ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

Immunology and Infection

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Summary

細菌は、細菌間の競争に従事するための多様なメカニズムをコードします。ここでは、細菌単離物間の競合相互作用を特徴付け、それらが混合集団の空間構造にどのように影響するかを特徴付ける培養ベースのプロトコルを提示する。

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Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

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Abstract

この原稿は、2つの細菌集団間の競合相互作用を検出し特徴付けるための培養ベースのコインcubationアッセイについて説明する。この方法は、各集団の選択と視覚的判別のための明確な抗生物質耐性能力と蛍光タンパク質をそれぞれ差別化してタグ付けすることを可能にする安定したプラスミドを採用しています。ここでは、競合するビブリオ・フィシェリ株の調製とコインキュベーション、蛍光顕微鏡イメージング、および定量データ解析について説明する。このアプローチは簡単で、迅速な結果をもたらし、ある集団が別の集団の増殖を殺すか阻害するか、また、競合が拡散性分子を介して媒介されるか、または直接細胞間接触を必要とするかを決定するために使用することができます。各細菌集団は異なる蛍光タンパク質を発現するので、アッセイは混合コロニー内の競合する集団の空間的な判別を可能にする。記載された方法は、この種に最適化された条件を用いて共生細菌V.fischeriで行われるが、プロトコルは、ほとんどの培養可能な細菌単離物に適応することができる。

Introduction

この原稿は、2つの細菌単離物が競合相互作用が可能であるかどうかを決定する培養ベースの方法を概説する。混合集団を研究する場合、細菌単離物がどの程度相互作用するか、特に分離分離が干渉メカニズムを介して直接競合しているかどうかを評価することが重要です。干渉競争とは、1 つの集団が直接成長を阻害したり、競合する集団1を殺したりする相互作用を指します。これらの相互作用は、微生物コミュニティの構造と機能2、3に大きな影響を及ぼす可能性があるため、識別することが重要です。

微生物競争のメカニズムは、宿主関連細菌と自由生殖細菌4、5、6、7、および両方を含む多様な環境からの細菌のゲノムで広く発見されている。 8,9.殺菌化学物質1、12、分泌抗菌ペプチド13などの拡散性メカニズムを含む様々な競争戦略が記載されている10、11 阻害エフェクターを標的細胞に移すために細胞接触を必要とする接触依存性機構と同様に、9,14,15,16,17 、18.

培養ベースのコインキュベーションは微生物学5、8、19で一般的に使用されていますが、この原稿は、アッセイを使用して競争のメカニズムを特徴付ける方法と適応のための提案を概説しています。他の細菌種と使用するためのプロトコル。さらに、この方法では、競合インタラクションの性質に関するさまざまな質問に答えるために、データを分析および提示するための複数のアプローチについて説明します。ここで説明する技術は、以前にコビオビブリオ・フィシェリ細菌19の共生性対称的競争の根底にある細菌間殺菌機構を同定するために用いられたが、それらは、それらのために適している環境分離物およびヒト病原体を含む多くの細菌種は、接触依存性および拡散性の両方の競争メカニズムを評価するために利用することができる。プロトコルのステップは、他の細菌種の最適化を必要とする場合があります。より多くのモデルシステムが異なる種型10、16、20、21を含むように同種生物の使用を超えて研究を拡大していることを考えると、この方法は貴重な資源となるでしょう。競争が多重株や多種系に与える影響を理解しようとする研究者のために。

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Protocol

1. コインキューベーション用の菌株を準備する

  1. コインベキュートアッセイ中に細菌競争の標的となる適切な基準株を選択します。参照ひずみの選択時のベスト プラクティスと、参照ひずみが結果に与える影響については、「ディスカッション」を参照してください。このプロトコルでは、V.fischeri株ES114が基準株として機能する。
  2. コインの中の分離物を区別するために使用される選択およびスクリーニング方法を決定する
    1. 典型的には、異なる抗生物質耐性遺伝子(例えばカナマイシンまたはクロラムフェニコール)を含む安定したプラスミドを有する株を変換し、各株に対して選択するだけでなく、異なる蛍光タンパク質(例えばGFPまたはRFP)をコードする遺伝子を視覚的に変換する。共培養における歪みの種類を区別する。
      注:安定したプラスミドの使用は、株が選択の不在でプラスミドを失う場合、この株の数は定量時に過小評価され、蛍光顕微鏡を使用して視覚的に検出できないため必要です。
    2. タグコインキバテッドV.フィシェリ株は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および抗生物質カナマイシン(Kan R)に対する耐性を発現するプラスミドpVSV102を含むような差別的に、第2株が含まれています。プラスミドpVSV208は、赤色蛍光タンパク質(dsRed)および抗生物質クロラムフェニコール(Cm R)22に対する耐性を発現する。
      注:他の差分選択は、コインキューバティング株を区別するために使用することができます。その他の方法については、「ディスカッション」を参照してください。
    3. 選択が堅牢であることを確認するために、コインcubationアッセイの初期最適化中に次の制御を含めます。それに対して選択する必要がある抗生物質を含む寒天プレート上で差別的にタグ付けされた各株をプレート(すなわち、歪み2のために選択する媒体上のプレート株1、およびその逆)。
  3. コインキューブレーションアッセイの2日前、筋参照株pVSV102、基準株pVSV208、および適切な抗生物質を含むLBS寒天プレート(例えば、100 μg/mLカナマイシンまたは2μg/mL)に-80°C株から各競合他社株pVSV208クロラムフェニコール)を24°Cで一晩インキュベートする。すべての細胞が実験の開始時にプラスミドを含んでいることを確認するには、抗生物質の選択が必要です。
  4. アッセイの1日前に、適切な抗生物質を用いた新鮮なLBS寒天プレートに対して、株タイプ(生物学的複製物)ごとに4つの個々のコロニーを選び、再ストリークし、24°Cで一晩インキュベートする。
    注:このステップは、他の細菌種に対する最適化を必要とし得るが、より長いまたはより短いインキュベーション時間は、目的の生物の増殖速度に応じて十分な細胞を得るために必要とされ得る。

2. コインキューバテ細菌株

  1. インキュベーションのための各細菌株の調製(図1A)
    1. 無菌のつまようじを使用して、寒天板から細胞を掻き取り(米粒の大きさと同じくらい)、LBSスープの1mLを含む1.5mLのマイクロ遠心管で細胞を再懸濁します。チューブの側面に押し込み、激しく上下にピペッティングして、細胞の塊を分割します。
    2. チューブと渦を1-2sでキャップします。細胞の塊がまだ見える場合は、サンプルが視覚的に均一になるまで渦またはピペットを上下に続けます。
    3. すべてのサンプルに対して手順 2.1.1-2.1.2 を繰り返します。
  2. すべてのサンプルの 600 nm (OD600)で光学密度を測定および記録します。正確なOD測定を得るためには、LBSブロスを使用してサンプルを最大10倍まで希釈する必要があります。各サンプルを所望の OD600に正規化します。株は通常、OD600〜1.0に正規化され、これはV.fischeriの〜106細菌/mLに変換される。
    注:このステップは、接種細胞密度が競争のメカニズムに応じてコインキュベーション結果に影響を与えるため、異なる細菌種の最適化を必要とする場合があります。最適化については、ディスカッションを参照してください。
  3. コインキューバティング株 (図1B,C)
    1. 標識された1.5 mL遠心管に各株の100 mL(OD 1.0に正規化)を加えることによって、1:1比(v/v)で基準株と競合他社株を混合します。対照として、参照歪み自体の差異タグ付きバージョンと混合する(参照歪みpVSV102+参照歪みpVSV208)。この制御は、競合他社株の存在が参照ひずみの成長に影響を与えるかどうかを判断するために、後の統計分析に必要です。1-2sの混合ひずみ培養物を渦。
      注:開始率が結果に大きな影響を与える可能性があり、調整が必要になる場合があるため、この手順では最適化が必要になる場合があります。最適化については、ディスカッションを参照してください。
    2. 生物学的反復ごとにステップ 2.3.1 を繰り返します。このステップを完了した後、合計8つの混合ひずみチューブが存在する必要があります:差別的にタグ付けされた参照株(コントロール)を持つ4つの生物学的反復、および差異タグ付き参照および競合株を持つ4つの生物学的反復()実験的)。
    3. LBS寒天を含むペトリプレート上の各コントロールと実験混合物のスポット10 mL;これらの培養スポットは、インキュベーション後の蛍光顕微鏡に使用されます。
    4. すべての液体が寒天に吸収されるまで、スポットがベンチで完全に乾燥し、24 °Cでペトリプレートをインキュベートします。pVSV102およびpVSV208でタグ付けされたV.fischeri株は、蛍光解剖顕微鏡を用いて集団レベルでGFPとRFPを可視化するのに十分な高い細胞密度に成長するために、最低15時間が必要です。ここでは、混合スポットをイメージングするために24時間のインキュベーションを使用します。
      注:湿りすぎたり、乾燥しすぎたりしないプレートを使用することが重要です。プレートが湿すぎる場合、コインキューブレーションスポットは寒天プレートに吸収されません。同じ日に注いだプレートの使用は避けてください。プレートが乾燥しすぎると、寒天面に小さな波や亀裂が生じ、コインの凹部が不規則な形をしています。
    5. ステップ2.3.3と同じ細菌懸濁液を使用して、各対照および実験混合物の10mLを、1ウェル当たり1mLのLBS寒天を含む24ウェルプレートにスポットします。ステップ2.3.3のように、24ウェルプレートの寒天に適切な水分があることを確認してください。スポットを完全に乾燥させ、24 °Cで5時間インキュベートします。これらの培養スポットは、実験終了時に各株のコロニー形成単位(CCF)を定量するために使用されます。
      注:個々の井戸の成長のための細菌の懸濁液をスポッティングは、終点でより容易な懸濁液を可能にする。このステップは、24ウェルプレートを使用するより経済的なアプローチとして正方形の無菌フィルター片を使用して達成することができる。正方形の滅菌フィルター片は寒天板の上に置くことができ、各実験混合物の10 mLは、24ウェルプレートではなく、これらのフィルタ上に見つけることができます。コインキューベーション時間の後、フィルターは1.5 mL遠心管に移され、コインキューブレーションスポットは渦または上下に渦巻くことによって再懸濁することができる。5時間のインキュベーション時間は、V.fischeri単離物19間の細菌間死を検出するのに十分であるが、このコインキュベーション時間は、他の種または競争的メカニズムのためにより短くまたは長くする必要があるかもしれない。詳細については、ディスカッションを参照してください。
  4. 接種を開始するためのシリアル希釈
    1. 開始コインキュベーション混合物の連続希釈を実行するには、8列と12行があるので、96ウェルプレート90°を回転させます。各行には、最初の列に希釈されていない混合物のサンプルが含まれ、その後、行の残りのウェル全体で 7 つの 10 倍の連続希釈が続きます (図 2A)。
    2. 各行にひずみ ID、反復数、および時間 (開始イノクル = T0) を付けます。希釈系列を見つける適切な抗生物質を補充したLBS寒天プレートにラベルを付けます。各抗生物質プレートが選択している株を特定してください。
    3. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルにLBSスープの180 mLを追加し、希釈されていないコインcubation混合物の最初の列を空のままにします。
      注:研究者は、リン酸緩衝生理食生(PBS)を使用して、特に急速に成長している細菌種で作業する場合、またはシリアル希釈が必要な大規模な実験を一貫して行う場合、コインキュベーションスポットを再中断し、シリアル希釈を行うことを選択することができます。実行する長い時間。これらのインスタンスでPBSを使用すると、シリアル希釈を行う過程で細菌の著しい増殖を防ぐことができます。ただし、サイズや持続時間に関係なく、すべての実験で使用されるソリューション(PBSやLBSなど)と一致することが重要です。
    4. 200 mLの単一チャネルピペットを使用して、チューブから最初のカラムにコインcubation混合物の100 mLをうまく転送します。先端を捨て、すべてのコインcubation混合物について繰り返します。
    5. マルチチャンネルピペットを使用して、列1から2に20 mLを転送し、上下にピペットでミックスします。各列のヒントを破棄し、各行が最初のコインキュベーション混合物の10倍のシリアル希釈を含むように、各列を繰り返します。
      注:希釈が上下にピペトされる回数と一致する。たとえば、希釈シリーズ全体で一貫性を保つために、各希釈ごとにピペットハンドルを5回押し下げます。
    6. 8つの先端を取り付けたマルチチャンネルピペットを使用して、希釈シリーズ(すなわち、8つのウェルの1行)で各ウェルから5mLを吸引し、参照株を選択するLBS寒天プレート(カナマイシンで補充)にスポットします。競合他社株(クロラムフェニコールを補充)を選択するプレート上にこのステップスポッティングを繰り返します(図2B)。インキュベーターに入れる前に、スポットを完全に乾燥させます。
      注:同じヒントを使用して、参照と競合株を選択するプレート上の複製希釈系列を見つけることができますが、反復間で変更する必要があります。これは、細菌のコロニーに似て、プレートカウント中に結果を歪めることができるうつ病を作成することができるので、LBS寒天プレートにピペット先端の端に触れないようにしてください。先端がプレートに触れる場合は、メモを作成し、コロニー数にうつ病を含めません。
  5. T最終測定の取り組み
    1. 24ウェルプレートのコインキュベーションスポットを24°Cで5時間インキュベートした後、各ウェルに1 mLのLBSスープを加え、すべての細胞が再懸濁するまで上下にピペッティングしてコインキューベーションスポットを再懸濁させます。すべての反復でセルが再中断される活力と一致します。たとえば、ピペット ハンドルを 8 回押し下げると、各サンプルを完全に再中断します。
    2. 各コインキュベーションスポットが再懸濁したら、ステップ2.4.1と同じ方法で希釈を見つける適切な抗生物質を使用して、シリアル希釈用の96ウェルプレートとLBS寒天プレートを準備します。
    3. ステップ 2.4.2-2.4.6 を実行して、T 最終測定のシリアル希釈を完了します。
      注:重要な制御は、コインcubationアッセイの初期最適化中に含まれるべきである。コインキュベーション期間の終わりに、両方の抗生物質を含む培地に混合株をプレートします。いずれの株も、1)自発的な突然変異が生じるか、または2)選択可能なマーカーが株間で交換されない限り、成長してはならない。

3. 蛍光顕微鏡を用いてコインcub化を可視化する

  1. LBS寒天ペトリプレート上の各コインキュベーションスポットを、安定したプラスミドで発現する蛍光タンパク質に対応した緑色および赤色蛍光検出用に装備されたステレオ顕微鏡を用いて、ステップ2.3.3および2.3.4から画像化する。
  2. まず、対照コインキューブレーションスポット(参照歪みpVSV102+参照歪株pVSV208)の画像を撮ることから始める。
    1. スポットがフォーカスに合わせられるように倍率を調整します。
    2. 適切な励起光とフィルタを使用してGFPを観察し、コインキューブレーションスポットからの蛍光のみが検出可能であり、媒体からの任意のバックグラウンド蛍光が低いか見えないように露光時間を調整します。
    3. 励起光とフィルタを変更して RFP を観察し、露出時間を調整してメディアからの背景を最小限に抑えます。
  3. 実験処理から各コインキュベーションスポットについて、ステップ3.2.2で決定したGFPフィルタと露光時間を用いて参照歪みの画像を用いて示す。
  4. RFPフィルタを用いて競合他社株を画像化し、培地からのコインキュベーションスポットおよび背景蛍光からのみ蛍光が観察されるように露光時間を調整することは最小限である。両方の画像を保存し、両方の歪みの一部のID、反復数、画像が撮影されたインキュベーション時間(例えば、24時間)を含むようにそれらを名前を付けます。すべての反復について繰り返します。
    注:コインキューブレーション時間は、異なるプラスミドまたは細菌種に対して調整する必要がある場合があります。最適化については、ディスカッションを参照してください。

4. データ分析

  1. 各コントロールおよび各タイムポイントでの実験処理の CFC の計算 (T 開始および T 最終)
    1. コロニーがシリアル希釈プレート上に見え始めたら(例えば、V.fischeriの24°Cで24h)、個々のコロニーをカウントすることができ、大きなマルチコロニークラスターに一緒に成長していない希釈因子を特定する(図2B)。反復ごとに、特定の希釈の個々のコロニーの数をカウントおよび記録します。この数値は、そのレプリケートの CFU を表します。
    2. 以下の式を使用して、コインキューベーションの各株の合計 CFO に希釈の CFO を変換します。
      [ CFC ÷ (希釈係数 x vol. 希釈スポットの vol. ] 希釈されていないサンプルの x vol. = 全 CFC
      例: T0: [(6 CFO) ] (10^-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] = 実験開始時の混合スポットにおける歪み 1 の合計 CFO 1
      T5: [(4 CFO) ( 10^-3 x 0.005 mL)] x [1.0 mL] = 5 h コインキュベーション後の混合スポットにおける歪み 1 の合計 CFO
      各時点での各ひずみの CFU 値は、複数の異なる分析および統計検定に使用できる生データです(下記のセクション 4.2 を参照)。
  2. 次のデータ変換を実行して、競合競技者ひずみが参照ひずみよりも優れているかどうかを判断します: (i) 参照ひずみの比率が競合株の存在下で減少するか、または (ii) を計算します。相対的な競争指数 (RCI) をログに記録します。これらの分析は生データを比率に変換し、相互作用の競合結果を決定するのに役立ちますが、競争のメカニズム(すなわち、殺害対成長阻害)を決定することはできません。
    1. コインキューベーション中の各時間ポイントの各歪みの比率の計算
      1. CFU データを処理中の各株の比率に変換します。T0 の参照ひずみ (RS) の場合、T0 での参照ひずみの合計 CFC を、参照ひずみの合計 CCF と T0 の競合企業 (CS) の合計で除算します。
        RST0 CFO ÷ (RST0 CFO + CST0 CFC) = T0 での参照歪みの比率。
        同じ計算を実行して、T0 での競合株の比率を決定します。
        CST0 CFC ÷ (RST0 CCF + CST0 CFC) = T0 での参照歪みの比率
        各時間点に対してこのプロセスを繰り返し、実験処理と対照処理(分化タグ付き参照歪みコインキュベーション)の両方を複製する。
      2. 積み上げ棒グラフでT0とT5の各ひずみタイプの平均比率をグラフ化します(図3A)。
      3. 株の所望の開始比が得られたことを確認します。株が最初に1:1混合されたコインキュベーションの場合、各株タイプはT0の母集団の約0.5を含み、学生のt検定(P> 0.05)を使用して統計的に異なってはならないはずです。1株の割合がT0の他の株よりも有意に大きい場合は、1:1の開始比が達成されるまで実験を繰り返します。
      4. 競技者株が5時間後に集団の有意に大きな割合を含むかどうかを決定する. T0およびT5での実験処理における各株の割合を比較する学生のt検定を行う。競合株の割合がT5(P<0.05)の基準株の割合と有意に異なる場合、この結果は歪み競争が発生した可能性を示唆している。手順 4.2.1.5 に進みます。
      5. 競技者株の存在が5時間後に基準株の比率を減少させたかどうかを判断するために、コントロール内の参照株の比率と参照歪の比率を比較する学生のt検定を実行する。実験的治療(参照株対競合他社株)。
        注:基準株の割合が対照(P<0.05)に対する実験処理において統計的に低い場合、競合株は5時間後に基準株の割合を有意に減少させ、参照株を上回った。
    2. 各処理のログ RCI 値の計算 (コントロールを含む)
      注:相対競合指数(RCI)は、歪みタイプの終わり率が開始比とどのように異なるかを比較する単一の値です。RCI 値は、ゼロより大きいログ RCI 値が競合株 (CS) が参照ひずみ (RS) を上回り、ログ RCI 値がゼロ未満であることを示すようにログ変換され、ログ RCI は競合株を上回り、ログ RCI は対照を超えています。0 の値は、どちらのひずみも競合が競合しがちにないことを示します。
      1. 次の式を使用して、各制御および実験処理の対数 RCI 値を計算します。
        ログ [(CST5 CFU の RST5 CFU) ( CST0 CFU の RST0 CFU)] = ログ RCI
      2. グラフログRCI値は、データが水平方向にグラフ化される別々のボックス&ウィスカープロットを使用して行われます(図3B)。
      3. 各治療がゼロ値で同じ数の反復を比較するデータ・セット(対照を含む)のログRCI値を比較する学生のt検定を行うことによって、各治療がゼロから有意に異なっていたかどうかを判別します。実験処理の対数 RCI 値が統計的にゼロ (P < 0.05) より大きい場合、競合株は参照ひずみを上回りました。
        注:対照は、差異的にタグ付けされた参照株が等元性であるため、ゼロ (P > 0.05) と統計的に異なってはならないはずです。
      4. 学生のt検定を実行して、実験処理のログRCI値が対照よりも有意に大きいかどうかを判断します(P< 0.05)。実験処理からの対数RCI値が対照処理よりも統計的に大きい場合、競合他社株は基準歪みを上回った。
  3. 次の統計分析を実行して、競合株が参照ひずみを上回るメカニズムを決定します: (i) 生の合計 CFU データを分析するか、(ii) 参照ひずみのパーセント回復率を調べます。これらの分析は、ステップ4.2からのものに対して相対的に見るのがより面倒な場合がありますが、競合他社株がそれを成長させ、参照株の成長を阻害するか、または積極的に参照株を排除することによって参照株を上回るかどうかを識別します。
    1. 未加工の CFU データの分析
      1. インターリーブ散布プロットを使用して両方の株の生の合計CFUデータをグラフ化し、そこで反復は個々のデータポイントとして表示されます(図4A)。ログスケールにデータを表示し、両方の株の平均 T0 CFO を示す水平線を追加します。
      2. 競合株の存在が参照株に悪影響を及ぼすかどうかを判断するには、T5での対照および実験処置に関する参照株CCFを比較する学生のt検定を実行する。実験処理における基準株CFCが対照(P<0.05)よりも統計的に低い場合、競合株の存在は参照株に有意に影響を与えた。
      3. 競合株の存在が参照株の増殖を阻害したか、または除去したかを決定するために、対照および実験的処置のためにT0およびT5における参照株CUを比較する学生のt検定を行う。
        注:競合他社が存在しない場合、基準株は対照処理のためにT0およびT5を比較する際にCFUの有意な増加を示すべきである。実験処理を分析する場合、T5における基準株CUがT0(P>0.05)と比較して統計的に異なっていない場合、競合株は参照株の増殖を阻害した。 参照株T5 CFCがT0CFO(P< 0.05)よりも有意に低い場合、競合株は参照歪みを殺した。
    2. 参照ひずみの回復率の計算
      1. 参照ひずみ (RS) の CFU データの合計を、次の式を使用してパーセントの回復データに変換します。
      2. (RST5 CCF の RST0 CFO) x 100 = 参照歪みの % リカバリ
      3. 各バーが対照または実験処理のいずれかを表す分離棒グラフを使用して、参照ひずみの回復率を表示します(図4B)。y = 100 で破線を追加して、参照ひずみの 100% の回復を示します (0 h から 5 h までの参照ひずみ CCF の増減はありません)。
      4. 競技者株が参照株に悪影響を及ぼしたかどうかを判断するには、対照処理と実験治療の基準歪み率回復を比較する学生のt検定を実行する。パーセントの回復がコントロール (P< 0.05) よりも有意に小さい場合、競合株は参照ひずみに悪影響を及ぼします。
      5. 競合他社株が基準株の増殖を阻害したか、または除去されたかを特定するために、実験治療のための参照歪みパーセント回復を比較する学生のt検定を実行し、同じ回数の反復を持つデータセットをすべて値は 100 です。
        注:実験治療が100(P> 0.05)と統計的に異なっていない場合、競合株は参照株の増殖を阻害した。 実験治療における基準株率回復が100(P<0.05)よりも有意に低い場合、競合株は参照株を殺した。
    3. 蛍光顕微鏡画像の解釈
      1. 蛍光顕微鏡画像が撮影されたら、各株がコインキュベーションスポットで目に見えて検出可能かどうかを判断します。対照コインキューベーション(参照歪株pVSV102+参照歪株pVSV208)の場合、GFPとRFPの両方が1つのコインキューベーションスポットから見える必要があります。そうでない場合は、再び実験を設定し、菌株が適切に標識され、抗生物質を含まないプレート上でコインキューバンされていることを確認します。
      2. 各実験コインキュベーションスポットについて、可能な結果を確認してください。
        注:競合株が目に見えるが、基準株が検出されない場合、競合株が死亡または参照株の増殖を阻害することを示唆する。両方の株が存在し、均一に混合されている場合(GFPとRFPがコインキュベーションスポット全体に存在する)、これらのデータは、競合他社株が基準株と競合せず、両方の株が共存することを示唆しています。両方の株が存在するが、空間的に分離されている場合(GFPまたはRFPのいずれかのマイクロコロニーがコインキュベーションスポット全体に存在する)、これは、参照株と競合他社株が競争的な相互作用と変更に従事している可能性があることを示唆しています。参照歪みまたは初期コインキュベーション比が必要な場合があります。詳細については、ディスカッションを参照してください。

5. インタラクションが接触依存であるかどうかを判断する

注:1つの株が参照株を殺すか阻害する場合、相互作用は拡散性または接触依存性である可能性があります。相互作用が細胞間接触に依存しているかどうかを判断するために、以下の修飾を伴うステップ1-2について、上記のようにコインcubationアッセイを行う。

  1. 手順 1.1-2.2 を実行します。
  2. 株が正規化されると、0.22mmの細孔サイズのニトロセルロースフィルターを使用して、物理的に別々の株。この細孔サイズは、抗菌剤と低分子の拡散を可能にしますが、V.フィシェリ細胞間の物理的な接触を防ぎます。
    注:相互作用が細胞間接触に依存する場合、フィルタとの競合株からの参照株の分離は、殺しまたは阻害表現型を分解し、参照株はCUを減少させるべきではない。相互作用が細胞間接触に依存せず、拡散可能なメカニズムである場合、株を分離することは、競合株が参照歪みを殺すことを妨げるべきではない。
    1. フィルタの中心に基準ひずみのスポット5 mLと、別のフィルタの中心に競合他社株のスポット5 mL。参照ひずみを含むフィルタをLBS寒天板の表面に配置します。競合他社のひずみを含むフィルタを、参照ひずみを持つフィルターの上に直接配置します。
      注:各株は寒天プレートに直接見つかった底株ではなく、フィルター上にスポットされているので、株は互いの上に直接置くことができます。
    2. 株が互いに直接積み重ねられていない懸念がある場合は、フィルター上に見つかった参照歪みのイノクルの体積を減らします。これにより、参照ひずみスポットの面積が小さく、競合他社の歪みの上または下に完全に含まれなくなります。寒天媒体からの栄養素の拡散の違いを説明するために、どの株が上と底にあるかの代替。
    3. フィルタが小分子の拡散を可能にするために、基準株がフィルター上に見つかった制御処理と、それが感受性である抗生物質(クロラムフェニコール)が他方に見つかった。フィルターを互いに直接積み重ね、LBS寒天プレートの上に置きます。抗生物質は、フィルタを介して拡散することができ、参照株を殺す必要があります。
  3. 24 °Cで5時間フィルターでプレートをインキュベートします。フィルターを動かさないようにインキュベーションする際は、寒天プレートを反転させないようにしてください。
  4. ステップ 2.4 に従って開始イヌキュラムのシリアル希釈を実行します。
  5. T最終測定の取り組み
    1. 滅菌ピンセットを使用して、LBSスープの5 mLを含む50 mLファルコンチューブにフィルターの各セットを転送します。フィルターがチューブ内で物理的に分離されていることを確認し、各ひずみタイプの完全な再停止を可能にします。
    2. フィルターがすべてのセルからクリアされるまで、上下にピペッティングして、フィルターから株を再中断します。ピンセットを使用して、フィルターを回転させ、両側からセル材料をクリアします。サンプル間のエタノールでピンセットを殺菌します。
    3. ステップ 2.5 に従って、T ファイナルのシリアル希釈を実行します。TファイナルのCFOの合計を計算する場合は、1 mLから5 mLに「希釈されていないサンプルの総体積」を調整します。

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Representative Results

細菌集団間の競合相互作用を評価するために、V.fischeri用に最適化されたコインcubationアッセイプロトコルが開発され、最適化された。この方法は、抗生物質耐性遺伝子および蛍光タンパク質をコードする安定したプラスミドを利用し、各株の差異選択および視覚的判別を可能にする。コインベーションアッセイから収集したデータを分析することで、相互作用の競合結果と相互作用のメカニズムを特定することができます。一例として、以下の実験は、V.フィシェリ単離物を用いて行った。コインキューバ行き株は、カナマイシン耐性およびGFP+を発現するpVSV102、またはクロラムフェニコール耐性およびDsRed+を発現するpVSV208の2つの安定なプラスミドのうちの1つを保有した。試料データでは、株を1:1比で混合し、LBS寒天プレート上で5時間インキュベートした。対照処理として、参照株の分化タグ付きバージョンを互いにコインキューバックスした。実験処置は、基準株(ハーピングpVSV102)および競合株1または競合株2(ハーピングpVSV208)のいずれかで行った。各株の培養物を調製し、上述したように、図1および図2に示すように造語した。

図3では、競合他社株1または2が基準ひずみを上回るかどうかを判定するために分析されたデータが2つの方法で提示される。図3Aでは、実験中の各時間点に対する各ひずみタイプの比率をステップ4.2.1に従って算出した。実験処理において、サンプルデータは、基準株および競合株1が実験の開始時(0時間)および終了(5時間)の割合で0.5の割合で存在することを示し、これは対照処理で観察されるものと一致する。これらのデータは、5時間の硬貨化後に株の割合が変化しなかったことを示し、したがって、競合は認められなかった。対照的に、基準株を競合株2でインキュベートした場合、基準ひずみは開始時(0時間)に0.5の割合で存在し、実験終了時(5時間)の割合<0.01は、対照よりも有意に低かった。治療(学生のt検定:P<0.001)。 これらのデータは、競合株2の存在下で基準株の割合が減少したことを示し、したがって、競合株2と基準株との間の競争が起こったことを示唆している。このタイプの分析は、コミュニティ内の株の比率が時間の経過と共にどのように変化するかを決定する際に適用されるべきであるが、競合相互作用のメカニズムを決定するために使用することはできないため、追加の分析と組み合わせる必要があります。例えば、競合他社株2の存在下で減少する基準株の割合は、いくつかのタイプの相互作用に起因し得る:(i)株2は参照株よりも速く成長し、(ii)株2は参照の成長を阻害した株、または(iii)株2は、殺害を通じて参照歪を排除した。

図3Bでは、ステップ4.2.2に従って各治療について対して対数相対競合指数(RCI)を算出した。基準株を競合株1でインキュベートした場合、対数RCI値はゼロまたは対照処理(P> 0.05)と統計的に異なっていなかった。.しかし、基準株を競合他社株2でインキュベートした場合、ログRCI値はゼロと対照処理(学生のt検定:P<0.001)よりも有意に大きかった。 これらのデータは、歪み2が基準株を上回った可能性を示唆している。ログ RCI 値を分析すると、インキュベーション期間中に一方のひずみが他の株を上回ったかどうかを判断する簡単な方法が提供されます。この分析では、実験の終わり(5時間)と開始(0時間)の歪みの比率が組み込みられており、開始比が結果に劇的に影響を与える可能性があります。したがって、ログ RCI データから結論を導き出す際には、開始率を調べ、検討する必要があります。さらに、この分析は、競合メカニズムに関する情報を提供せず、単にインキュベーション中に株の比率がどのように変化するかを報告します。

図 4は、特定の相互作用に対する競合のメカニズムを決定する 2 つのデータ分析方法を表示します。図4Aでは、実験の各時点における各歪みの合計CFOが表示される。基準株を競合株1でインキュベートした場合、両方の株のCFOは5時間の経過とともに増加し、基準株についてはCFCは5hで株1または対照(P> 0.05)と有意に異ならなかった。これらのデータは、歪み1の存在下で基準株が成長したことを示し、競合が発生しなかったことを示唆している。しかし、基準株を競合株2でインキュベートした場合、5時間後に株2CUSが増加したが、基準株についてはCFCが減少した。リファレンス株CFOは、株2 CFOよりも有意に低く、5時間でコントロール(学生のt検定:P<0.002)。これらのデータは、参照株CFCが株2の存在下で減少することを示し、株2が参照株細胞を殺すことを示唆する。参照株がCUの減少を示さなかったが、むしろ変化がない場合(0hおよび5hでの参照株CU間の統計的差異なし)、これらのデータは、参照株の増殖を阻害することによって参照株を上回ることを示唆する。変換されていない合計CFUデータの分析は、各時点における両方の株のCFUが独立して表示され、競争のメカニズムを識別するために使用することができるので、特に有益です。

図4Bは、競合株の存在が参照歪みにどのように影響するかを決定するために、参照歪のパーセント回復率を示す。基準株を競合株1でインキュベートした場合、約3,200%の回復が観察されたが、これは対照と統計的に異なっていなかったし、株1は参照株の回復率に影響を与えなかったことを示す。基準株を競合他社株2でインキュベートした場合、約4%の回復が観察され、これは対照よりも有意に低かった(学生のt検定:P<0.002)。パーセント回復も100未満(学生のt検定:P<0.002)未満で、参照歪み細胞を殺すことによって参照株を上回った株2を示した。 パーセント回復が100と統計的に異なっていない場合、これらのデータは、株2が参照株の増殖を阻害することを示唆するであろう。パーセント回復データは、参照ひずみ母集団が競合株の存在にどのように反応するかを調べることによって、競争のメカニズムを特徴付ける簡略化された方法を提供します。ただし、この方法でデータを表示すると、開始比に関する情報や、インキュベーション全体で競合他社株の存在がどのように変化したかについての情報は除外されます。

Figure 1
図1:コインキュベーションアッセイを示すフローチャート。(A) pVSV102(参照株を示す参照株)またはpVSV208(競合株が示すComp.株またはC.S.)のいずれかを保有する細菌株は、参照株(LBS Kan)またはいずれに対して選択的なメディア上で別々に成長する。競合他社株(LBSカム)。その後、株はLBSブロスで再懸濁され、OD = 1.0に正規化されます。(B) 基準ひずみと競合株は、体積別に1:1の比率で混合される。この混合物を使用してシリアル希釈を行い、0 h.(C)の両方の株のCCWを決定し、次にLBS寒天を含む24ウェルプレート上に歪み混合物をスポットします。各反復は、独自のウェルにスポットされます。スポットを乾燥させ、24°Cで5時間インキュベートする。5時間後、各株のCFOを定量するためにシリアル希釈が行われます。(D)パネルBからの歪み混合物はまた、24時間24°Cで乾燥し、インキュベートすることができるLBS寒天ペトリプレート上にスポットされる。24時間で、コインキュベーションスポットは、緑色(参照株)と赤色(競合株)蛍光を検出するように適合された蛍光解剖顕微鏡を使用して画像化されます。スケールバー = 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:連続希釈に必要なプレートの代表的な画像。(A) シリアル希釈を行うために使用される96ウェルプレート。プレートは12行と8列があるような回転を行います。各処置の記述子には、使用される株およびそれらが保有するプラスミド(例えば、pVSV102との参照株およびpVSV208を伴う競合株)および各行の反復数(R1、R2、R3、またはR4)が含まれる。最初の列は希釈されていないサンプルで、右側の各列は前の列の 10 倍の希釈を表します (上記の希釈係数)。(B) LBSカンプレート上の基準歪み(上)およびLBSカムプレート上の競合株(下)のCFCを決定するために使用されるLBS寒天プレート(下)。各行は、処理中の1回の反復(例えば、R1)であり、各スポットの希釈係数がプレートの上部にリストされている。各反復でカウントされる CFU の数が右側に表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:競合他社株が基準ひずみより競合するかどうかを評価するためのサンプルデータ。(A) pVSV102(ダークグレー)またはpVSV208(ライトグレー)のいずれかを保有するコインキューバティング株の割合。R.S.は基準株を示し、C.S.は競合株を示す。破線の水平線は、0.5 の割合を示します。アスタリスクは、5時間で対照の競合株または参照歪みよりも統計的に小さい母集団の割合を構成する参照歪を示します(学生のt検定:P< 0.001)。ns は有意でないと示します (P > 0.05)。(B) コインキュベーションアッセイの相対競合指数(RCI)をログに記録します。太線の垂直線は、ログ RCI = ゼロを示します。アスタリスクは、ログ RCI 値が統計的にゼロより大きく、コントロール (学生の t 検定: P < 0.001) を示します。誤差バーはSEMを示していますこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:競争のメカニズムを決定するためのサンプルデータ。(A) pVSV102またはpVSV208で差別的にタグ付けされたV.fischeri分離株で行われたコインcubationアッセイの合計CFUカウント。 CFOは実験開始時(0時間)及び5時間後に採取した。R.S.は基準株を示し、C.S.は競合他社株を示す。破線の水平線は、両方の株の平均 0 h CKW を示します。アスタリスクは、5時間での対照処理に対する実験処理において、参照株CCWが統計的に低かいことを示す(学生のt検定:P<0.002)。(B) 基準歪みのパーセンテージ回復率。水平破線は100%の回復を示します(CFCの増減はありません)。アスタリスクは、パーセンテージ回復率が統計的に100%より低く、対照治療(学生のt検定:P<0.002)を示します。誤差バーはSEMを示していますこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:インキュベーション時間とイメージング最適化のためのサンプルデータ。(A) 実験開始時にCFOを回収したコインキュベーションアッセイの合計CFO(0時間)、5、12、および24hインキュベーション後。R.S.は基準株を示し、C.S.2は競合株2を示す。破線の水平線は、両方の株の平均 0 h CKW を示します。アスタリスクは、所定の時点での対照処理に対する実験治療において、参照株CCWが統計的に低かされたことを示す(学生のt検定:P<0.002)。誤差バーは、パネルA.スケールバー=1mmのCFUデータに対応する蛍光顕微鏡画像を示し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6.コインの比率最適化のためのサンプルデータ。基準株(R.S.)×pVSV102(緑、上段)と競合株(C.S.)の間でコインキューベーション実験を行い、pVSV208(赤色、下段)と蛍光顕微鏡画像を24時間(A)株で撮影した。pVSV102を含む基準株がpVSV208を含む競合株によって上回った1:1比または(B)比1:5で混合した。スケールバー = 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

上記のコインcubationアッセイは、細菌間の競合を発見するための強力な方法を提供する。このアプローチは、V.fischeri分離と競争メカニズム19の特性特性間の特異的競争の同定を可能にした。記載された方法は海洋細菌V.フィシェリ用に最適化されたが、臨床および環境分離を含む他の細菌種に対応するように容易に改変することができる。競争メカニズムは、多くの場合、条件付きで規制されていることに注意することが重要です 5,6,23,24,25,26,27,28は、従って成長条件の小さな違い(例えば、揺れ対立培養、温度など)および媒体タイプ(例えば、塩分含有量)が結果に劇的に影響を与えることができる。したがって、異なる細菌種だけでなく、異なる競争メカニズムのためにコインキュベーション条件を最適化する必要がある可能性が高いです。隔離の自然環境を密接に反映した培養条件を選択するのが最善です。例えば、V.フィシェリ株間のコインcubationアッセイは、海洋環境の生理性および温度を反映するために、24°CでLBS培温で行った。しかしながら、一部の細菌は自然にその環境27、28で有能であり、したがって、拮抗的相互作用29の間にlysed細胞によって放出される遺伝物質を取り込むことができる。このようなDNA移植がコインキュベーションの結果に影響を与えるのを防ぐためには、当然のことながら、またはDNA取り込み機械の不活性化を通じて、能力や能力を持たない株を促進しない条件を使用することが重要です。さらに、細胞増殖相、培養密度、インキュベーション時間、または開始歪み比などの実験パラメータは、異なる細菌種または競合機構に対する最適化を必要とする場合もある。例えば、初期培養密度は、菌が競合する接触依存機構を展開する能力に影響を与える可能性のある株間の細胞間接触量を決定する。

図5Aは、V.fischeri単離物を使用したコインcubationアッセイの最適化プロセスを表示する。ここで、CFU収集および蛍光顕微鏡イメージングに対するインキュベーション時間の範囲を評価し、収集する各メトリックに最適な時間を決定した。CFUは、参照株と競合株2の混合物がLBS寒天プレート(0時間)上に発見された直後に収集され、CFU測定および蛍光顕微鏡画像は、5、12、および24時間の直後に撮影された。これらのサンプルデータは、2つの株間の相互作用に関する結論を導く前に、徹底的な最適化の重要性を強調しています。例えば、相互作用のメカニズムに関する2つの異なる結論は、CFCが収集されるタイミングに基づいて推測することができる:5または12hからのCFCは、株2が参照株を殺した、一方、24時間で収集されたCFCは、株2の成長を阻害する参照ひずみ。

蛍光顕微鏡を用いてコインキュベーションスポットを可視化するための最適な時間は、CFUコレクションの最適な時間とは異なる場合があります。図5Bは、0、5、12、および24時間のコインcubationスポットの蛍光顕微鏡画像を表示する。0および5時間では、コインキュベーションスポットは蛍光顕微鏡では見えません。12時間で撮影された画像の場合、対照処理における両方の株が見えるが、RFP(参照歪み×pVSV208)は特に調光される。12hでの実験処理では、競合株2が目に見える(まだ薄暗い)、基準歪みは検出できない。細菌単離物間のひずみ特異的な違いは、蛍光タンパク質の発現に影響を与え、したがって混合スポットにおける細胞の明るさに影響を与える可能性がある。RFP はコントロール内の GFP よりも著しく暗くなるため、コインキューブ化スポットは引き続きインキュベートされ、後で再びイメージ化する必要があります。24時間で撮影された画像では、両方の株が目に見えて検出可能であり、対照実験で同様の明るさで。実験処理では歪み2は、基準歪みがコインキュベーションスポット内で観察されない間に目に見える。15-24 hインキュベーション時間は、それぞれ安定なプラスミドpVSV102およびpVSV208を用いてV.fischeriのGFPおよびRFPを可視化するのに十分であるが、インキュベーション時間は異なるプラスミドまたは細菌種に対して調整する必要があるかもしれない。コインベキューーションスポットの可視化とCFUデータの収集に最適な時間は異なりますが、24時間のイメージングは24時間のイメージングから得られた結果が見えるかどうかにかかわらず、V.fischeriの相互作用を迅速にスクリーニングする良い方法です。は、5 時間または 12 時間のめっき CFO から得られる、より時間の多い定量データを反映します。

開始比は、特に2つの阻害株をインキュベートする場合に結果に大きな影響を与える可能性があり、および殺害効率または増殖速度の歪み特異的な違いを考慮して調整する必要がある場合がある。例えば、図6Aは、参照株がそれ自体(対照)と1:1の比率で始まる他の3つのV.fischeri単離物でコインキューバーションされた実験の蛍光顕微鏡画像を表示する。これらのサンプルデータでは、参照ひずみは、それ自体、競合他社株1、および24時間後に競合他社株3をインキュベートすると目に見えて検出される。しかし、開始比を1:5に調整した場合(すなわち、競合株の250mLと混合された基準株の50mL)は、参照歪み自体と歪み1とコインキューバクでコインクバトした場合にのみ目に見えて検出され、歪み2と株3の両方が競合することを示す参照ひずみ。この調整により、参照株の成長速度が速く、競合株が示す干渉競争メカニズムの効果を不明瞭にするのを防ぐことができます。図6Aの結果に基づいて、1:5の比率(参照株:競合株)は、参照株を殺す能力のための追加のV.fischeri株をスクリーニングするために使用されるべきである。

このプロトコルは、カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドを用いて株を差別的に標識することによって、コインキューバチン株を区別する。しかし、異なる抗生物質または他の選択方法は、異なる細菌種に適してもよい。差分選択のための他の方法は、1)特定の成長因子(例えば、DAPまたはチミジン)のための株/種特異的な補助体を利用する)、2)条件付き成長要件(例えば、1つの株は37°Cで成長し、もう一方は成長しない)、または3)「キル」遺伝子(例えば、ccdBまたはsacB)を発現するために適切な条件下で成長した場合にタグ付けされた株の増殖を排除または阻害するカウンター選択マーカー。

適切な基準歪みを選択することは、コインキュベーションアッセイから再現可能な結果を得て解釈するために重要です。参照株はよく研究されるべきである(すなわち、科学文献の広いボディを有する)、明らかな殺害または阻害能力を有しない、理想的には配列ゲノムを有する。例えば、大腸菌の特定の株は、多くの細菌コインキュベーション実験30、31に共通の基準株である。しかし、大腸菌は、特定の競争メカニズムや競合他社に生態学的に関連しない可能性があり、結果に影響を与える可能性があります。例えば、一部の細菌は、同じ生態学的ニッチのために密接に関連する種または競合他社を特異的に標的とするメカニズムを進化させており、その競争力のあるメカニズムは大腸菌参照株に対して有効ではないであろう。

要約すると、ここで説明する方法は、細菌間相互作用および競争性を評価するための容易に改変され、堅牢なアプローチを提供することを目的とする。この方法は、環境や臨床研究に関連する細菌単離物に適用することができ、これまで知られていなかったか、または調査が困難であった微生物相互作用の多様なメカニズムを探索するために使用することができます。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

私たちは、彼らの有用なフィードバックのためのレビュー担当者に感謝したいと思います。A.N.S.は、ライフサイエンス研究財団への助成金GBMF 255.03を通じてゴードンとベティムーア財団によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

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References

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