اختبار تكعيبي لتحديد التفاعلات التنافسية بين عزل فيبريو فيشري

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

البكتيريا ترميز آليات متنوعة للانخراط في المنافسة بين البكتيريا. هنا، نقدم بروتوكولاً قائماً على الثقافة لتوصيف التفاعلات التنافسية بين العزلات البكتيرية وكيفية تأثيرها على البنية المكانية للسكان المختلطين.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تصف هذه المخطوطة اختبارًا قائمًا على الثقافة وتكعيباً للكشف عن التفاعلات التنافسية بين اثنين من التجمعات البكتيرية ووصفها. وتستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تسمح لكل مجموعة من السكان بأن تكون الموسومة بشكل مختلف بقدرات مقاومة المضادات الحيوية المتميزة والبروتينات الفلورية للاختيار والتمييز البصري لكل شعب، على التوالي. هنا، نقوم بوصف إعداد وتكتكع سلالات Vibrio fischeri المتنافسة، والتصوير المجهري الفلوري، وتحليل البيانات الكمية. وهذا النهج بسيط، ويسفر عن نتائج سريعة، ويمكن استخدامه لتحديد ما إذا كان أحد السكان يقتل أو يعوق نمو سكان آخرين، وما إذا كانت المنافسة تتوسط من خلال جزيء غير قابل للاستخدام أو تتطلب الاتصال المباشر بالخلايا الخلوية. ولأن كل مجموعة بكتيرية تعبر عن بروتين فلورسنت مختلف، فإن هذا التحليل يسمح بالتمييز المكاني للسكان المتنافسين داخل مستعمرة مختلطة. على الرغم من أن يتم تنفيذ الأساليب الموصوفة مع البكتيريا التكافلية V. fischeri باستخدام الظروف الأمثل لهذا النوع، يمكن تكييف البروتوكول لمعظم العزلات البكتيرية القابلة للزراعة.

Introduction

تحدد هذه المخطوطة طريقة قائمة على الثقافة لتحديد ما إذا كان عزلتان بكتيريتان قادرتين على التفاعل التنافسي. عند دراسة السكان المختلطين، من المهم تقييم مدى تفاعل العزلات البكتيرية، لا سيما ما إذا كانت المعزولات تتنافس مباشرة من خلال آليات التداخل. تشير المنافسة على التداخل إلى التفاعلات التي يمنع فيها أحد السكان بشكل مباشر النمو أو يقتل السكان المنافسين1. هذه التفاعلات مهمة لتحديد لأنها يمكن أن يكون لها آثار عميقةعلى بنية المجتمع الميكروبي ووظيفته 2،3.

وقد تم اكتشاف آليات للمنافسة الميكروبية على نطاق واسع في جينومات البكتيريا من بيئات متنوعة بما في ذلك كل من البكتيريا المرتبطة بالمضيف والبكتيريا الحية الحرة4،5،6،7، 9. وقد تم وصف مجموعة متنوعة من استراتيجيات المنافسة10،11 بما في ذلك آليات غير قابلة للاختراق، مثل المواد الكيميائية مبيدة للجراثيم12 والببتيدات المضادة للميكروبات تفرز13 ، وكذلك الآليات المعتمدة على الاتصال التي تتطلب اتصال الخلية لنقل تأثيرمثبط إلى الخلايا المستهدفة 9،14،15،16،17 ،18.

على الرغم من أن التكعيبات القائمة على الثقافة تستخدم عادة في علم الأحياء الدقيقة5و8و19،فإن هذه المخطوطة تحدد كيفية استخدام التدقيق لتوصيف آلية المنافسة، فضلاً عن اقتراحات للتكيف بروتوكول للاستخدام مع الأنواع البكتيرية الأخرى. وعلاوة على ذلك، تصف هذه الطريقة نُهجاً متعددة لتحليل البيانات وعرضها للإجابة على أسئلة مختلفة حول طبيعة التفاعلات التنافسية. على الرغم من أن التقنيات الموصوفة هنا استخدمت سابقا لتحديد آلية القتل بين البكتيريا الكامنةالكامنة داخل المنافسة المحددة بين سلالات تكافلية من البكتيريا Vibrio fischeri معزولة co9 ، فهي مناسبة ل العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك العزلات البيئية ومسببات الأمراض البشرية، ويمكن استخدامها لتقييم كل من الآليات التنافسية المعتمدة على الاتصال وغير القابلة للاختراق. وقد تتطلب الخطوات المتخذة في البروتوكول تحسين الأنواع البكتيرية الأخرى. وبالنظر إلى أن المزيد من النظم النموذجية توسع دراساتها إلى ما بعد استخدام الكائنات المسببة للسرطان لتشمل مختلف الأنماط الجينية10و16و20و21،فإن هذه الطريقة ستكون مورداً قيماً للباحثين الذين يسعون إلى فهم كيفية تأثير المنافسة على الأنظمة متعددة السلال أو الأنواع المتعددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد سلالات لCoincubation

  1. اختيار سلالة المرجعية المناسبة التي من شأنها أن تكون بمثابة الهدف للمنافسة البكتيرية خلال اختبار coincubation. راجع المناقشة للاطلاع على أفضل الممارسات عند تحديد سلالة مرجعية وكيفية تأثير السلالة المرجعية على النتائج. في هذا البروتوكول، V. fischeri سلالة ES114 سوف تكون بمثابة سلالة المرجعية.
  2. تحديد طرق الاختيار والفرز التي سيتم استخدامها للتمييز بين العزلات في تكوبيشن
    1. عادة، تحويل سلالات مع بلازميدات مستقرة تحتوي على جينات مقاومة المضادات الحيوية مختلفة (على سبيل المثال كانامايسين أو الكلورامفينيكول) لاختيار لكل سلالة، فضلا عن الجينات ترميز البروتينات الفلورية المختلفة (على سبيل المثال GFP أو RFP) لبصريا تمييز أنواع السلالة في الثقافة المشتركة.
      ملاحظة: استخدام بلازميدات مستقرة مطلوب لأنه إذا فقدت سلالة بلازميد في غياب الاختيار، ثم سيتم التقليل من أرقام هذه السلالة عند قياسها كميا، ولن تكون قابلة للكشف بصريا باستخدام المجهرية الفلورية.
    2. العلامة coincubated V. fischeri سلالات بشكل تفاضلي بحيث سلالة واحدة تحتوي على pVSV102 بلازميد، الذي يعبرعن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ومقاومة كانامايسين المضادات الحيوية (كان R)، وسلالة الثانية يحتوي على بلازميد pVSV208، الذي يعبر عن بروتين الفلورسنت الأحمر (dsRed)ومقاومة للمضادات الحيوية الكلورامفينيكول (سم R)22.
      ملاحظة: ويمكن استخدام اختيارات تفاضلية أخرى للتمييز بين سلالات التكوّن. راجع المناقشة للحصول على أساليب إضافية.
    3. قم بتضمين عنصر التحكم التالي أثناء التحسين الأولي لالفحص بتكعيب العملة لضمان أن يكون الاختيار قويًا. لوحة كل سلالة التي يتم وضع علامة بشكل تفاضلي على لوحات أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية التي ينبغي أن تختار ضدها (أي، لوحة سلالة 1 على وسائل الإعلام التي تختار للسلالة 2، والعكس بالعكس).
  3. قبل يومين من اختبار تكعيب، سلالة المرجعية خط pVSV102، سلالة المرجعية pVSV208، وكل منافس سلالة pVSV208 من -80 درجة مئوية مخزونات على لوحات أجار LBS التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال، 100 ميكروغرام / مل كانامايسين أو 2 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول) وحضانة بين عشية وضحاها في 24 درجة مئوية. مطلوب اختيار المضادات الحيوية لضمان احتواء جميع الخلايا على بلازميد في بداية التجربة.
  4. قبل يوم واحد من اختبار، واختيار وإعادة خط أربع مستعمرات فردية لكل نوع سلالة (ينسخ البيولوجية) على لوحات أجار LBS الطازجة مع المضادات الحيوية المناسبة وحضانة بين عشية وضحاها في 24 درجة مئوية.
    ملاحظة: وقد تتطلب هذه الخطوة التحسين الأمثل للأنواع البكتيرية الأخرى، حيث قد تكون هناك حاجة إلى فترات حضانة أطول أو أقصر للحصول على خلايا كافية حسب معدل نمو الكائن الحي موضع الاهتمام.

2. سلالات بكتيرية Coincubate

  1. إعداد كل سلالة بكتيرية للحضانة (الشكل 1A)
    1. باستخدام مسواك معقمة، كشط الخلايا من لوحة أجار (بقدر حجم حبة الأرز) وإعادة تعليق الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل التي تحتوي على 1 مل من مرق LBS. تفريق كتل الخلية عن طريق الضغط عليها في جانب الأنبوب والأنابيب صعودا وهبوطا بقوة.
    2. سقف الأنبوب ودوامة ل1-2 s. إذا كانت كتل الخلية لا تزال مرئية، والاستمرار في دوامة أو ماصة صعودا وهبوطا حتى العينة موحدة بصريا.
    3. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.2 لكافة العينات.
  2. قياس وتسجيل الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600)لجميع العينات. العينات سوف تحتاج على الأرجح إلى تخفيف ما يصل إلى عشرة أضعاف باستخدام مرق LBS للحصول على قياس OD دقيقة. تطبيع كل عينة إلى OD المطلوب600. عادة ما يتم تطبيع سلالات إلى OD600 ~ 1.0، والذي يترجم إلى ~ 106 بكتيريا / مل لV. fischeri.
    ملاحظة: وقد تتطلب هذه الخطوة تحسين الأنواع البكتيرية المختلفة لأن كثافة الخلايا اللامعة تؤثر على نتائج تكعيبات اعتماداً على آلية المنافسة. راجع المناقشة للتحسين.
  3. سلالات النقود(الشكل1B،C)
    1. امزج الضغط المرجعي وسلالة المنافسين بنسبة 1:1 (v/v) بإضافة 100 مل من كل سلالة (عادية إلى OD 1.0) إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. كعنصر تحكم، خلط سلالة المرجعية مع نسخة ذات علامات متفاوتة من نفسها (مرجع سلالة pVSV102 + مرجع سلالة pVSV208). وهذه الرقابة مطلوبة لإجراء تحليل إحصائي لاحق لتحديد ما إذا كان وجود سلالة منافس يؤثر على نمو السلالة المرجعية. دوامة ثقافة مختلطة سلالة ل1-2 ق.
      ملاحظة: قد تتطلب هذه الخطوة التحسين لأن نسبة البدء يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج وقد تحتاج إلى تعديل. راجع المناقشة للتحسين.
    2. كرر الخطوة 2.3.1 لكل تكرار بيولوجي. بعد الانتهاء من هذه الخطوة، يجب أن يكون هناك ما مجموعه ثمانية أنابيب مختلطة السلالة: أربعة تكرار البيولوجية مع سلالات مرجعية ذات علامات متفاوتة (السيطرة)، وأربعة تكرارات البيولوجية مع مرجع الموسومة بشكل تفاضلي وسلالات المنافسين ( التجريبية).
    3. بقعة 10 مل من كل عنصر تحكم وخليط تجريبي على لوحات بيتري التي تحتوي على أجار رطل؛ سيتم استخدام هذه البقع الثقافية للتنظير المجهري الفلوري بعد الحضانة.
    4. السماح للبقع لتجف تماما على مقاعد البدلاء حتى يتم امتصاص جميع السائل في أجار واحتضان لوحات بيتري في 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. مطلوب ما لا يقل عن 15 ساعة لسلالات V. fischeri الموسومة pVSV102 و pVSV208 لتنمو إلى كثافة عالية بما فيه الكفاية للخلايا لتصور GFP وRFP، على التوالي، على مستوى السكان باستخدام مجهر تشريح الفلورة. هنا، نستخدم حضانة 24 ساعة لتصوير البقع المختلطة.
      ملاحظة: من المهم استخدام لوحات ليست رطبة جدا أو جافة جدا. إذا كانت لوحات رطبة جدا، لن يتم امتصاص بقع coincubation في لوحة أجار. تجنب استخدام لوحات سكب في نفس اليوم. إذا كانت الصفائح جافة جدا، قد تشكل موجات صغيرة أو الشقوق على سطح أجار، مما يجعل بقع coincubation غير منتظمة في الشكل.
    5. باستخدام نفس التعليق البكتيري كما هو الحال في الخطوة 2.3.3، بقعة 10 مل من كل عنصر تحكم والمخاليط التجريبية في لوحات 24 جيدا تحتوي على 1 مل من رطل أجار لكل بئر. كما هو الحال في الخطوة 2.3.3، تأكد من أجار في لوحات 24-جيدا لديه الرطوبة المناسبة. السماح للبقع لتجف تماما وحضانة في 24 درجة مئوية لمدة 5 ساعة. وسوف تستخدم هذه البقع الثقافية لتحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) لكل سلالة في نهاية التجربة.
      ملاحظة: اكتشاف تعليق البكتيرية للنمو في الآبار الفردية يسمح لإعادة تعليق أسهل في نقطة نهاية الوقت. ويمكن إنجاز هذه الخطوة باستخدام قطع فلتر معقمة مربع كنهج أكثر اقتصادا لاستخدام لوحات 24 جيدا. يمكن وضع قطع فلتر معقمة مربع على لوحة أجار ويمكن رصد 10 مل من كل خليط تجريبي على هذه المرشحات، بدلا من لوحات 24 جيدا. بعد وقت تكعيب، يمكن نقل المرشحات إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل ويمكن إعادة تعليق بقعة coincubation عن طريق الدوامة أو الأنابيب صعودا وهبوطا. وقت حضانة 5 ح يكفي للكشف عن القتل بين البكتيريا بين V. fischeri يعزل19، ومع ذلك ، قد تحتاج إلى أن يكون هذا الوقت coincubation أقصر أو أطول لأنواع أخرى أو آليات تنافسية. راجع المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل.
  4. تخفيف تسلسلي لبدء التلقيح
    1. لإجراء تخفيف تسلسلي من بدء خلطات التكعيب، تدوير لوحة 96-well 90 درجة لذلك هناك ثمانية أعمدة واثني عشر صفا. كل صف سوف تحتوي على عينة من الخليط غير المخفف في العمود الأول تليها سبعة عشرة أضعاف التخفيفات التسلسلية عبر الآبار المتبقية في الصف (الشكل2A).
    2. تسمية كل صف مع معرف السلالة، رقم النسخ المتماثل، والوقت (بدء inoculum = T0). تسمية لوحات أجار LBS تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة التي لبقعة سلسلة تخفيف. تأكد من تحديد أي سلالة يتم اختيار كل لوحة المضادات الحيوية.
    3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 180 مل من مرق LBS إلى كل بئر، وترك العمود الأول فارغة لخليط coincubation غير المخفف.
      ملاحظة: قد يختار الباحثون استخدام الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لإعادة تعليق بقع تكعيبات وإجراء التخفيف التسلسلي إذا كان العمل مع الأنواع البكتيرية سريعة النمو بشكل خاص أو إجراء تجارب كبيرة باستمرار حيث قد يستغرق التخفيفات التسلسلية وقت طويل لأداء. استخدام PBS في هذه الحالات سوف يمنع نمو كبير من البكتيريا خلال عملية تنفيذ التخفيفات التسلسلية. ومع ذلك، من المهم أن تكون متسقة مع الحل الذي يتم استخدامه (على سبيل المثال، PBS أو LBS) عبر جميع التجارب، بغض النظر عن حجمها أو مدتها.
    4. باستخدام ماصة قناة واحدة 200 مل، نقل 100 مل من خليط coincubation من الأنبوب إلى العمود الأول جيدا. تجاهل غيض وكرر لجميع خليط coincubation.
    5. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 20 مل من العمود 1 إلى 2 ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. تجاهل النصائح وكرر لكل عمود بحيث بحلول النهاية، كل صف يحتوي على تخفيف تسلسلي عشرة أضعاف من خليط coincubation الأولي.
      ملاحظة: تكون متسقة مع عدد المرات يتم أنابيب التخفيف صعودا وهبوطا. على سبيل المثال، قم بالاكتئاب مقبض الماصة خمس مرات لكل تخفيف لتكون متسقة عبر سلسلة التخفيف.
    6. باستخدام ماصة متعددة القنوات مزودة بثماني نصائح، يستنشق 5 مل من كل بئر في سلسلة تخفيف (أي صف واحد من ثمانية آبار) وبقعة على لوحة أجار LBS التي تختار للسلالة المرجعية (تستكمل مع كانامايسين). كرر هذه الخطوة اكتشاف على لوحة اختيار لسلالة المنافس (تستكمل مع الكلورامفينيكول) (الشكل2B). السماح للبقع لتجف تماما قبل وضعها في حاضنة.
      ملاحظة: يمكن استخدام نفس النصائح لاكتشاف سلسلة تخفيف تكرار على لوحات اختيار للمرجع وسلالة المنافس، ولكن يجب تغيير بين النسخ المتماثل. تجنب لمس نهاية طرف ماصة للوحات أجار LBS لأن هذا يمكن أن يخلق الاكتئاب التي يمكن أن تشبه مستعمرة البكتيرية والنتائج الانحراف أثناء العد لوحة. إذا كان غيض لا تلمس لوحة، وجعل مذكرة ولا تشمل الاكتئاب في التهم مستعمرة.
  5. أخذ T القياسات النهائية
    1. بعد أن تم احتضان بقع تكعيبفيت في لوحات 24 جيدا لمدة 5 ساعة في 24 درجة مئوية، إضافة 1 مل من مرق LBS إلى كل بئر وإعادة تعليق بقع coincubation عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا حتى يتم إعادة تعليق جميع الخلايا. أن تكون متسقة مع النشاط الذي يتم إعادة تعليق الخلايا عبر كافة النسخ المتماثلة. على سبيل المثال، قم بالاكتئاب مقبض الماصات ثماني مرات لإعادة تعليق كل عينة بشكل كامل.
    2. مرة واحدة يتم إعادة تعليق كل بقعة coincubation، وإعداد لوحة 96 جيدا لتخفيف المسلسل ولوحات أجار LBS مع المضادات الحيوية المناسبة التي لبقعة التخفيف بنفس الطريقة كما الخطوة 2.4.1.
    3. تنفيذ الخطوات 2.4.2-2.4.6 لإكمال التخفيف التسلسلي للقياسات النهائية T.
      ملاحظة: وينبغي إدراج عنصر تحكم هام أثناء التحسين الأولي للتصنيف. في نهاية فترة تكعيب، لوحة سلالات مختلطة على وسائل الإعلام التي تشمل كل من المضادات الحيوية. لا ينبغي أن تكون سلالة قادرة على النمو ما لم 1) يحدث طفرة عفوية، أو 2) يتم تبادل علامات للاختيار بين سلالات.

3. تصور Coincubations باستخدام مجهريال الفلورية

  1. صورة كل بقعة coincubation على لوحات LB أجار بيتري من الخطوتين 2.3.3 و 2.3.4 باستخدام مجهر ستيريو مجهزة للكشف عن الفلورة الخضراء والحمراء، والتي تتوافق مع البروتينات الفلورية التي يتم التعبير عنها على بلازميدات مستقرة.
  2. تبدأ بأخذ صور من بقعة تكعيبات التحكم (مرجع سلالة pVSV102 + مرجع سلالة pVSV208).
    1. ضبط التكبير بحيث يكون البقعة في التركيز.
    2. باستخدام ضوء الإثارة المناسبة ومرشح لمراقبة GFP، وضبط وقت التعرض بحيث الفلورة فقط من بقعة coincubation يمكن الكشف عنها وأي الفلورة الخلفية من وسائل الإعلام منخفضة أو غير مرئية.
    3. تغيير ضوء الإثارة وعامل التصفية لمراقبة RFP، وضبط وقت التعرض لتقليل الخلفية من الوسط.
  3. لكل بقعة coincubation من العلاجات التجريبية، صورة للسلالة المرجعية باستخدام مرشح GFP ووقت التعرض المحدد في الخطوة 3.2.2.
  4. صورة سلالة المنافس باستخدام مرشح RFP، وضبط وقت التعرض بحيث لا يلاحظ الفلورة إلا من بقعة تكعيبي والخلفية الفلورية من المتوسط هو الحد الأدنى. حفظ الصور على حد سواء وتسميتها لتشمل كل من السلالة الهويّة، ورقم النسخ المتماثل، ووقت الحضانة عند التقاط الصورة (على سبيل المثال، 24 ساعة). كرر لكافة النسخ المتماثل.
    ملاحظة: قد يحتاج وقت التكعيب إلى تعديل لمختلف البلازميدات أو الأنواع البكتيرية. راجع المناقشة للتحسين.

4- تحليل البيانات

  1. حساب CFUs لكل عنصر تحكم وعلاج تجريبي في كل نقطة زمنية (بدء T وT final)
    1. بمجرد أن تكون المستعمرات مرئية على لوحات التخفيف التسلسلي (على سبيل المثال، 24 ساعة عند 24 درجة مئوية لV. fischeri)،حدد عامل التخفيف حيث يمكن حساب المستعمرات الفردية ولم تنمو معا في مجموعات كبيرة متعددة المستعمرات (الشكل2B). لكل تكرار، عد وسجل عدد المستعمرات الفردية لتخفيف معين. يمثل هذا الرقم CFUs لذلك النسخ المتماثل.
    2. تحويل CFUs للتخفيف إلى إجمالي CFUs لكل سلالة في coincubation باستخدام الصيغة أدناه:
      [CFUs - (عامل التخفيف x المجلد من بقعة التخفيف)] x المجلد للعينة غير المخففة = إجمالي CFUs
      مثال: [(6 CFUs) ( 10 ^-6 × 0.005 مل)] x [0.01 مل] = 1.2E7 إجمالي CFUs من السلالة 1 في البقعة المختلطة في بداية التجربة
      T5: [(4 CFUs) و (10^-3 x 0.005 مل)] x [1.0 مل] = 8.0E5 إجمالي CFUs من السلالة 1 في البقعة المختلطة بعد 5 h coincubation
      قيم CFU لكل سلالة في كل نقطة زمنية هي البيانات الأولية التي يمكن استخدامها في العديد من التحليلات المختلفة والاختبارات الإحصائية (انظر القسم 4-2 أدناه).
  2. إجراء تحويلات البيانات التالية لتحديد ما إذا كانت سلالة المنافس تتفوق على السلالة المرجعية عن طريق: '1' تحديد ما إذا كانت نسبة الضغط المرجعي تنخفض في وجود سلالة المنافس، أو '2' حساب سجل مؤشر تنافسي نسبي (RCI). وتحوّل هذه التحليلات البيانات الخام إلى نسب ويمكن أن تكون مفيدة في تحديد النتيجة التنافسية للتفاعل، ولكنها لا تستطيع تحديد آلية المنافسة (أي القتل مقابل تثبيط النمو).
    1. حساب نسبة كل سلالة لكل نقطة زمنية خلال عملية التكعيب
      1. تحويل بيانات CFU إلى نسبة كل سلالة في العلاج. بالنسبة للسلالة المرجعية (RS) في T0، قم بتقسيم إجمالي وحدات CFUs للسلالة المرجعية في T0 على مجموع وحدات CFUs الإجمالية للسلالة المرجعية والمنافس (CS) في T0:
        RST0 CFUs ‹ (RST0 CFUs + CST0 CFUs) = نسبة الإجهاد المرجعي في T0.
        إجراء نفس الحساب لتحديد نسبة سلالة المنافس في T0:
        CST0 CFUs ‹ (RST0 CFUs + CST0 CFUs) = نسبة الإجهاد المرجعي في T0
        كرر هذه العملية لكل نقطة زمنية وتكرار لكل من العلاج التجريبي ومعالجة التحكم (تفاضلية الموسومة المرجعية سلالة coincubation).
      2. رسم بياني متوسط نسبة كل نوع سلالة في T0 و T5 في الرسم البياني شريط مكدسة (الشكل3A).
      3. تأكد من الحصول على نسبة البدء المطلوبة من السلالات. بالنسبة لتجمعات العملات حيث كانت السلالات مختلطة في البداية 1:1، يجب أن يتألف كل نوع من أنواع السلالة من حوالي 0.5 من السكان في T0 ولا ينبغي أن يكون مختلفاً إحصائياً عن بعضهم احصائياً باستخدام اختبار t للطالب (P > 0.05). إذا كانت نسبة سلالة واحدة أكبر بكثير من نسبة السلالة الأخرى في T0، ثم كرر التجربة حتى يتم تحقيق نسبة بداية 1:1.
      4. تحديد ما إذا كانت سلالة المنافس تشكل نسبة أكبر بكثير من السكان بعد 5 ح. إجراء اختبار t الطالب مقارنة نسبة كل سلالة في العلاج التجريبي في T0 و T5. إذا كانت نسبة سلالة المنافسين مختلفة بشكل كبير عن نسبة الضغط المرجعي في T5 (P < 0.05)، فإن هذه النتيجة تشير إلى أن المنافسة في السلالة قد تكون حدثت. انتقل إلى الخطوة 4.2.1.5.
      5. لتحديد ما إذا كان وجود سلالة المنافس خفض نسبة السلالة المرجعية بعد 5 ساعة، إجراء اختبار t الطالب مقارنة نسبة الإجهاد المرجعي في عنصر التحكم مع نسبة الإجهاد المرجعي في العلاج التجريبي (سلالة المرجعية ضد سلالة المنافس).
        ملاحظة: إذا كانت نسبة السلالة المرجعية أقل إحصائياً في العلاج التجريبي بالنسبة للتحكم (P < 0.05)، فإن سلالة المنافس خفضت بشكل كبير نسبة السلالة المرجعية بعد 5 h و تفوقت على سلالة المرجعية.
    2. حساب قيمة RCI سجل لكل علاج (بما في ذلك عنصر التحكم)
      ملاحظة: المؤشر التنافسي النسبي، أو RCI، هو قيمة واحدة تقارن كيفية اختلاف نسبة إنهاء أنواع السلالة عن نسبة البدء. قيمة RCI يتم تحويل السجل بحيث تشير قيمة RCI سجل أكبر من الصفر إلى سلالة المنافس (CS) تنافس سلالة المرجع (RS)، قيمة RCI سجل أقل من صفر يشير إلى سلالة المرجع تفوق سلالة المنافس، وسجل RCI قيمة الصفر يشير إلى أن أيا من سلالة لم يكن تنافس.
      1. حساب قيم RCI سجل لكل عنصر تحكم والعلاج التجريبي باستخدام المعادلة التالية:
        السجل [(CST5 CFU - RST5 CFUs) (CST0 CFU - RST0 CFUs)] = سجل RCI
      2. قيم RCI سجل الرسم البياني باستخدام مربع منفصل وشعيرات رسم حيث يتم رسم البيانات في الاتجاه الأفقي (الشكل3B).
      3. تحديد ما إذا كان كل علاج يختلف بشكل ملحوظ عن الصفر عن طريق إجراء اختبار t الخاص بالطالب بمقارنة قيم RCI للسجل لكل علاج (بما في ذلك عنصر التحكم) إلى مجموعة بيانات تقارن نفس العدد من النسخ المتماثل مع قيمة صفرية. إذا كانت قيم RCI سجل للعلاج التجريبي هي أكبر إحصائيا من الصفر (P < 0.05)، ثم سلالة المنافس تفوق سلالة المرجع.
        ملاحظة: يجب ألا يكون عنصر التحكم مختلفاً إحصائياً عن الصفر(P > 0.05)، لأن السلالات المرجعية ذات العلامات التفاضلية هي إسجينية.
      4. إجراء اختبار t الطالب لتحديد ما إذا كانت قيم RCI سجل للعلاج التجريبي أكبر بكثير من عنصر التحكم (P < 0.05). إن السجل [رسي] قيم من المعالجة تجريبيّة إحصائيّا عظيمة من التحكم معالجة, بعد ذلك المنافسة سلالة يتفوق ال [رفرنس ستّر].
  3. إجراء التحليل الإحصائي التالي لتحديد الآلية التي تفوق بها سلالة المنافس على الضغط المرجعي: (1) تحليل بيانات CFU الإجمالية الخام، أو (2) فحص نسبة استرداد السلالة المرجعية. ويمكن أن تكون هذه التحليلات أكثر تعقيداً في النظر إليها بالنسبة للتحليلات المستمدة من الخطوة 4-2، ولكنها ستحدد ما إذا كانت سلالة المنافس تتفوق على الضغط المرجعي بتجاوزها، أو إعاقة نمو السلالة المرجعية، أو القضاء بنشاط على الإجهاد المرجعي.
    1. تحليل إجمالي بيانات CFU الخام
      1. الرسم البياني مجموع البيانات الأولية CFU لكلا السلالات باستخدام مؤامرة مبعثر مخطوف، حيث يتم عرض النسخ المتماثل كنقاط بيانات فردية (الشكل4A). عرض البيانات على مقياس سجل وإضافة خط أفقي يشير إلى متوسط CfUs T0 لكلا السلالات.
      2. لتحديد ما إذا كان وجود سلالة المنافس يؤثر سلبا على سلالة المرجع، قم بإجراء اختبار t للطالب مقارنة الضغط المرجعي CFUs للتحكم والعلاجات التجريبية في T5. إذا كانت السلالة المرجعية CFUs في العلاج التجريبي أقل إحصائياً مما كانت عليه في عنصر التحكم (P< 0.05)، فإن وجود سلالة المنافس يؤثر بشكل كبير على السلالة المرجعية.
      3. لتحديد ما إذا كان وجود سلالة المنافس إما تثبيط نمو أو القضاء على سلالة المرجعية، وإجراء اختبار t الطالب مقارنة CFUs سلالة المرجعية في T0 و T5 للتحكم والعلاجات التجريبية.
        ملاحظة: في حالة عدم وجود منافس، يجب أن تظهر سلالة المرجعية زيادة كبيرة في CFU عند مقارنة T0 و T5 لعلاج التحكم. عند تحليل العلاج التجريبي، إذا كانت سلالة المرجع CFUs في T5 لا تختلف إحصائيا بالمقارنة مع T0 (P> 0.05)، ثم سلالة المنافس منعت نمو سلالة المرجعية. إذا كانت سلالة المرجع T5 CFUs أقل بكثير من T0 CFUs (P< 0.05)، ثم سلالة المنافس قتل سلالة المرجع.
    2. حساب النسبة المئوية لاسترداد السلالة المرجعية
      1. تحويل إجمالي بيانات CFU للسلالة المرجعية (RS) إلى بيانات استرداد النسبة المئوية باستخدام المعادلة أدناه:
      2. (RST5 CFUs - RST0 CFUs) x 100 = % استرداد السلالة المرجعية
      3. عرض النسبة المئوية لاسترداد سلالة المرجع باستخدام رسم بياني شريطي منفصل حيث يمثل كل شريط إما التحكم أو العلاج التجريبي (الشكل4B). إضافة خط متقطع في y = 100 للإشارة إلى استرداد 100٪ من سلالة المرجع (لا زيادة أو نقصان في الضغط المرجعي CFUs من 0 ساعة إلى 5 ح).
      4. لتحديد ما إذا كان سلالة المنافس تؤثر سلبا على سلالة المرجع، إجراء اختبار t الطالب مقارنة الانتعاش نسبة الإجهاد المرجعي لعلاج التحكم إلى العلاج التجريبي. إذا كان الاسترداد النسبة المئوية أقل بكثير من عنصر التحكم (P< 0.05)، ثم سلالة المنافس أثرت سلبا على سلالة المرجع.
      5. لتحديد ما إذا كانت سلالة المنافس تمنع نمو أو القضاء على الضغط المرجعي، قم بإجراء اختبار t للطالب الذي يقارن استرداد نسبة الضغط المرجعي للعلاج التجريبي ومجموعة بيانات بنفس العدد من النسخ المتماثل مع كل ذلك باستخدام قيمة 100.
        ملاحظة: إذا كان العلاج التجريبي لا يختلف إحصائيا عن 100 (P > 0.05) ، ثم سلالة المنافس منعت نمو سلالة المرجعية. إذا كان الانتعاش نسبة سلالة المرجعية في العلاج التجريبي هو أقل بكثير من 100 (P < 0.05)، ثم سلالة المنافس قتل سلالة المرجعية.
    3. تفسير الصور المجهرية الفلورية
      1. بمجرد التقاط صور مجهرية الفلورية، حدد ما إذا كانت كل سلالة يمكن اكتشافها بشكل واضح في بقعة تكعيب. لcoincubation التحكم (مرجع سلالة pVSV102 + مرجع سلالة pVSV208)، يجب أن يكون كل من GFP وRFP مرئية من بقعة عملة واحدة. إذا لم يكن هذا هو الحال، وإعداد التجربة مرة أخرى ضمان السلالات وصفت بشكل صحيح وcoincubated على لوحات خالية من المضادات الحيوية.
      2. لكل بقعة تكعيب ة تجريبية، تحقق من النتائج المحتملة.
        ملاحظة: إذا كانت سلالة المنافس مرئية، ولكن لم يتم الكشف عن سلالة المرجع، وهذا يشير إلى سلالة المنافس قتل أو تثبيط نمو سلالة المرجع. إذا كانت كل من السلالات موجودة ومختلطة بشكل موحد (GFP وRFP موجودة في جميع أنحاء بقعة coincubation)، وتشير هذه البيانات سلالة المنافس لا تتنافس مع سلالة المرجعية وكلا السلالات تتعايش. إذا كانت كل من السلالات موجودة ولكن منفصلة مكانيا (المستعمرات الصغيرة إما GFP أو RFP موجودة في جميع أنحاء بقعة coincubation)، وهذا يشير إلى سلالة المرجعية وسلالة المنافس قد تكون الانخراط في التفاعلات التنافسية والتعديلات على قد تكون هناك حاجة إلى سلالة مرجعية أو نسبة تكعيب الأولية. راجع المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل.

5. تحديد ما إذا كان التفاعل يعتمد على جهة الاتصال

ملاحظة: إذا وجدت أن سلالة واحدة تقتل أو تمنع الضغط المرجعي، قد يكون التفاعل غير قابل للاختراق أو يعتمد على الاتصال. لتحديد ما إذا كان التفاعل يعتمد على جهة اتصال الخلية، قم بإجراء تحليل تكعيبية كما هو موضح أعلاه للخطوات 1-2 مع التعديلات التالية.

  1. تنفيذ الخطوات 1.1-2.2.
  2. بمجرد تطبيع السلالات، سلالات منفصلة جسديا باستخدام مرشح nitrocellulose مع حجم المسام 0.22 ملم. يسمح حجم المسام هذا بنشر مضادات الميكروبات والجزيئات الصغيرة ولكنه يمنع الاتصال الجسدي بين خلايا V. fischeri.
    ملاحظة: إذا كان التفاعل يعتمد على اتصال الخلية الخلية، فصل سلالة المرجع من سلالة المنافس مع مرشح ينبغي إلغاء القاتل أو النمط الظاهري المثبط وسلالة المرجع لا ينبغي أن يكون خفض CFUs. إذا كان التفاعل لا يعتمد على اتصال الخلية، وكان آلية غير قابلة للاختراق، وفصل السلالات لا ينبغي أن يمنع سلالة المنافس من قتل سلالة المرجع.
    1. بقعة 5 مل من الضغط المرجعي على مركز مرشح وبقعة 5 مل من سلالة المنافس على مركز مرشح مختلف. ضع عامل التصفية الذي يحتوي على الضغط المرجعي على سطح لوحة أجار LBS. ضع عامل التصفية الذي يحتوي على سلالة المنافس مباشرة ً أعلى عامل التصفية مع الضغط المرجعي.
      ملاحظة: يتم رصد كل سلالة على المرشحات بدلا من سلالة أسفل رصدت مباشرة على لوحة أجار حتى سلالات يمكن وضعها بسهولة أكبر مباشرة على رأس بعضها البعض.
    2. إذا كان هناك قلق من أن السلالات ليست مكدسة مباشرة على رأس بعضها البعض، وانخفاض حجم السلالة المرجعية inoculum رصدت على مرشح. وهذا يضمن أن منطقة بقعة الضغط المرجعي أصغر وتماما فوق أو تحت سلالة المنافس. البديل الذي سلالة على رأس وعلى أسفل لحساب الاختلافات في نشر المواد الغذائية من وسيط أجار.
    3. لضمان أن يسمح المرشح بنشر الجزيئات الصغيرة، وتشمل علاج التحكم حيث يتم رصد سلالة مرجعية على مرشح والمضادات الحيوية التي هي حساسة ل (الكلورامفينيكول) رصدت على الآخر. كومة المرشحات مباشرة على رأس بعضها البعض ووضعها على لوحة أجار LBS. يجب أن تكون المضادات الحيوية قادرة على الانتشار من خلال مرشح وينبغي أن تقتل سلالة المرجعية.
  3. احتضان لوحات مع مرشحات في 24 درجة مئوية لمدة 5 ساعة. لا تعكس لوحة أجار عند الحضانة لتجنب نقل المرشحات.
  4. تنفيذ التخفيفات التسلسلية لinoculum البداية وفقا ً للخطوة 2.4.
  5. أخذ T القياسات النهائية
    1. باستخدام ملاقط معقمة، نقل كل مجموعة من المرشحات إلى أنبوب الصقر 50 مل التي تحتوي على 5 مل من مرق LBS. تأكد من فصل الفلاتر فعليًا داخل الأنبوب للسماح بإعادة التعليق الكامل لكل نوع من أنواع السلالة.
    2. إعادة تعليق السلالات من المرشحات عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا حتى المرشحات واضحة من جميع الخلايا. استخدام ملاقط لتدوير المرشحات ومسح المواد الخلية من كلا الجانبين. تعقيم ملاقط مع الإيثانول بين العينات.
    3. تنفيذ تخفيف تسلسلي لT النهائي وفقا للخطوة 2.5. عند حساب إجمالي وحدات CFUs للنهائي T، اضبط "الحجم الإجمالي للعينة غير المخففة" من 1 مل إلى 5 مل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل تقييم التفاعلات التنافسية بين السكان البكتيرية، تم وضع بروتوكول فحص coincubation والأمثل لV. fischeri. تستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تقوم بترميز جينات مقاومة المضادات الحيوية والبروتينات الفلورية، مما يسمح بالاختيار التفاضلي والتمييز البصري لكل سلالة. من خلال تحليل البيانات التي تم جمعها من اختبار تكعيب، يمكن تحديد النتيجة التنافسية للتفاعل وآلية التفاعل. على سبيل المثال، تم إجراء التجارب التالية باستخدام عزل V. fischeri. السلالات coincubated تأوي واحدة من اثنين من بلازميدات مستقرة: pVSV102 التعبير عن مقاومة الكاناميسين وGFP +، أو pVSV208 التعبير عن مقاومة الكلورامفينيكول وDsRed +. في عينة البيانات، تم خلط سلالات في نسبة 1:1 واحتضنت على لوحات أجار LBS لمدة 5 ساعة. كعلاج التحكم، تم عملة الإصدارات الموسومة بشكل تفاضلي من سلالة المرجعية مع بعضها البعض. تم إجراء العلاجات التجريبية مع سلالة مرجعية (إيواء pVSV102) وإما سلالة المنافس 1 أو سلالة المنافس 2 (إيواء pVSV208). تم إعداد ثقافات كل سلالة وcoincubated كما هو موضح أعلاه وكما هو مبين في الشكل 1 والشكل 2.

في الشكل 3، يتم عرض البيانات التي تم تحليلها لتحديد ما إذا كانت سلالة المنافس 1 أو 2 تفوقت على الضغط المرجعي بطريقتين. وفي الشكل 3ألف،حُسبت نسبة كل نوع إجهاد لكل نقطة زمنية أثناء التجربة وفقاً للخطوة 4-2-1. وفي العلاجات التجريبية، تبين بيانات العينة أن السلالة المرجعية وسلالة المنافسين 1 موجودتان بنسبة 0.5 في بداية (0 ساعة) ونهاية (5 ح) من التجربة، وهو ما يتسق مع ما لوحظ في علاج التحكم. وتبين هذه البيانات أن نسبة السلالات لم تتغير بعد عملية تكتك، وبالتالي لم تلاحظ أي منافسة. وعلى النقيض من ذلك، عندما تم احتضان السلالة المرجعية مع سلالة المنافس 2، كانت السلالة المرجعية موجودة بنسبة 0.5 في البداية (0 ساعة)، ونسبة <0.01 في نهاية (5 ح) من التجربة، والتي كانت أقل بكثير من عنصر التحكم العلاج (اختبار الطالب t: P < 0.001). وتشير هذه البيانات إلى أن نسبة السلالة المرجعية انخفضت في وجود سلالة المنافسين 2، وبالتالي تشير إلى حدوث منافسة بين سلالة المنافسين 2 والإجهاد المرجعي. وينبغي تطبيق هذا النوع من التحليل عند تحديد كيفية تغير نسبة السلالات داخل المجتمع المحلي مع مرور الوقت، ولكن لا يمكن استخدامها لتحديد آلية التفاعل التنافسي، وبالتالي ينبغي الجمع بينها وبين تحليل إضافي. على سبيل المثال، يمكن أن تعزى نسبة الإجهاد المرجعي الذي يتناقص في وجود سلالة المنافسين 2 إلى عدة أنواع من التفاعلات: '1' نمت السلالة 2 بسرعة أكبر من السلالة المرجعية، '2' وتثبيط السلالة 2 نمو المرجع سلالة، أو '3' سلالة 2 القضاء على سلالة المرجعية من خلال القتل.

وفي الشكل 3باء، حُسب مؤشر السجل التنافسي النسبي (RCI) لكل معاملة وفقاً للخطوة 4-2-2. عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 1، لم تكن قيم RCI سجل مختلفة إحصائيا من الصفر أو من العلاج التحكم (P > 0.05)، مما يشير إلى عدم ملاحظة المنافسة بين سلالات. عندما تم احتضان سلالة المرجع مع سلالة المنافس 2، ومع ذلك، كانت قيم RCI سجل أكبر بكثير من الصفر والعلاج التحكم (الطالب t-اختبار: P < 0.001). وتشير هذه البيانات إلى أن السلالة 2 تفوقت على السلالة المرجعية. تحليل قيم RCI سجل يوفر طريقة بسيطة لتحديد ما إذا كان سلالة واحدة تفوقت على الآخر خلال فترة الحضانة. لأن هذا التحليل يتضمن نسبة السلالات في نهاية (5 ح) وبداية (0 ح) من التجربة، يمكن أن تؤثر نسبة البداية بشكل كبير على النتيجة. ولذلك، ينبغي دراسة نسبة البدء والنظر فيها عند استخلاص استنتاجات من بيانات السجل RCI. وعلاوة على ذلك، لا يقدم هذا التحليل معلومات عن الآلية التنافسية، بل يفيد ببساطة بكيفية تغير نسبة السلالات أثناء الحضانة.

ويعرض الشكل 4 طريقتين لتحليل البيانات لتحديد آلية التنافس من أجل تفاعل معين. في الشكل 4A، يتم عرض إجمالي CFUs لكل سلالة في كل نقطة زمنية من التجربة. عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 1، CFUs من كل من سلالات زيادة على مدى 5 ح وCFUs للسلالة المرجعية لم تكن مختلفة بشكل كبير من سلالة 1 أو السيطرة في 5 ح (P > 0.05). وتشير هذه البيانات إلى أن السلالة المرجعية نمت في وجود السلالة 1، وتشير إلى عدم حدوث أي منافسة. ومع ذلك، عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 2، زادت سلالة 2 CFUs بعد 5 ساعة ولكن CFUs للسلالة المرجعية انخفضت. وكانت السلالة المرجعية CFUs أقل بكثير من سلالة 2 CFUs والتحكم في 5 ح (الطالب t-اختبار: P < 0.002). وتشير هذه البيانات إلى أن الضغط المرجعي CFUs انخفاض في وجود سلالة 2، وتشير إلى سلالة 2 يقتل خلايا السلالة المرجعية. إذا لم تظهر السلالة المرجعية انخفاضاً في CFUs، ولكن بدلاً من ذلك لا تغيير (لا فرق إحصائي بين السلالة المرجعية CFUs في 0 ساعة و 5 ح)، فإن هذه البيانات تشير إلى أن السلالة 2 تفوق تجهد السلالة المرجعية عن طريق تثبيط نمو السلالة المرجعية. تحليل البيانات الإجمالية غير المحولة CFU هو معلومات ية بشكل خاص، حيث يتم عرض CFUs لكلا السلالات في كل نقطة زمنية بشكل مستقل ويمكن استخدامها لتحديد آلية المنافسة.

ويبين الشكل 4باء نسبة استرداد السلالة المرجعية من أجل تحديد كيفية تأثير وجود سلالة منافس على السلالة المرجعية. عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 1، لوحظ انتعاش ~ 3200 في المئة، والتي لم تكن مختلفة إحصائيا عن السيطرة ويشير إلى سلالة 1 لم تؤثر على الانتعاش في المئة من سلالة المرجعية. عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 2، لوحظ انتعاش ~ 4 في المئة، والتي كانت أقل بكثير من عنصر التحكم (الطالب t-اختبار: P < 0.002). وكان الانتعاش في المئة أيضا أقل بكثير من 100 (الطالب t-اختبار: P < 0.002)، مما يشير إلى سلالة 2 تفوق تجهد المرجعية عن طريق قتل خلايا سلالة المرجعية. إذا كان الانتعاش في المئة لا تختلف إحصائيا عن 100، فإن هذه البيانات تشير إلى سلالة 2 تحول دون نمو سلالة المرجعية. وتوفر بيانات الاسترداد في المائة طريقة مبسطة لتوصيف آلية المنافسة من خلال دراسة كيفية استجابة مجموعة السلالة المرجعية لوجود سلالة منافسة. ومع ذلك، فإن عرض البيانات بهذه الطريقة يستبعد معلومات حول نسبة البداية وكذلك كيف تغيرت وفرة سلالة المنافس في جميع أنحاء الحضانة.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي يوضح اختبار تكعيب. (أ) السلالات البكتيرية التي تأوي إما pVSV102 (سلالة مرجعية المشار إليها المرجع سلالة أو R.S.) أو pVSV208 (سلالة المنافس المشار إليها Comp. سلالة أو C.S.) تزرع بشكل منفصل على وسائل الإعلام الانتقائية إما للسلالة المرجعية (LBS كان) أو سلالة المنافس (LBS كام). ثم يتم إعادة تعليق السلالات في مرق LBS وتطبيعها إلى OD = 1.0. (ب) يتم خلط سلالة المرجعية وسلالة المنافس بنسبة 1:1 حسب الحجم. يتم تنفيذ تخفيف تسلسلي مع هذا الخليط لتحديد CFUs لكلا السلالات في 0 ساعة (C)ثم يتم رصد خليط سلالة على لوحات 24 جيدا التي تحتوي على أجار LBS. يتم رصد كل تكرار في بئره الخاصة. يسمح للبقع لتجف ثم يتم احتضانها في 24 درجة مئوية لمدة 5 ساعة. بعد 5 ح، يتم إجراء تخفيف تسلسلي لتحديد مقدار CFUs لكل سلالة. (D) يتم رصد خليط سلالة من لوحة B أيضا على لوحات LB أجار بيتري يسمح لتجف وحضانة في 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في 24 ح، يتم تصوير بقعة تكعيب باستخدام مجهر تشريح الفلورية التي يتم تكييفها للكشف عن الأخضر (سلالة المرجعية) والأحمر (سلالة المنافس) الفلورة. شريط مقياس = 1 ملم.

Figure 2
الشكل 2: الصور التمثيلية لللوحات اللازمة للتخفيف التسلسلي. (أ) 96 جيدا لوحة تستخدم لأداء التخفيف التسلسلي. يتم تدوير لوحة بحيث يكون هناك 12 صفوف و 8 أعمدة. تتضمن واصفات كل علاج السلالات المستخدمة والبلازميدات التي تأويها (على سبيل المثال، سلالة المرجع مع pVSV102 وسلالة المنافس مع pVSV208) ورقم النسخ المتماثل لكل صف (R1 أو R2 أو R3 أو R4). العمود الأول هو العينة غير المخففة ويمثل كل عمود إلى اليمين تخفيف 10 أضعاف من العمود السابق (عامل التخفيف المذكورة أعلاه). (B) LBS لوحة أجار المستخدمة لتحديد CFUs للإجهاد المرجعي على لوحات LBS Kan (أعلى) وسلالة المنافس على لوحات LB كام (أسفل) من العلاج التجريبي. كل صف هو واحد تكرار في العلاج (على سبيل المثال، R1) ويتم سرد عامل التخفيف من كل بقعة في الجزء العلوي من لوحة. يتم سرد عدد وحدات CFUs التي تم حسابها لكل نسخة متماثلة إلى اليمين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: عينة من البيانات لتقييم ما إذا كانت سلالات المنافسين تفوق الضغط المرجعي. (أ) نسبة سلالات النقود التي تأوي إما pVSV102 (رمادي غامق) أو pVSV208 (رمادي فاتح). R.S. يشير إلى سلالة المرجعية وC.S. يشير إلى سلالة المنافس. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى نسبة 0.5. تشير العلامة النجمية إلى أن السلالة المرجعية تشكل نسبة أقل إحصائياً من السكان من سلالة المنافس أو الضغط المرجعي في عنصر التحكم عند 5 ساعة (اختبار الطالب: P < 0.001)؛ ns يشير إلى عدم أهمية (P > 0.05). (ب) سجل مؤشر تنافسي نسبي (RCI) لتجارب تكعيب. يشير الخط العمودي المتقطع إلى سجل RCI = صفر. تشير العلامة النجمية إلى قيمة RCI السجل بشكل إحصائي أكبر من الصفر وعنصر التحكم (اختبار t للطالب: P < 0.001). أشرطة الخطأ تشير SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: عينة من البيانات لتحديد آلية المنافسة. (أ) إجمالي CFU التهم لتشريح العملة التي أجريت مع V. fischeri المعزولات التي تم تمييزها بشكل تفاضلي مع pVSV102 أو pVSV208. تم جمع CFUs في بداية التجربة (0 ح) وبعد 5 ح الحضانة. R.S. يشير إلى سلالة المرجعية وC.S. يشير إلى سلالة المنافسين. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى متوسط 0 h CFUs لكلا السلالات; تشير العلامة النجمية إلى أن السلالة المرجعية كانت مركبات الكربون الكلورية فلورية أقل إحصائياً في العلاج التجريبي بالنسبة للعلاج بالرقابة عند 5 ساعة (اختبار الطالب t: P < 0.002). (B) النسبة المئوية لاسترداد سلالة المرجع. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى استرداد 100% (لا زيادة أو نقصان في CFUs)؛ تشير العلامة النجمية إلى أن نسبة الاسترداد كانت أقل إحصائياً من 100% ومعالجة التحكم (اختبار t للطالب: P < 0.002). أشرطة الخطأ تشير SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: عينة من البيانات لوقت الحضانة وتحسين التصوير. (أ) إجمالي CFUs لتجارب تكعيبحيث تم جمع CFUs في بداية التجربة (0 ساعة)، بعد 5 و12 و24 ساعة الحضانة. R.S. يشير إلى سلالة المرجعية وC.S.2 يشير إلى سلالة المنافس 2. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى متوسط 0 h CFUs لكلا السلالات; تشير العلامات النجمية إلى أن السلالة المرجعية كانت مركبات الكربون الكلورية فلورية أقل إحصائياً في العلاج التجريبي بالنسبة للعلاج بالرقابة في نقطة زمنية معينة (اختبار الطالب t: P < 0.002). أشرطة الخطأ تشيرSEM. (B) الصور المجهرية الفلورسنت المقابلة مع بيانات CFU في لوحة A. مقياس شريط = 1 ملم.

Figure 6
الشكل 6 عينة من البيانات لتحسين نسبة تكعيبات. أجريت تجارب تكعيبية بين سلالة المرجعية (R.S.) التي تأوي pVSV102 (الأخضر، الصف العلوي) وسلالة المنافسين (C.S.) التي تأوي pVSV208 (الأحمر، الصف السفلي) وتم التقاط الصور المجهرية الفلورية في 24 ساعة . (A) سلالات كانت مختلطة في نسبة1:1 أو (ب) نسبة 1:5 حيث تم تجاوز سلالة المرجعية، التي تحتوي على pVSV102، من سلالة المنافس التي تحتوي على pVSV208. شريط مقياس = 1 ملم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر تصنيف التكعيبات الموضحة أعلاه طريقة قوية لاكتشاف المنافسة بين البكتيريا. وسمح هذا النهج بتحديد المنافسة الداخلية بين V. fischeri isolates وتوصيف الآلية التنافسية19. على الرغم من أن الطريقة الموصوفة تم تحسينها للبكتيريا البحرية V. fischeri، فإنه يمكن تعديلها بسهولة لاستيعاب الأنواع البكتيرية الأخرى بما في ذلك العزلات السريرية والبيئية. من المهم ملاحظة أن الآليات التنافسية غالباًما تكون مشروطة تنظيم 5،23،24،25،26،27 , 28، وبالتالي فإن الاختلافات الصغيرة في ظروف النمو (على سبيل المثال، الهز مقابل الثقافة الدائمة، ودرجة الحرارة، وما إلى ذلك) ونوع وسائل الإعلام (على سبيل المثال، محتوى الملح) يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج. ولذلك، فإن تحسين ظروف تكعيب العملة من المرجح أن يكون ضرورياً لمختلف الأنواع البكتيرية وكذلك لآليات تنافسية مختلفة. فمن الأفضل لاختيار الظروف الثقافية التي تعكس عن كثب البيئة الطبيعية للعزل. على سبيل المثال، أجريت الاختبارات تكعيبية بين سلالات V. fischeri مع وسائل الإعلام LBS في 24 درجة مئوية، لتعكس ملوحة ودرجة حرارة البيئة البحرية. ومع ذلك، فإن بعض البكتيريا هي المختصة بشكل طبيعي في بيئتها27،28 وبالتالي يمكن أن تأخذ المواد الوراثية التي تطلقها الخلايا lysed خلال التفاعلات العدائية29. لمنع نقل الحمض النووي من التأثير على نتائج تكعيب، من المهم استخدام الظروف التي لا تعزز الكفاءة أو السلالات التي ليست مختصة، سواء بشكل طبيعي أو من خلال تعطيل آلات تناول الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، فإن البارامترات التجريبية مثل مرحلة نمو الخلايا، أو الكثافة الثقافية، أو وقت الحضانة، أو نسبة الإجهاد الأولي، قد تتطلب أيضاً تحسين الأنواع البكتيرية المختلفة أو الآليات التنافسية. فعلى سبيل المثال، ستملي الكثافة الثقافية الأولية مقدار ملامسة الخلايا الخلوية بين السلالات، مما يمكن أن يؤثر على قدرة البكتيريا على نشر آليات للمنافسة تعتمد على الاتصال.

الشكل 5A يعرض عملية التحسين من الاختبارات coincubation مع V. fischeri المعزولات. هنا، تم تقييم مجموعة من أوقات الحضانة لجمع CFU والتصوير المجهري الفلورسنت لتحديد الوقت الأمثل لكل مقياس ليتم جمعها. وقد جُمعت مركبات الكربون الكلورية فلورية مباشرة بعد رصد خليط من السلالة المرجعية وسلالة المنافس 2 على لوحات أجار رطل (0 ساعة)، والتقطت قياسات CFU وصور الفحص المجهري الفلوري على الفور وبعد 5 و12 و24 ساعة. وتبرز هذه البيانات النموذجية أهمية التحسين الشامل قبل استخلاص أي استنتاجات بشأن التفاعل بين سلالات اثنين. على سبيل المثال، يمكن استخلاص استنتاجين مختلفين حول آلية التفاعل على أساس عندما يتم جمع CFUs: CFUs من 5 أو 12 ح تشير إلى سلالة 2 قتل سلالة المرجعية، في حين أن CFUs التي تم جمعها في 24 ح تشير إلى سلالة 2 يمنع نمو سلالة المرجعية.

قد يكون الوقت الأمثل لتصور بقع تكعيبات من خلال الفحص المجهري الفلورسنت مختلفة عن الوقت الأمثل لجمع CFU. يعرض الشكل 5B الصور المجهرية الفلورية لبقع تكعيب اتّصال في 0 و5 و12 و24 ساعة. في 0 و 5 ساعة، بقع coincubation غير مرئية مع المجهرية الفلورسنت. للصور التي اتخذت في 12 ساعة، كل من سلالات في العلاج التحكم مرئية، ومع ذلك RFP (سلالة مرجعية تأوي pVSV208) هو باهتة بشكل ملحوظ. في العلاج التجريبي في 12 ساعة، سلالة المنافس 2 مرئية (ولكن قاتمة) وسلالة المرجعية غير قابلة للكشف. يمكن أن تؤثر الاختلافات الخاصة بالإجهاد بين العزلات البكتيرية على التعبير عن بروتينات الفلورسنت، وبالتالي سطوع الخلايا في البقعة المختلطة. لأن RFP هو باهتة بشكل ملحوظ من GFP في السيطرة، يجب أن تستمر بقع coincubation أن تكون حاضنة ويتم تصويرها مرة أخرى في وقت لاحق. في الصور التي تم التقاطها في 24 ساعة، كلا السلالات قابلة للكشف بشكل واضح وسطوع مماثل في تجربة التحكم. في سلالة العلاج التجريبي 2 مرئية في حين لا يلاحظ سلالة المرجعية داخل بقعة coincubation. 15-24 ساعة وقت الحضانة كافية لتصور GFP وRFP لV. fischeri باستخدام بلازميدات مستقرة pVSV102 و pVSV208، على التوالي، ولكن قد تحتاج إلى تعديل وقت الحضانة لمختلف بلازميدات أو الأنواع البكتيرية. على الرغم من أن الوقت الأمثل لتصور بقع تكعيبات وجمع بيانات CFU مختلفة، التصوير في 24 ساعة هو وسيلة جيدة لتفاعلات الشاشة بسرعة لV. fischeri، لأن النتيجة التي تم الحصول عليها من التصوير في 24 ساعة (الهدف مرئي أم لا) يعكس البيانات الكمية الأكثر كثافة من حيث الوقت التي تم الحصول عليها من طلاء CFUs في 5 أو 12 ساعة.

يمكن أن تؤثر نسبة البداية بشكل كبير على النتائج، لا سيما عند احتضان اثنين من سلالات المثبطة، وقد تحتاج إلى تعديل لحساب الاختلافات سلالة محددة في كفاءة القتل أو معدل النمو. على سبيل المثال، يعرض الشكل 6A الصور المجهرية الفلورية للتجارب حيث تم عملة سلالة المرجع مع نفسها (السيطرة) وثلاثة عزلات V. fischeri أخرى بدءاً من نسبة 1:1. في هذه البيانات عينة، يتم الكشف عن سلالة المرجعية بشكل واضح عندما احتضنت مع نفسها، سلالة منافس 1، وسلالة منافس 3 بعد 24 ساعة. ومع ذلك، عندما تم تعديل نسبة البداية إلى 1:5 (أي، 50 مل من سلالة المرجعية مختلطة مع 250 مل من سلالة المنافس) يتم الكشف عن سلالة المرجع بشكل واضح فقط عندما coincubated مع نفسها وسلالة 1، مما يشير إلى أن كل من سلالة 2 وسلالة 3 خارج المنافسة سلالة المرجع. ويحول هذا التعديل دون أن يؤدي معدل النمو الأسرع للسلالة المرجعية إلى حجب أثر أي آليات للمنافسة على التداخل تظهرها سلالات المنافسين. استناداً إلى النتائج في الشكل 6A، يجب استخدام نسبة 1:5 (سلالة المرجع : سلالة المنافس) لفحص سلالات V. fischeri إضافية للقدرة على قتل سلالة المرجع.

ويميز هذا البروتوكول بين سلالات التكوّن عن طريق وضع علامات تفاضلية على سلالات تحتوي على جينات مقاومة الكاناميسين أو الكلورامفينيكول. ومع ذلك، قد تكون المضادات الحيوية المختلفة أو طرق الاختيار الأخرى أكثر ملاءمة لمختلف الأنواع البكتيرية. ويمكن أن تشمل الأساليب الأخرى للاختيار التفاضلي ما يلي: (1) استغلال ضمور الأوبوكسوين الخاص بسلالة/أنواع محددة لعوامل نمو محددة (مثل DAP أو thymidine)، 2) متطلبات النمو المشروط (على سبيل المثال، تنمو سلالة واحدة عند 37 درجة مئوية بينما لا يحدث للآخر)، أو 3) علامات الاختيار المضاد التي تقضي على نمو سلالة الموسومة أو تمنعها عندما تزرع في ظل ظروف مناسبة للتعبير عن جين "قتل" (على سبيل المثال، ccdB أو sacB).

اختيار سلالة المرجع المناسب أمر بالغ الأهمية للحصول على وتفسير النتائج القابلة للاستنساخ من اختبار تكعيبي. وينبغي دراسة السلالة المرجعية دراسة جيدة (أي أن يكون لديها مجموعة واسعة من المؤلفات العلمية)، وليس لديها قتل واضح أو قدرة مثبطة، ومن الناحية المثالية لديها جينوم متسلسل. على سبيل المثال، سلالات معينة من الإشريكية القولونية هي سلالات مرجعية شائعة للعديد من التجارب البكتيرية تكعيبية30،31. ومع ذلك، قد لا تكون E. coli ذات صلة من الناحية البيئية لآلية تنافسية معينة أو منافس معين، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج. فعلى سبيل المثال، قد تكون بعض البكتيريا قد طورت آليات تستهدف على وجه التحديد الأنواع أو المنافسين ذوي الصلة الوثيقة بنفس المكانة الإيكولوجية، ولن تكون آليتها التنافسية فعالة ضد سلالة الإشريكية القولونية.

وباختصار، فإن الطريقة الموصوفة هنا تهدف إلى توفير نهج سهل التعديل وقوي لتقييم التفاعلات بين البكتيريا والمنافسة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على العزلات البكتيرية ذات الصلة بالبحوث البيئية أو السريرية، ويمكن استخدامها لاستكشاف آليات متنوعة للتفاعل الميكروبي كانت غير معروفة من قبل أو يصعب التحقيق فيها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر المراجعين على ملاحظاتهم المفيدة. وقد تم دعم A.N.S. من قبل مؤسسة غوردون وبيتي مور من خلال منحة GBMF 255.03 لمؤسسة بحوث علوم الحياة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8, (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2, (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8, (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6, (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4, (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198, (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12, (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7, (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198, (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25, (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427, (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24, (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25, (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71, (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72, (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287, (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9, (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4, (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80, (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12, (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347, (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82, (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics