DNA Sequence anerkjennelse av DNA Primase ved hjelp av høy gjennomstrømming Primase profilering

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Microarray (PBM) eksperimenter kombinert med biokjemiske analyser knytter de bindende og katalysatorer til DNA-primase, et enzym som syntetiserer RNA-primere på mal-DNA. Denne metoden, utpekt som høy gjennomstrømming primase profilering (HTPP), kan brukes til å avdekke DNA-bindende mønstre av en rekke enzymer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA primase syntetiserer kort RNA primere som starter DNA-syntese av Okazaki fragmenter på henger strand av DNA polymerase under DNA-replikering. Bindingen av prokaryote DnaG-lignende primases til DNA oppstår ved en bestemt trinucleotide anerkjennelse sekvens. Det er et vesentlig skritt i dannelsen av Okazaki fragmenter. Konvensjonelle biokjemiske verktøy som brukes til å bestemme DNA-anerkjennelse sekvensen av DNA-primase gir bare begrenset informasjon. Ved hjelp av en Microarray bindings analyse med høy gjennomstrømming og påfølgende biokjemiske analyser, har det vist seg at 1) den spesifikke bindings konteksten (flankerer sekvenser av anerkjennelses stedet) påvirker bindings styrken til DNA-primase til dens mal DNA, og 2) sterkere binding av primase til DNA gir lengre RNA-primere, noe som indikerer høyere processivity av enzymet. Denne metoden kombinerer PBM og primase aktivitet analysen og er utpekt som høy gjennomstrømming primase profilering (HTPP), og det tillater karakterisering av spesifikke sekvens anerkjennelse av DNA primase i enestående tid og skalerbarhet.

Introduction

HTPP gjør bruk av DNA bindende Microarray teknologi kombinert med biokjemiske analyse (figur 1) for å statistisk identifisere bestemte funksjoner i DNA-maler som påvirker enzymatisk aktivitet av DNA-primase. Derfor gir HTPP en teknologisk plattform som forenkler et kunnskaps sprang i felten. Den klassiske verktøy som brukes til å bestemme primase anerkjennelse nettsteder ikke har muligheten til å gi enorme mengder data, mens HTPP gjør.

PBM er en teknikk som rutinemessig brukes til å bestemme bindende preferanser av transkripsjon faktorer til DNA1,2; Det er imidlertid ikke egnet for påvisning av svake/forbigående binding av proteiner til DNA. I motsetning til den universelle PBM som gir informasjon om gjennomsnittlig protein bindende spesifisitet til alle mulige sekvenser bestående av åtte base parene, HTPP er basert på biblioteket av single-strandet DNA maler bestående av unike sekvens elementer. Slike DNA sekvens elementer innebære titusenvis kort (noen titalls BP) genomisk sekvenser, samt beregningsmessig utformet DNA-sekvenser beriket i visse DNA repeterende sekvens elementer til stede i Genova, som besitter ulike gjennomsnittlige GC innhold . En slik høy gjennomstrømmings tilnærming gjør det mulig å bestemme, på en systematisk, kvantitativ og hypotese-drevet måte, de sekvens relaterte egenskapene som er viktige for primase binding og dets enzymatisk aktivitet3. Spesielt den viktige koblingen mellom primase-DNA bindende preferanser, (modulert av DNA-sekvenser flankerer spesifikke Tri-nukleotid bindende områder) og primase processivity har blitt identifisert for dette enzymatisk system4.

Den nye teknologien ble brukt for å revidere vår forståelse av primase anerkjennelse nettsteder selv for T7 DNA primase som har blitt grundig studert5. Nærmere bestemt, re-undersøkelse av klassiske konsepter, slik som DNA-anerkjennelse nettsteder av T7 DNA primase (som ble bestemt nesten fire ti år siden 6) ved hjelp av PROTEIN-DNA bindende MICROARRAY (PBM) har ført til enestående innsikt i funksjoner knyttet til flankerer sekvensen av disse anerkjennelse nettsteder3. Det var forventet at sekvensene flankerer Tri-nukleotid anerkjennelse stedet av T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') vil være tilfeldig. I stedet fant vi at TG-rike flankerer sekvenser øker sjansene for T7 DNA-primase til å syntetisere lengre RNA-primere som indikerer en økning i processivity.

Andre metoder som kan brukes til å studere DNA-bindende egenskaper av proteiner in vitro inkluderer Elektroforetiske mobilitet Shift-analysen (EMSA)7, DNase jeg Footprinting8, overflate-Plasmon resonans (spr)9, og Southwestern blotting 10. disse er imidlertid lav gjennomstrømming metoder bare gjelder for å undersøke et lite antall DNA-sekvenser. I tillegg er presisjonen og følsomheten til noen av disse teknikkene (f. eks EMSA) lav. På den annen side, in vitro utvalg11 er en teknikk som, på samme måte som PBM, kan brukes til identifisering av mange bindende sekvenser. Imidlertid, lav affinitet sekvenser er vanligvis utelukket i de fleste anvendelser av in vitro valg; Denne tilnærmingen er derfor ikke egnet for innhenting av komparative bindings data for alle tilgjengelige sekvenser. Den universelle PBM1,2 er i hovedsak brukt til å karakterisere bindingen særegenheter av transkripsjon faktorer fra prokaryoter og Landplantenes samt spesifikke faktorer (for eksempel tilstedeværelsen av visse ligander, kofaktorer, etc.) som kan påvirke denne samhandlingen12.

HTPP utvider PBM programmet til DNA prosessering enzymer ved å kombinere enestående høy gjennomstrømming statistisk effekt med høy presisjon for å gi informasjon om bindende sekvens sammenheng. Slike data er ennå ikke innhentet for primases og beslektede enzymer (som har svake/forbigående binding til DNA) på grunn av nevnte tekniske begrensninger for andre tilgjengelige teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design av Microarray

Merk: DNA-sonder representerer tilpassede 36-nukleotid sekvenser, bestående av anerkjennelses stedet for T7 DNA-primase (GTC) mellom to variable flankerer regioner, etterfulgt av en konstant 24-nukleotid sekvens bundet til et glass Slide3. Vi brukte en 4 x 180 000 Microarray format, som aktiverte spotting av hver DNA-sekvens i seks replikerer, tilfeldig fordelt på lysbildet.

  1. Design av DNA-bibliotek for primases med kjente gjenkjennings sekvenser
    1. Sørg for at hver sekvens er sammensatt av 60 nukleotider. Behold den første 24 nukleotider konstanten (som skal festes til glassdekselet). Variable regioner bør ha følgende generell form: (N)16GTC (n)17; der N representerer ønsket nukleotid.
    2. Design flankerer regionen for å løse et bestemt vitenskapelig spørsmål (et eksempel på utformingen er presentert i følgende tekst). De flankerer regionene kan være utformet for å inneholde spesifikke funksjoner som gjenta elementer eller spesifikk symmetri.
      Merk: vi har opprettet åtte kategorier av forskjellige flankerer sekvenser bestående av to eller tre spesifikke nukleotider: T og G (gruppe 1); T og C (gruppe 2); C og A (gruppe 3); A og G (gruppe 4); G, C og T (gruppe 5); C, T og A (gruppe 6); G, A og T (gruppe 7); G, A og C (gruppe 8). 2 000 forskjellige sekvenser ble utformet for hver gruppe. Hver gruppe hadde undergrupper av sekvenser med ulike typer og ulike antall sekvens repetisjoner.
    3. Inkluder et sett med negative kontroll sekvenser (mangler det bestemte bindings området)4. Tilstedeværelsen av slike sekvenser gjør det mulig å validere forekomsten av spesifikke bindende i eksperimentet.
  2. Design av DNA-bibliotek for primases med ukjente gjenkjennings sekvenser
    1. Hvis gjenkjennings sekvensen er ukjent, oppretter du DNA-biblioteket ved å velge sekvensene (med eller uten spesifikke funksjoner nevnt tidligere) fra Genova av ønsket organisme (bakterier, sopp, etc.).
  3. Design av Microarray Slide
    1. Kjøp egendefinerte lysbilder (for eksempel 4x180K, AMADID #78366) fra en kommersiell leverandør (for mer informasjon, se tabell over materialer). Bestill hver sekvens i seks replikerer, der hver replikering skal knyttes til et tilfeldig valgt sted på lysbildet.

2. Primase DNA bindende eksperiment

Merk: dagen før (eller minst 2 timer før) PBM, klargjør blokkerings løsningen [2% w/v skummet melk i fosfat buffer saltvann (PBS)] og rør den på en magnetisk rører. Filtrer oppløsningen med et 0,45 μM-filter før bruk. For å oppdage primase binding til DNA-trådene, bør flere trinn utføres i følgende rekkefølge.

  1. Blokkering prosedyre
    1. Pre-Wet den Microarray lysbilde i en Coplin krukke med 0,01% v/v Triton X-100 i PBS (5 min på 125 RPM på en lab Rotator).
    2. Vask kort paknings bildet (også referert til som dekkglass) med vann og etanol og tørk med trykkluft.
    3. Monter nederste del av stål hybridisering kammer (PBM kammer) med pakningen lysbildet vendt opp (kommersiell etikett vendt opp). For mer informasjon om forsamlingen, se tabellen over materialer.
    4. Pipet blokkerings løsning (2% w/v skummet melk i PBS) i hvert kammer.
    5. Fjern Microarray lysbilde fra Coplin glasset, tørk deretter ikke-DNA side (DNA bør være på samme side som selskapet etiketten) og kanter ved hjelp av en fin tørke. Plasser Microarray langsomt på paknings lysbildet, og unngå bobler (firma etikett vendt ned). Umiddelbart montere og stramme stål hybridisering kammer apparater. Ruge for 1 time ved romtemperatur (RT).
    6. Fyll en farge rett ("PBS" parabolen) med 800 mL fersk PBS. Fyll en andre farging parabolen (den "WASH" parabolen) med 800 mL nylaget 0,5% v/v mellom-20 i PBS.
    7. Skru av PBM kammeret og fjern Microarray Slide-dekkglass "sandwich", ta vare ikke å bryte forseglingen. Demonter det under vann i WASH parabolen ved å plassere tang mellom raset og dekkglass.
    8. Rist Microarray Slide under vann og raskt overføre til en Coplin krukke.
    9. Vask en gang med 0,1% v/v mellom-20 i PBS (5 min ved 125 RPM på en lab Rotator).
    10. Vask en gang med 0,01% v/v Triton X-100 i PBS (2 min ved 125 RPM på en lab Rotator).
    11. Overfør raskt lysbildet til en Coplin-krukke som inneholder PBS.
  2. Protein binding
    1. Monter PBM kammeret som tidligere beskrevet (trinn 2.1.2-2.1.3).
    2. Pipette proteinbinding blanding som inneholder 5 μM T7 DNA primase, 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mM MgCl2, 30 mm K-glutamat, 6 mm DITHIOTREITOL (DTT), 65 μM ribonucleoside trifosfat (rNTP), 2% w/v skummet melk, 100 ng/μL storfe serum ALBUMIN (BSA), 50 ng/μL laks testiklene DNA, og 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) i hvert kammer av pakningen Slide (uten å berøre gummi sidene og uten å innføre bobler).
    3. Skyll Microarray i en kort stund ved å dyppe den i PBS-parabolen, som fjerner overflødig vaskemiddel fra overflaten av lysbildene. Tørk av de ikke-DNA-overflatene på lysbildet med en fin tørke.
    4. Sakte senke Microarray Slide (vendt ned) på pakningen slide, være forsiktig for å hindre lekkasje fra ett kammer til et annet. Umiddelbart montere og stramme PBM kammer apparat uten å innføre bobler. Hvis boblene gjør form, kan de fjernes ved å forsiktig tappe stålet kammeret mot en hard overflate.
    5. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur (RT).
  3. Fluorescerende antistoff vedlegg
    1. Skru av PBM kammeret og fjern Microarray Slide-dekkglass "sandwich", ta vare ikke å bryte forseglingen. Demonter under vann i WASH parabolen ved hjelp av tang. Rist lysbildet under vann og raskt overføre til en Coplin krukke som inneholder PBS.
    2. Monter PBM kammer med pakning lysbilde som tidligere beskrevet (trinn 2.1.2-2.1.3).
    3. Legg Alexa 488-bøyd anti-hans antistoff (10 ng/μL i binding buffer) til pakningen lysbildet.
    4. Skyll raset kort ved å dyppe den i PBS parabolen som før, og deretter fjerne lysbildet fra PBS langsomt, tørk av ikke-DNA overflaten og plassere den vendt ned på pakning lysbilde.
    5. Ruge 30 min ved RT i mørket (fluorescens sonde er lysfølsom) for å redusere Foto-bleking.
    6. Demonter PBM kammeret og dekkglass som før, og fjern dekkglass under vann i vaske fatet.
    7. Skyll lysbildene kort ved å dyppe dem i PBS-parabolen. Tørk lysbildene med trykkluft. Oppbevares i mørket i en lysbilde boks til du er klar til å skanne.
  4. Skanne Microarray lysbilde
    1. Skann brikken ved å bruke Microarray Scanner (se tabell over materialer) med eksitasjon på 495 NM og utslipp av 519 NM og samle median fluorescens intensitet.

3. Microarray dataanalyse

Merk: all databehandling ble utført ved hjelp av egendefinerte skriftlige skript i MATLAB.

  1. Utfør den første PBM databehandling ved hjelp av Wilcoxon rang sum test p-verdi som beskrevet tidligere4.
  2. Bruk median verdien av bindings intensiteten for hver DNA-sekvens for videre analyse.
  3. Deretter, ved hjelp av enveis ANOVA p-verdier, sammenligne statistisk betydning av de observerte forskjellene i primase-DNA bindende intensitet innhentet for ulike grupper av DNA-sonder, som forklart ovenfor i DNA-biblioteket design seksjon3.

4. mal-regissert RNA syntese katalysert av T7 DNA primase

  1. Fremstilling av denaturering polyakrylamid gel
    1. For å forberede 100 mL gel blanding, kombinere 62,5 mL 40% akrylamid-bisacrylamide (19:1), 42 g urea, 1,1 g Tris Base (2-amino-2-(hydroksymetyl)-1, 3-propandiol), 0,55 g av borsyre syre, og 0,4 mL av 0,5 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) løsning.
    2. Del blandingen i 14 mL alikvoter (mengden som trengs for en gel på 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) og hold dem beskyttet mot lys ved 4 ° c i opptil 1 måned.
    3. For å fremstille en denaturering polyakrylamid gel, tilsett 4 μL av TEMED og 40 μL av 10% w/v ammonium persulfate til 14 mL av den tidligere tilberedte blandingen, kast den og la den stå i polymeres i minst 2 timer ved RT. Gelen kan oppbevares for en dag ved 4 ° c.
  2. Eksempel på tilberedning
    Merk: Oppbevar reagensene, reaksjonsblandingen og prøvene på isen.
    1. For å klargjøre reaksjonsblandingen som kreves for ti reaksjoner kombinerer 11 μL av 5x aktivitets buffer (200 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM dithiotreitol, 250 mM kalium glutamat, 50 mM MgCl2), 5,5 μl av 2,5 mm blanding av nukleotid tri-fosfat (NTPs) og 5,5 μL av radiolabeled ribonucleotide [f. eks, ATP, (α-32P) 3000 CI/mmol].
      Merk: alle beløp har blitt økt med 10% på grunn av mulige pipettering feil. Radiolabeled ribonucleotid bør fortynnes i henhold til styrken av radioaktivt signal (første fortynning er vanligvis 1:10 eller mer).
    2. Overfør 2 μL av reaksjonsblandingen til ti PCR-rør.
    3. Tilsett 1 μL av 100 μM DNA-mal til det tilsvarende PCR-røret og snurr ned.
    4. Tilsett 2 μL av 16 μM T7 DNA-primase, spinn ned, bland forsiktig og spinn ned igjen.
    5. Ruge reaksjonen ved RT i 20 min.
    6. Stopp reaksjonen ved å legge til 5 μL slukke oppløsning (95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05% w/v xylen cyanol og bromophenol blå), mix, og spinne ned.
  3. Separasjon av RNA-produkter ved elektroforese gjennom denaturering polyakrylamid gel og påfølgende signal deteksjon
    1. Pre-Run gelen for 1 h (10 mA, 600 V) i 1x TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA).
    2. Legg opptil 2 μL av hver prøve og utfør elektroforese (20 mA, 1100 V) i 1x TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA).
    3. Tørk gelen for 2 timer ved 80 ° c under et vakuum.
    4. Utsett fosfor bilde platen til radioaktivt gel for et par timer til over natten, avhengig av styrken av radioaktivt signal.
    5. Ta opp signalet (photostimulated luminescence) ved hjelp av phosphorimager (se tabell over materialer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne teknologiske fremskritt for kartlegging av primase bindende områder tillater innhenting av DNA bindende egenskaper som er vanskelig, om ikke umulig, å observere ved hjelp av klassiske verktøy. Enda viktigere, HTPP muliggjør besøke den tradisjonelle forståelsen av primase bindende nettsteder. Spesielt avslører HTPP bindende særegenheter i tillegg til kjente 5 '-GTC-3 ' anerkjennelse sekvenser, noe som fører til endringer i funksjonelle aktiviteter av T7 DNA primase. Nemlig, to grupper av sekvenser ble identifisert: sterke bindende DNA-sekvenser som inneholdt T/G i flanken og svake-bindende sekvenser som inneholdt A/G i flanken (alle thymines i strong-binding maler ble erstattet av adenines). Ingen primase binding til DNA-maler som manglet 5 '-GTC-3 ' i sekvensen ble oppdaget.

Den primase DNA-anerkjennelse nettsteder som inneholdt bestemte funksjoner, slik som T/G-Rich flanken, økt primase-DNA binding opp til 10-fold, og overraskende også økt lengden av nylig dannet RNA (opp til tredelt) (figur 2 i forrige publikasjon 3). VIKTIGERE, HTPP tillot oss å observere og kvantifisere variasjonen i primer lengde i forhold til SEKVENSEN av DNA malen.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av primase profilering med høy gjennomstrømming (HTPP). (A) lysbildet ble inkubert med primase i aktivitets bufferen (40 mm Tris-HCL, pH 7,5; 10 mm MgCl2, 50 mm K-GLUTAMAT, 10 mm DTT, 100 μM rNTPs). Deretter ble Alexa 488-bøyd anti-hans fluorescerende antistoff innført for å merke proteinet. Etter det milde vaske trinnet ble lysbildet skannet med Microarray skanner. Bindende affinitet ble fastslått i henhold til median fluorescens signal og DNA-sekvenser ble delt inn i grupper tilsvarende. (B) biokjemiske analyser ble utført for å KOORDINERE de DNA-bindende resultatene som ble innhentet fra det Microarray eksperimentet, med de funksjonelle egenskapene til T7 DNA-primase. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: sammenligning av katalysator for T7 DNA-primase på to grupper av DNA-maler (sterk binding med T/g i flanken og svak binding med A/g i flanken) innhentet fra PBM. (A) RNA primer formasjon katalysert av T7 DNA-primase. Reaksjonene inneholdt oligonukleotider med primase gjenkjennings sekvens (nummererte baner), 32P-α-ATP, ATP, CTP, UTP og GTP i standard reaksjons blanding. En gruppe DNA-oligonukleotider (mørk blå) inneholdt T/G i flanken, mens alle thymines ble erstattet med adenines i den andre gruppen (lys blå). Etter inkubasjons ble de radioaktive RNA-produktene adskilt av elektroforese gjennom en 25% polyakrylamid gel som inneholdt 7M urea og ble autoradiografi. (B) relativ lengde (antall ribonucleotid som utgjør hver RNA-primer er ukjent) og mengden RNA-primere syntetisert av T7 DNA-primase på to grupper av DNA-maler (panel A). De tomter viser at lengre RNA primere er syntetisert (økt processivity) på DNA-maler som primase binder med høyere affinitet (som inneholder T/G i flanken) i forhold til malene som er bundet med lavere affinitet (som inneholder A/G i flanken). (C) kvantifisering av mengden av syntetisert RNA primere på to grupper av DNA-maler. Resultatene viser en sammenheng mellom DNA-bindende affinitet og mengden av syntetisert RNA av T7 DNA-primase. AU (vilkårlig enhet) er målet på intensiteten av radioaktivt signal som direkte samsvarer med mengder syntetisert RNA primere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den PBM metoden har vært mye brukt til å undersøke bindende egenskaper transkripsjon faktorer og kan også brukes til DNA prosessering enzymer, slik som DNA primase, som binder til DNA med lav affinitet. Imidlertid er visse modifikasjoner av eksperimentelle prosedyrer nødvendig. Den Microarray eksperimentet omfatter flere trinn: design av DNA-biblioteket, utarbeidelse av chip, binding av proteinet målet, fluorescerende merking, og skanning. Milde vasketrinn er avgjørende, siden den lange vasker med løsninger som inneholder vaskemidler forårsake dissosiasjon av proteinet fra DNA malen på grunn av svake/forbigående modus for binding. Andre viktige trinn inkluderer bindende forhold (for eksempel buffer sammensetning, kofaktorer) og inkubasjons tider som må optimaliseres for hvert enkelt enzym.

Resultatene Hentet fra Microarray må valideres i biokjemiske analyser. Biokjemiske analyser gir også innsikt i interessante funksjoner i DNA prosessering enzymer som sammenhengen mellom DNA bindende affinitet og enzymatisk aktivitet/processivity. HTPP gjort det mulig for oss å observere effekten av DNA binding på funksjonelle egenskaper av T7 DNA primase. Det har for eksempel blitt observert at hvis primase viser høyere bindings affinitet for DNA-malen, katalyserer det dannelsen av lengre RNA-primere (økt processivity).

Samlet sett er metoden som presenteres i denne artikkelen rask, pålitelig, og gir mulighet til å samtidig teste bindende egenskaper på titusenvis av ulike DNA-sekvenser i et enkelt eksperiment i en hypotese-drevet måte. Tilsetning av andre proteiner eller metall kofaktorer til reaksjonsblandingen gir mulighet til å undersøke deres effekt på DNA bindende egenskaper av primases i en rask, høy gjennomstrømming måte. På den annen side er anvendelsen av denne metoden begrenset av relativt høy pris på Microarray lysbilder og sikkerhetsforanstaltninger som kreves ved håndtering av radioaktivt materiale for primase aktivitet analyser.

Det er viktig å merke seg at ulike primases krever modifikasjoner av både Microarray bindings forhold og buffer forhold for aktivitets analyser. For eksempel krever primase av Mycobacterium tuberkulose substitusjon av magnesium med divalent mangan i reaksjons bufferen. Upassende metall kofaktorer eller upassende reaksjon buffere kan føre til dårlig primase aktivitet eller redusert DNA binding affinitet.

Som nevnt tidligere, primases bind til DNA-maler med svak affinitet; Derfor kreves milde vasketrinn under Microarray bindings eksperiment. Ellers vil de bli vasket ut fra Microarray slide, noe som fører til tap av fluorescerende signalet ved tilsetning av fluorescensmerkete merket antistoff.

For å oppsummere, DNA bindende egenskaper av mange prokaryote primases (inkludert trinucleotide DNA anerkjennelse sekvens) er fortsatt dårlig forstått, hovedsakelig på grunn av de tekniske begrensningene for tiden tilgjengelige metoder. HTPP representerer en rask og effektiv plattform for oppdagelse av DNA-anerkjennelse nettsteder eller undersøkelser av andre mal-relaterte faktorer (dvs. generelle nukleotid sammensetning, GC innhold, tilstedeværelse av repeterende DNA sekvens elementer og deres symmetri) som påvirker bindingen affinitet og aktivitet av ssDNA bindende enzymer. I tillegg kan fremtidige applikasjoner rettes mot virkningene av ulike proteiner eller kofaktorer på DNA bindende affinitet, anerkjennelse mønstre, eller funksjonell aktivitet av primases og andre DNA prosessering enzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av ISRAELS VITENSKAPS STIFTELSE (Grant no. 1023/18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4, (3), 393-411 (2009).
  3. Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
  4. Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111, (48), 17140-17145 (2014).
  5. Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274, (50), 35889-35898 (1999).
  6. Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78, (1), 205-209 (1981).
  7. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9, (23), 6505-6525 (1981).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  9. Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19, (10), 2788 (1991).
  10. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8, (1), 1-20 (1980).
  11. Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9, (7), 2944-2949 (1989).
  12. Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics