环境细颗粒物小鼠组织中三种 DNA 损伤的质谱定量及水平评价

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

我们在这里描述的方法敏感和准确定量的病变 8-氧-7-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-氧 ',1, n6-乙基 2 '-脱氧腺苷 (1,n6-do)和 1,n2-在 DNA 中的乙二-2 '-脱氧鸟苷 (1,n2-dguo)。应用该方法对暴露的阿可姆小鼠组织 (肺、肝、肾) 环境细颗粒物 (PM2.5) 的影响进行了评价。

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Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

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Abstract

DNA 加合物和氧化 DNA 碱基是 DNA 病变的例子, 是对亲电物质的毒性评估、生物转化后产生活性电极或诱发氧化应激的有用生物标志物。在氧化核酸酶中, 研究最多的是 8-氧-7-8-二氢鸟嘌呤 (8-Xocogua) 或 8-oxo-7-8-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-氧果), 这是氧化诱导的 DNA 碱基损伤的生物标志物。脂质过氧化过程产生的醛和环氧醛是能够形成诱变外环 DNA 加合物的亲电分子, 如乙二烯加合物 1,n2-乙二-2 '-脱氧鸟苷 (1,n2-1,n6-乙二-2 '-脱氧腺苷 (1,n 6-dado), 已被认为是炎症病理生理学中潜在的生物标志物。选择和敏感的方法, 他们在 DNA 中量化是必要的制定预防战略, 以减缓细胞突变率和慢性病的发展 (例如, 癌症, 神经退行性疾病)。在可用于检测它们的敏感方法 (与电化学或串联质谱检测器耦合的高效液相色谱 (彗星分析、免疫检测、 32p 后标记) 中, 最具选择性的是基于这些方法。在高效液相色谱联接到串联质谱 (HPLC-ESI-MSMS)。在分析复杂的生物样本时, 选择性是一个重要优势, HPLC-ESI-MMSY 演变为 DNA、尿液、血浆和唾液等生物基质中修饰核苷的黄金标准。使用同位素标记的内部标准增加了在 DNA 水解和分析物富集步骤中更正分子损失的优势, 以及样品之间分析物电离的差异。当存在多个峰时, 它还有助于识别正确的色谱峰。

我们在这里提出了验证敏感, 准确的 HPLC-ESIC-MMSMS 方法, 成功地应用于定量的 8-oxodGuo, 1,n-dAdo1,n-dAdo 在肺, 肝脏和肾脏 do肺, 肝脏和肾脏 do环境 PM2.5暴露的影响的评估。

Introduction

一些活性氧物种 (ROS) 能够氧化 DNA 碱基的碳双键和脱氧核糖中的一些碳键, 产生氧化碱基和 DNA 链断裂1。作为一种富含氮和氧原子的负电荷分子, DNA 也是与亲核位点 (氮和氧) 共价反应的亲电基团的靶标, 其产物被称为 DNA 加合物2。因此, DNA 加合物和氧化 DNA 碱基是 DNA 病变的例子, 这些病变是对亲电物质的毒性评估、生物转化时产生活性电泳或诱导氧化应激1的有用生物标志物, 2。虽然修改后的 DNA 碱基可以通过碱基或核苷酸切除修复 (BER 或 NER) 从 DNA 中去除, 但诱导 DNA 病变的产生和去除之间的不平衡有利于前者导致他们的 DNA 加班水平净增加 3 。结果是 dna 突变率的增加, 基因表达的减少, 蛋白质活性降低2,4,5,6, 7,与疾病的发展。DNA 突变可能会影响多种细胞功能, 如细胞信号转导、细胞周期、基因组完整性、端粒稳定性、表观基因组、染色质结构、RNA 拼接、蛋白质稳态、代谢、凋亡和细胞分化 8 ,9。减缓细胞突变率和慢性病发展 (如癌症、神经退行性疾病) 的策略通过突变来源的知识, 其中包括 DNA 病变及其原因。

由于接触污染物、持续炎症、疾病病理生理学 (如糖尿病) 等原因, 内生异常过度, 是生物分子损伤的重要原因, 包括 DNA 和脂质损伤1。例如, 由过渡金属离子 (Fe2 +, cu+) 还原的 h2o2 形成的高反应羟基自由基 (oh) 氧化扩散控制下的 DNA 碱基、dna 糖层和多不饱和脂肪酸10。在已经有特征的80种氧化核酸酶3中, 研究最多的是 8-oxo-7, 8-二氢鸟嘌呤 (8-oxoGua) 或 8-oxo-7-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-奥科德戈戈,图 1), 这种病变能够诱导 gt 转化。哺乳动物细胞10,11。它是由鸟嘌呤的单电子氧化或 dna 1 中的羟基自由基或鸟嘌呤的单氧攻击而形成的。多不饱和脂肪酸是高活性氧化剂的其他重要靶点, 如·oh , 它启动了脂质过氧化1,12的过程。它产生脂肪酸过氧化氢, 可能分解为亲电醛和环氧醛, 如丙二醛, 4-羟基-2-非烯, 2, 4-十二烷基, 4, 5-py-(2e)-十二烯, 六烯, 阿克罗林, 氯酮醛, 这些能够形成诱变的外环 dna 加合物, 如丙二醛、丙醇或乙二醇加合物1,12,13。乙二醇加合物 1,n2-乙二 '-脱氧鸟苷 (1,n2-dguo,图 1) 和 1,n6-乙二-2 '-脱氧腺苷 (1,n6-dado,图1) 已被认为是炎症病理生理学潜在的生物标志物 14,15

Figure 1
图 1.本研究量化的 DNA 病变的化学结构.dR = 2 脱氧核糖。奥利维拉等对这一数字作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.

20世纪80年代初进行的研究使其能够通过高效液相色谱结合电化学检测 (HPLC-ECD) 对 8-氧郭进行灵敏检测。在氧化条件下, hplc-ecd 对 8-氧果进行定量, 使人们认识到, 8-氧果是 dna1,16中氧化诱导碱基损伤的生物标志物。虽然在低 fmol 范围17中, Hplc-ecd 测量具有鲁棒性, 并允许对 8-氧郭进行量化, 但它依赖于分析物保留时间的准确性进行分析物的识别, 并依靠色谱分辨率来避免干扰。其他样品成分。由于电化学检测需要在流动阶段使用盐 (例如, 磷酸钾、醋酸钠), 因此维持适当的分析条件需要常规的柱和设备清洗时间。

或者, 使用细菌 DNA 修复酶甲胺吡啶 dna 糖基酶 (FPG) 和人类8-oxoguanine 糖基酶 1 (Gggg1), 从 DNA 中检测和去除 8-Xooga, 作为诱导 DNA 碱的一种方法网站。碱基不稳定位点转化为 DNA 链断裂, 并允许非常敏感的间接定量 8-奥克瓜通过碱性单细胞凝胶电泳 ("彗星检测")。高灵敏度和完成的分析, 而不需要细胞 DNA 提取是这种类型的检测的主要优点。它给出了 DNA 中 8-氧瓜的最低稳态水平, 通常比基于高效液相色谱的生物分析方法获得的水平低7-10 倍。然而, 它是一个间接测量的8-oxoGua 和一些缺点是缺乏特异性或未知的效率, 使用的修复酶 1,16,18

免疫检测是用于检测 8-oxoGua 1 和外环 DNA 加合物其他方法, 如 1,n6-Dado 和 1,n2-dowo12。尽管灵敏度很高, 但使用抗体检测 dna 病变的一个缺点是, 由于与生物样本的其他成分 (包括正常 dna 碱基1,12)的交叉反应, 缺乏特异性。外环 DNA 加合物, 包括 1,n-dAdo 和 1,n2-dguo, 也可以检测和量化高度敏感的32p 后标记检测12。32p 后贴标的高灵敏度允许使用极少量的 dna (例如, 10 微克) 来检测每10个正常碱基中大约1个加合物 19.然而, 放射性化学品的使用、缺乏化学特异性和精度低是一些缺点 1920

上述方法的一个共同局限性是检测所需分子的选择性或特异性较低。在这种情况下, HPLC 与电喷雾电离串联质谱 (HPLC-ESI-MSMS 和 HPLC-MS3) 相结合, 发展成为在 dna、尿液、血浆和唾液等生物基质中定量修饰核苷的黄金标准1,19,20. hplc-esi-mmsms 方法的优点是灵敏度 (通常在低 fmol 范围内) 和高特异性提供的 i) 色谱分离, ii) 在质量内分子分裂的特征和已知模式分光计碰撞室, 以及 iii) 在多反应监测模式1,19中准确测量所选质量电荷比 (m/z)。使用同位素标记的内部标准增加了在 DNA 水解和分析物富集步骤中更正分子损失的优势, 以及样品之间分析物电离的差异。当一个峰出现 1121920时, 它还有助于识别正确的色谱峰。

在从不同生物样本 1215、20中提取的 dna 中, 采用了几种基于 hplc-esi-mmsms 的方法对其进行了定量. , 21,22,23,24,25, 26,27, 28,29.细颗粒 (PM2.5) 携带有机和无机化学物质, 如多环芳烃 (pahs)、硝基多环芳烃、醛、酮、羧酸、奎诺、金属和水溶性离子, 这些化学物质可能会引起炎症和氧化应激, 有利于生物分子损伤发生的条件和疾病30,31,32,33。我们在这里验证了 HPLC-ESI-MMSMS 方法, 成功地应用于定量的 8-oxodGuo, 1,n6-do和 1,n2-dguo 在肺, 肝脏和肾脏 do阿美鼠的评估环境 PM2.5曝光的影响34

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Protocol

从巴西里约热内卢 Oswaldo Cruz 基金会 (FIOCURZ) 实验动物繁育中心获得了四周大的无病原体的雄性阿布 j 小鼠, 并接受了大学医学院道德委员会的相应治疗(第113第十届议定书)

1. 收集小鼠组织

  1. 用木胺和氯胺酮对动物进行麻醉。对于体重为30克的小鼠, 注射含有2.63 毫克氯胺酮和0.38 毫克木胺的溶液 (不超过2毫升)。
  2. 收集血液 (0.5-1.5 毫升) 进行补充分析 (例如, 抗氧化酶活性, 丙二醛水平)。
  3. 从骨盆到小灵的过程中, 把腹部的头发剪掉。在无毛区域的垂直中线上做一个切口。在水平侧线进行切口, 以暴露腹部器官。
  4. 切断腹主动脉, 促进失血过多, 并对动物实施安乐死。
  5. 删除感兴趣的组织 (在这种情况下, 肝脏, 肾脏和肺)。
    1. 切除肝, 切下卡瓦静脉和门静脉肝静脉。
    2. 要切除肾脏, 可以分割肾静脉和动脉。
    3. 要切除肺部, 请在横隔膜四肢和靠近胸壁的周长处做一个切口。在胸腔内部打开剪刀, 打破锁骨。将外生骨从灵皮过程中切入气管, 以暴露肺和心脏。
      1. 用钳子固定肺, 将气管和韧带切开肺部周围。小心地取出阻塞的肺加上心脏。要将肺移出块, 用钳子按住心脏, 切断其底部的所有血管。
  6. 立即用冷盐水 (0.9% 氯化钠) 清洗分离的组织, 转移到低温管中, 并立即将导管浸入液氮中。完成工作后, 将管材存放在-80°c。
    注意: 与皮肤、粘膜或眼睛直接接触的液氮会导致烧伤。使用适当的个人保护, 以避免接触。在通风的实验室工作, 避免因液氮蒸气而窒息。

2. DNA 提取

注: 对 Loureiro 等人 (2009年)35中的 dna 提取方法进行了修改, 以便对这里研究的病变进行分析。

  1. 将含有组织的管子转移到干冰中。
  2. 用放在冰上的培养板作为基础, 用手术刀切割一块组织。重量1克, 可立即使用。剩余的组织应保存在干冰上, 直到在-80°c 恢复储存。
    注: 重要的是要避免解冻剩余的组织, 以防止人工制品的形成, 如果重复的分析是需要的。
  3. 在50毫升封管中的每1克组织中, 加入含有 0.5 mM 地氧胺的商业细胞裂解溶液的10毫升, 并保持在冰上。
    注: 在溶液体积中添加去氧胺, 以便立即使用。对于每100毫升溶液, 加入0.0328 克的甲磺酸二磺酸二甲酯盐。
  4. 使用组织均质机对组织进行均质化, 直到获得没有组织碎片的均匀溶液。在均质过程中保持管冷 (在冰上)。使用低速, 以避免加热。
  5. 在每个均质样品中加入150μl 蛋白酶 k 溶液 (20 Mg/ml)。通过倒置晃动管道, 并在室温下过夜。
  6. 加入40μl 的核糖核酸溶液 (15 Mg/ml), 倒置晃动, 并将管材保持室温2小时。
    注: 在醋酸钠缓冲液 10 mM, pH 5.2 中制备核糖核酸酶溶液, 以避免沉淀。在使用前, 在100°c 下加热溶液 15分钟, 以获得无脱氧核糖核酸酶的溶液。
  7. 加入5毫升的商业蛋白沉淀液, 用力涡流, 离心机在 2000 x, 4°c, 10分钟。
  8. 将上清液转移到含有10毫升冷异丙醇的50毫升封管中。轻轻反转管几次, 直到观察沉淀的 DNA。
    注: 协议可以在这里暂停, 使管道保持在-20°c。
  9. 使用在末端关闭的巴斯德移液器收集沉淀的 DNA。将其转移到含有4毫升 10 Mm 反渗透缓冲液、1 mM 去氧胺、pH 7.0 的管中。
  10. 在 DNA 完全溶解在上述溶液中 (不产生涡流) 后, 加入含有4% 异戊醇的氯仿溶液4毫升。
  11. 将管材反转 10次, 离心机在 2, 000 x 克,4°c, 10分钟分离两个阶段, 并将上部阶段转移到一个新的管。
  12. 重复步骤2.10 和2.11 两次。
  13. 加入8毫升的绝对乙醇和0.4 毫升的5m 氯化钠溶液沉淀 dna。
  14. 再收集沉淀的 DNA, 并将其转移到70% 乙醇的3毫升。重复此步骤一次。
  15. 谨慎地丢弃乙醇溶液, 并将含有沉淀 DNA 的管倒置在吸收性纸上, 以去除溶液中多余的物质。
  16. 加入 200μl 0.1 mM 去氧胺溶液溶解 DNA。将试管保持在 4°c, 直到 DNA 完全补水 (隔夜)。
  17. 通过在260纳米的吸收率和260/280 纳米的吸收率测定其纯度来确定 DNA 浓度。
    注: 要确定 DNA 浓度, 请将10ΜL 的 dna 溶液转移到99μl 的超纯水 (100x 稀释)。将吸收率乘以260纳米 (应低于 1) 50 (50μg/ml 是双链 DNA 的浓度, 当在260纳米的1厘米路径长度溶液的吸收率为1时), 并通过稀释 (100x) 以μg/mL 获得 dna 浓度。如果在260纳米的吸收率高于 1, 则需要额外的稀释。26/280 纳米吸收率应等于或高于 1.8, 以达到所需的 DNA 纯度, 但在1.6 左右的比率是可以接受的。

3. DNA 酶解

  1. 分析配方
    1. 1 ,n6 -dado 和 1 , n 2 - dgo分析 : 对于含有150μg Dna 的 Aliquot , 加入 7 . 5Μl的 200 mm Trisl mggcl 2 缓冲液 ( ph 7 . 4 ) , 1 . 4 μl的内部标准溶液含有 250 fmo / μl的 [15n 5] 1,n6-dado 和 [15n5] 1,n2-d果, 和15个单位的脱氧核糖核酸酶 i. 用超纯水将最终体积调整到 200μl, 减去在步骤3.2.1 上使用的酶的体积。
    2. 8-oxodGuo 分析: 对于含有 80μg DNA 的 aliquot, 加入3.8 微米 200 mM Trris变 mgl2缓冲液 (ph 7.4), 2 微米升的内部标准溶液含有 1, 000 fmolμμμl 的 [15n5] 8-奥索德, 以及8个单位的脱氧核糖核酸 ii。用超纯水将最终体积调整为 100μl, 减去在3.2.2 步骤中使用的酶体积。
      注: 内部标准 [15n5] 1,n 6-dado,[15n 5] 1,n 2-doo 和 [15n5] 8-氧国可以被合成, 并被描述为描述35,36,37。注入样品卷中的内部标准数量应与注入的校准曲线体积中的数量相同。
  2. 在37°c 下将样品培养1小时。
    1. 步骤3.1 的样本:添加 0.006个单位的鳄鱼毒素麻疯细胞磷酸二酯酶 i 和15个单位的碱性磷酸酶从牛肠道黏膜。
    2. 步骤3.2 的样本: 添加0.0032个单位的鳄鱼毒素麻疯细胞磷酸二酯酶 i 和8个单位的碱性磷酸酶从牛肠道黏膜。
  3. 在37°c 下将样品培养1小时。
  4. 以 14, 000 x克离心样品10分钟。
  5. 步骤3.2.1 的样品: 用 HPLC/DAD 对每个样品进行10μl 的分离, 以便对脱氧核苷 (dAdo, DAdo) 进行定量 (步骤 9)。将剩余体积进行固相萃取 (第4步)。
  6. 步骤3.2.2 的样品: 将上清液的80μl 转移到小瓶中, 用于在 HPLC-ESI-MMSMS 系统中注射50μl (1, 000 fmol 的 [15n5] 8-oxodGuo)。保留剩余的 20μl, 以便用 HPLC/DAD 对 Doo 进行定量 (步骤 9)。

4. 固相萃取分析 1, n6-dado 和 1, n2-doo

  1. 用以下一系列溶液的1毫升装入墨盒 (SPE-C18、30mgml、33μm、1 mL): 100% 甲醇、去离子水、水解 DNA 样品、去离子水、10% 甲醇、15% 甲醇和100% 甲醇 (待收集)。
    注: 不要让墨盒在不同溶液的应用之间干燥。在上一个解决方案完全进入墨盒后立即添加下一个解决方案。
  2. 真空干燥含有加合物的最后一个洗脱分数 (100% 甲醇)。
  3. 在 HPLC-ESI-MSMS 分析之前, 立即将83.1 微米的超纯水中的干燥样品重新悬浮, 在每个样品的50Μl 中获得每个内部标准的 200 fmol。

5. 校准曲线的准备

  1. 在8-oxodGuo 标准的300至 6, 000 fmol 间隔内准备至少5个点, 每个点的固定数量为 [15n5]8-氧郭氏 1, 000 fmol。考虑注入量中的这些量。
  2. 在 1, n 6-dado 和 1,n2-dguo 的1至 40 fmol 的间隔中至少准备5个点, 固定金额为 200 Fmol [15n 5]1,n6-dado 和 [15n5] 1,N2在每一点。考虑注入量中的这些量。
  3. 在 Doo 和 dAdo 的 0.05-1 nmol 区间内至少准备5个点。考虑注入量中的这些量。

6. 用于方法验证的 DNA 样本的制备

  1. 1,n6-dado 和 1,n2-dguo 分析: 添加不同数量的 1,n6-dado 和 1, n2-dguo (例如, 1.75, 8.75, 17.5 和 35 fmol) 和固定数量 [15n5] 1 ,N6-p dado 和 [15n5] 1,n2-dguo (350 fmol) 到100微克的小腿胸腺 dna, 并进行酶解, 如步骤3所述。在两个不同的日子里将样品加工成一式两份。使用样品进行方法的准确性和精度评估。
    注: DNA 水解物的最终体积为 200Μl (步骤 3), 其中10Μl 将被分离, 以便用 HPLC/DAD 对脱氧核苷进行定量 (步骤 9)。剩余的溶液 (190Μl) 将进行固相萃取 (步骤 4), 干燥的部分将重新悬浮在83.1 μL (步骤 4.3) 中, 其中50μl 将被注入 HPLC-ESI-MSEMS 系统。注入的 1,n6-dado 和1, n2-dol 的量将为 1, 5, 10 和 20 fmol, 200 fmol 的 [15n 5] 1,n6-dado 和 [15n5] 1,n, n 每个样品 2-多。
  2. 8-Oxodow 分析: 添加不同数量的 8-oxodGuo (例如, 734、1468、2, 938 和 4 408 fmol) 和固定数量的 [15n5] 8-奥多果 (2, 000 fmol) 到100微克的小牛胸腺 dna, 并进行步骤3所述的酶解。在两个不同的日子里将样品加工成一式两份。使用样品进行方法的准确性和精度评估。
    注: DNA 水解物的最终体积为 100μl (步骤 3), 其中50μl 将注入 HPLC-ESI-MSMS 系统。郭某注射的8-oxodGuo 的用量为367、734、1469和 2204 fmol, 每个样品中含有 1, 000 fmol [15n 5] 8-氧果。
  3. 在 8个100微克小牛胸腺 dna 样本中加入 13.125 Fmol 的 1,n6-dado (在注射体积中获得 7.5 fmol) 和 35 fmol 1, n 2-dguo (在注射体积中获得 20 fmol)。
    1. 在四个样品中加入内部标准 [15n5] 1,n6-dado 和 [15n5] 1,n2-doo (200 fmol) 到四个样品中。对所有样品进行 DNA 水解和固相萃取。
    2. 在其他四个样品中加入内部标准 [15n 5]1、n6-Dado[15n 5] 1、n2-dguo (200 fmol)。
    3. 使用样品计算固相萃取中的加合物的回收情况。

7. 8-oxodGuo 的 HPLC-ESI-MSMS 分析

  1. 将8-oxodGuo 标准注入设备, 设置 ESI-MMSMS 参数, 以便通过多重反应监测 (M/Z) 对其碎裂模式进行最佳检测: m/z [m + h] + →m\ 168 [m-2 '-脱氧核糖 + h]+
    1. 使用相同的参数检测 [15n 5] 8-oxodgo:m\ z289 [m + h]+m\ z→173 [m-2 '-脱氧核糖 + h]+
      注: 使用与本工作中使用的设备相当或更好的设备 (见材料表)。ESI-MSMS 参数如表 1所示进行了设置。
  2. 过滤器 (使用0.22 微米多孔膜) 和脱胶 (使用声纳器) 所有的水性高效液相色谱溶剂。
  3. 使用以下色谱条件进行分析, 安装系统, 如图 2所示。
    注: A 列连接到二元泵。它的洗脱剂是针对紫外线检测和浪费在前16分钟和32到46分钟的色谱, 如图 2 a 所示。这是注射后立即通过样品洗脱的色谱柱。B 列连接到等有权泵和质谱仪。当阀门切换到图2B 所示的位置时, 它只在16-32分钟的时间间隔内接收 a 列的洗脱。阀门开关允许两个列之间的连接, 这是由二元泵梯度洗脱。图 2B中所示的配置允许进一步的峰值分离和收缩。此外, 只有色谱分数达到质谱仪, 提高灵敏度和选择性。
    1. 将 50 x 2.0 mm i. d.、2.5μm、C18 柱 (图 2a 列) 与 c18 保安墨盒 (4.0 x 3.0 mm i. d.) 耦合, 梯度为0.1% 甲酸 (溶剂 a) 和含有0.1% 甲酸 (溶剂 b) 的甲醇, 流量为 150μll/min 和25°c。
      1. 二元泵使用以下梯度程序: 从0分钟到 25分钟, 溶剂 B 的 0-15%;25至28分钟, 15-80% 的溶剂 B;28至31分钟, 溶剂 B 的 80%;31至33分钟, 80-0% 的溶剂 B;33至 46分钟, 溶剂的 0% B。
      2. 使用开关阀将洗脱的前16分钟引导到废物, 将16-32 分钟的分数定向到连接到 ESI 源并通过等有权泵调节的第二列 (150 x 2.0 mm i. d., 3.0 微米,图 2的 C18, b 列)含有0.1% 甲酸 (150μlmin) 的水中的乙醇。
        注: 在使用步骤7.3.1.2 的开关阀程序之前, 请检查 8-奥多国标准从第一列的 l洗在16分钟后。在32分钟关闭阀门是很重要的, 使用二元泵的梯度, 从第二柱中排出 8-氧, 并得到一个清晰的色谱峰。病灶 8-奥克洛-郭从第二柱在大约36分钟时, 根据所使用的柱和设备的不同, 可能会发生分析物保留时间的变化。HPLC 溶剂梯度程序的适应性可能是必要的。

Figure 2
图2。用于分析 8-oxo-7-8-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-氧果) 的两柱系统。A) 在色谱的前16分钟和32到46分钟使用的配置;B) 在间隔16-32分钟中使用的配置, 允许在洗脱质量谱仪的 esi 源之前, 在 b 列中进一步分离和峰值变窄。奥利维拉等34 人重新公布了这一数字。请点击这里查看此图的较大版本.

8. HPLC-ESI-MMSS 分析 1, n 6- Dado 和 1, n 2 -do

  1. 将 1,n6-dado 和 1 ,n2-DGUO 标准注入设备, 通过多重反应监测 (mrm) 设置 esi-m1/ms 参数, 以获得对其碎片模式的最佳检测: m/z276 [ m + h]  +→z160 [m 2 '-脱氧核糖 + h]+用于检测 1,n6-dado 和 m/z292 [m + h] + →m/z 176 [m-2 '-脱氧核糖 + h]+ 用于检测 1,n2
    1. 使用相同的参数检测 [15n5] 1,n6-do (m/z 281[m + h]+m/z→165 [m-2 '-脱氧核糖 + h]+) 和 [15n5] 1,n2-dguo(m/z 297 [m + h]+ m/z 181 [m-2 '-脱氧核糖 + h]+). 按照表 1中的说明设置 esi-mmsms 参数。
参数 郭八通 乙二醇加收
窗帘气体 20 psi 20 psi
雾化气体 55 50
离子源气体 50 psi 40 psi
碰撞引起的分离气体
离子喷涂电压 5000元 4500
ESI 探头温度 450元 450元
消除潜力 31 v, 8-oxodGuo 41 v, 1, n6-dado
31 v, [15n 5] 8-Oxodguo 41 v, [15n5] 1, n6-dado
45 v, 1, n2do
45V, [15n5] 1, n2do
碰撞能量 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, n6-dado
23 eV, [15n5] 8-oxodGuo 25 eV, [15n5]1, n6-dado
27 eV, 1, n2do
27 ev, [15n5] 1, n2do
碰撞细胞退出潜力 16 v, 8-oxodGuo, 8 v, 1, 000n 6-dado
16 v, [15n 5] 8-Oxodguo 8 v, [15n5] 1, n6-dado
16 v, 1, n2do
16 v, [15n5] 1, n2do
入学潜力 10 v 10 v

表1。用于检测 dna 病变的 ESI-MSMS 设备中使用的参数.这张桌子是由 Oliveira 等人修改的

  1. 过滤器 (使用0.22 微米多孔膜) 和脱胶 (使用声纳器) 所有的水性高效液相色谱溶剂。
  2. 使用以下色谱条件进行分析。
    1. 使用 150 x 2.0 mm i. d.、3.0 微米、C18 柱与 C18 安全防护弹药筒 (4.0 x 3.0 mm i. d.) 耦合, 梯度为 5 mM 醋酸铵、pH 6.6 (溶剂 A) 和乙腈 (溶剂 B), 流速为 130Μl/min 和25°c。
      1. 二元泵使用以下梯度程序: 从0分钟到 10分钟, 溶剂 B 的 0%;10至39分钟, 0-20% 的溶剂 B;39至41分钟, 20-75% 的溶剂 B;41至 46分钟, 溶剂 B 的 75%;46至 47分钟, 75-0% 的溶剂 B;47至60分钟, 溶剂 B 的0%。
      2. 使用开关阀将洗脱液的前35分钟引导到 ESI 源, 并将35-42分钟的分数引导到 ESI 源。确保在设定的时间间隔 (35-42分钟) 内, 从柱中发出的加合标准。如有必要, 请进行调整。

9. 用 HPLC-UV 对正常的 2 '-脱氧核糖核酸进行定量

  1. 使用与本工作中使用的设备类似的设备 (见材料表)。
  2. 使用250毫米 x 4.6 毫米身份证, 5μm, C18 柱连接到 C18 保安墨盒 (4.0 x 3.0 毫米身份证), 梯度为0.1% 甲酸和甲醇。
    1. 使用以下梯度程序: 从0分钟到 25分钟, 0 至18% 甲醇;从 25至27分钟, 18 至0% 甲醇;流量为 1 mL/min 和 30°c, 为 27至37分钟, 甲醇为0%。
    2. 为 2 '-脱氧核苷定量而保留的每个样品的5Μl。
    3. 将 DAD 检测器设置为260纳米, 用于集成 dGuo 和 DGuo 峰。

10. DNA 病变的定量

  1. 积分8-oxodGuo 的峰, [15n5] 8-oxodguo, 1,n6-dado,[15n 5] 1,n6-dado,1, n2-doo, 和 [15n5] 1,n2-HPLC-ESI-MMS 分析。
    1. 计算 8-Oxodgue/[15 n 5]8-OxodGuo/、1, n6-dadoe/[15n5] 1、n6-dado 和 1,n2-guoe/郭内/[15n5] 1,n2-doo 用于校准曲线和样品。
    2. 使用在 y 轴10.1.1 的步进中获得的面积比以及 x 轴中每个点上存在的分析物量绘制校准曲线。
    3. 使用步骤10.1.1 计算的比率和步骤10.1.2 的校准曲线计算每个注射样本中病变的数量 (fmol)。
  2. 从 HPLC-UV 分析中整合了 dGuo 和 dAdo 的峰值。
    1. 使用 y 轴中步骤10.2 中获得的区域和 x 轴中每个点中存在的分析物量绘制校准曲线。
    2. 利用步骤10.2 中获得的区域和步骤10.2.1 的校准曲线, 计算每个注入样品中 Dol 和 dAdo 的数量 (nmol)。
  3. 计算在 HPLC-ESI-MMSMS 系统中注入的每个样品中存在的 dGuo 和 dAdo 的数量 (nmol), 考虑到在步进10.2.2 中计算的数量存在于5μl 的样品体积中, 而50μl 则被注入到 HPLC-ESI-MMSS 系统中。
    注: 要计算用于8-Oxoodguo 分析的样品中的 Dgue 量, 只需将步骤10.2.2 中获得的量 (nmolseμμl) 乘以50即可。为计算样品中的 dAdo 和 DAdo 的含量, 用于分析 1,n6-DAdo 和 1, n2dAdo, 考虑固相萃取后的浓度步骤。在 HPLC-ESI-MMSMS 系统中注入50Μl 的体积相当于原始样品的114.32μl。在步骤10.2.2 中获得的量 (nmol/μL) 应乘以 114.32, 以获得正确的值。
  4. 计算磨牙分数 8-oxodGuo/dGuo,1, nDado变,1, n2-guoe/dguo。比率 (fmol lesion/nmol 正常脱氧核苷) 给出每10个正常 dGuo 或 dado 的病变数。

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Representative Results

小鼠肝脏 (约1克组织)、肺 (约0.2 克组织) 和肾脏 (约0.4 克组织) 的平均 DNA 浓度 (±sd) 分别为 5, 068±665、4, 369±0200和 3, 223±723μml, 最终体积为200微米。图 3显示了由 HPLC-DAD 获得的纯化 dna 的代表性色谱图。从 RNA 核糖核酸中释放的四种 2 '-脱氧核苷的存在, 在相应的 2 '-脱氧核苷之前立即发出, 显示了 DNA 的纯度。

图4至图6 显示了 HPLC-ESI-MMSS 分析对小鼠组织 dna 样本中的 8-氧、1、n6-dado 和1, n2进行定量的代表性色谱图。图 4中通过紫外检测获得的色谱显示, 从第一列到 ~ 10分钟, 四个 2 '-脱氧核苷的洗脱, 与 8-氧果分离良好, 消除了不想要的干扰。在对 1,n6-dado 和 1, n 2 doo 的分析中, 没有正常的 2 '-脱氧核苷, 因为它们在固相萃取过程中被淘汰。图 7显示了本工作中使用的标准的质谱。

图 834 显示了用于定量的 8 - Oxodguo 、1,n 6 -dado 和 1 ,n2 -dguo 的典型线性校准曲线。如表 234 所示, 这些方法是准确和准确的。DNA aliquots 的日精度计算为 16.97, 辅于367fmol 的 8-oxodo, 辅于 10 fmol 的 1,n 2-d果为 14.01, 辅以 1 fmol 的 1,n6-dado 为16.97。在柱上注射标准的定量限度 (sn = 10) 为 8-氧果 25 fmol,1, n6-dado 0.3 Fmol, 1 Fmol 为 1,n2-dgoo34

将该方法应用于对阿可氏组织肺、肝脏肾脏 dado 中的 8-奥克多1, n2-和 1, n6-dado 进行定量, 使其在 pm2.5中暴露于环境空气中。那些暴露在现场环境空气中的人作为研究控制34。发现的水平见表 3, 并表明通过 pm2.5暴露34诱导、肝脏和肾脏的 dna 病变。

Figure 3
图 3.从小鼠肺中提取的 DNA 样品水解物的色谱图。从 HPLC-DAD 系统获得260纳米的色谱。四个 2 '-脱氧核苷: dC, 2 '-脱氧胞苷;dA, 2 '-脱氧腺苷;dG, 2 '-脱氧鸟苷;dT, 2 '-脱氧胸苷。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.代表性色谱图, 显示检测到 8-oxo-7-8-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-notogo) 和内部标准 [15n 5] 8-氧 ms,以及正常的 2 '-脱氧核苷从第一列的洗脱, 并转用于 DAD 检测 (= 260 nm) 和废物.DNA 样本是从小鼠肺中提取的。利用图像中指定的碎片, 采用多反应监测 (MRM) 对 HPLC-ESI-MMSMS 进行了分析。请点击这里查看此图的较大版本. 

Figure 5
图 5.代表性色谱图显示检测 1,N6-乙二醇-2-脱氧腺苷 (1,n 6-dado) 和内部标准 [15n5] 1,N6-由 HPLC-ESI-MSMS.DNA 样本是从小鼠肾脏提取的。利用图像中指定的碎片, 采用多反应监测 (MRM) 进行分析。请点击这里查看此图的较大版本. 

Figure 6
图 6.代表性色谱图显示检测 1,N2-乙基-2-脱氧鸟苷 (1,n2-dguo) 和内部标准 [15n5] 1,N2-HPLC-ESI-MSMS.DNA 样本是从小鼠肝脏中提取的。利用图像中指定的碎片, 采用多反应监测 (MRM) 进行分析。请点击这里查看此图的较大版本. 

Figure 7
图 7. 本工作中使用的标准的质谱.利用 20 eV 的碰撞能量对 [M + H] + 离子进行分裂, 在 MS2得到了光谱。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8.Hplc-esi-mmsms 获得的校准曲线, 用于定量 8-氧-7-8-二氢-2 '-脱氧鸟苷 (8-oxodgoo)、1,n2-乙酯-2 N6-乙二-2-脱氧腺苷 (1,n6-dado).相对面积是指病变与其各自 [15n5] 内部标准之间的面积比。奥利维拉等对这一数字作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.

参数 郭八通 乙二醇加收
窗帘气体 20 psi 20 psi
雾化气体 55 50
离子源气体 50 psi 40 psi
碰撞引起的分离气体
离子喷涂电压 5000元 4500
ESI 探头温度 450元 450元
消除潜力 31 v, 8-oxodGuo 41 v, 1, n6-dado
31 v, [15n 5] 8-Oxodguo 41 v, [15n5] 1, n6-dado
45 v, 1, n2do
45V, [15n5] 1, n2do
碰撞能量 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, n6-dado
23 eV, [15n5] 8-oxodGuo 25 eV, [15n5]1, n6-dado
27 eV, 1, n2do
27 ev, [15n5] 1, n2do
碰撞细胞退出潜力 16 v, 8-oxodGuo, 8 v, 1, 000n 6-dado
16 v, [15n 5] 8-Oxodguo 8 v, [15n5] 1, n6-dado
16 v, 1, n2do
16 v, [15n5] 1, n2do
入学潜力 10 v 10 v

表1。用于检测 dna 病变的 ESI-MSMS 设备中使用的参数.这张桌子是由 Oliveira 等人修改的

基本水平 添加 检测 检测到 (-) 基部 精度 简历
平均±sd (fmol) 费莫尔 平均±sd (fmol) 平均 (fmol) % %
郭八通
373.00 ± 2.71 0 372.79 ± 50。6 - - 13.57
373.98 ± 4.86 367 755.41 ± 107.92 381 103.93 14.29
374.84 ± 5.19 734 1069.57 ± 108. 51 695 94.65 10.14
357.94 ± 15.05 1469年 1671. 67 ± 4.27 1314 89.43 2.65
371.07 ± 2.43 2204 2272.01 ± 40。2 1901年 要是有86.25 1.77
1,n 2do
0.54 ± 0.01 0 0.54 ± 0.09 - - 16.88
0.54 ± 0.01 1 1.47 ± 0.16 0.93 93.39 11.17
0.55 ± 0.01 5 5.30 ± 0.72 4.76 95.11 13.50
0.53 ± 0.01 10 10.60 ± 0.39 10.06 100.63 3.67
0.54 ± 0.01 20 20.20 ± 0.93 19.66 98.29 4.60
1,n 6-dado
2.08 ± 0.10 0 2.29 ± 0.39 - - 17.05
2.05 ± 0.04 1 3.06 ± 0.47 1.01 100.89 15.31
1.99 ± 0.06 5 7.87 ± 1.66 5.88 117.60 21.10
2.03 ± 0.07 10 12.43 ± 1.25 10.41 104.06 10.06
1.97 ± 0.03 20 22.42 ± 3.89 20.46 102.29 17.34

表 2.方法精度和变异系数 (cv) 定量 8-奥克德, 1,N2-do 和 1 ,N6-DNA 里的 "大户"这张桌子是由 Oliveira 等人修改的

环境空气 下午2.5             N P 值
平均±SEM 平均±SEM   
8-Xodhoine/108 dguo 2124 ± 5696 2466 ± 93.10 6 0.01
1,n 2Guo/108 dguo ND ND - -
1,n 6-Dado/108 dado 1.41 ± 0.23 1.44 ± 0.13 7。 Ns
8-Xodhoine/108 dguo 2848 ± 183。5 2949 ± 223。8 6;5 Ns
1,n 2Guo/108 dguo 7.79 ± 2.49 24.94 ± 5.21 4个 0.02
1,n 6-Dado/108 dado 2.82 ± 0.30 2.18 ± 0.25 6 Ns
8-Xodhoine/108 dguo 1854年 ± 87.13 2363 ± 157。0 6 0.02
1,n 2Guo/108 dguo ND ND - -
1,n 6-Dado/108 dado 1.09 ± 0.15 1.52 ± 0.12 7。 0.04
(NS, 不显著;ND, 未检测到)

表 3.小鼠组织样本中 DNA 损伤水平.小鼠暴露在环境空气和环境空气中, 在 PM2.5 ( pm2.5浓缩 30次)。采用 t 检验方法比较了两组 (环境空气和 PM2.5) 之间的均值。当 P 值小于0.05 时, 结果被认为有统计学意义。这张桌子是由 Oliveira 等人修改的

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Discussion

采用高效液相色谱法进行的8-oxodguo 分析中发现的一个主要问题是, 在 dna 提取、dna 水解和 dna 水解物浓度 22,38的研究过程中, 可能会诱导其形成。为了最大限度地减少8-Oxodoguo 人工物形成的问题, 建议在所有 DNA 提取、储存和水解溶液中添加脱氧胺, 使用碘化钠碎屑法, 并避免 DNA 提取中的苯酚, 如并且脱氧核糖核酸的用途共计接近100μg 在水解做法, 以最大限度地减少虚假氧化的贡献对最后的结果39。我们考虑到了上述建议, 但使用碘化钠的混沌方法进行 DNA 提取。相反, 为了简单起见, 我们使用商业解决方案提取 DNA, 在使用前在它们中添加去甲氧胺。此外, 所获得的 DNA 水解物直接注入 HPLC-ESI-MMSMS 系统的第一柱, 以便以前从正常的核苷中分离出 8-氧果。就在8-oxodGuo 洗脱之前, 使用开关阀将第一柱洗脱剂分流到第二柱, 在第二柱上实现进一步分离和峰值收缩。这种方法为8-oxodGuo 定量提供了足够的灵敏度, 不受干扰。赵又廷和22号同事介绍了 dna 中 8-氧郭的最相似的定量方法, 他们使用陷阱柱进行样品清理, 然后在样品洗脱进入分析柱之前, 使用开关阀列。另外, 在 HPLC-ESI-MMSMS 分析之前, 从高效液相色谱分离 dna 水解物中提取的 8-氧果浓度步骤为15, 这种方法更加费力。

根据 hplc 分析, 报告啮齿类动物肺组织中的 8-氧郭的基本水平为 180-50/8 doguo23394142、43、1, 340-2120/108 dGuo44, 约 3000/108 doo45,46, 用碘化钠从 dGuo 提取方法中获得的取值最低。在暴露于环境空气的小鼠的肺中发现的8-Coxodguo 平均水平为 2124/10 8 dGuo.暴露在 p m 2.5 (表 3) 34 中的环境空气中, 暴露于环境空气的动物的水平上升到2466/10 8 dGuo.用碘化钠的沙向同性法提取 DNA, 可以提高检测组间差异的灵敏度。在本研究中, 对照组肺、肾和肝脏 DGUO 中的平均 8-氧水平分别为2.0、1.8 和 2.7倍, 高于欧洲标准委员会获得的中位基础水平 (1047/108 dGuo )从猪肝标准样品中提取的 8-氧郭实验室间评估中的 DNA 损伤 (ESCODD)38。

DNA 中 1,n6-dado 和1, 2-dguo 的检测主要限制是方法敏感性, 因为这些病变发生在很低的水平。经 hplc-esi-msms 量化的 dna 中 1,n2-dgoo 的最低水平在人类细胞系和大鼠组织中每 108 doo 0.87-4 个病变范围为25,47。提高其定量灵敏度和选择性的一种方法是使用固相萃取从 DNA 水解物的大样本中浓缩。这一清理步骤解决了将超过100微克的 DNA 水解物注入 HPLC 分析柱可能产生的色谱问题。我们在这里介绍的验证方法中使用了这种方法。在这项研究中检测到的 1, n6-dado 的水平在使用超敏免疫类似/32p 贴标签 48, 49 的研究中获得的范围内.50,51 , 低于使用 hplc-esi-mms/212324的其他群体所描述的情况。同样, 这里量化的 1,n2-doo水平34与 garcia25和 angeli26报告的使用 hplc-esi-msms 的最低水平一致。

可提供比本研究中使用的设备更高灵敏度的 HPLC-ESI-MMSMS 系统。使用这类系统可以分析少量的 DNA, 从而扩大了这里介绍的方法在组织可用性受到限制的情况下的应用范围。这里介绍的方法可适用于其他改性脱氧核苷的量化, 这取决于其标准和同位素标准的可用性。为了获得分析中包括的所有分子的尖峰, 有必要调整色谱条件。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

Fapesp (和平与安全基金会), cnpq (prc. 454214/2014-6 和 42918m/2016-6)、capes、prpusp (próreitoria de pesquisa da o d sculo)、inct inaira (mct/cnpq/fndc-capese/capese/FEMIG/FAPERJ/FAPESP;Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (Fapsp/cnpqq/capes;Proc. 573530/2008-4), NAP 氧化还原瘤 (PRPUSP;Proc. 2011.1.9352.1.8) 和 CENID 氧化还原瘤 (FAPESP;方案 2012-0797-8)。T. f. Oliveira 和 A. A. F. Oliveira 获得了 FAPESP (Proc. 2012163-8、201-r8891比0、2012/08617-4) 和 CAPES (卫六-德苏格) 和 CAPES (卫六) 的奖学金。M. H. g. Medeiros、P. di Mascio、P. h. n. Saldiva 和 a. p. m. Loureiro 接受了 CNPq 的研究金。

这项工作中的一些数字和表格最初发表在奥利维拉 a. a. f. 等人身上, 对来自巴西圣保罗市的接触浓缩环境微粒物质的小鼠的遗传毒性和表观毒性作用 (PM2.5)粒子和纤维毒理学.15、40 (2018年)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

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