DNA-sekvens erkännande av DNA-Primase med hög genomströmning Primase profilering

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Proteinbindnings metoder för microarray (PBM) kombinerat med biokemiska analyser binder samman de bindande och katalytiska egenskaperna hos DNA-Primase, ett enzym som syntetiserar RNA-primers på mallDNA. Denna metod, som betecknas som hög genomströmning Primase profilering (HTPP), kan användas för att avslöja DNA-bindande mönster av en mängd olika enzymer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA-Primase syntetiserar korta RNA-primrar som initierar DNA-syntes av Okazaki fragment på släpar strand med DNA-polymeras under DNA-replikering. Bindningen av prokaryota DnaG-liknande primaser till DNA sker vid en specifik trinukleotid erkännande sekvens. Det är ett avgörande steg i bildandet av Okazaki fragment. Konventionella biokemiska verktyg som används för att bestämma DNA-igenkänningssekvens av DNA-Primase ger endast begränsad information. Med hjälp av ett mikromatrisbaserat bindnings test med hög kapacitet och konsekutiva biokemiska analyser har det visats att 1) den specifika bindnings kontexten (flanka sekvenser av tolknings platsen) påverkar DNA-priminas bindningsstyrka till dess mall DNA, och 2) starkare bindning av Primase till DNA ger längre RNA-primers, vilket indikerar högre processivitet av enzymet. Denna metod kombinerar PBM och Primase Activity assay och betecknas som High-throughput Primase profilering (HTPP), och det gör karakterisering av specifika sekvens erkännande av DNA-Primase i oöverträffad tid och skalbarhet.

Introduction

HTPP använder sig av DNA-bindande Mikroarrayteknik kombinerat med biokemisk analys (figur 1) för att statistiskt identifiera specifika egenskaper hos DNA-mallar som påverkar den enzymatiska AKTIVITETEN hos DNA-Primase. Därför erbjuder HTPP en teknologisk plattform som underlättar ett kunskaps språng på fältet. De klassiska verktyg som används för att bestämma Primase erkännande platser inte har förmågan att ge massiv mängd data, medan HTPP gör.

PBM är en teknik som rutinmässigt används för att bestämma bindnings preferenserna för transkriptionsfaktorerna till DNA1,2; emellertid, det är inte lämpligt för detektion av svag/övergående bindning av proteiner till DNA. Till skillnad från Universal PBM som ger information om genomsnittlig proteinbindnings noggrannhet till alla möjliga sekvenser bestående av åtta bas par, är HTPP baserad på biblioteket av enkelsträngade DNA-mallar som består av unika sekvens element. Sådana DNA-sekvens element innebär tiotusentals korta (några tiotals BP) genomiska sekvenser, samt beräkningsmässigt utformade DNA-sekvenser berikats i vissa DNA repetitiva sekvens element som finns i genomet, som besitter olika genomsnittliga GC innehåll . En sådan hög genomströmning tillvägagångssätt möjliggör bestämning av, på ett systematiskt, kvantitativt och hypotes-driven sätt, sekvens-relaterade egenskaper som är viktiga för Primase bindning och dess enzymatisk aktivitet3. I synnerhet har den viktiga kopplingen mellan Primase-DNA-bindande preferenser (modulerad med DNA-sekvenser som kantas av specifika Tri-nukleotidbindnings ställen) och primasprocessivitet identifierats för detta enzymatiska system4.

Den nya tekniken tillämpades för att åter besöka vår förståelse av Primase erkännande platser även för T7 DNA Primase som har studerats utförligt5. Specifikt, förnyad undersökning av klassiska begrepp, såsom DNA-erkännande platser av T7 DNA Primase (som bestämdes nästan fyra decennier sedan 6) med hjälp av protein-DNA-bindning microarray (PBM) har lett till oöverträffad insikt i funktioner relaterade till den kompletterande sekvens av dessa erkännande platser3. Det förväntades att sekvenserna flanera Tri-nukleotid erkännande plats av T7 DNA Primase (5 '-GTC-3 ') kommer att vara slumpmässigt. Istället fann vi att TG-rika kompletterande sekvenser öka chanserna för T7 DNA Primase att syntetisera längre RNA-primers indikerar en ökning av processivitet.

Andra metoder som kan användas för att studera DNA-bindande egenskaper hos proteiner in vitro inkluderar den elektroforetiska Mobility Shift-analysen (EMSA)7, DNase I fotavtryck8, Surface-Plasmon resonans (SPR)9, och sydvästra blotting 10. dessa är dock låg genomflöde metoder endast tillämpas för att undersöka ett litet antal DNA-sekvenser. Dessutom är precisionen och känsligheten hos vissa av dessa tekniker (t. ex. EMSA) låg. Å andra sidan, in vitro-val11 är en teknik som, på samma sätt som PBM, kan användas för identifiering av många bindnings sekvenser. Låg affinitet sekvenser är dock oftast uteslutna i de flesta tillämpningar av in vitro-val; den här metoden lämpar sig därför inte för att erhålla jämförande bindnings data för alla tillgängliga sekvenser. Universal PBM1,2 används främst för att karakterisera de bindande särdragen hos transkriptionsfaktorerna från prokaryoter och Eukaryoter samt specifika faktorer (t. ex. förekomst av vissa ligander, kofaktorer etc.) som kan påverka denna interaktion12.

HTPP utökar PBM-programmet till DNA-bearbetningsenzymer genom att kombinera oöverträffad statistisk kraft med hög kapacitet med hög precision för att ge information om bindningssekvenskontext. Sådana uppgifter har ännu inte erhållits för primaser och relaterade enzymer (som har svag/övergående bindning till DNA) på grund av ovannämnda tekniska begränsningar för andra tillgängliga tekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utformning av microarray

Anmärkning: DNA-sonder representerar anpassade 36-nukleotidsekvenser, bestående av tolknings platsen för T7 DNA-Primase (GTC) som ligger mellan två variabla flanka regioner, följt av en konstant 24-nukleotid sekvens bundna till en glas bild3. Vi använde en 4 x 180 000 microarray format, som möjliggjorde spotting av varje DNA-sekvens i sex replikat, slumpmässigt fördelade på bilden.

  1. Design av DNA-bibliotek för primaser med kända igenkännings sekvenser
    1. Se till att varje sekvens består av 60 nukleotider. Behåll den första 24 nukleotider konstant (som skall fästas på glas bilden). Variabla regioner bör ha följande allmänna form: (N)16GTC (n)17; där N representerar någon önskad nukleotid.
    2. Utforma den kompletterande regionen för att ta itu med en specifik vetenskaplig fråga (ett exempel på utformningen presenteras i följande text). De kompletterande regionerna kan utformas så att de innehåller specifika egenskaper som upprepnings elementen eller den specifika symmetrin.
      Notera: vi har skapat åtta kategorier av olika flanell sekvenser som består av två eller tre specifika nukleotider: T och G (grupp 1); T och C (grupp 2). C och A (grupp 3). A och G (grupp 4). G, C och T (grupp 5). C, T och A (grupp 6). G, A och T (grupp 7). G, A och C (grupp 8). 2 000 olika sekvenser utformades för varje grupp. Varje grupp hade undergrupper av sekvenser med olika typer och olika antal sekvens upprepas.
    3. Inkludera en uppsättning negativa kontrollsekvenser (som saknar den specifika bindnings platsen)4. Förekomsten av sådana sekvenser gör det möjligt att validera förekomsten av specifik bindning i experimentet.
  2. Design av DNA-bibliotek för primaser med okända igenkännings sekvenser
    1. Om tolknings ordningen är okänd, skapa DNA-biblioteket genom att välja sekvenser (med eller utan specifika funktioner som nämns tidigare) från genomet av önskad organism (bakterier, svampar, etc.).
  3. Design av microarray Slide
    1. Köpa anpassade bilder (t. ex., 4x180K, AMADID #78366) från en kommersiell leverantör (för mer information se tabell över material). Beställ varje sekvens i sex replikat, där varje replikat ska kopplas till en slumpvis vald plats i bilden.

2. Primase DNA-bindande experiment

Anmärkning: dagen före (eller minst 2 h före) PBM, förbereda blockerande lösning [2% w/v skumma mjölk i fosfatbuffert saltlösning (PBS)] och rör om den på en magnetisk omrörare. Filtrera lösningen med ett 0,45 μM-filter före användning. För att detektera Primase bindning till DNA-strängar, flera steg bör utföras i följande ordning.

  1. Blockerande förfarande
    1. Pre-våt microarray Slide i en Coplin burk med 0,01% v/v Triton X-100 i PBS (5 min vid 125 rpm på en Lab rotator).
    2. Tvätta snabbt packnings glaset (även kallat täckglas) med vatten och etanol och torka med tryckluft.
    3. Montera nedre delen av stål hybridisering kammare (PBM kammare) med packningen glida uppåt (kommersiell etikett vänd uppåt). För mer information om monteringen, se material tabellen.
    4. Pipet blockerande lösning (2% w/v skumma mjölk i PBS) i varje kammare.
    5. Ta bort microarray bilden från Coplin burken, torka sedan icke-DNA-sidan (DNA bör vara på samma sida som företagets etikett) och kanter med en fin torka. Placera långsamt mikromatrisen på packnings glaset, Undvik bubblor (företags etikett vänd nedåt). Omedelbart montera och dra åt stål hybridisering kammar apparat. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur (RT).
    6. Fyll en Färgnings rätt ("PBS" skålen) med 800 mL färsk PBS. Fyll en andra färgning skålen (den "tvätta" skålen) med 800 mL nyberedd 0,5% v/v Tween-20 i PBS.
    7. Skruva loss PBM kammaren och ta bort microarray Slide-Coverslip "Sandwich", noga med att inte bryta tätningen. Demontera den under vatten i disk skålen genom att placera tång mellan bilden och täckglas.
    8. Skaka microarray glida under vattnet och snabbt överföra till en Coplin burk.
    9. Tvätta en gång med 0,1% v/v Tween-20 i PBS (5 min vid 125 rpm på en Lab rotator).
    10. Tvätta en gång med 0,01% v/v Triton X-100 i PBS (2 min vid 125 rpm på en Lab rotator).
    11. Överför snabbt bilden till en Coplin-burk som innehåller PBS.
  2. Proteinbindningen
    1. Montera PBM-kammaren enligt beskrivningen ovan (steg 2.1.2 – 2.1.3).
    2. Med pipett proteinbindnings blandning innehållande 5 μM T7 DNA-Primas, 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mM MgCl2, 30 mm K-Glutamat, 6 mm Ditiotreitol (dTT), 65 μm ribonucleoside trifosfat (rntp), 2% vikt/volym skummjölk, 100 ng/μl bovint serumalbumin (BSA), 50 ng/μl lax testiklarna DNA, och 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) i varje kammare av packningen Slide (utan att vidröra gummisidorna och utan att införa bubblor).
    3. Skölj mikroarraybilden en kort stund genom att doppa den i PBS-skålen, vilket avlägsnar överflödigt rengöringsmedel från glidytorna. Torka av de icke-DNA ytorna på bilden med en fin torka.
    4. Sänk sakta mikroarraybilden (vänd nedåt) mot packnings glaset och var noga med att förhindra läckage från en kammare till en annan. Omedelbart montera och dra åt PBM kammare apparat utan att införa bubblor. Om bubblor bildar, kan de avlägsnas genom att försiktigt knacka på stål kammaren mot en hård yta.
    5. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur (RT).
  3. Fluorescerande antikropps infästning
    1. Skruva loss PBM kammaren och ta bort microarray Slide-Coverslip "Sandwich", noga med att inte bryta tätningen. Demontera under vatten i disk skålen med hjälp av pinps. Skaka glida under vattnet och snabbt överföra till en Coplin burk som innehåller PBS.
    2. Montera PBM-kammaren med packnings glas enligt beskrivningen ovan (steg 2.1.2 – 2.1.3).
    3. Lägg till Alexa 488-konjugerad antikropp (10 ng/μL i bindningsbuffert) till packnings glaset.
    4. Skölj bilden en kort stund genom att doppa den i PBS-skålen som förut, ta sedan bort bilden från PBS långsamt, torka av icke-DNA-ytan och placera den vänd nedåt på packnings glaset.
    5. Inkubera 30 min vid RT in the Dark (fluorescenssonden är ljuskänslig) för att reducera foto blekning.
    6. Demontera PBM kammaren och täckslip som tidigare, ta bort täckslip under vattnet i disk skålen.
    7. Skölj bilderna en kort stund genom att doppa dem i PBS-skålen. Torka av bilderna med tryckluft. Förvara i mörker i en bildruta tills du är klar att skanna.
  4. Skanna microarray-bilden
    1. Skanna chip med microarray Scanner (se tabell över material) med excitation av 495 nm och utsläpp av 519 nm och samla medianen fluorescens intensitet.

3. microarray dataanalys

Obs: all databehandling utfördes med hjälp av anpassade skriftliga skript i MATLAB.

  1. Utföra den första PBM databearbetning med Wilcoxon Rank sum test p-värde som beskrivs tidigare4.
  2. Använd medianvärdet för bindningsintensiteten för varje DNA-sekvens för vidare analys.
  3. Därefter, med hjälp av enkelriktade ANOVA p-värden, jämför statistisk signifikans för de observerade skillnaderna i Primase-DNA-bindningsnivån som erhållits för olika grupper av DNA-sonder, som förklaras ovan i DNA-bibliotekets design sektion3.

4. template-riktad RNA-syntes katalyseras av T7 DNA Primase

  1. Beredning av denatureringen polyakrylamidgel
    1. För beredning av 100 mL gel blandning, kombinera 62,5 mL av 40% akrylamid-bisacrylamid (19:1), 42 g urea, 1,1 g av Tris Base (2-amino-2-(hydroximetyl)-1,3-Propanediol), 0,55 g borsyra och 0,4 mL av 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning.
    2. Dela upp blandningen i 14 mL-alikvoter (det belopp som behövs för en gel på 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) och förvara dem skyddat från ljus vid 4 ° c i upp till 1 månad.
    3. Tillsätt 4 μL TEMED och 40 μL 10 viktprocent ammoniumpersulfat till 14 mL av den tidigare beredda blandningen för att förbereda en denaturerande polyakrylamidgel, och låt den polymerisera i minst 2 timmar vid RT. Gelen kan förvaras i en dag vid 4 ° c.
  2. Provberedning
    Anmärkning: Förvara reagenser, reaktionsblandningen och proverna på isen.
    1. För att bereda reaktionsblandningen som krävs för tio reaktioner, kombinera 11 μL 5x aktivitetbuffert (200 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM Ditiotreitol, 250 mM kaliumglutamat, 50 mM MgCl2), 5,5 μl av 2,5 mm blandning av nukleotidtri-fosfat (NTPs) och 5,5 μl av radiomärkade ribonukleotid [t. ex., ATP, (α-32P) 3000 CI/mmol].
      Obs: alla belopp har höjts med 10% på grund av eventuella pipettering fel. Radioaktivt märkt ribonukleotides bör spädas enligt styrkan av radioaktivt signalerar (initial utspädning är vanligt 1:10 eller mer).
    2. Överför 2 μL reaktionsblandning till tio PCR-rör.
    3. Tillsätt 1 μL 100 ìm DNA-mall till motsvarande PCR-rör och snurra ner.
    4. Tillsätt 2 μL av 16 μM T7 DNA-Primase, snurra ner, blanda försiktigt och snurra ner igen.
    5. Inkubera reaktionen vid RT i 20 minuter.
    6. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 5 μL kylnings lösning (95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05% w/v xylencyanol och bromfenolblått), blanda och snurra.
  3. Separation av RNA-produkter genom elektrofores genom denatureringen polyakrylamidgel och efterföljande signaldetektering
    1. Pre-Run gelen för 1 h (10 mA, 600 V) i 1x TBE buffert (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA).
    2. Fyll på upp till 2 μL av varje prov och utför elektrofores (20 mA, 1100 V) i 1x TBE-buffert (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA).
    3. Torka gelen i 2 h vid 80 ° c under ett vakuum.
    4. Exponera fosfor avbildning plattan till radioaktivt gel för ett par timmar att natten, beroende på styrkan av radioaktivt signal.
    5. Spela insignalen (photostimulerad Luminescens) med hjälp av phosphorimager (se tabell över material).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna tekniska förskott för kartläggning av Primase bindande platser tillåter erhållande av DNA-bindande egenskaper som är svåra, om inte omöjligt, att observera med hjälp av klassiska verktyg. Ännu viktigare, HTPP möjliggör återbesök av den traditionella förståelsen av Primase bindande webbplatser. Specifikt, HTPP avslöjar bindande särdrag utöver kända 5 '-GTC-3 ' erkännande sekvenser, vilket leder till förändringar i funktionella aktiviteter av T7 DNA Primase. Nämligen, två grupper av sekvenser identifierades: starkt bindande DNA-sekvenser som innehöll T/G i flanker och svagt bindande sekvenser som innehöll A/G i flanker (alla tymines i starkt bindande mallar ersattes av adeniner). Ingen Primase bindning till DNA-mallar som saknades 5 '-GTC-3 ' inom deras sekvens upptäcktes.

Den Primase DNA-erkännande webbplatser som innehöll specifika funktioner, såsom T/G-rika flanker, ökad Primase-DNA-bindning upp till 10-faldigt, och överraskande också ökat längden på nybildade RNA (upp till trefaldigt) (figur 2 i föregående publikation 3). viktigare, htpp tillät oss att iaktta och kvantifiera variationen i primer längd i förhållande till sekvensen av DNA-mall.

Figure 1
Figur 1: schematisk representation av höggenomflödeprimase profilering (HTPP). (A) bilden inkuberas med Primase i Aktivitetskromen (40 mm Tris-HCl, pH 7,5; 10 mm mgcl2, 50 mm K-Glutamat, 10 mm DTT, 100 μm rntps). Nästa, Alexa 488-konjugerat anti-hans fluorescerande antikropp infördes för att märka proteinet. Efter det milda tvättsteget skannades bilden med microarray scanner. Bindningsaffinitet bestämdes enligt median fluorescenssignalen och DNA-sekvenser delades i grupper därefter. (B) biokemiska analyser utfördes för att KORRELERA de DNA-bindande resultat som erhållits från microarray-experimentet, med de funktionella egenskaperna av T7 DNA-Primase. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: jämförelse av katalytisk aktivitet av T7 DNA-Primase på två grupper av DNA-mallar (stark bindning med T/g i flanker och svag bindning med A/g i flankerna) som erhållits från PBM. (A) RNA-primer bildas katalyseras av T7 DNA Primase. Reaktionerna innehöll oligonukleotides med Primase erkännande sekvens (numrerade körfält), 32P-α-ATP, ATP, CTP, UTP, och GTP i standard reaktionsblandningen. En grupp av DNA-oligonukleotides (mörkblå) innehöll T/G i flankerna, medan alla thymines ersattes med adeniner i den andra gruppen (ljusblå). Efter inkubering avskiljdes de radioaktiva RNA-produkterna genom elektrofores genom en 25% polyakrylamidgel som innehöll 7M urea och visualiserades av Autoradiography. (B) relativ längd (antal ribonukleotides som utgör varje RNA-primer är okänd) och mängden RNA-primrar som syntetiseras av T7 DNA-Primase på två grupper av DNA-mallar (panel A). Tomterna visar att längre RNA-primers syntetiseras (ökad processivitet) på DNA-mallar som Primase binder med högre affinitet (som innehåller T/G i flanker) jämfört med de mallar som är bundna med lägre affinitet (som innehåller A/G i flanker). Ckvantifiering av mängden SYNTETISERADE RNA-primrar på två grupper av DNA-mallar. Resultaten visar ett samband mellan den DNA-bindande affiniteten och mängden syntetiserade RNA av T7 DNA-Primase. AU (godtycklig enhet) är måttet på intensiteten av radioaktivt signal som direkt korrelerar med de mängder av syntetiserade RNA-primers. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PBM-metoden har ofta använts för att undersöka bindningsegenskaper hos transkriptionsfaktorer och kan även appliceras på DNA-bearbetningsenzymer, såsom DNA-Primase, som binder till DNA med låg affinitet. Emellertid, vissa ändringar av experimentella förfaranden krävs. Microarray experimentet omfattar flera steg: design av DNA-biblioteket, beredning av chip, bindning av proteinet målet, fluorescerande märkning, och skanning. Milda tvättsteg är kritiska, eftersom de långa tvättar med lösningar som innehåller rengöringsmedel orsakar dissociation av proteinet från DNA-mallen på grund av det svaga/övergående bindnings läget. Andra kritiska steg är bindande villkor (t. ex. buffertsammansättning, kofaktorer) och inkubationstider som måste optimeras för varje specifikt enzym.

De resultat som erhålls från microarray måste valideras i biokemiska analyser. Biokemiska analyser ger också insikt i intressanta egenskaper hos DNA-bearbetningsenzymer såsom sambandet mellan DNA-bindningstillhörighet och enzymatisk aktivitet/processivitet. HTPP gjorde det möjligt för oss att iaktta effekten av DNA-bindning på funktionella egenskaper av T7 DNA-Primase. Till exempel, det har observerats att om Primase uppvisar högre bindning affinitet för DNA-mall, det katalyserar bildandet av längre RNA-primers (ökad processivitet).

Sammantaget är den metod som presenteras i denna artikel snabb, pålitlig, och ger möjlighet att samtidigt testa bindande egenskaper på tiotusentals olika DNA-sekvenser i ett enda experiment på ett hypotes-driven sätt. Tillsats av andra proteiner eller metall kofaktorer till reaktionsblandningen ger möjlighet att undersöka deras effekt på DNA-bindande egenskaper av primaser i ett snabbt, högt dataflöde sätt. Å andra sidan är tillämpningen av denna metod begränsas av relativt höga priset på microarray diabilder och de säkerhetsåtgärder som krävs vid hantering av radioaktivt material för Primase aktivitets analyser.

Det är viktigt att notera att olika primaser kräver modifieringar av både microarray bindande villkor och buffert villkor för aktivitets analyser. Till exempel, Primase av Mycobacterium tuberculosis kräver substitution av magnesium med tvåvärda mangan i reaktionsbufferten. Olämpliga metallkofaktorer eller olämpliga reaktionsbuffertar kan leda till dålig Primase aktivitet eller minskad DNA-bindningsaffinitet.

Som tidigare nämnts är primaser binder till DNA-mallar med svag affinitet; Därför krävs milda tvättsteg under microarray bindande experiment. Annars kommer de att tvättas ur microarray bilden, vilket leder till förlust av fluorescerande signalen vid tillsats av Fluorescent märkt antikropp.

Sammanfattningsvis är de DNA-bindande egenskaperna hos många prokaryota primaser (inklusive trinukleotid DNA-igenkänningssekvens) fortfarande dåligt förstådda, främst på grund av de tekniska begränsningarna för nu tillgängliga metoder. HTPP utgör en snabb och effektiv plattform för upptäckten av DNA-erkännande platser eller utredningar av andra mallrelaterade faktorer (dvs., övergripande nukleotid sammansättning, GC innehåll, förekomst av repetitiva DNA-sekvens element och deras symmetri) som påverkar bindningsaffinitet och aktiviteten hos ssDNA-bindningsenzymer. Dessutom kan framtida tillämpningar riktas mot effekterna av olika proteiner eller kofaktorer på DNA-bindningstillhörighet, igenkännings mönster eller funktionell aktivitet av primaser och andra DNA-bearbetningsenzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant nr 1023/18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4, (3), 393-411 (2009).
  3. Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
  4. Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111, (48), 17140-17145 (2014).
  5. Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274, (50), 35889-35898 (1999).
  6. Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78, (1), 205-209 (1981).
  7. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9, (23), 6505-6525 (1981).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  9. Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19, (10), 2788 (1991).
  10. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8, (1), 1-20 (1980).
  11. Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9, (7), 2944-2949 (1989).
  12. Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics