एमएल ग्लास Teflon homogenizer करने के लिए जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों को स्थानांतरित. Teflon ट्यूब के लिए Lysis बफर के 500 $L जोड़ें.
    1. मूसल बी का उपयोग करके, 15 स्ट्रोक का उपयोग करते हुए एक ही ऊतक को तब तक homogenize जब तक कि ठोस सामग्री की कोई दृश्य मात्रा मौजूद न हो। प्रत्येक स्ट्रोक के दौरान एक मोड़ गति (घड़ी या काउंटर दक्षिणावर्त) का प्रयोग करें।
  5. एक 1,000 $L पिपेट का उपयोग करना, एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए homogenized नमूना हस्तांतरण. ट्यूब को गीली बर्फ पर रखें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में ट्यूब रखें और 10 मिनट के लिए 845 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। पूरा होने के बाद, ध्यान से pipeting द्वारा supernatant निकालें और एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में जगह; यह साइटोप्लाज्मिक अंश है, जिसे धारा 2.9 तक बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
  7. परिणामस्वरूप गोली के लिए निष्कर्षण बफर के 50 डिग्री एल जोड़ें और pipeting द्वारा resuspend. गोली भंवर मत करो. 30 मिनट के लिए बर्फ और इनक्यूबेट पर resuspended गोली युक्त ट्यूब रखें.
  8. ट्यूब को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में रखें और 20 मिनट के लिए 21,456 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। पूरा होने के बाद, ध्यान से pipeting द्वारा supernatant निकालें और एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में जगह; यह परमाणु अंश है। गोली अब खारिज किया जा सकता है.
  9. डीसी प्रोटीन परख का उपयोग कर Cytoplasmic और परमाणु extractions के प्रोटीन एकाग्रता उपाय (निर्माता के निर्देशों के अनुसार), या गैर-आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग कर एकत्र नमूनों के लिए किसी भी बराबर परख. proteasome गतिविधि परख (धारा 4) या पश्चिमी blotting (धारा 5) के लिए तुरंत आगे बढ़ें. वैकल्पिक रूप से, नमूनों की जरूरत है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. Synaptic भिन्न संग्रह

नोट: इस प्रोटोकॉल 1 एम Tris (पीएच 7.5), 0.5 एम EDTA, 5 एम NaCl और 10% एसडीएस सहित आम प्रयोगशाला रसायनों के पूर्वनिर्मित स्टॉक समाधान का उपयोग करता है. यदि एंडपॉइंट का उपयोग प्रोटीसोम गतिविधि परख में किया जाता है, तो lysis के दौरान प्रोटेसोम परिसरों के disassembly को रोकने में मदद करने के लिए ग्लिसरोल और एटीपी सभी बफ़र्स में जोड़ा जा सकता है

  1. 320 m M sucrose के साथ TEVP बफर तैयार करें। एक साफ 100 एमएल बीकर के लिए ultrapure (deionized और आसुत) पानी के 60 एमएल जोड़ें।
    1. बीकर के लिए, 1 एम ट्रास (पीएच 7.5), 0.5 एम EDTA के 260 डिग्री एल, प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के 100 डिग्री एल, फॉस्फेटसे अवरोधक कॉकटेल के 100 डिग्री एल और 10.944 ग्राम सुक्रोज जोड़ें। एक हलचल पट्टी के साथ मिक्स जब तक sucrose पूरी तरह से भंग कर दिया है.
    2. पिपेट का उपयोग करके समाधान में हाइड्रोक्लोरिक अम्ल (एचसीएल) ड्रॉपवार जोड़कर पी एच को 7-4 रुपए लाएं।
    3. समाधान को 100 एमएल आयतिक फ्लास्क पर स्थानांतरित करें। अल्ट्राप्यूर पानी जोड़कर 100 एमएल तक वॉल्यूम लाएं। बर्फ पर अंतिम समाधान ठंडा जब तक की जरूरत है.
  2. Homogenization बफ़र तैयार करें. एक साफ 100 एमएल बीकर के लिए ultrapure (deionized और आसुत) पानी के 60 एमएल जोड़ें।
    1. बीकर के लिए, 1 एम ट्रास (पीएच 7.5), 5 एम NaCl के 3,000 $L, प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के 100 $L, फॉस्फेटसी अवरोधक कॉकटेल के 100 $L और 10% एसडीएस के 2,000 जेडएल जोड़ें। एक हलचल बार के साथ मिक्स.
      नोट: आयनिक डिटर्जेंट प्रोटीसोम जटिल के denaturing में जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीसोम गतिविधि परख के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। एसडीएस की मात्रा अगर वांछित proteasome समारोह को बनाए रखने में मदद करने के लिए कम किया जा सकता है।
    2. एक पिपेट का उपयोग कर समाधान के लिए एचसीएल dropwise जोड़कर $7.4 के लिए पीएच लाओ.
    3. समाधान को 100 एमएल आयतिक फ्लास्क पर स्थानांतरित करें। अल्ट्राप्यूर पानी जोड़कर 100 एमएल तक वॉल्यूम लाएं। कमरे के तापमान पर अंतिम समाधान स्टोर; ठंडा नहीं है के रूप में एसडीएस समाधान से बाहर वेग होगा।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ROI के एक गोलार्द्ध युक्त 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज निकालें। सुनिश्चित करें कि उपयोग किया गया गोलार्द्ध प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए निष्कर्षण स्थितियों में प्रतिसंतुलित है। उदाहरण के लिए, दो समूह प्रयोग में, अगले दो नमूनों आदि के लिए प्रत्येक समूह में पहले दो जंतुओं के लिए बाएँ गोलार्द्ध और दाएँ गोलार्द्ध का उपयोग करें।
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक 2 एमएल ग्लास Teflon homogenizer करने के लिए जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों को स्थानांतरित. Teflon ट्यूब के लिए TEVP बफर के 500 $L जोड़ें.
    1. मूसल बी का उपयोग करके, 15 स्ट्रोक का उपयोग करते हुए एक ही ऊतक को तब तक homogenize जब तक ठोस सामग्री का कोई दृश्य स्थान मौजूद नहीं होता है। प्रत्येक स्ट्रोक के दौरान एक मोड़ गति (घड़ी या काउंटर दक्षिणावर्त) का प्रयोग करें।
  5. एक 1,000 $L पिपेट का उपयोग करना, एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए homogenized नमूना हस्तांतरण. 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1,000 x ग्राम पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. supernatant लीजिए और एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण एक 1,000 डिग्री एल पिपेट का उपयोग कर. 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 10,000 x ग्राम पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। मूल गोली (P1) नाभिक और बड़े मलबे होते हैं और खारिज किया जा सकता है.
  7. सुपरनेंट को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह एक साइटोसोलिक अंश है। गोली (P2) के लिए Homogenization बफर के 50 डिग्री एल जोड़ें और कोई ठोस सामग्री दिखाई देता है जब तक pipeting द्वारा resuspend.
  8. 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 20,000 x ग्राम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज। एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण; यह क्रूड सिनैप्टोसोमल झिल्ली (सिन्पटिक) अंश है। गोली खारिज किया जा सकता है.
  9. डीसी प्रोटीन परख का उपयोग Synaptic अंश के प्रोटीन एकाग्रता को मापने (निर्माता के निर्देशों के अनुसार), या आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग कर एकत्र नमूनों के लिए किसी भी बराबर परख. proteasome गतिविधि परख (धारा 4) या पश्चिमी blotting (धारा 5) के लिए तुरंत आगे बढ़ें. वैकल्पिक रूप से, नमूनों की जरूरत है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. Proteasome गतिविधि परख

नोट: Proteasome गतिविधि homogenized मस्तिष्क ऊतक में 20S Proteasome गतिविधि किट के एक थोड़ा संशोधित संस्करण का उपयोग कर मापा जा सकता है. यह परख सीधे पूरा 26S proteasome परिसरों की गतिविधि को मापने नहीं है. बल्कि, यह 20S कोर की गतिविधि के उपाय, जिसका अर्थ यह केवल एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा करने के लिए कोर ही की गतिविधि को समझने के रूप में पूरे 26S proteasome परिसर का विरोध कर सकते हैं. इस परख की सफलता बार-बार फ्रीज-थॉ व चक्र और/या डिटर्जेंट के बढ़ते स्तर, विशेष रूप से आयनिक के साथ गिरावट आती है, और एक प्लेट रीडर के उपयोग की आवश्यकता होती है जिसमें 360/460 (उत्तेजना/उत्सर्जन) फिल्टर सेट और हीटिंग क्षमताओं को 37 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाना होता है।

  1. प्लेट रीडर सेटिंग्स: 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म और रन के माध्यम से पकड़।
    1. 360 और उत्सर्जन के लिए 460 के लिए उत्तेजना सेट करें. यदि 96 अच्छी तरह से इस्तेमाल प्लेट स्पष्ट है, नीचे प्रकाशिकी स्थिति सेट . यदि एक काले / काले 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग किया जाता है, ऊपरकरने के लिए प्रकाशिकी की स्थिति सेट .
    2. फ्लोरोसेंट पढ़ने के विकल्प के तहत ऑटो-गेन के लिए पुराने प्लेट रीडर मॉडल सेट करें; नए मॉडल इस के लिए पूर्व निर्धारित कर रहे हैं. कार्यक्रम 2 एच के एक समय के साथ एक गतिज चलाने के लिए, स्कैनिंग (पढ़ना) हर 30 मिनट.
  2. 10x परख बफर ultrapure पानी के 13.5 एमएल के साथ किट में प्रदान की पुनर्निमाण। अब 1x बफर करने के लिए 100 m एटीपी के 14 $L जोड़ें; यह काफी नमूनों में proteasome गतिविधि को बढ़ाता है और परख विश्वसनीयता में सुधार. अंतिम 20S परख बफर बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक की जरूरत है और कई महीनों के लिए स्थिर है.
  3. DMSO के 100 $L के साथ किट में प्रदान की एएमसी मानक का पुनर्गठन. मानक प्रकाश संवेदनशील है के रूप में, अंधेरे में या कम प्रकाश की स्थिति में इस कदम को प्रदर्शन.
  4. पुनर्गठित मानक का उपयोग कर ए एम सी के एक स्टैंड वक्र बनाएँ, अंधेरे में या कम प्रकाश की स्थिति के तहत.
    1. अलग 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में, जोड़ें 16, 8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 और एएमसी मानक के 0 $L, जो 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0.5 और 0 डिग्री एम ए एम एकाग्रता से मेल खाती है.
    2. इन ट्यूबों के लिए, एक ही क्रम में, 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 और 20S परख बफर के 100 $L जोड़ें. यह कम एएमसी सांद्रता के लिए उच्च की एक श्रृंखला बनाता है, जो प्लेट रीडर अंशांकन और homogenized नमूनों में proteasome गतिविधि के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    3. जब तक आवश्यक अंधेरे में बर्फ पर सभी पतला मानकों स्टोर.
  5. DMSO के 65 डिग्री एल के साथ किट में प्रदान की गई प्रोटीसम सब्सट्रेट (सूक-एलवीवाई-एएमसी) का पुनर्गठन करें। सब्सट्रेट प्रकाश संवेदनशील है के रूप में अंधेरे में या कम प्रकाश की स्थिति में इस कदम को निष्पादित करें। 20S परख बफर का उपयोग कर एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में प्रोटीसोम सब्सट्रेट के एक 1:20 कमजोर पड़ने बनाएँ। जरूरत तक अंधेरे में बर्फ पर पतला सब्सट्रेट स्टोर.
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि प्लेट में 10 नमूने और 1 रिक्त होंगे, तो आपको 22 कुओं के लिए पर्याप्त पतला सब्सट्रेट की आवश्यकता होगी (डुप्लिकेट के साथ) प्रति अच्छी तरह से 10 डिग्री सेल्सियस पर। यह 220 डिग्री सेल्सियस की जरूरत के बराबर + 30 पाइपिंग त्रुटियों के लिए, की आवश्यकता होती है 12.5 $L सब्सट्रेट के और 237.5 $L के 20S परख बफर.
  6. Thaw वांछित नमूने (यदि जमे हुए) और एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए एक सामान्यीकृत राशि जोड़ें. डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूना चलाएँ। आवश्यक नमूने की मात्रा ऊतक तैयार करने के आधार पर भिन्न होती है। आम तौर पर, 10-20 g किसी भी subcellular अंश के लिए पर्याप्त है.
  7. अल्ट्राप्यूर पानी के साथ नमूना अच्छी तरह से मात्रा 80 डिग्री सेल्सियस के लिए ले आओ। जोड़ा गया राशि जोड़े गए नमूने की मात्रा पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, यदि नमूना 1 प्रोटीन का 4.5 डिग्री सेल्सियस था और नमूना 2 8ण्7 डिग्री सेल्सियस था, तो आवश्यक जल की मात्रा क्रमशः 75.5 डिग्री सेल्सियल और 71.3 डिग्री सेल्सियस होगी। दो अलग-अलग कुओं में अकेले 80 डिग्री सेल्सियस पानी मिलाएं; ये परख रिक्त स्थान होगा.
    नोट: पाइपिंग त्रुटियों के कारण प्रोटीन की मात्रा में परिवर्तन को सीमित करने के लिए, प्रोटीन सांद्रता को कम से कम केंद्रित नमूने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। यह सभी स्थितियों में एक ही नमूना मात्रा का उपयोग करने की अनुमति देगा.
  8. 20S परख बफर के 10 $L प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें, परख रिक्त स्थान सहित. कुओं में संगत परख मात्रा सुनिश्चित करने के लिए यहां एक पुनरावर्तक/स्वत: पाइपेट की सिफारिश की जाती है।
  9. वैकल्पिक: इस स्तर पर, यदि वांछित हो तो इन विट्रो जोड़तोड़ में परिचय; यह आवश्यक होगा कि प्रत्येक नमूना वाहन सहित उपचार प्रति एक अतिरिक्त 2 कुओं, है. यदि हां, तो नमूना कुओं के 2 में 5-10 $एल औषध/ब्याज का यौगिक तथा अन्य 2 कुओं में नियंत्रण/वाहन की समतुल्य मात्रा जोड़ें। प्लेट को पूर्व-गर्म प्लेट रीडर पर या 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  10. रोशनी बंद करें या एक अंधेरे कमरे में प्रवेश करें। एक नए कुएं में पतला एएमसी मानकों के सभी 100 $L जोड़ें; प्रत्येक मानक एक भी अच्छी तरह से होगा.
  11. अंधेरे में, नमूना और परख रिक्त स्थान युक्त कुओं के लिए पतला proteasome सब्सट्रेट के 10 डिग्री एल जोड़ें, लेकिन एएमसी मानक के लिए नहीं। कुओं में संगत परख मात्रा सुनिश्चित करने के लिए यहां एक पुनरावर्तक/स्वत: पाइपेट की सिफारिश की जाती है।
  12. प्लेट को प्लेट रीडर में रखें और गतिज रन शुरू करें।
    नोट: प्लेट गतिज चलाने के दौरान लगातार आंदोलन के तहत होने की जरूरत नहीं है, हालांकि, उपयोगकर्ता अगर वांछित करने के लिए चुन सकते हैं
  13. गतिज रन के अंत में, Microsoft Excel को कच्चे 360/460 फ्लोरोसेंट मानों का निर्यात करें।
    1. प्रत्येक मानक के लिए एक साथ डुप्लिकेट कुओं औसत, प्रत्येक नमूना और परख सभी 5 स्कैन के लिए खाली. कच्चे फ्लोरोसेंट मूल्यों नमूनों के लिए स्कैन भर में वृद्धि करनी चाहिए, लेकिन स्थिर रहना (या थोड़ा कमी) मानकों और परख रिक्त स्थान के लिए.
    2. उच्चतम एएमसी मानक अच्छी तरह से औसत ले लो और ज्ञात एकाग्रता से विभाजित (20 डिग्री सेल्सियस). मानकीकृत एएमसी मान प्राप्त करने के लिए परख में इस्तेमाल नमूना एकाग्रता द्वारा इस मान विभाजित करें। प्रत्येक नमूना और परख खाली औसत के लिए, मानकीकृत AMC मान से विभाजित करें।
    3. इस अंतिम मूल्य ले लो और प्रत्येक नमूना और परख खाली के लिए सामान्यीकृत मूल्य प्राप्त करने के लिए परख में इस्तेमाल नमूना एकाग्रता से विभाजित. सभी 5 स्कैन के लिए यह मत करो.
    4. सभी 5 स्कैन के लिए प्रत्येक सामान्यीकृत नमूना मान से सामान्यीकृत परख रिक्त मान घटाएँ।

5. लिंकेज-विशिष्ट प्रोटीन Ubicuitination की मात्रा

  1. कृंतक मस्तिष्क के ऊतकों से एकत्र विभिन्न उपकोशिकीय अंशों में विविध पॉलीयूबिक्विटिन टैग का परिमाण अद्वितीय, लिंकेज-विशिष्ट पॉलीयूबिक्विटिन एंटीबॉडी के संयोजन में मानक पश्चिमी ब्लॉटिंग प्रोटोकॉल की एक किस्म का उपयोग किया जाना चाहिए।
    1. denaturing के लिए, Laemli नमूना बफर की एक समान मात्रा के साथ सामान्यीकृत नमूनों मिश्रण मात्रा से 5% का एक प्रतिशत करने के लिए $-mercaptoethanol के साथ पूरक, निर्माता के निर्देश के अनुसार.
    2. सभी मोनोबिक्विटीशन और पॉलीयुबिकेशन संशोधनों के परिमाणीकरण के लिए, लिंकेज की परवाह किए बिना, एक पैन-यूबक्विटीन एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    3. सभी पॉलीयूबिक्विटिनेट प्रोटीन को पहचानने के लिए, एक सर्वव्यापक एंटीबॉडी का उपयोग करें जो मोनोयूबिक्विटिनेशन के साथ क्रॉस-रिएक्ट नहीं करता है।
    4. लिंकेज-विशिष्ट पॉलीयुबिक्विटिनेशन के लिए, एंटीबॉडी का उपयोग करें जो Lysine-27, Lysine-48, Lysine-63 और रैखिक (M1) पॉलीयुबिक्विटिनेशन का पता लगा सकते हैं।
  2. विकास के बीच पार संदूषण को रोकने के लिए, जो एक झूठी सकारात्मक में परिणाम या एक अलग ubicuitin संशोधन की इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, 10 मिनट के लिए 0.1 एम NaOH का उपयोग कर घटनाओं के बीच झिल्ली पट्टी.
    1. टीबीएस में झिल्ली को 10 मिनट के लिए दो बार 0.1% ट्वीन के साथ धोएं और reblock (जो कुछ भी अवरुद्ध एजेंट का उपयोग पश्चिमी दाग प्रोटोकॉल में पसंद किया जाता है) का उपयोग करना)
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें और यह पुष्टि करने के लिए फिर से विकसित करें कि झिल्ली को प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी से ठीक से छीन लिया गया था।
    3. अनुशंसित: संदूषण के बिना विभिन्न ubicuitin एंटीबॉडी के सफल विकास के लिए, फ्लोरोसेंट या पास-इनफ्रारेड इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करें। यह अक्सर बार एंटीबॉडी के बीच ले जाने को रोका जा सकता है।
  3. कुछ सर्वव्यापक पश्चिमी धब्बा छवियों अलग बैंड के कॉलम प्रदान करेगा (जैसे M1) जबकि दूसरों को कुछ या कोई स्पष्ट लाइनों के साथ एक स्मीयर की तरह पैटर्न का उत्पादन (K48 के साथ आम). पश्चिमी धब्बों की छवि वाले सर्वव्यापकता के परिमाणीकरण के लिए, स्तंभ के चारों ओर एक बॉक्स बनाते हैं जो संपूर्ण आण्विक मानक सीढ़ी का विस्तार करता है।
    1. बॉक्स को समायोजित करें (या नीचे) यदि सर्वव्यापक अभिरंजन पूरी सीढ़ी के माध्यम से विस्तार करता है; यह Lysine-48 संशोधनों के लिए आम है और उपकोशिक डिब्बों में व्यापक रूप से भिन्न होता है.
    2. पृष्ठभूमि है, जो तुरंत सभी पक्षों पर स्तंभ के आसपास पृष्ठभूमि के मतलब ऑप्टिकल घनत्व के रूप में गणना की है बाहर घटाना.

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Representative Results

यहाँ वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, परमाणु, कोशिकाद्रव्यी और synaptic भिन्न चूहे मस्तिष्क के पार्श्व amygdala से एकत्र किए गए थे (चित्र 1) . व्यक्तिगत अंशों की शुद्धता पश्चिमी blotting के माध्यम से पुष्टि की गई, प्रोटीन है कि समृद्ध या lysate में समाप्त किया जाना चाहिए के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच. पहले गोलार्द्ध में जहां एक कच्चे synaptic अंश एकत्र किया गया था, postsynaptic घनत्व प्रोटीन 95 (PSD95) synaptic में मौजूद था, लेकिन नहीं परमाणु, अंश, कोशिका द्रव्य में निम्न स्तर के साथ (चित्र 2A). यह पिछले काम के अनुरूप है जो यह प्रदर्शित करता है कि synaptic भिन्न तैयारी दोनों presynaptic और postsynaptic घटक25को अलग करती है . इसके विपरीत, परमाणु प्रोटीन हिस्टोन H3 परमाणु में मौजूद था, लेकिन नहीं synaptic, अंश, कोशिका द्रव्य में निम्न स्तर के साथ (चित्र 2B) . कोशिकाद्रव्य में PSD95 और H3 की उपस्थिति उनके कोशिकाद्रव्यी अनुवाद के अनुरूप है. कोशिकाद्रव्यी प्रोटीन - टबुलिन हमारे कोशिकाद्रव्यी अंश में मौजूद था, लेकिन काफी हद तक परमाणु lysate से अनुपस्थित था (चित्र 2C),synaptic क्षेत्र में निम्न स्तर के साथ. यह पता चलता है कि हम एक परमाणु अंश है कि मोटे तौर पर कोशिका द्रव्यीय प्रोटीन के अनुपस्थित था उत्पादन करने में सक्षम थे. संग्रथनी क्षेत्र में ट्यूबुलिन की उपस्थिति पिछले अध्ययनों के अनुरूप है. सभी तीन भिन्नों में आवास के समान स्तर दिखाई देते हैं जो प्रोटीन को रखते हुए - -actin (चित्र2D),जो एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सामूहिक रूप से, इन परिणामों की पुष्टि करते हैं कि परमाणु की शुद्धता, साइटोप्लाज्मिक और synaptic भिन्न एक चूहे पार्श्व amygdala से एकत्र.

अगले, सभी lysates में इन विट्रो 20S proteasome गतिविधि परख के वर्णित संशोधित संस्करण का उपयोग कर कार्यात्मक proteasome गतिविधि के लिए पुष्टि की गई. सभी lysates में, परख की सफलता कच्चे फ्लोरोसेंट इकाइयों में वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया था (RFU) पहले स्कैन से पता चला (0 मिनट) पांचवें / इन विश्लेषणों के सभी के लिए, 10 डिग्री एम एएमसी कच्चे फ्लोरोसेंट इकाइयों (RFU) के सामान्यीकरण के लिए उच्चतम मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था. अपरिष्कृत संग्रथनीय भिन्न में, RFU स्कैन 5 पर शिखर पर था (चित्र 3A, जिसके परिणामस्वरूप केवल 0ण्1 (चित्र 3ख) के अधीन एक सामान्यीकृत RFU होता है। कोशिकाद्रव्यी अंश में, RFU स्कैन भर में वृद्धि हुई (चित्र 3C) एक अंतिम सामान्यीकृत RFU के साथ $1.6 (चित्र 3 D) . नाभिकीय अंश में RFU में समय-निर्भर परिवर्तन भी प्रदर्शित किए गए हैं (चित्र 3E) 0ण्3 के अंतिम सामान्यीकृत RFU के साथ (चित्र 3F)। डिब्बों में प्रोटीसोम गतिविधि में अंतर की संभावना अंश में proteasomes की उपलब्धता को दर्शाता है, जो आम तौर पर कोशिका द्रव्य और नाभिक27में सबसे प्रचुर मात्रा में हैं , डिब्बों जो हमारे में गतिविधि का उच्चतम स्तर है तैयारी. synaptic क्षेत्र में गतिविधि का निम्नतम स्तर यह केवल lysate कि आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग कर एकत्र किया गया था जा रहा है के साथ संगत है, जो कठोर denaturing हालत के कारण proteasome गतिविधि को कम कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि RFU परख रिक्त स्थान में या lysates (synaptic) में समय भर में वृद्धि नहीं हुई अत्यधिक विशिष्ट और शक्तिशाली proteasome अवरोध करनेवाला clasto-lactacystin-जेड-लैक्टोन के साथ incubated ( चित्र ांधंत:3जी,जेड-लाक), अंतिम सामान्यीकृत RFU के स्तर को प्रदर्शित करने के 0.01 और 0.001, क्रमशः (चित्र 3H)। यह पता चलता है कि RFU में मनाया परिवर्तन proteasome और नहीं अन्य proteases की गतिविधि के लिए विशेष रूप से कारण था. इसके अलावा, जब प्रयोगात्मक स्थितियों में विश्लेषण किया, वहाँ परमाणु में वृद्धि हुई थी, लेकिन नहीं साइटोप्लाज्मिक, पार्श्व amygdala में प्रोटीज गतिविधि सीखने के बाद, जो में synaptic प्रोटेसोम गतिविधि में कमी के साथ एक साथ हुई नियंत्रण पशुओं की तुलना (चित्र 4)। सामूहिक रूप से, इन परिणामों की पुष्टि करें कि proteasome गतिविधि सही एक चूहे पार्श्व amygdala से एकत्र सभी तीन subcellular अंशों में मापा जा सकता है.

प्रोटेसोम गतिविधि परख के फायदे में से एक यह है कि इन विट्रो जोड़तोड़ में तुरंत proteasome सब्सट्रेट के अलावा करने से पहले नमूनों के लिए पेश किया जा सकता है, जो विशिष्ट अणुओं जो में proteasome को विनियमित कर सकते हैं की पहचान की अनुमति देता है कि विशेष रूप से उपकोशिकीय अंश. इस का एक उदाहरण के रूप में, CaMKII की भूमिका (कैल्शियम/calmodulin निर्भर प्रोटीन kinase द्वितीय) synaptic अंश में मूल्यांकन किया गया था, कठोर denatured lysate एकत्र, के बाद से CaMKII synapses में proteasome समारोह को विनियमित करने के लिए सोचा है. CaMKII अवरोधक myr-AIP के साथ एक 30 मिनट ऊष्मायन (myristolayted autocamtide-2 संबंधित निरोधक पेप्टाइड) परख पर proteasome गतिविधि में काफी कम वृद्धि हुई है, जो केवल स्तर तक पहुँच गया है कि इलाज के $61% थे नियंत्रण (चित्र 5क) इसके विपरीत, कोशिकाद्रव्य पर लागू समान जोड़-तोड़ के परिणामस्वरूप वाहन उपचारित कुओं से प्रोटीसोम गतिविधि में परिवर्तन नहीं हुआ (चित्र 5ख)। इन परिणामों की पुष्टि करते हैं कि proteasome गतिविधि आगे इन विट्रो में हेरफेर किया जा सकता है और यह कि इस हेरफेर एकत्र subcellular अंश के आधार पर अलग अलग प्रभाव हो सकता है.

proteasome गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के अलावा, वर्णित प्रोटोकॉल पश्चिमी धब्बा प्रक्रियाओं का उपयोग कर विविध सर्वव्यापक संशोधनों में subcellular मतभेद को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह ध्यान दें कि सर्वव्यापक टैग है कि पता लगाया जा सकता है लिंकेज-विशिष्ट एंटीबॉडी, जो वर्तमान में चूहों के लिए K48, K63 और M1 शामिल की उपलब्धता द्वारा सीमित कर रहे हैं महत्वपूर्ण है (ध्यान दें: एक K27 एंटीबॉडी उपलब्ध है, हालांकि किसी में एक डिटेक्टेबल छवि का उत्पादन नहीं किया पार्श्व amygdala अंश या पूरे सेल lysates शर्तों की एक किस्म के तहत). समग्र बहु-विमुक्तता, अवक्रमण-स्वतंत्र रैखिक/M1 और K63 सर्वव्यापकता और निम्नीकरण-विशिष्ट K48 सर्वव्यापकता सभी उपकोशिकीय अंशों में पाई गई। महत्वपूर्ण बात यह है कि जब विभिन्न प्रायोगिक स्थितियों में विश्लेषण किया जाता है, तो समग्र (चित्र 6क), रैखिक (चित्र 6ख), के63 (चित्र 6सी) और के48 (चित्र 6डी) पार्श्व एमिग्डाला में पॉलीयुबिकेशन में वृद्धि हुई है । जानवरों को नियंत्रित करने की तुलना में सीखने के बाद परमाणु अंश। एक ही समय में, साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र में, समग्र polyubiquitination कमी आई और K48 सर्वव्यापकता सीखने के बाद वृद्धि हुई है, जबकि synaptic K63 सर्वव्यापकता कम हो गया था. सामूहिक रूप से, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एक ही जानवर के भीतर संबंध विशेष प्रोटीन सर्वव्यापकता में एक ही जानवर subcellular मतभेद सही पाया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1 : चूहे मस्तिष्क के ऊतकों के subcellular अंशीकरण के लिए Schematic. Rodent मस्तिष्क निकाला जाता है, मस्तिष्क क्षेत्र विच्छेदित और गोलार्द्धों विभाजित. बफर और अपकेंद्रण चरणों की एक श्रृंखला का उपयोग करते हुए, परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्न एक गोलार्द्ध से एकत्र किए जाते हैं, जबकि एक कच्चे synaptic अंश दूसरे से एकत्र किया जाता है. दोनों भागों तो proteasome गतिविधि परख और पश्चिमी blotting के लिए उपयोग किया जाता है, प्रोटीन polyubiquitination के स्तर परख. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : कच्चे synaptic, परमाणु और कोशिका द्रव्य ीय अंश शुद्धता की पुष्टि. (ए) सिटॉपद्रव्य में निम्न स्तर के साथ सिनैप्टिक प्रोटीन पोस्टिनैप्टिक घनत्व प्रोटीन 95 (PSD95; 1:1,000) synaptic में मौजूद था, लेकिन कोशिकाद्रव्य में निम्न स्तर के साथ परमाणु अंश नहीं. (बी) हिस्टोन एच 3 (1:500) परमाणु में मौजूद था, लेकिन साइटोप्लाज्म में निम्न अभिव्यक्ति के साथ अंश नहीं, synaptic. (ग) - तुबुलिन (1:1,000) कोशिकाद्रव्य में मौजूद थे, लेकिन काफी हद तक परमाणु से अनुपस्थित थे, जो synaptic lysate में कम अभिव्यक्ति के साथ भिन्न होते हैं। (घ) हाउसकीपिंग प्रोटीन -एक्टिन (1:1,000) सभी उपकोशिकीय डिब्बों में मौजूद था। क्षेत्र लक्ष्य प्रोटीन के अपेक्षित आकार को दर्शाते हैं। यह आंकड़ा Orsi, S.A. एट अल21से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एक ही जानवर के पार्श्व amygdala से एकत्र परमाणु, कोशिका द्रव्य और synaptic भिन्न में proteasome गतिविधि की मात्रा. इन विट्रो प्रोटीसोम गतिविधि परख के दौरान, सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों (RFU) का पता लगाया शुरू से वृद्धि हुई (स्कैन 1) synaptic में परख के अंत (स्कैन 5) (), साइटोप्लाज्मिक (सी) और परमाणु () भिन्न. आधार रेखा से इस परिवर्तन के परिमाण एक सामान्यीकृत RFU मान संकेत दिया (के सापेक्ष 10 डिग्री एम ए एम सी) 0.1 के synaptic में (बी), 1.6 कोशिकाद्रव्य में (डी) और 0.3 परमाणु में (एफ) भिन्न. प्रोटीसोम अवरोधक जेडलैक ने आर एफ यू को पूरे सत्र(जी-एच) में परिवर्तन करने से रोका। यह आंकड़ा Orsi, S.A. एट अल21से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एक ही जानवर के पार्श्व amygdala में proteasome गतिविधि में subcellular मतभेद. नियंत्रण के सापेक्ष प्रशिक्षित (डर वातानुकूलित) पशुओं में परमाणु प्रोटीसोम गतिविधि में वृद्धि पाई गई, जो synaptic अंश के भीतर गतिविधि में कमी के अनुरूप थी। साइटोप्लाज्मिक प्रोटीसोम गतिविधि आधार रेखा पर बनी रही। * नियंत्रण सेपी एंड एलटी; 0.05. यह आंकड़ा Orsi, S.A. एट अल21से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : एकत्र synaptic और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों में proteasome गतिविधि के इन विट्रो हेरफेर में. इन विट्रो हेरफेर के माध्यम से CaMKII संकेतन में अवरोधक AIP synaptic में proteasome गतिविधि कम (), लेकिन नहीं कोशिकाद्रव्य (बी), चूहे पार्श्व amygdala से अंश. यह आंकड़ा Jarome, T.J. एट अल23से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : एक ही जानवर के पार्श्व amygdala में लिंकेज-विशिष्ट प्रोटीन सर्वव्यापकता में subcellular मतभेद सीखने के बाद. (ए) सीखने के बाद नाभिकीय अंश में समग्र सर्वव्यापकता में वृद्धि हुई, जो कोशिकाद्रव्यी अंश में कमी के साथ संबंधित थी। (बी) परमाणु में रैखिक सर्वव्यापकता में वृद्धि हुई थी, लेकिन कोशिकाद्रव्यी या synaptic, अंश सीखने के बाद नहीं. (ग) सीखने के बाद नाभिकीय अंश में K63 सर्वव्यापकता में वृद्धि हुई, जो synaptic अंश में कमी के साथ सहसंबद्ध थी। (घ) K48 सर्वव्यापकता परमाणु और कोशिकाद्रव्य में वृद्धि हुई है, लेकिन synaptic नहीं, अंश निम्नलिखित सीखने. * नियंत्रण सेपी एंड एलटी; 0.05. सभी प्राप्त सब्बीक्विटिन ऑप्टिकल घनत्व को सामान्यीकृत किया गया था -एक्टिन स्तर (ए में कम प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा छवियों), जो एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा Orsi, S.A. एट अल21से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ, हम एक ही जानवर में विभिन्न subcellular डिब्बों में सर्वव्यापक गतिविधि में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कुशल विधि का प्रदर्शन. वर्तमान में, सर्वव्यापक प्रणाली की गतिविधि में उपकोशिकीय परिवर्तनों को मापने के अधिकांश प्रयास प्रति नमूने एक डिब्बे तक सीमित रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रयोगों को दोहराने की आवश्यकता होती है। यह महत्वपूर्ण लागत और पशु जीवन के नुकसान की ओर जाता है. हमारे प्रोटोकॉल गोलार्द्धों बंटवारे से इस समस्या को दूर, विभिन्न सेलुलर भिन्न एक ही जानवर के प्रत्येक गोलार्द्ध से एकत्र किया जा करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम पहली बार यह दिखाने में सक्षम थे कि एक ही पशु सर्वव्यापक गतिविधि में21सीखने के जवाब में परमाणु, कोशिकाद्रव्यऔर और synaptic भिन्नों में अंतर परिवर्तन.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा यह मस्तिष्क ऊतक (नमूना) प्राप्त की मात्रा पर निर्भर है. उदाहरण के लिए, जैसा कि ऊपर बताया गया है, इस प्रोटोकॉल के लिए किसी दिए गए मस्तिष्क क्षेत्र के गोलार्द्धों को विभाजित करने की आवश्यकता होती है। हालांकि, यह हमेशा संभव नहीं हो सकता है, जैसे कुछ क्षेत्रों है कि केवल एक गोलार्द्ध में मौजूद हैं के मामले में. इन मामलों में, प्रोटोकॉल पहले synaptic अंश चरण में इस्तेमाल TEVP बफर में पूरे मस्तिष्क क्षेत्र homogenizing द्वारा संशोधित किया जा सकता है (धारा 3.1), के बाद से इस बफर सभी denaturing एजेंटों से मुक्त है. नमूना तो मात्रा से दो बराबर भागों में विभाजित किया जा सकता है. पहले भाग synaptic अंश के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित निम्नलिखित. नमूने की दूसरी छमाही के लिए, गैर-आयनिक डिटर्जेंट एनपी-40 0.05% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा जा सकता है, के बाद के रूप में धारा 2.6 में वर्णित centrifuging. यह गोली में supernatant और परमाणु प्रोटीन में कोशिका द्रव्य प्रोटीन के पृथक्करण की अनुमति देगा, जो आगे खंड 2 में शेष चरणों के बाद अलग किया जा सकता है. ऊतक मात्रा में एक और चिंता का विषय यह है कि कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों के आकार में बहुत छोटे हैं, इस तरह के prelimbic प्रांतस्था के रूप में. हालांकि, इन मामलों में, उपरोक्त प्रोटोकॉल अभी भी इस्तेमाल किया बफ़र्स की मात्रा को कम करने के द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, जो अनुभवजन्य मस्तिष्क क्षेत्र एकत्र के आकार के आधार पर निर्धारित किया जाना होगा. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल और भी अधिक कठिन मस्तिष्क क्षेत्रों में कम ऊतक उपलब्ध है करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल हम यहाँ रूपरेखा के प्रमुख लाभ में से एक यह है कि यह आम प्रयोगशाला उपकरण और अभिकर्मकों कि सबसे अधिक सुविधाओं में पाया जा सकता है का उपयोग करता है, इस पद्धति को भी एक सीमित बजट पर या सीमित संसाधनों के साथ उन लोगों के लिए संशोधन योग्य होने की अनुमति. इसके अलावा, जब कि हम सब्बुक्विटिन-प्रोटेसोम सिग्नलिंग में उपकोशिकीय परिवर्तनों को मापने के एक तरीके के रूप में इस प्रोटोकॉल की रूपरेखा बनाते हैं, तो इस पद्धति को किसी भी अन्य प्रोटीन या सेलुलर प्रक्रिया पर भी लागू किया जा सकता है जिसमें सेलुलर स्थानीयकरण और समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल सीखने और स्मृति या विभिन्न रोग राज्यों के दौरान विशिष्ट प्रोटीन या परिसरों के subcellular कार्यों को समझने के लिए व्यापक अनुप्रयोगों हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम कृषि और जीवन विज्ञान के कॉलेज से स्टार्टअप धन द्वारा समर्थित था और वर्जीनिया टेक में विज्ञान के कॉलेज T.M. वर्जीनिया टेक में जॉर्ज वाशिंगटन Carver कार्यक्रम द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

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References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
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