Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn elektrofiele, het genereren van reactieve elektrofielen op biotransformatie, of induceren oxidatieve stress. Onder de geoxideerde nucleobasen, de meest bestudeerde is een 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) of 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), een biomarker van oxidatively geïnduceerde basis schade in DNA. Aldehyden en epoxyaldehydes als gevolg van het lipiden peroxidatie proces zijn elektrofiele moleculen die in staat zijn mutagene exocyclic DNA adducten te vormen, zoals de etheno adducten 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2- εdGuo) en 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo), die als potentiële biomarkers in de pathofysiologie van ontsteking zijn voorgesteld. Selectieve en gevoelige methoden voor de kwantificering ervan in DNA zijn noodzakelijk voor de ontwikkeling van preventieve strategieën om de mutaties van cellen en de ontwikkeling van chronische ziekten te vertragen (bijv. kanker, neurodegeneratieve ziekten). Onder de gevoelige methoden die beschikbaar zijn voor hun detectie (hoge prestaties vloeibare chromatografie gekoppeld aan elektrochemische of tandem massaspectrometrie detectoren, Comet Assay, immunoassays, 32P-postlabeling), de meest selectieve zijn die op basis op hoge prestaties vloeibare chromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (HPLC-ESI-MS/MS). Selectiviteit is een essentieel voordeel bij het analyseren van complexe biologische monsters en HPLC-ESI-MS/MS geëvolueerd als de gouden standaard voor de kwantificering van gemodificeerde nucleosiden in biologische matrices, zoals DNA, urine, plasma en speeksel. Het gebruik van isotopically gelabeld interne normen voegt het voordeel van correcties voor molecule verliezen tijdens de DNA-hydrolyse en analyt verrijking stappen, alsmede voor de verschillen van de analyt ionisatie tussen de monsters. Het helpt ook bij de identificatie van de juiste chromatografie piek wanneer er meer dan een piek aanwezig is.

We presenteren hier gevalideerd gevoelige, accurate en nauwkeurige HPLC-ESI-MS/MS methoden die met succes werden toegepast voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-Dado en 1,N2-dGuo in de Long-, lever-en nier-DNA van A/J muizen voor de beoordeling van de effecten van ambient PM2,5 blootstelling.

Introduction

Sommige reactieve zuurstofsoorten (ROS) kunnen koolstof dubbele banden van de basissen van DNA en sommige koolstof in deoxyribose moiety oxideren, die geoxideerde basissen en de bundel onderbrekingen van DNA produceert1. Als een negatief geladen molecuul rijk aan stikstof-en zuurstofatomen, DNA is ook een doelwit voor elektrofiele groepen die covalente reageren met de nucleofiele sites (stikstof en zuurstof), het geven van producten die worden genoemd DNA adducten2. Dus, DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn elektrofiele, het genereren van reactieve elektrofielen op biotransformatie, of induceren oxidatieve stress1, 2. Hoewel de gewijzigde DNA-bases kunnen worden verwijderd uit DNA door base of nucleotide accijns reparatie (BER of NER), de inductie van een onbalans tussen de generatie en verwijdering van DNA-laesies in het voordeel van de voormalige leidt tot een netto stijging van hun niveau in DNA overwerk3 < /C5 >. Resultaten zijn de toename van de DNA-mutatie, verminderde genexpressie, en verminderde eiwit activiteit2,4,5,6,7, effecten die nauw verwant zijn aan de ontwikkeling van ziekten. De veranderingen van DNA kunnen diverse cellulaire functies, zoals cel signalering, cel cyclus, de integriteit van het genoom, Telomere stabiliteit, de epigenome, chromatin structuur, het verbinden van RNA, eiwit homeostase, metabolisme, apoptosis, en de differentiatie van de cel beïnvloeden8 ,9. Strategieën om de mutatie tarieven van cellen en de ontwikkeling van chronische ziekten (bijv. kanker, neurodegeneratieve ziekten) te vertragen passeren de kennis van de mutatie bronnen, onder hen, DNA laesies en hun oorzaken.

ROS gegenereerd endogene in overmaat, als gevolg van blootstelling aan verontreinigende stoffen, aanhoudende ontsteking, ziekte Pathofysiologie (bijv. diabetes), enz., zijn belangrijke oorzaken van Biomolecuul schade, met inbegrip van DNA en lipide schade1. Als voorbeeld, de zeer reactieve hydroxyl radicale (OH) gevormd uit H2O2 reductie door overgang metaalionen (FE2 +, Cu+) oxideert de DNA-bases, DNA-suiker moiety en meervoudig onverzadigde vetzuren bij diffusie-gecontroleerde tarieven10. Onder de 80 reeds gekenmerkt geoxideerd nucleobasen3, de meest bestudeerde is een 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) of 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-OxodGuo, Figuur 1), een laesie die in staat is om te induceren gt-transversies in zoogdiercellen10,11. Het wordt gevormd door de mono elektronische oxidatie van guanine, of door hydroxyl radicale of singlet zuurstof aanval van Guanine in DNA1. Meervoudig onverzadigde vetzuren zijn andere belangrijke doelstellingen van zeer reactieve oxidanten, zoals Oh, die het proces van lipide peroxidatie1,12te initiëren. Het geeft aanleiding tot vetzuur waterstof peroxiden die kunnen ontbinden aan elektrofiele aldehyden en epoxyaldehydes, zoals malondialdehyde, 4-hydroxy-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4,5-epoxy-(2E)-Decena, hexenal, acroleïne, Crotonaldehyde, die bekwaam om mutagene exocyclic te vormen DNA adducten, zoals malondialdehyde-, Propano-, of etheno adducten1,12,13. De etheno adducten 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2-εdGuo, Figuur 1) en 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo, Figuur 1 ) zijn voorgesteld als potentiële biomarkers in de pathofysiologie van ontsteking14,15.

Figure 1
Figuur 1. Chemische structuren van de DNA-laesies gekwantificeerd in de huidige studie. dR = 2 ´-deoxyribose. Dit cijfer is gewijzigd van Oliveira et al.34. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De studies die in de vroege jaren ' 80 worden uitgevoerd lieten de gevoelige opsporing van 8-oxodGuo door hoge prestaties vloeibare chromatografie toe die aan elektrochemische opsporing wordt gekoppeld (HPLC-ECD). De kwantificering van 8-oxodGuo door HPLC-ECD in verscheidene biologische systemen die aan oxiderende voorwaarden worden onderworpen leidde tot de erkenning van 8-oxodGuo als biomarker van oxidatively veroorzaakte basis schade in DNA1,16. Hoewel robuust en waardoor de kwantificering van 8-oxodGuo in de lage fmol bereik17, HPLC-ECD metingen vertrouwen op de nauwkeurigheid van de analyt retentietijd voor de identificatie van de analyt en op de chromatografie resolutie om interferenties te voorkomen van andere monster bestanddelen. Aangezien de elektrochemische opsporing het gebruik van zout (b.v., kaliumfosfaat, natriumacetaat) in de mobiele fase vereist, vergt het behoud van adequate analytische voorwaarden routine kolom en materiaal het schoonmaken tijd.

Als alternatief, het gebruik van de bacteriële DNA-reparatie enzym formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) en, daarna, menselijke 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), voor de opsporing en verwijdering van 8-oxoGua van DNA, ontstond als een manier voor de inductie van DNA-alkali labiele Sites. De alkali labiele plaatsen worden omgezet in de bundel onderbrekingen van DNA en laten de zeer hoge gevoelige indirecte kwantificering van 8-oxoGua door alkalische enige Elektroforese van het gel (de "komeet assay") toe. De hoge gevoeligheid en de verwezenlijking van de analyses zonder de behoefte aan cellulaire DNA-extractie zijn de belangrijkste voordelen van dit type van analyse. Het geeft de laagste steady-state niveaus van 8-oxoGua in DNA, meestal 7-10 keer lager dan de niveaus verkregen door bioanalytische methoden op basis van HPLC. Het is echter een indirecte meting van 8-oxoGua en sommige nadelen zijn het gebrek aan specificiteit of de onbekende efficiëntie van de reparatie-enzymen gebruikt1,16,18.

Immunoassays zijn andere set van methoden die worden gebruikt voor de detectie van 8-oxoGua1 en exocyclic DNA adducten, zoals 1,n6-dAdo en 1,n2-dGuo12. Ondanks de gevoeligheid, is een tekortkoming van het gebruik van antilichamen voor opsporing van de letsels van DNA het gebrek aan specificiteit toe te schrijven aan cross-reactiviteit aan andere componenten van biologische steekproeven, met inbegrip van de normale DNA-basissen1,12. De exocyclic DNA adducten, met inbegrip van 1,n6-Dado en 1,n2-dGuo, kan ook worden gedetecteerd en gekwantificeerd door zeer gevoelige 32P-postlabeling assays12. De hoge gevoeligheid van 32P-postlabeling staat het gebruik van zeer kleine hoeveelheden DNA toe (b.v., 10 µ g) voor opsporing van ongeveer 1 adduct per 1010 normale basissen19. Echter, het gebruik van radio-chemicaliën, gebrek aan chemische specificiteit en lage nauwkeurigheid zijn enkele nadelen19,20.

Een gemeenschappelijke beperking van de hierboven aangehaalde methoden is de geringe selectiviteit of specificiteit voor de detectie van de gewenste moleculen. In dit scenario, HPLC gekoppeld aan electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (HPLC-ESI-MS/MS en HPLC-MS3) geëvolueerd als de gouden standaard voor de kwantificering van gemodificeerde nucleosiden in biologische matrices, zoals DNA, urine, plasma en speeksel 1 , 19 , 20. voordelen van HPLC-ESI-MS/MS methoden zijn de gevoeligheid (meestal in de lage fmol bereik) en de hoge specificiteit die door i) de chromatografie scheiding, II) de karakteristieke en bekende patroon van molecule fragmentatie in de massa de botsings kamer van de spectrometer, en III) de nauwkeurige meting van de geselecteerde massa aan lasten verhouding (m/z) in veelvoudige reactie controle wijze1,19. Het gebruik van isotopically gelabeld interne normen voegt het voordeel van correcties voor molecule verliezen tijdens de DNA-hydrolyse en analyt verrijking stappen, alsmede voor de verschillen van de analyt ionisatie tussen de monsters. Het helpt ook bij de identificatie van de juiste chromatografie piek wanneer meer dan een piek aanwezig is1,12,19,20.

Verschillende methoden op basis van HPLC-ESI-MS/MS zijn gebruikt voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-dAdo en 1,n2-dGuo in DNA geëxtraheerd uit verschillende biologische monsters12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . De fijne deeltjes (PM2,5) dragen organische en anorganische chemische producten, zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (pak's), Nitro-pak's, aldehyden, ketonen, carbonzuren, quinolines, metalen, en in water oplosbare ionen, die ontsteking kunnen veroorzaken en oxidatieve stress, voorwaarden die het voorkomen van biomolecule schade en ziekte30,31,32,33gunst. We presenteren hier gevalideerd HPLC-ESI-MS/MS methoden die met succes werden toegepast voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-Dado en 1,n2-dGuo in Long-, lever-en nier-DNA van A/J muizen voor de beoordeling van de effecten van ambient PM2,5 exposure34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vier weken oude mannelijke A/J muizen, specifieke pathogeen vrij, werden verkregen uit het broed centrum van proefdieren van Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brazilië, en werden dienovereenkomstig behandeld aan de ethische commissie van de Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van São Paulo (protocol no 1310/09).

1. verzameling van muizen weefsels

  1. Verdoven het dier met xylazine en ketamine. Voor een muis met 30 g lichaamsgewicht, een oplossing injecteren (niet meer dan 2 mL) met 2,63 mg ketamine en 0,38 mg xylazine, ze intraperitoneaal.
  2. Verzamel bloed (0,5-1,5 mL) voor aanvullende analyses (bijv. antioxidant enzymactiviteit, malondialdehyde niveaus).
  3. Scheer het buikhaar van het bekken naar het xiphoid proces. Maak een incisie in een verticale middelste lijn in het haarloze gebied. Maak incisies in horizontale laterale lijnen om de buikorganen bloot te leggen.
  4. Snijd de abdominale aorta om exsanguination te bevorderen en om het dier te euthanaseren.
  5. Verwijder de weefsels van belang (in dit geval, lever, nieren en longen).
    1. Voor het verwijderen van de lever, snijd de inferieure Cava ader en Portal lever ader.
    2. Voor het verwijderen van de nieren, sectie de renale aderen en slagaders.
    3. Voor het verwijderen van de longen, maak een incisie in het diafragma ledematen en omtrek dicht bij de thoracale wand. Breek de clavicles door het openen van een schaar in het interieur van de thoracale holte. Snijd de externe bot van de xiphoid proces naar de luchtpijp, om de longen en het hart bloot.
      1. Houd de Long met een tang, sectie de luchtpijp en de ligamenten rond de longen. Verwijder zorgvuldig de blok longen plus hart. Voor het verwijderen van de longen uit het blok, houd het hart met een tang en snijd alle schepen in de basis.
  6. Was de geïsoleerde weefsels onmiddellijk in koude zoutoplossing (0,9% NaCl), de overdracht aan cryogene buizen, en onmiddellijk Dip de buizen in vloeibare stikstof. Na het voltooien van het werk, slaan de buizen bij-80 °C.
    Let op: vloeibare stikstof in direct contact met de huid, slijmvliezen of ogen veroorzaakt brandwonden. Gebruik de juiste individuele bescherming om contact te vermijden. Werk in een geventileerde laboratorium om te voorkomen dat verstikking als gevolg van vloeibare stikstof damp.

2. DNA-extractie

Nota: de extractiemethode van DNA werd gewijzigd van Loureiro et al. (2009)35 om de analyses van de hier onderzochte letsels toe te staan.

  1. Breng de buizen met de weefsels naar droog ijs.
  2. Gebruik een kweek plaat die op ijs wordt geplaatst als basis om een stuk van weefsel met een scalpel te snijden. Gewicht 1 g voor onmiddellijk gebruik. Het resterende weefsel zou op droog ijs moeten worden gehouden tot het aan opslag bij-80 °C terugkeert.
    Nota: het is belangrijk om het ontdooien van het resterende weefsel te vermijden om de vorming van artefacten te verhinderen als de herhalingen van de analyses nodig zijn.
  3. Aan elke 1 g weefsel in 50 mL afgedekte buizen, voeg 10 mL van de commerciële cel lysis oplossing met 0,5 mM deferoxamine en houden op ijs.
    Nota: Voeg deferoxamine aan het volume van oplossing voor direct gebruik toe. Voor elke 100 mL van de oplossing, Voeg 0,0328 g van de deferoxamine mesylate zout.
  4. Meng de weefsels met behulp van een weefsel homogeniseer tot een homogene oplossing zonder weefsel fragmenten wordt verkregen. Houd de buis koud (op ijs) tijdens de homogenisering. Gebruik een lage snelheid om te voorkomen dat Verwarming.
  5. Voeg 150 µ L van proteïnase K oplossing (20 mg/mL) toe aan elk gehomogeniseerd monster. Schud de buizen door inversie en bewaar ze bij kamertemperatuur 's nachts.
  6. Voeg 40 µ L van ribonuclease een oplossing (15 mg/mL), schud door inversie, en houd de buizen bij kamertemperatuur voor 2 uur.
    Opmerking: bereid ribonuclease een oplossing in Natriumacetaat buffer 10 mM, pH 5,2 om neerslag te voorkomen. Verwarm de oplossing bij 100 °C voor 15 min voor gebruik om een oplossing vrij van deoxyribonuclease te verkrijgen.
  7. Voeg 5 mL van de commerciële eiwit neerslag oplossing toe, draai de Vortex krachtig en centrifugeer bij 2.000 x g, 4 °c, gedurende 10 minuten.
  8. Breng de supernatants naar 50 mL afgedekte buizen met 10 mL koude isopropanol. Omkeren de buizen voorzichtig meerdere malen tot de observatie van het neergeslagen DNA.
    Nota: het protocol kan hier worden onderbroken, houdend de buizen bij-20 °C.
  9. Verzamel de neergeslagen DNA met behulp van een Pasteur pipet gesloten aan het eind. Breng het over naar buizen met 4 mL 10 mM tris buffer, 1 mM deferoxamine, pH 7,0.
  10. Nadat het DNA volledig is opgelost in de bovenstaande oplossing (niet Vortex), Voeg 4 mL van een chloroformoplossing met 4% van isoamyl alcohol.
  11. Omkeren de buizen 10 keer voor homogenisering, centrifugeer bij 2.000 x g, 4 °c, 10 minuten om de twee fasen te scheiden, en breng de hogere fase naar een nieuwe buis over.
  12. Herhaal de stappen 2,10 en 2,11 nog twee keer.
  13. Voeg 8 mL absolute ethanol en 0,4 mL van een oplossing van 5 M NaCl toe om het DNA neer te storten.
  14. Verzamel opnieuw het neergeslagen DNA en breng het over naar 3 mL van 70% ethanol. Herhaal deze stap nog een keer.
  15. Gooi de ethanol oplossing met voorzichtigheid en omkeren de buizen met de neergeslagen DNA op absorberend papier om de overmaat van de oplossing te verwijderen.
  16. Voeg 200 µ L van 0,1 mM deferoxamine oplossing om het DNA te ontbinden. Onderhoud de buizen bij 4 °C tot het DNA volledig wordt gehydrateerd (overnachting).
  17. Bepaal de concentratie van DNA door de absorptie bij 260 nm en zijn zuiverheid door de de absorptie verhouding van 260/280 nm te meten.
    Nota: om de concentratie van DNA te bepalen, breng een hoeveelheid van 10 µ L van de oplossing van DNA naar 990 µ L van ultrapuur water (100x verdunning) over. Vermenigvuldig de absorptie op 260 nm (het moet lager zijn dan 1) door 50 (50 µ g/mL is de concentratie van dubbele gestrande DNA wanneer de absorptie van een 1 cm pad lengte oplossing bij 260 nm is 1) en door de verdunning gebruikt (100x) om de DNA-concentratie in µ g/mL te verkrijgen. Als de absorptie bij 260 nm boven 1 is, zijn extra verdunningen noodzakelijk. De 260/280 nm absorptie ratio moet gelijk zijn of boven de 1,8 voor de gewenste zuiverheid van DNA, maar ratio's rond 1,6 zijn aanvaardbaar.

3. de enzymatische hydrolyse van DNA

  1. Analyse recept
    1. 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo analyses: aan een hoeveelheid die 150 µ g van DNA bevat, voeg 7,5 µ l van 200 mM tris/MgCl2 buffer (pH 7,4) toe, 1,4 µ l van de interne standaardoplossing die 250 fmol/µ l van [15N5 bevat ] 1,n6-εdAdo en [15n5] 1,n2-εdGuo, en 15 eenheden van deoxyribonuclease I. pas het uiteindelijke volume aan 200 µ l met ultrapuur water af, aftrekkend de volumes van enzymen die bij stap 3.2.1 moeten worden gebruikt.
    2. 8-oxodGuo analyses: aan een hoeveelheid bevattend 80 µ g van DNA, voeg 3,8 µ L van 200 mM tris/MgCl2 buffer (pH 7,4) toe, 2 µ l van de interne standaardoplossing die 1.000 fmol/µ l van [15N5] 8-oxodGuo, en 8 eenheden van deoxyribonuclease I. bevat. Pas het uiteindelijke volume aan 100 µ L met ultrapuur water af, aftrekkend de volumes van enzymen die bij stap 3.2.2 moeten worden gebruikt.
      Opmerking: de interne normen [15n5] 1,n6-εdAdo, [15n5] 1,n2-εdGuo en [15n5] 8-oxodGuo kunnen worden synthetized en gekarakteriseerd als beschreven35,36,37. De hoeveelheden van de interne normen in de geïnjecteerde monster volumes moeten dezelfde zijn als die in de geïnjecteerde kalibratiecurve volumes.
  2. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 1 uur.
    1. Samples van stap 3,1: Voeg 0,006 eenheden van phosphodiesterase I uit Crotalus Atrox en 15 eenheden van alkalische fosfatase van boviene intestinale mucosa.
    2. Monsters van stap 3,2: Voeg 0,0032 eenheden van phosphodiesterase I uit Crotalus Atrox en 8 eenheden van alkalische fosfatase van boviene intestinale mucosa.
  3. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 1 uur.
  4. Centrifugeer de monsters op 14.000 x g gedurende 10 minuten.
  5. Monsters van stap 3.2.1: Scheid 10 µ L van elk monster voor de kwantificering van de deoxynucleosides (dAdo, dGuo) door HPLC/DAD (stap 9). Het restvolume wordt onderworpen aan een vaste fase extractie (stap 4).
  6. Samples uit stap 3.2.2: overdracht 80 µ L van de bovendrijvende naar flacons voor injecties van 50 µ L (1.000 fmol van [15N5] 8-OXODGUO) in het HPLC-ESI-MS/MS systeem. Reserveer de resterende 20 µ L voor de kwantificering van dGuo door HPLC/DAD (stap 9).

4. Solid phase extractie voor analyses van 1, n6-ΕdAdo en 1, n2-εdGuo

  1. Laad de cartridges (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 µm mL) met 1 mL van de volgende reeks oplossingen: 100% methanol, geioniseerd water, gehydrolyseerd DNA-monster, geioniseerd water, 10% methanol, 15% methanol en 100% methanol (te verzamelen).
    Opmerking: laat de cartridges niet drogen tussen de toepassingen van de verschillende oplossingen. Voeg de volgende oplossing onmiddellijk na de vorige oplossing komt de cartridge volledig.
  2. Vacuüm droog de laatste elutie fractie (100% methanol) met de adducten.
  3. Hersuspendeer de gedroogde monsters in 83,1 l van ultrapuur water onmiddellijk voorafgaand aan de HPLC-ESI-MS/MS analyse om 200 fmol van elke interne standaard in 50 µ L van elk monster te verkrijgen.

5. voorbereiding van kalibratiekrommen

  1. Bereid ten minste vijf punten in het interval van 300 tot 6.000 fmol van 8-oxodGuo standaard, met het vaste bedrag van 1.000 fmol van [15N5] 8-oxodGuo in elk punt. Beschouw deze bedragen in het volume geïnjecteerd.
  2. Bereid ten minste vijf punten in het interval van 1 tot 40 fmol van 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo, met vaste bedragen van 200 fmol van [15n5] 1,n6-εdAdo en [15n5] 1, Neirynck 2-εdGuo in elk punt. Beschouw deze bedragen in het volume geïnjecteerd.
  3. Bereid ten minste vijf punten in het interval van 0,05-1 nmol van dGuo en dAdo. Beschouw deze bedragen in het volume geïnjecteerd.

6. bereiding van DNA-monsters voor methode validatie

  1. 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo analyses: Voeg verschillende hoeveelheden van 1, n6-εdAdo en 1, n2-εdGuo (bijv. 1,75, 8,75, 17,5, en 35 fmol) en vaste bedragen van [15n5] 1, N6-εdAdo en [15n5] 1,N2-εdGuo (350 fmol) tot 100 µ g van kalf Thymus DNA en uitvoeren van de enzymatische hydrolyse zoals beschreven in stap 3. Verwerken van de monsters in viervoud in twee verschillende dagen. Gebruik de steekproeven voor methode nauwkeurigheid en precisie beoordeling.
    Nota: het definitieve volume van het DNA eiwithydrolysaten zal 200 µ L (stap 3) zijn, waarvan 10 µ L voor kwantificering van deoxynucleosides door HPLC/Papa (stap 9) zal worden gescheiden. De resterende oplossing (190 µ L) zal worden onderworpen aan een solide fase extractie (stap 4), zal de gedroogde fractie worden opnieuw geschorst in 83,1 µ L (stap 4,3), waaruit 50 µ L zal worden geïnjecteerd in de HPLC-ESI-MS/MS systeem. De hoeveelheden 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo geïnjecteerd zullen 1, 5, 10 en 20 fmol zijn, met 200 fmol van [15n5] 1,n6-εdAdo en [15n5] 1,n 2-εdGuo in elk monster.
  2. 8-oxodGuo analyses: Voeg verschillende hoeveelheden van 8-oxodGuo (bijv. 734, 1.468, 2.938, en 4.408 fmol) en een vast bedrag van [15N5] 8-oxodGuo (2.000 fmol) tot 100 µ g van kalf Thymus DNA en het uitvoeren van de enzymatische hydrolyse zoals beschreven in stap 3. Verwerken van de monsters in viervoud in twee verschillende dagen. Gebruik de steekproeven voor methode nauwkeurigheid en precisie beoordeling.
    Nota: het definitieve volume van het DNA eiwithydrolysaten zal 100 µ L (stap 3) zijn, waarvan 50 µ L in het systeem HPLC-ESI-MS/MS zal worden ingespoten. De bedragen van 8-oxodGuo geïnjecteerd zullen 367, 734, 1469, en 2204 fmol, met 1.000 fmol van [15N5] 8-oxodGuo in elk monster.
  3. Voeg 13,125 fmol van 1,n6-εdAdo (voor het verkrijgen van 7,5 fmol in het injectie volume) en 35 Fmol van 1,n2-εdGuo (tot en met 20 fmol in het injectie volume te verkrijgen) tot acht monsters van 100 µ g van kalf Thymus DNA.
    1. Voeg de interne normen [15n5] 1,n6-εdAdo en [15n5] 1,n2-εdGuo (200 fmol) aan vier van de monsters toe. Ga verder met de DNA-hydrolyse en Solid phase extractie van alle monsters.
    2. Voeg de interne normen [15n5] 1,n6-εdAdo en [15n5] 1,n2-εdGuo (200 fmol) toe aan de andere vier monsters.
    3. Gebruik de samples om het herstel van de adducten te berekenen van Solid phase extractie.

7. HPLC-ESI-MS/MS analyse van 8-oxodGuo

  1. Infusen van de 8-oxodGuo standaard in de apparatuur, stel de ESI-MS/MS parameters voor de beste detectie van haar fragmentatie patroon door meerdere reactie monitoring (MRM): m/z 284 [m + H] + → m/z 168 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
    1. Gebruik dezelfde parameters voor de detectie van [15N5] 8-oxodGuo: m/z 289 [m + H]+m/z → 173 [m-2 '-deoxyribose + h]+.
      Opmerking: gebruik een gelijkwaardige apparatuur of beter dan de apparatuur die wordt gebruikt in dit werk (Zie de tabel van materialen). De ESI-MS/MS parameters zijn ingesteld zoals beschreven in tabel 1.
  2. Filter (met behulp van 0,22 µm poreuze membranen) en degasify (met behulp van een geen ultrasoonapparaat) alle op water gebaseerde HPLC oplosmiddelen.
  3. Gebruik de volgende chromatografie voorwaarden voor de analyses, het monteren van het systeem zoals weergegeven in Figuur 2.
    Opmerking: kolom A is verbonden met de binaire pomp. De eluens is gericht op UV-detectie en afval in de eerste 16 min en van 32 tot 46 min van de chromatografie, zoals weergegeven in Figuur 2a. Dit is de kolom waardoor de steekproef onmiddellijk na injectie wordt geëlueerd. Kolom B is aangesloten op de isocratic pomp en de massaspectrometer. Het ontvangt de eluens van kolom A slechts in 16-32 min interval, wanneer de klep aan de positie wordt geschakeld die in Figuur 2bwordt getoond. De klep omschakeling staat de verbinding tussen de twee kolommen toe, die door de binaire pomp gradiënt worden geëlueerd. De configuratie weergegeven in Figuur 2b maakt verdere piek scheiding en vernauwing mogelijk. Bovendien, alleen de chromatografie Fractie van belang bereikt de massaspectrometer, het verbeteren van de gevoeligheid en selectiviteit.
    1. Elueer een 50 x 2,0 mm id, 2,5 µm, C18 kolom (kolom A van Figuur 2) gekoppeld aan een C18 beschermhuls (4,0 x 3,0 mm ID) met een gradiënt van 0,1% vorm zuur (oplosmiddel a) en methanol met 0,1% vorm zuur (oplosmiddel B) met een debiet van 150 µ l/min en 25 °C.
      1. Gebruik de volgende gradiënt programma voor de binaire pomp: van 0 tot 25 min, 0-15% van solvent B; 25 tot 28 min, 15-80% van oplosmiddel B; 28 tot 31 min, 80% van oplosmiddel B; 31 tot 33 min, 80-0% van oplosmiddel B; 33 tot 46 min, 0% van solvent B.
      2. Gebruik de Schakel klep om de eerste 16 min van eluens naar afval en de 16-32 min Fractie om een tweede kolom (150 x 2,0 mm id, 3,0 µm, C18, kolom B van Figuur 2) aangesloten op de ESI bron en geconditioneerd door de isocratic pomp met een oplossing van 15% me thanol in water met 0,1% vorm zuur (150 µ L/min).
        Opmerking: voordat u de Schakel klep programma van stap 7.3.1.2, controleer dan of de 8-oxodGuo standaard elutes uit de eerste kolom na 16 min. Het is belangrijk om de klep bij 32 min te sluiten om de gradiënt van de binaire pomp aan Elueer 8-oxodGuo van de tweede kolom te gebruiken en een scherpe chromatografie piek te krijgen. De laesie 8-oxodGuo elutes van de tweede kolom op ongeveer 36 min. variaties van de retentietijd van de analyt kunnen optreden afhankelijk van de gebruikte kolom en apparatuur. Aanpassingen van de HPLC oplosmiddel gradiënt programma kan nodig zijn.

Figure 2
Figuur 2. Systeem van twee kolommen gebruikt voor 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo) analyses. A) configuratie die in de eerste 16 min en van 32 tot 46 min van de chromatografie wordt gebruikt; B) configuratie gebruikt in het interval 16-32 min, waardoor verdere scheiding en piek vernauwing in kolom B voorafgaand aan elutie aan de ESI bron van de massaspectrometer. Dit cijfer is heruitgegeven van Oliveira et al.34. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

8. HPLC-ESI-MS/MS analyse van 1, n 6 -ΕdAdo en 1, n 2 -εdGuo

  1. Infusie van de 1, n6-ΕdAdo en 1, n2-ΕDGUO normen in de apparatuur, stel de ESI-MS/MS parameters voor de beste detectie van hun versnippering patronen door meerdere reactie monitoring (MRM): m/z 276 [m + H]+m/z 160 [m 2 '-deoxyribose + h]+ voor de opsporing van 1,N6-εdAdo en m/z 292 [m + H]+  m/z 176 [m-2 '-deoxyribose + H ]+ voor detectie van 1,N2-εdGuo.
    1. Gebruik dezelfde parameters voor de detectie van [15n5] 1,n6-εdAdo (m/z 281 [m + H]+m/z → 165 [m-2 '-deoxyribose + H]+) en [15N 5] 1,N2-εdGuo (m/z 297 [m + H]+m/z 181 [m-2 '-deoxyribose + h]+). Stel de ESI-MS/MS parameters in zoals beschreven in tabel 1.
ESI-MS/MS parameters 8-oxodGuo Etheno adducten
Gordijn gas 20 psi 20 psi
Verstuivings systemen gas 55 50
Ion bron gas 50 psi 40 psi
Botsing-geïnduceerde dissociatie gas Medium Medium
Ion spray voltage 5000 4500
ESI sonde temperatuur 450 450
Potentieel voor ontclustering 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdAdo
31 V, [15N5] 8-oxodGuo 41 V, [15n5] 1, n6-εdAdo
45 V, 1, N2-εdGuo
45V, [15n5] 1, n2-εdGuo
Botsing energie 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdAdo
23 eV, [15N5] 8-oxodGuo 25 eV, [15n5] 1, n6-εdAdo
27 eV, 1, N2-εdGuo
27 eV, [15n5] 1, n2-εdGuo
Botsing cel exit potentiaal 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdAdo
16 V, [15N5] 8-oxodGuo 8 V, [15n5] 1, n6-εdAdo
16 V, 1, N2-εdGuo
16 V, [15n5] 1, n2-εdGuo
Entree potentieel 10 V 10 V

Tabel 1. Parameters gebruikt in de ESI-MS/MS apparatuur voor de opsporing van de DNA-laesies. Deze tabel is gewijzigd van Oliveira et al.34.

  1. Filter (met behulp van 0,22 µm poreuze membranen) en degasify (met behulp van een geen ultrasoonapparaat) alle op water gebaseerde HPLC oplosmiddelen.
  2. Gebruik de volgende chromatografie voorwaarden voor de analyses.
    1. Elueer een 150 x 2,0 mm id, 3,0 µm, C18 kolom gekoppeld aan een C18 Security Guard cartridge (4,0 x 3,0 mm ID) met een gradiënt van 5 mM ammoniumacetaat, pH 6,6 (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B) met een stroomsnelheid van 130 µ L/min en 25 ° c.
      1. Gebruik de volgende gradiënt programma voor de binaire pomp: van 0 tot 10 min, 0% van solvent B; 10 tot 39 min, 0-20% van oplosmiddel B; 39 tot 41 min, 20-75% van oplosmiddel B; 41 tot 46 min, 75% van oplosmiddel B; 46 tot 47 min, 75-0% van het oplosmiddel B; 47 tot 60 min, 0% van solvent B.
      2. Gebruik de Schakel klep om de eerste 35 min van eluens naar afval en de 35-42 min Fractie aan de ESI bron. Wees er zeker van dat de adduct standaarden Elueer uit de kolom in het ingestelde interval (35-42 min). Indien nodig aanpassingen aanbrengen.

9. kwantificering van normale 2 '-deoxyribonucleosides door HPLC-UV

  1. Gebruik een apparatuur vergelijkbaar met de apparatuur die wordt gebruikt in dit werk (Zie de tabel van materialen).
  2. Elueer een 250 mm x 4,6 mm id, 5 µm, C18 kolom bevestigd aan een C18 Security Guard cartridge (4,0 x 3,0 mm ID) met een gradiënt van 0,1% vorm zuur en methanol.
    1. Gebruik het volgende verloop programma: van 0 tot 25 min, 0 tot 18% methanol; van 25 tot 27 min, 18 tot 0% methanol; van 27 tot 37 min, 0% methanol) met een stroomsnelheid van 1 mL/min en 30 °C.
    2. Injecteer 5 µ L van elk monster voorbehouden voor 2 '-deoxynucleosides kwantificering.
    3. Stel de papa detector op 260 nm voor de integratie van de dGuo en dAdo pieken.

10. kwantificering van de DNA laesies

  1. Integreer de pieken van 8-oxodGuo, [15n5] 8-OxodGuo, 1,n6-εdAdo, [15n5] 1,n6-εdAdo, 1,n2-εdGuo, en [15n5] 1,n2 -εdGuo uit de HPLC-ESI-MS/MS analyses.
    1. Bereken de gebieds verhoudingen van 8-oxodGuo/[15n5] 8-OxodGuo, 1,n6-εdAdo/[15n5] 1,n6-εdAdo, en 1,n2-εdGuo/[15n5 ] 1,N2-εdGuo voor de kalibratiekrommen en de monsters.
    2. Plot de kalibratiekrommen met behulp van de oppervlakte ratio's verkregen in stap 10.1.1 in de y-as en de hoeveelheden analyten aanwezig zijn in elk punt in de x-as.
    3. Bereken de bedragen (fmol) van laesies in elk geïnjecteerd monster met behulp van de ratio's berekend in stap 10.1.1 en de kalibratie bochten van stap 10.1.2.
  2. Integreer de toppen van dGuo en dAdo van de HPLC-UV-analyses.
    1. Plot de kalibratiekrommen met behulp van de gebieden verkregen in stap 10,2 in de y-as en de hoeveelheden analyten aanwezig zijn in elk punt in de x-as.
    2. Bereken de bedragen (nmol) van dGuo en dAdo in elk geïnjecteerd monster met behulp van de gebieden verkregen in stap 10,2 en de kalibratie bochten van stap 10.2.1.
  3. Bereken de bedragen (nmol) van dGuo en dAdo aanwezig in elk monster geïnjecteerd in het HPLC-ESI-MS/MS systeem; overwegende dat de bedragen berekend in stap 10.2.2 aanwezig zijn in het monstervolume van 5 µ L, terwijl 50 µ L werden geïnjecteerd in de HPLC-ESI-MS/MS systeem.
    Nota: om de hoeveelheid dGuo in de steekproeven te berekenen die voor 8-oxodGuo analyse worden gebruikt, vermenigvuldig enkel het bedrag (nmol/µ L) dat in stap 10.2.2 door 50 wordt verkregen. Voor de berekening van de bedragen van dAdo en dGuo in de monsters gebruikt voor analyses van 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo, overweeg dan de concentratie stap na een vaste fase extractie. Het volume van 50 µ L geïnjecteerd in de HPLC-ESI-MS/MS systeem komt overeen met 114,32 µ L van het oorspronkelijke monster. De in stap 10.2.2 verkregen bedragen (nmol/µ L) moeten worden vermenigvuldigd met 114,32 om de juiste waarden te verkrijgen.
  4. Bereken de Kies fracties 8-oxodGuo/dGuo, 1,n6-εdAdo/Dado, 1,n2-εdGuo/dGuo. De ratio's (fmol laesie/nmol normale deoxynucleoside) geven het aantal laesies per 106 normale DGuo of dAdo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De gemiddelde concentraties van DNA (± BR) die van muizen lever (~ 1 g weefsel) worden verkregen, Long (~ 0,2 g weefsel) en nier (~ 0,4 g weefsel) waren, respectievelijk, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021, en 3.223 ± 723 µ g/mL in het uiteindelijke volume van 200 µ L. Een vertegenwoordiger chromatogram verkregen door HPLC-papa van het gezuiverde DNA wordt getoond in Figuur 3. De aanwezigheid van de vier 2 '-deoxynucleosides, vrij van de RNA ribonucleosides, die Elueer onmiddellijk vóór de overeenkomstige 2 '-deoxynucleosides, toont de zuiverheid van DNA.

Representatieve chromatogrammen van HPLC-ESI-MS/MS analyses voor kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo in muizen weefsel DNA-monsters worden weergegeven in figuren 4 tot en met 6. De chromatogram verkregen met UV-detectie in Figuur 4 toont de vier 2 '-deoxynucleosides eluting van de eerste kolom tot ~ 10 min, met een goede scheiding van 8-oxodGuo, waardoor ongewenste interferenties. Normale 2 '-deoxynucleosides waren niet aanwezig in de analyses van 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo, aangezien zij in de stevige fase extractie procedure werden geëlimineerd. Massaspectra van de normen die in dit werk worden gebruikt, worden weergegeven in Figuur 7.

Typische lineaire kalibratiekrommen voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo zijn weergegeven in Figuur 834. De methoden waren nauwkeurig en nauwkeurig, zoals uiteengezet in tabel 234. De interdag precisie berekend voor DNA-fracties aangevuld met 367 fmol van 8-oxodGuo was 16,97%, aangevuld met 10 fmol van 1,n2-εdGuo was 14,01%, en aangevuld met 1 Fmol van 1,n6-εdAdo was 16,66%. De grenzen van de kwantificering (S/N = 10) voor de normen geïnjecteerd op de kolom waren 25 fmol voor 8-oxodGuo, 0,3 fmol voor 1,n6-εdAdo, en 1 Fmol voor 1,n2-εdGuo34.

De methoden werden toegepast op de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n2-ΕdGuo en 1,n6-εdAdo in de Long-, lever-en nier-DNA-monsters van A/J muizen weefsels blootgesteld hele lichaam aan de omgevingslucht verrijkt in PM2,5, in vergelijking met die worden blootgesteld aan in situ Ambient Air als de studie controle34. De gevonden niveaus worden getoond in lijst 3, en wijzen op de inductie van de letsels van DNA in Long, lever en nier door PM2,5 blootstelling34.

Figure 3
Figuur 3 . Chromatogram van de hydrolysaat van een DNA-monster geëxtraheerd uit muis Long. De chromatogram werd verkregen op 260 nm van het HPLC-papa systeem. Vier 2 '-deoxynucleosides zijn vermeld: gelijkstroom, 2 '-deoxycytidine; dA, 2 '-deoxyadenosine; dG, 2 '-deoxyguanosine; dT, 2 '-deoxythymidine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 . Vertegenwoordiger chromatogrammen toont de opsporing van 8-Oxo-7, 8-dihydro-2 ´-deoxyguanosine (8-oxodGuo) en de interne standaard [15N5] 8-oxodGuo door HPLC-ESI-MS/MS, evenals de normale 2 '-deoxynucleosides eluting van de eerste kolom en doorgeschakeld naar de opsporing van de Papa (λ = 260 nm) en afval. Het DNA-monster werd geëxtraheerd uit muis Long. De analyses door HPLC-ESI-MS/MS werden uitgevoerd met veelvoudige reactie controle (MRM) gebruikend de versnipperingen die in de beelden worden gespecificeerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figure 5
Figuur 5 . Vertegenwoordiger chromatogrammen waaruit de detectie van 1, Neirynck 6 -etheno-2 ´-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo) en de interne norm [15n5] 1, Neirynck 6 -εdAdo door HPLC-ESI-MS/MS. De DNA-monster werd gewonnen uit muis nier. De analyses werden uitgevoerd met veelvoudige reactie controle (MRM) gebruikend de versnipperingen die in de beelden worden gespecificeerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figure 6
Figuur 6 . Vertegenwoordiger chromatogrammen waaruit de detectie van 1, Neirynck 2 -etheno-2 ´-deoxyguanosine (1,n2-εdGuo) en de interne norm [15n5] 1, Neirynck 2 -εdGuo door HPLC-ESI-MS/MS. De steekproef van DNA werd gehaald uit muis lever. De analyses werden uitgevoerd met veelvoudige reactie controle (MRM) gebruikend de versnipperingen die in de beelden worden gespecificeerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figure 7
Figuur 7 . Massaspectra van de normen die in dit werk worden gebruikt. De spectra werden verkregen in MS2 met behulp van de botsing energie van 20 eV aan het fragment van de [M + H]+ ionen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figure 8
Figuur 8 . Kalibratiekrommen verkregen door HPLC-ESI-MS/MS voor kwantificering van 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n2-etheno-2 ´-deoxyguanosine (1,n2-εdGuo) en 1, N6-etheno-2´-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo). Het relatieve gebied betekent de gebieds verhoudingen tussen het letsel en zijn respectieve [15N5] interne norm. Dit cijfer is gewijzigd van Oliveira et al.34. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

ESI-MS/MS parameters 8-oxodGuo Etheno adducten
Gordijn gas 20 psi 20 psi
Verstuivings systemen gas 55 50
Ion bron gas 50 psi 40 psi
Botsing-geïnduceerde dissociatie gas Medium Medium
Ion spray voltage 5000 4500
ESI sonde temperatuur 450 450
Potentieel voor ontclustering 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdAdo
31 V, [15N5] 8-oxodGuo 41 V, [15n5] 1, n6-εdAdo
45 V, 1, N2-εdGuo
45V, [15n5] 1, n2-εdGuo
Botsing energie 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdAdo
23 eV, [15N5] 8-oxodGuo 25 eV, [15n5] 1, n6-εdAdo
27 eV, 1, N2-εdGuo
27 eV, [15n5] 1, n2-εdGuo
Botsing cel exit potentiaal 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdAdo
16 V, [15N5] 8-oxodGuo 8 V, [15n5] 1, n6-εdAdo
16 V, 1, N2-εdGuo
16 V, [15n5] 1, n2-εdGuo
Entree potentieel 10 V 10 V

Tabel 1. Parameters gebruikt in de ESI-MS/MS apparatuur voor de opsporing van de DNA-laesies. Deze tabel is gewijzigd van Oliveira et al.34.

Basaal niveau Toegevoegd Gedetecteerd Gedetecteerd (-) basale Nauwkeurigheid Cv
Gemiddeld ± SD (fmol) fmol Gemiddeld ± SD (fmol) Gemiddelde (fmol) % %
8-oxodGuo
373,00 ± 2,71 0 372,79 ± 50,6 - - 13,57
373,98 ± 4,86 367 755,41 ± 107,92 381 103,93 14,29
374,84 ± 5,19 734 1069,57 ± 108,51 695 94,65 10,14
357,94 ± 15,05 1469 1671,67 ± 44,27 1314 89,43 2,65
371,07 ± 2,43 2204 2272,01 ± 40,2 1901 86,25 1,77
1, N2-εdGuo
0,54 ± 0,01 0 0,54 ± 0,09 - - 16,88
0,54 ± 0,01 1 1,47 ± 0,16 0,93 93,39 11,17
0,55 ± 0,01 5 5,30 ± 0,72 4,76 95,11 13,50
0,53 ± 0,01 10 10,60 ± 0,39 10,06 100,63 3,67
0,54 ± 0,01 20 20,20 ± 0,93 19,66 98,29 4,60
1, N6-εdAdo
2,08 ± 0,10 0 2,29 ± 0,39 - - 17,05
2,05 ± 0,04 1 3,06 ± 0,47 1,01 100,89 15,31
1,99 ± 0,06 5 7,87 ± 1,66 5,88 117,60 21,10
2,03 ± 0,07 10 12,43 ± 1,25 10,41 104,06 10,06
1,97 ± 0,03 20 22,42 ± 3,89 20,46 102,29 17,34

Tabel 2. Methode nauwkeurigheid en coëfficiënt van variatie (CV) voor kwantificering van 8-oxodGuo, 1, Neirynck 2 - εdGuo en 1, Neirynck 6 -εdAdo in DNA. Deze tabel is gewijzigd van Oliveira et al.34.

Lucht PM2,5             N P-waarde
Gemiddeld ± SEM Gemiddeld ± SEM   
Long
8-oxodGuo/108 dGuo 2124 ± 56,96 2466 ± 93,10 6 0,01
1, N2-εdGuo/108 dGuo Nd Nd - -
1, N6-εdAdo/108 dAdo 1,41 ± 0,23 1,44 ± 0,13 7 Ns
Lever
8-oxodGuo/108 dGuo 2848 ± 183,5 2949 ± 223,8 6 5 Ns
1, N2-εdGuo/108 dGuo 7,79 ± 2,49 24,94 ± 5,21 4 0,02
1, N6-εdAdo/108 dAdo 2,82 ± 0,30 2,18 ± 0,25 6 Ns
Nier
8-oxodGuo/108 dGuo 1854 ± 87,13 2363 ± 157,0 6 0,02
1, N2-εdGuo/108 dGuo Nd Nd - -
1, N6-εdAdo/108 dAdo 1,09 ± 0,15 1,52 ± 0,12 7 0,04
(NS, niet significant; ND, niet gedetecteerd)

Tabel 3. Niveaus van de DNA-laesies in A/J muizen weefselmonsters. De muizen werden blootgesteld aan de omgevingslucht en de omgevingslucht verrijkt in PM2,5 (PM2,5 geconcentreerd 30 keer). De middelen tussen de twee groepen (omringende lucht en PM2,5) werden vergeleken gebruikend t-test. De resultaten werden beschouwd als statistisch significant toen P de waarde minder dan 0,05 was. Deze tabel is gewijzigd van Oliveira et al.34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een groot probleem dat in de 8-oxodGuo analyses door HPLC methodes wordt gevonden is de mogelijke inductie van zijn vorming tijdens de Workup procedures van de extractie van DNA, de hydrolyse van DNA, en concentratie van DNA eiwithydrolysaten22,38. Om het probleem van 8-oxodGuo artefactuele vorming te minimaliseren, wordt het aanbevolen de toevoeging van deferoxamine aan alle DNA-extractie, opslag en hydrolyse oplossingen, het gebruik van de Natriumjodide chaotropic methode en het vermijden van fenol in DNA-extractie, zoals goed als het gebruik van DNA-bedragen dicht bij 100 µ g in de hydrolyse procedure om de bijdrage van valse oxidatie tot het eindresultaat39te minimaliseren. We hebben rekening gehouden met de hierboven genoemde aanbevelingen, met uitzondering van het gebruik van de Natriumjodide chaotropic methode voor DNA-extractie. In plaats daarvan, voor eenvoud, gebruikten wij commerciële oplossingen voor de extractie van DNA, toevoegend deferoxamine aan hen vóór gebruik. Bovendien werden de verkregen DNA eiwithydrolysaten rechtstreeks geïnjecteerd in een eerste kolom van de HPLC-ESI-MS/MS systeem voor een eerdere scheiding van 8-oxodGuo van de normale nucleosiden. Onmiddellijk vóór de elutie van 8-oxodGuo, werd een omschakelings klep gebruikt om de eerste kolom eluens naar een tweede kolom af te leiden waar de verdere scheiding en het piek versmallen werden bereikt. Deze benadering liet voldoende gevoeligheid voor 8-oxodGuo kwantificatie vrij van interferenties. De meest gelijkaardige benadering voor kwantificering van 8-oxodGuo in DNA werd beschreven door Chao en medewerkers22, die een val kolom voor steekproef opruiming en 8 oxodGuo retentie voorafgaand aan steekproef elutie in de analytische kolom gebruikten, gebruikend een omschakelings klep tussen de kolommen. Als alternatief, een concentratie stap van 8-oxodGuo verzameld uit fracties geëlueerd van HPLC scheidingen van DNA-eiwithydrolysaten voorafgaand aan HPLC-ESI-MS/MS analyses werd uitgevoerd15, dat is veel meer bewerkelijk.

Gerapporteerde basale niveaus van 8-oxodGuo in knaagdieren longweefsel, op basis van HPLC-analyses, variëren van 180-450/108 dGuo23,39,41,42,43, 1.340-2120/108 dGuo44, of ongeveer 3000/108 dGuo45,46, met de laagste waarden verkregen uit DNA-extractie methoden met behulp van natriumjodide. De gemiddelde 8-oxodGuo niveau gevonden hier in de Long van muizen blootgesteld aan de omgevingslucht was 2124/108 dGuo. Het niveau steeg tot 2466/108 dGuo in de dieren blootgesteld aan de omgevingslucht verrijkt in PM2,5 (tabel 3)34. Het is mogelijk dat de gevoeligheid voor de opsporing van verschillen tussen groepen kan worden verbeterd door het uitpakken van het DNA met de Natriumjodide chaotropic methode. In de huidige studie, de gemiddelde 8-oxodGuo niveaus gevonden in de controle muizen Long, nier, en lever DNA waren, respectievelijk, 2,0, 1,8, en 2,7 keer hoger dan de mediaan basale niveau (1047/108 dGuo) verkregen door de European Standards Committee op oxidatieve De schade van DNA (ESCODD) in een inter-laboratorium beoordeling van 8-oxodGuo in DNA dat uit standaard steekproeven van Varkenslever38wordt gehaald.

De belangrijkste beperking voor opsporing van 1,n6-ΕdAdo en 1,n2-εdGuo in DNA is de methode gevoeligheid, aangezien deze letsels bij zeer lage niveaus voorkomen. De laagste niveaus van 1,N2-dGuo in DNA, gekwantificeerd door HPLC-ESI-MS/MS, waren in het bereik van 0,87-4 laesies per 108 dGuo in een menselijke cel lijn en rat weefsels25,47. Een manier om de gevoeligheid en selectiviteit voor hun kwantificering te verbeteren is om ze te concentreren van grote monsters van DNA-eiwithydrolysaten, met behulp van Solid phase extractie. Deze opschonings stap lost chromatografie problemen op die zouden kunnen voortvloeien uit injecties van meer dan 100 µ g DNA eiwithydrolysaten in HPLC analytische kolommen. We gebruikten deze aanpak in de gevalideerde methode hier gepresenteerd. De niveaus van 1,N6-εdAdo gedetecteerd in deze studie34 vallen binnen het bereik verkregen in studies in dienst ultrasensitive immunoaffinity/32P-postlabeling48,49, 50 , 51 en zijn lager dan die beschreven door andere groepen in dienst HPLC-ESI-MS/MS21,23,24. Evenzo, de 1,N2-εdGuo niveaus gekwantificeerd hier34 zijn in overeenstemming met de laagste niveaus gerapporteerd door Garcia25 en ANGELI26 met behulp van HPLC-ESI-MS/MS.

HPLC-ESI-MS/MS systemen met een hogere gevoeligheid dan de apparatuur die in deze studie beschikbaar zijn. Het gebruik van dergelijke systemen maakt het mogelijk de analyses van kleinere hoeveelheden DNA, die de toepassingen van de hier gepresenteerde methoden voor situaties waarin de beschikbaarheid van weefsels is een beperking verbreedt. De hier gepresenteerde methoden kunnen worden aangepast voor de kwantificering van andere gewijzigde deoxynucleosides, afhankelijk van de beschikbaarheid van hun normen en isotopische normen. Aanpassing van de chromatografie voorwaarden nodig zou zijn om scherpe pieken van alle moleculen opgenomen in de analyses te verkrijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do de São Paulo, proc. 2012/22190-3 en 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 en 429184/2016-6), Kaap, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPEs/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPEs; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) en CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira en A. A. F. Oliveira kregen beurzen van FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) en CAPEs (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva, en A. P. M. Loureiro ontvangen beurzen van CNPq.

Sommige figuren en tabellen in dit werk werden oorspronkelijk gepubliceerd in Oliveira A.A.F. et al. epigenotoxic effecten in muizen blootgesteld aan geconcentreerde fijn stofdeeltjes (PM2,5) uit São Paulo stad, Brazilië. Deeltjes-en vezel toxicologie. 15, 40 (2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
  4. Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
  5. Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
  6. Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
  7. Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
  8. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
  9. Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. John Wiley & Sons. UK. (2015).
  10. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
  11. Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
  12. Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
  13. Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
  14. Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
  15. Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
  16. Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
  17. Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
  18. Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. 69-76 (2017).
  19. Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
  20. Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
  21. Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
  22. Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
  23. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
  24. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
  25. Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
  26. Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
  27. Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
  28. Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
  29. Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
  30. IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
  31. De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
  32. Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
  33. Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
  34. Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40 (2018).
  35. Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
  36. Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
  37. Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
  38. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
  39. Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
  40. Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
  41. Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
  42. Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
  43. Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
  44. Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
  45. Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
  46. Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
  47. Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
  48. Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
  49. Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
  50. Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
  51. Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics