Detección y monitorización del ADN circulante asociado al tumor en los Biofluides del paciente

Cancer Research
 

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Bonner, E. R., Saoud, K., Lee, S., Panditharatna, E., Kambhampati, M., Mueller, S., Nazarian, J. Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids. J. Vis. Exp. (148), e59721, doi:10.3791/59721 (2019).

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Abstract

Las complicaciones asociadas con el muestreo de tejido quirúrgico inicial y repetitivo presentan la necesidad de plataformas mínimamente invasivas capaces de sub-clasificación molecular y monitoreo temporal de la respuesta tumoral a la terapia. Aquí describimos nuestro método basado en dPCR para la detección de mutaciones somáticas tumorales en el ADN sin células (cfDNA), disponible fácilmente en biofluides de pacientes. Aunque está limitado en el número de mutaciones que se pueden probar en cada ensayo, este método proporciona un alto nivel de sensibilidad y especificidad. La monitorización de la abundancia de mutaciones, calculada por MAF, permite la evaluación de la respuesta tumoral al tratamiento, proporcionando así un suplemento muy necesario a las imágenes radiográficas.

Introduction

Debido a las limitaciones en la disponibilidad de tejido tumoral para análisis moleculares, es necesario el desarrollo de métodos altamente sensibles capaces de detectar mutaciones somáticas tumorales en biofluides de pacientes, incluyendo plasma, suero y líquido cefalorraquídeo (CSF) . Por ejemplo, los gliomas de media línea difusa pediátrica (DMGs) presentan un desafío debido a su ubicación neuroanatómica. Durante la última década, el perfilado molecular de las muestras de tejido DMG ha descubierto mutaciones de conductor en este tumor tipo1 y ha revelado una heterogeneidad espacial y temporal de las mutaciones, haciendo necesaria la biopsia para caracterizar a un paciente dentro de una enfermedad subgrupo y promover terapias molecularmente dirigidas2. Como tal, los ensayos clínicos abogan por la integración de biopsias quirúrgicas para el perfilado molecular tumoral en el diagnóstico inicial3,4,5,6. Durante el tratamiento, el control de la respuesta terapéutica en DMGs se limita a la RMN, que carece de sensibilidad para detectar pequeños cambios o la evolución genómica tumoral. La resonancia magnética también es propenso a detectar pseudoprogresión, inflamación transitoria en el sitio del tumor que imita el verdadero progreso en la imagen y puede desinformar la interpretación de la respuesta tumoral7. Por lo tanto, los DMGs representan un tipo de tumor con una alta necesidad de un medio alternativo, mínimamente invasivo para detectar mutaciones tumorales y monitorear la respuesta clínica. Con el fin de abordar estas necesidades, desarrollamos y optimizamos un protocolo para detectar y cuantificar la frecuencia alélica de las mutaciones tumorales en el cfDNA de plasma, suero y CSF de niños con gliomas de línea media8. Dado que las DMGs infantiles a menudo (> 80%) Puerto de una mutación somática de lisina a metionina en la posición 27 de la histona variante H 3.1 (H 3.1 K27M, 20% de los casos) o H 3.3 (H 3.3 K27M, 60% de los casos)1, estas y otras mutaciones características de dmgs (es decir, ACVR1, PIK3R1) fueron dirigidos para cuantificación de alelo mutante usando cfDNA8. Este ensayo se puede adaptar para detectar mutaciones de puntos críticos en otros tipos de tumores utilizando cebadores y sondas específicos de la secuencia. La versatilidad de este enfoque lo hace aplicable a una variedad de cánceres que se beneficiarían de la integración de herramientas de diagnóstico basadas en cfDNA y monitoreo terapéutico.

Para detectar con sensibilidad las mutaciones de frecuencia alélica baja en cfDNA, empleamos un enfoque basado en PCR digital de gota (dPCR). En este método, la mezcla de reacción PCR se divide en un máximo teórico de 10 millones gotas utilizando la plataforma de dPCR (por ejemplo, RainDance), con 7-9 millones de gotas por PCR bien típicamente visto experimentalmente. Debido al alto grado de compartimentación de muestras, en cada gota puede haber solamente una o dos moléculas de ADN. La amplificación de PCR y la hibridación por sonda fluorescente específica de la secuencia pueden ocurrir en cada gota, de tal manera que se producen millones de reacciones. Esto maximiza la sensibilidad y permite la detección de alelos mutantes raros, que de otro modo podrían pasar desapercibidos contra un fondo de ADN de tipo salvaje. La utilización de sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) mejora la especificidad del ensayo restringiendo la hibridación de discordancia y apoyando la detección precisa de mutaciones9,10,11. Aquí describimos nuestros métodos de procesamiento de muestras, extracción de cfDNA, preamplificación de alelos objetivo, dPCR y análisis de datos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) Teknova T0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) Becton Dickinson Diagnostics 367525 For plasma collection
BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) Becton Dickinson Diagnostics 367895 For serum collection
Bleach General Lab Supplier
Buffer ATL Qiagen 19076
Cell-Free DNA Blood Collection Tubes Streck 218961 cfDNA blood collection tubes (optional)
CentriVap Concentrator Labconco 7810010
Forward Primer Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
MiniAmp Thermal Cycler Thermofisher Scientific A37834
Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) General Lab Supplier
Mutant Probe Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
PAXgene Blood ccfDNA tubes PreAnalytiX 768115 cfDNA blood collection tubes (optional)
PCR 8 well strip tube caps VWR 10011-786
PCR 8 well strip tubes Axygen PCR-0208-C
Pipette (p20, p200, p1000) General Lab Supplier
Pipette filter tips (p20, p200, p1000) General Lab Supplier
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs Inc M0494S
QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook  Qiagen cfDNA extraction kit handbook (2013 edition)
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit Qiagen 55114 cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) 
QIAamp MinElute Virus Spin Kit Qiagen 57704 Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes
Qiavac 24 Plus Qiagen 19413 For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit
Raindance Consumable Kit Bio-Rad 20-04411 Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil
Raindance Sense Instrument Bio-Rad Quantification instrument (used in Protocol Step 9)
Raindance Source Instrument Bio-Rad Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9)
RainDrop Analyst II Software RainDance Technologies Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10)
Refrigerated Vapor Trap Savant RVT5105-115
Reverse Primer Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
Smartblock 2 mL Eppendorf 05 412 506
TaqMan Genotyping Master Mix Thermofisher Scientific 4371353
Thermomixer C Eppendorf 14 285 562PM
WT Probe Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design

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References

  1. Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
  2. Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4, (1), (2016).
  3. Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31, (10), 1773-1780 (2015).
  4. Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19, (4), iv21 (2017).
  5. Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19, (4), iv14 (2017).
  6. Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20, (2), i64 (2018).
  7. Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
  8. Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. (2018).
  9. Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29, (4), 455-456 (1998).
  10. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, (43), 9352-9367 (2011).
  11. Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
  12. Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. 1090257 (2013).
  13. Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18, (2), 235-243 (2016).
  14. Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. LCN 50-04334 Rev. D (2016).
  15. Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. LCN 50-08157, Rev. A (2015).
  16. Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
  17. Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
  18. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3, (1), 27-38 (2013).
  19. Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324, (1), 143-152 (2004).
  20. Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. (2018).
  21. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. (2018).
  22. Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67, (11), 1995-2005 (2018).

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