Vibrio fischeri Izolatlar arasında rekabetçi etkileşimleri ölçmek için kokuluçak assay

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bakteriler, interbakteriyel rekabetle uğraşmak için farklı mekanizmalar kodlayabilir. Burada, bakteriyel izolatlar ve karma bir nüfusun uzamsal yapısını nasıl etkilediğini arasında rekabetçi etkileşimleri karakterize etmek için kültür tabanlı bir protokol sunuyoruz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu yazıda iki bakteriyel nüfus arasındaki rekabet etkileşimlerini algılamak ve karakterize etmek için kültür tabanlı, kokuluçlama tahlili açıklanmaktadır. Bu yöntem, her nüfusun, sırasıyla her nüfusun seçim ve görsel ayrımcılığı için farklı antibiyotik direnci yetenekleri ve floresan proteinleri ile ayırt edilmesini sağlayan istikrarlı plazmids kullanır. Burada, rakip Vibrio fischeri suşları, floresans mikroskopisi görüntüleme ve nicel veri analizinin hazırlanması ve kokulerasyonu açıklanmaktadır. Bu yaklaşım basittir, hızlı sonuçlar verir ve bir nüfus öldürür veya başka bir nüfusun büyümesini inhibe olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir, ve rekabet bir differe molekül yoluyla aracılık veya doğrudan hücre hücresi temas gerektirir. Her bakteriyel nüfus farklı bir floresan protein ifade ettiği için, tahlil karma bir koloni içinde rakip nüfusun uzamsal ayrımcılık izin verir. Açıklanan yöntemler bu tür için optimize koşulları kullanarak simbiyotik bakteri V. fischeri ile gerçekleştirilir rağmen, protokol en culturable bakteriyel izolatlar için adapte edilebilir.

Introduction

Bu yazıda iki bakteriyel yalıtın rekabetçi etkileşimlere sahip olup olmadığını belirlemek için kültür tabanlı bir yöntem özetlenmiştir. Karışık nüfus okurken, özellikle izolatlar doğrudan girişim mekanizmaları ile rekabet olup olmadığını, bakteriyel yalıtılmaların etkileşim ölçüde değerlendirmek önemlidir. Girişim Yarışması, bir nüfusun doğrudan büyüme inhibe veya bir rakip nüfus öldürür etkileşimleri anlamına gelir1. Bu etkileşimlerin bir mikrobiyal topluluğun yapısı ve işlevi2,3üzerinde derin etkileri olabilir çünkü tanımlamak için önemlidir.

Mikrobiyal yarışma mekanizmaları, hem konak bağlantılı hem de serbest yaşayan bakteri4,5,6,7dahil olmak üzere çeşitli ortamlarda bakterilerin genomlarını geniş ölçüde keşfedilmiştir. 8,9. Çeşitli rekabet stratejileri, bakterisidal kimyasallar1,12 ve salgılanan antimikrobiyal peptitler gibi difüzyon mekanizmaları da dahil olmak üzere10,11 olarak tanımlanmıştır.13 , bir inhibitör efektör hedef hücrelere aktarmak için hücre hücresi temas gerektiren temas bağımlı mekanizmalar yanı sıra9, 14,15,16,17 ,18.

Kültür tabanlı kokulinasyonlar yaygın Mikrobiyoloji5,8,19, bu makalede kullanılan rağmen nasıl test rekabet mekanizmasını karakterize etmek için, hem de uyarlama için öneriler özetlemek diğer bakteriyel türler ile kullanım için protokol. Ayrıca, bu yöntem, rekabetçi etkileşimlerin niteliği hakkında farklı sorulara yanıt vermek için verileri analiz etmek ve sunmak için birden çok yaklaşım açıklar. Burada açıklanan teknikler daha önce, koizole Vibrio fischeri bakterilerinin simbiyotik suşları arasında intraspecific rekabet altta yatan interbakteriyel öldürme mekanizması tanımlamak için kullanılmış olmasına rağmen19, onlar için uygundur çevresel izolatlar ve insan patojenleri de dahil olmak üzere birçok bakteriyel tür ve hem kontakt bağımlı hem de yayılabilen rekabetçi mekanizmaları değerlendirmek için kullanılabilir. Protokoldeki adımlar diğer bakteriyel türler için optimizasyon gerektirebilir. Daha fazla model sistemleri, farklı genotip10,16,20,21dahil etmek için izojenik organizmaların kullanımı ötesinde çalışmalarını genişletiyor göz önüne alındığında, bu yöntem değerli bir kaynak olacak nasıl rekabet etkileri Multi-strain veya çok türler sistemleri anlamak isteyen araştırmacılar için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kokuleleme için suşları hazırlayın

  1. Kokuluzasyon tahlil sırasında bakteriyel rekabet için hedef olarak hizmet edecek uygun bir referans gerinim seçin. Başvuru gerinim seçerken en iyi uygulamalar için tartışma konusuna ve referans gerinimin sonuçları nasıl etkilediğini görün. Bu protokolde, V. fischeri strain ES114 referans gerinim olarak hizmet verecektir.
  2. Kokulinasyon içinde yalıtlar arasında ayrım yapmak için hangi seçim ve tarama yöntemlerinin kullanılacağına karar vermek
    1. Tipik olarak, her bir gerginlik için seçmek için farklı antibiyotik direnci genler (örneğin kanamisin veya chloramphenicol) içeren istikrarlı plazmids ile suşları dönüştürmek, hem de genlerin farklı floresan proteinleri kodlaması (örn. Gfp veya RFP) görsel olarak coculture içinde gerinim türlerini ayırt etmek.
      Not: Stabil plazmids kullanımı gereklidir, çünkü bir gerinim seçimin yokluğunda Plasmid 'yi kaybederse, bu gerinim sayıları nicelik olduğunda hafife alınabilir ve floresan mikroskobu kullanılarak görsel olarak algılanamaz.
    2. Etiket Co, V. fischeri suşları farklılaşmış gibi bir gerinim plazmid pVSV102 içerir, hangi bir yeşil floresan protein ifade (Gfp) ve antibiyotik kanamisin direnç (kanR), ve ikinci gerinim içerir Plazmid pVSV208, kırmızı floresan protein (DSRed) ve antibiyotik kloramfenikol (cmR)22direnç ifade eder.
      Not: Diğer diferansiyel seçimler kokuler suşları ayırt etmek için kullanılabilir. Bkz: tartışma ek yöntemler için.
    3. Seçim sağlam olduğundan emin olmak için kokuluçu tahlil ilk optimizasyon sırasında aşağıdaki denetimi içerir. Plaka farklılaşarak ona karşı seçmeniz gereken antibiyotik içeren agar plakaları üzerinde etiketlenmiş her gerinim (yani, gerilim 2 için seçer medyada plaka gerinim 1, ve tersi).
  3. İki gün önce kokuluzasyon tahlil, çizgi referans gerinim pVSV102, referans gerinim pVSV208, ve her rakip gerilme pVSV208-80 °c stokları lbs agar plakaları üzerine uygun antibiyotik içeren (örn., 100 μg/ml kanamisin veya 2 μg/ml kloramphenicol) ve gece 24 °C ' de inküytir. Antibiyotik seçimi tüm hücrelerin deney başında Plasmid içermesini sağlamak için gereklidir.
  4. Bir gün önce tahlil, pick ve restreak her gerinim türü (biyolojik çoğaltır) başına dört bireysel koloniler uygun antibiyotik ile taze LBS agar plakaları üzerine ve gece 24 °C ' de inkübe.
    Not: Bu adım, diğer bakteriyel türler için optimizasyon gerektirebilir, daha uzun veya daha kısa inkübasyon süreleri ilgi organizmanın büyüme hızına bağlı olarak yeterli hücre elde etmek için gerekli olabilir.

2. bakteriyel suşları kokulat

  1. Kuluçş için her bakteriyel gerilimin hazırlanması (Şekil 1a)
    1. Steril bir kürdan kullanarak, agar plaka (kadar pirinç bir tanesi boyutu olarak) hücreleri kazımak ve yeniden bir 1,5 mL mikrosantrifüjler tüp 1 mL LBS suyu içeren hücreleri askıya. Tüp tarafına basarak ve güçlü bir şekilde aşağı ve aşağı pipetleme ile hücre kümeleri bölmek.
    2. 1-2 s için tüp ve girdap kap. Hücre kümeleri hala görünüyorsa, örnek görsel olarak üniforma olana kadar Vortex veya pipet yukarı ve aşağı devam edin.
    3. Tüm örnekler için 2.1.1-2.1.2 arasındaki adımları yineleyin.
  2. Tüm örnekler için 600 Nm (OD600) cinsinden optik yoğunluğu ölçün ve kaydedin. Örneklerin büyük olasılıkla, doğru bir OD ölçümü elde etmek için LBS suyu kullanarak on katına kadar seyreltilmiş olması gerekir. Her örnek istenen OD600normalleştirmek. Suşları genellikle bir OD600 normalize ~ 1,0, hangi çevirir ~ 106 bakteriler/ml V. fischeriiçin.
    Not: Bu adım, farklı bakteriyel türler için optimizasyon gerektirebilir, inokulumunu hücre yoğunluğu rekabet mekanizmasına bağlı olarak kokuluçl sonuçları etkiler. Optimizasyon için tartışma konusuna bakın.
  3. Coinkulasyon suşları (Şekil 1B, C)
    1. Referans gerinim ve rakip gerginliği 1:1 (v/v) oranında, her bir gerilimin 100 mL 'yi (OD 1,0 'ye normalleştirilmiş) etiketli bir 1,5 mL santrifüjle karıştırın. Bir kontrol olarak, referans gerinim kendisini bir farklılaşarak etiketli sürümü ile karıştırın (referans gerinim pVSV102 + referans gerinim pVSV208). Bu denetim, daha sonraki istatistiksel analiz için bir rakip gerinim varlığının referans gerinim büyümesini etkilediğini belirlemek için gereklidir. 1-2 s için karma-gerinim kültürü Vortex.
      Not: Başlangıç oranı sonuçları önemli ölçüde etkileyebilir ve ayarlanması gerekebilir gibi bu adım optimizasyon gerektirebilir. Optimizasyon için tartışma konusuna bakın.
    2. Her biyolojik çoğaltma için 2.3.1 adımını yineleyin. Bu adımı tamamladıktan sonra, toplam sekiz karışık gerilme tüpü olmalıdır: farklılaşmış referans suşları (kontrol) ile dört biyolojik çoğaltır ve farklılaşarak etiketli referans ve rakip suşlar ile dört biyolojik çoğaltır ( deneysel).
    3. £ Agar içeren Petri plakaları üzerine her kontrol ve deneysel karışımı spot 10 mL; Bu kültür lekeleri kuluçdan sonra floresans mikroskobu için kullanılacaktır.
    4. Tüm sıvı agar içine absorbe edilmiş ve 24 h için 24 °C Petri plakaları inkük kadar noktalar tamamen bankta kurumaya izin verin. PVSV102 ve pVSV208 ile etiketlenmiş V. fischeri suşları için en az 15 h gereklidir, sırasıyla Gfp ve RFP görselleştirmek için yüksek bir hücre yoğunluğuna büyümek için, bir floresan diseksiyon mikroskop kullanarak nüfus düzeyinde. Burada, biz görüntüleme karışık lekeler için 24 saat kuluçk kullanın.
      Not: Çok nemli veya çok kuru olmayan plakaları kullanmak önemlidir. Plakalar çok nemli ise, kokuluçar lekeler agar plaka içine absorbe olmayacaktır; aynı gün dökülmüş plakaları kullanmaktan kaçının. Plakalar çok kuru ise, küçük dalgalar veya çatlaklar agar yüzeyinde oluşabilir, şekil düzensiz kokulinasyon lekeleri yapma.
    5. Adım 2.3.3 olarak aynı bakteriyel süspansiyonlar kullanarak, spot 10 her kontrol ve deneysel karışımları 24-kuyu plakaları içine 1 mL LBS agar yanı başına her kontrolü. Adım 2.3.3 gibi, 24-kuyu plakaları içinde agar uygun nem vardır emin olun. Noktaların tamamen kurumasına izin verin ve 24 °C ' de 5 saat boyunca inküye yapın. Bu kültür noktaları, denemenin sonunda her bir gerginlik için koloni şekillendirme birimlerini (CFUs) ölçmek için kullanılacaktır.
      Not: Bireysel kuyularda büyüme için bakteriyel süspansiyonlar Spotting son zaman noktasında daha kolay Resuspension sağlar. Bu adım, 24-kuyu plakaları kullanarak daha ekonomik bir yaklaşım olarak kare steril filtre parçaları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Kare steril filtre parçaları bir agar plaka üzerine yerleştirilebilir ve 10 mL her deneysel karışımı bu filtreler üzerine fark edilebilir, yerine 24-kuyu plakaları üzerine. Kokulerasyon süresi sonra, filtreler bir 1,5 mL Santrifüjü tüpüne transfer edilebilir ve kokulerasyon spot, yukarı ve aşağı pipetleme veya vortoplama tarafından resuspended edilebilir. A 5 h inkübasyon süresi V. fischeri ısolates arasında interbakteriyel öldürme algılamak için yeterlidir19, ancak, bu kokulerasyon süresi diğer türler veya rekabetçi mekanizmalar için daha kısa veya daha uzun olması gerekebilir. Daha fazla ayrıntı için tartışma konusuna bakın.
  4. Başlangıç inokulumunu için seri seyreltme
    1. Sekiz sütun ve oniki satır var böylece bir 96-kuyu plaka 90 ° döndürmek, kokuluzasyon karışımları başlangıç bir seri seyreltme gerçekleştirmek için. Her satırda, ilk sütunda seyreltilmiş karışımı bir örnek ve ardından kalan kuyular arasında 7 10-Fold seri dilüsyonları takip eder (Şekil 2a).
    2. Her satırı gerinim kimliği, çoğalan sayı ve zaman (inokulumunu = T0 başlangıç) ile etiketleyin. Etiket LBS agar plakaları hangi seyreltme Serisi Spot uygun antibiyotik ile desteklenmektedir. Her antibiyotik plakasının hangi gerinim için seçtiğinden emin olun.
    3. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir kuyu için 180 mL lb suyu ekleyin, ilk sütunu seyreltilmiş kokulerasyon karışımı için boş bırakarak.
      Not: Araştırmacılar, özellikle hızlı büyüyen bakteriyel türler ile çalışıyorsanız veya seri dilüsyonların alabileceği büyük deneylerde sürekli performans gösterirken, kokuluçluk noktalarını pelletini ve seri seyreltme gerçekleştirmek için fosfat tamponlu tuzlu (PBS) kullanmayı tercih edebilir uzun bir süre gerçekleştirmek için. Bu durumlarda PBS kullanmak, seri dilüsyonları gerçekleştirme sürecinde bakterilerin önemli ölçüde büyümesini önleyecek. Ancak, boyutu veya süresi ne olursa olsun tüm deneyler boyunca hangi çözümün kullanılacağı (örn. PBS veya LBS) tutarlı olması önemlidir.
    4. Kullanarak bir 200 mL tek kanallı pipet, transfer 100 mL kokulinasyon karışımı tüpten ilk sütuna iyi. Ucu atın ve tüm kokulinasyon karışımları için tekrarlayın.
    5. Çok kanallı pipet kullanarak, 1-2 sütunundan 20 mL aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın. İpuçları atın ve her sütun için tekrar böylece sonunda, her satır ilk kokulerasyon karışımı on kat seri seyreltme içerir.
      Not: Dilüsyonlar yukarı ve aşağı pipetli sayısı ile tutarlı olun. Örneğin, her seyreltme için beş kez pipet kolu düşürmek seyreltme Serisi boyunca tutarlı olması.
    6. Sekiz ipucu ile donatılmış çok kanallı pipet kullanarak, bir seyreltme serisinin her bir iyi 5 ml Aspire (yani, sekiz kuyuların bir satır) ve referans gerinim için seçer lbs agar plaka üzerine nokta (kanamycin ile tamamlayıcı). Bu adımı, rakip gerilme (kloramphenikol ile tamamlayıcı) için seçim plakasına göre tekrarlayın (Şekil 2B). Kuluçat yerleştirmeden önce noktaların tamamen kurumasına izin verin.
      Not: Aynı ipuçları, referans ve rakip gerinim için seçme plakalara çoğaltır seyreltme serisini belirlemek için kullanılabilir, ancak çoğlar arasında değiştirilmesi gerekir. Bu bir bakteriyel koloniye benzer ve plaka sayımı sırasında sonuçları eğriltme bir depresyon yaratabilir gibi LBS agar plakaları için pipet ucunun sonuna dokunmadan kaçının. Eğer ipucu plakaya dokunursanız, bir Not yapın ve depresyon koloni sayılarında içermez.
  5. T final ölçümlerini alma
    1. 24-kuyu plakalardaki kokulerasyon lekeleri 24 °c ' de 5 saat boyunca inkübe edildikten sonra, her bir kuyu için 1 ml lbs suyu ekleyin ve tüm hücreler resuspended olana kadar yukarı ve aşağı pipetleme yaparak kokuluçlu lekeleri yeniden pelletini. Hücrelerin tüm çoğaltır arasında resuspended hangi Vigor ile tutarlı olun. Örneğin, pipet tutamacını sekiz kez bastırabilir, her numuneyi tamamen yeniden pelletini.
    2. Bir kez her kokuleleme spot resuspended, bir seri seyreltme ve LBS agar plakaları için hangi adım 2.4.1 aynı şekilde seyreltme spot uygun antibiyotikler ile bir 96-Well plaka hazırlayın.
    3. T final ölçümleri için seri seyreltme işlemini tamamlamak için 2.4.2-2.4.6 adımlarını gerçekleştirin.
      Not: Önemli bir kontrol coinkübasyon tahlil ilk optimizasyon sırasında dahil edilmelidir. Kokulinasyon döneminin sonunda, hem antibiyotikler içeren medya üzerine karışık suşları plaka. 1) spontan mutasyon ortaya çıkarsa ya da 2) seçilebilir belirteçleri suşları arasında değiş tokuş edilir sürece ne strain büyümek mümkün olmalıdır.

3. floresans mikroskobu kullanarak Kokuleslerini görselleştirin

  1. Her kokuleleme spot LBS agar Petri plakaları üzerinde adımları 2.3.3 ve 2.3.4 yeşil ve kırmızı floresan algılama için donatılmış bir stereo mikroskop kullanarak, hangi floresan proteinleri istikrarlı plasmids üzerinde ifade ediliyor karşılık.
  2. Başlangıç kontrol kokuluçu spot görüntüleri alarak (referans gerinim pVSV102 + referans gerinim pVSV208).
    1. Büyütme noktasını odak noktası olarak ayarlayın.
    2. GFP 'i gözlemlemek için uygun uyarılma ışığı ve filtreyi kullanarak, pozlama süresini ayarlayın, böylece sadece kokuluziyet noktasından floresans algılanabilir ve medyadaki herhangi bir arka plan floresans düşük veya görünmez olur.
    3. RFP gözlemlemek için uyarma ışık ve filtre değiştirmek, orta arka plan en aza indirmek için pozlama süresini ayarlama.
  3. Deneysel tedavilerden her kokuleleme noktası için, adım 3.2.2 'de belirlenen GFP filtresini ve pozlama süresini kullanarak referans gerinim için görüntü.
  4. RFP filtresini kullanarak rakip gerginliği görüntü, pozlama süresini ayarlayarak floresan sadece kokuluzasyon spot ve arka plan floresans ortamdan gözlenen minimal. Her iki görüntüyü kaydedin ve her iki gerinim kimlikleri, çoğalan sayı, görüntü alındığında inkübasyon süresi (örn., 24 saat) dahil etmek için bunları adlandırın. Tüm çoğaltır için tekrarlayın.
    Not: Kokulinasyon süresi farklı plazmids veya bakteriyel türler için ayarlanması gerekebilir. Optimizasyon için tartışma konusuna bakın.

4. veri analizi

  1. Her zaman noktasında her kontrol ve deneysel tedavi için CFUs hesaplaması (T başlangıç ve T Final)
    1. Koloniler seri seyreltme plakaları üzerinde görünürken (örn., V. fischeriIçin 24 °c ' de 24 saat), bireysel kolonilerin sayılması ve büyük, çok kolonik kümeleri içine birlikte yetişmesi olmayan seyreltme faktörünü belirleyin (Şekil 2B). Her çoğaltma için, saymak ve belirli bir seyreltme için bireysel kolonilerin sayısını kaydedin. Bu sayı, çoğaltma için CFUs temsil eder.
    2. Aşağıdaki formülü kullanarak kokulinasyon her gerilme için toplam CFUs seyreltme için CFUs dönüştürün:
      [CFUs ÷ (seyreltme faktörü x cilt. seyreltme spot)] x cilt. seyreltilmemiş örnek = Toplam CFUs
      Örnek: T0: [(6 CFUs) ̧ (10 ^-6 x 0,005 mL)] x [0,01 mL] = 1.2 E7 toplam CFUs gerilme 1 deneme başlangıcında karışık noktada
      T5: [(4 CFUs) ̧ (10 ^-3 x 0,005 mL)] x [1,0 mL] = 8.0 E5 toplam CFUs gerilim 1 ' den sonra karışık nokta 5 h kokuluzlama
      Her zaman noktasında her gerinim için CFU değerleri, birkaç farklı analizler ve istatistiksel testler için kullanılabilecek ham verilerdir (aşağıda bölüm 4,2 bakın).
  2. Bir rakip gerinim tarafından referans gerinimi outcompetes olup olmadığını belirlemek için aşağıdaki veri dönüşümleri gerçekleştirin: (i) referans gerinim oranının rakip gerilme varlığını azaltıp azalmayacağını belirleme veya (ii) göreli rekabetçi indeksi (RCI) günlüğe yazılır. Bu analizler ham verileri oranlarına dönüştürecektir ve bir etkileşimin rekabetçi sonucunu belirlemek için yararlı olabilir, ancak rekabetin mekanizmasını belirleyemez (yani, büyüme inhibisyonu ile öldürme).
    1. Kokuleleme sırasında her zaman noktası için her gerinim oranını hesaplamak
      1. Bir tedavi her gerinim oranına CFU veri dönüştürün. T0 adresindeki referans gerinim (RS) için, t0 adresinde bulunan başvuru gerinim için toplam CFUs toplamı ve T0 adresindeki rakip (CS) için toplam CFUs toplamını bölün:
        RST0 CFUs ÷ (RST0 CFUs + CST0 CFUs) = referans gerilme oranı T0.
        T0 adresindeki rakip gerginliği oranını belirlemek için aynı hesaplaması gerçekleştirin:
        CST0 CFUs ÷ (RST0 CFUs + CST0 CFUs) = T0 adresinde referans gerinim oranı
        Her zaman noktası için bu işlemi tekrarlayın ve hem deneysel tedavi ve kontrol tedavisi için çoğaltmak (farklılaşarak etiketli referans gerinim kokuluçla).
      2. Bir yığılmış çubuk grafikte T0 ve T5 her gerinim türü ortalama oranını grafik (Şekil 3A).
      3. Suşların istenilen başlangıç oranının elde edildiğinden emin olun. Suşların başlangıçta 1:1 karışık olduğu kokulinasyonlar için, her bir gerinim türü T0 'de nüfusun ~ 0,5 ' i içermelidir ve bir öğrencinin t-testi (P > 0,05) kullanarak birbirinden istatistiksel olarak farklı olmamalıdır. Bir gerinim oranı T0 adresindeki diğer gerilimin değerinden önemli ölçüde büyükse, 1:1 başlangıç oranı elde edilinceye kadar deneyi tekrarlayın.
      4. Rakip gerinim, 5 saat sonra nüfusun önemli ölçüde daha büyük bir oranını içerir olup olmadığını belirleyin. T0 ve T5 'de deneysel tedavide her bir gerilimin oranını karşılaştırarak bir öğrencinin t-testi gerçekleştirin. Eğer rakip gerginlik oranı T5 (P < 0,05) ' deki referans gerinminden önemli ölçüde farklıysa, bu sonuç gerinim yarışmasının oluştuğunu göstermektedir. Adım 4.2.1.5 devam edin.
      5. Rakip gerinim varlığının 5 saat sonra referans gerilme oranını azaltıp indirmediğini belirlemek için, bir öğrencinin t-testini, kontrol içindeki referans gerilimin oranını, deneysel tedavi (referans strain v rakip gerilme).
        Not: kontrol (P < 0,05) ile göreli olarak deneysel tedavide referans gerinim oranı istatistiksel olarak düşükse, rakip gerinim 5 saat sonra referans gerinimin oranını önemli ölçüde azalttı ve referans gerilme outcompeted.
    2. Her tedavi için günlük RCI değerini hesaplama (denetim dahil)
      Not: Göreli rekabetçi dizin veya RCI, gerinim türlerinin bitiş oranının başlangıç oranından nasıl farklı olduğunu karşılaştıran tek bir değerdir. RCI değeri, bir günlük RCI değeri sıfırdan büyük rakip gerinim (CS) başvuru gerinim (RS) outcompeted, bir günlük RCI değeri sıfırdan küçük olduğunu gösterir günlük dönüştürüldüğünde, referans gerinim rakip gerilme outcompeted ve bir günlük RCI sıfır değeri, ne gerilme outcompeted gösterir.
      1. Her denetim ve deneysel tedavi için aşağıdaki denklemin kullanıldığı günlük RCI değerlerini hesaplayın:
        Log [(CST5 CFU ̧ RST5 CFUs) ̧ (CST0 CFU ̧ RST0 CFUs)] = RCI günlüğü
      2. Verileri yatay yönde grafikli olduğu ayrı bir kutu & bıyık Plot kullanarak grafik günlük RCI değerleri (Şekil 3B).
      3. Her tedavi (denetim dahil) her tedavinin günlük RCI değerlerini karşılaştırmak için bir öğrencinin t-test gerçekleştirerek sıfırdan önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek tüm sıfır değeri ile aynı sayıda çoğaltır karşılaştırarak bir veri kümesi. Deneysel tedavi için günlük RCI değerleri sıfırdan istatistiksel olarak büyükse (P < 0,05), rakip gerinim referans gerinimi aşmış olur.
        Not: Denetim istatistiksel olarak sıfırdan farklı olmamalıdır (P > 0,05), çünkü farklılaşarak etiketli referans sustları isogenic.
      4. Deneysel tedavi için günlük RCI değerlerinin denetimden önemli ölçüde daha büyük olup olmadığını belirlemek için bir öğrencinin t-testi gerçekleştirin (P < 0,05). Deneysel tedavinin günlük RCI değerleri kontrol tedavisinden istatistiksel olarak büyükse, rakip gerinim referans gerinliği aşmış olur.
  3. Rakip gerilimin referans gerinliği outcompetes mekanizması belirlemek için aşağıdaki istatistiksel analiz gerçekleştirin: (i) ham toplam CFU verileri analiz veya (ii) referans gerinim yüzde kurtarma inceleyin. Bu analizler daha hantal Bu adım 4,2 göre görüntülemek için olabilir, ancak rakip gerinim onu büyüyen tarafından referans gerinim outcompetes olup olmadığını belirlemek, referans gerinim büyümesini inhibe, ya da aktif referans gerinim ortadan kaldırmak.
    1. Ham toplam CFU verilerini analiz etme
      1. Çoğaltır bireysel veri noktaları (Şekil 4A) olarak gösterilen bir Interleaved dağılım çizim kullanarak her iki suşları için ham toplam CFU veri grafiği. Günlük ölçeği üzerinde verileri görüntüler ve her iki suşları için Ortalama T0 CFUs gösteren bir yatay çizgi ekleyin.
      2. Rakip gerinimin varlığının referans gerginliği olumsuz yönde etkilediğini belirlemek için T5 'deki kontrol ve deneysel tedaviler için bir öğrencinin t-test karşılaştırması referans gerinim CFUs gerçekleştirin. Deneysel tedavide referans gerinim CFUs, kontrol alanında istatistiksel olarak daha düşüktür (P < 0,05), sonra rakip gerinim varlığı referans gerinimi önemli ölçüde etkiledi.
      3. Rakip gerinmenin varlığının, referans geriliminin büyümesini ya da ortadan kaldırılıp giderilmediğini belirlemek için, kontrol ve deneysel tedaviler için T0 ve T5 'deki referans gerinim CFUs 'ı karşılaştırarak bir öğrencinin t-testi gerçekleştirin.
        Not: Bir rakip yokluğunda, başvuru gerinim CFU karşılaştırırken önemli bir artış göstermelidir T0 ve T5 denetim tedavisi için. Deneysel tedaviyi analiz ederken, T5 'de referans gerinim CFUs, t0 (P > 0,05) ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak farklı değilse, rakip gerinim referans geriliminin büyümesini engellenir. Referans gerinim T5 CFUs, t0 CFUs (P < 0,05) ' dan önemli ölçüde düşüktür, ardından rakip gerinim referans gerinimi öldürdü.
    2. Referans gerilimin yüzde kurtarmasını hesaplama
      1. Referans gerinim (RS) için toplam CFU verilerini, aşağıdaki denklemin kullanıldığı yüzde kurtarma verilerine dönüştürün:
      2. (RST5 CFUs ̧ RST0 cfus) x 100 =% referans gerilme kurtarma
      3. Her çubuk denetim veya deneysel tedavi temsil eden ayrı bir çubuk grafik kullanarak referans gerinim yüzde kurtarma görüntüleme (Şekil 4b). Referans gerinim 100% kurtarma belirtmek için y = 100 bir kesikli çizgi ekleyin (0 h ila 5 h referans gerinim CFUs hiçbir artış veya azalma).
      4. Rakip gerinmenin referans gerginliği olumsuz etkilemiştir olup olmadığını belirlemek için, deneysel tedaviye kontrol tedavisi için bir öğrencinin t-testi karşılaştırma referans gerinim yüzde kurtarma gerçekleştirin. Yüzde kurtarma denetimi (P < 0,05) önemli ölçüde küçüktür, sonra rakip gerinim referans gerinim olumsuz etkiledi.
      5. Rakip gerginliği referans geriliminin büyümesini engeller veya ortadan kaldırıp kaldırmayacağını belirlemek için, deneysel tedavi için bir öğrencinin t-test karşılaştırma referans gerinim yüzde kurtarma ve aynı sayıda çoğaltır ile bir veri kümesi gerçekleştirmek bir 100 değeri.
        Not: Deneysel tedavi 100 'den (P > 0,05) istatistiksel olarak farklı değilse, rakip gerinim referans gerinmenin büyümesini engellenir. Deneysel tedavinin referans gerinim yüzdesi kurtarma 100 'den (P < 0,05) önemli ölçüde düşükse, rakip gerinim referans gerinimi öldürdü.
    3. Floresan mikroskopisi görüntülerini yorumlama
      1. Floresan mikroskopinin görüntüleri alındığında, her bir gerilimin kokuluzasyon noktasında gözle görülür şekilde algılanabilir olup olmadığını belirleyin. Kontrol kokuleleme (referans gerinim pVSV102 + referans gerinim pVSV208) için, hem GFP ve RFP bir kokuluçu noktadan görünür olmalıdır. Bu durumda değilse, suşların düzgün etiketlenmesini ve antibiyotik içermeyen plakalar üzerinde kokuleli olmasını sağlamak için deneyi yeniden ayarlayın.
      2. Her deneysel kokuleleme Spot için, olası sonuçları kontrol edin.
        Not: Rakip gerinim görünüyorsa, ancak referans gerinim algılanmazsa, bu da referans geriliminin büyümesini öldüren veya etkisiz hale gelen rakip zorluğu gösterir. Her iki suşları mevcut ve eşit karışık (GFP ve RFP kokuluzasyon spot boyunca mevcut ise), bu veriler rakip gerinim referans gerilme ile rekabet etmez ve her iki suşları bir arada olduğunu düşündürmektedir. Her iki suşları mevcut ama dağınık olan (ya GFP veya RFP mikrokoloniler kokuluzlama spot boyunca mevcut), bu referans gerinim ve rakip gerinim rekabetçi etkileşimler ve değişiklikler çekici olabilir öneriyor referans gerinim veya ilk kokuluzasyon oranı gerekebilir. Daha fazla ayrıntı için tartışma konusuna bakın.

5. etkileşimin bağlantıya bağlı olup olmadığını belirleme

Not: Eğer bir gerginlik öldürür veya referans gerilimini inhibe bulursanız, etkileşim diffusible veya temas bağımlı olabilir. Etkileşim hücre hücresi ilgili kişiye bağımlı olup olmadığını belirlemek için aşağıdaki değişiklikler ile 1-2 adımları için yukarıda açıklandığı gibi bir kokuluçka tahlil gerçekleştirin.

  1. 1,1-2.2 arasındaki adımları gerçekleştirin.
  2. Suşlar normalleştirilmiş bir kez, 0,22 mm gözenek boyutuna sahip bir nitroselüloz filtre kullanarak fiziksel olarak ayrı suşları. Bu gözenek boyutu antimikokarlar ve küçük moleküllerin difüzyon sağlar ama V. fischeri hücreleri arasında fiziksel temas önler.
    Not: Etkileşim hücre hücresi temas bağımlıdır ise, filtre ile rakip gerinim referans gerinim ayrılması öldürme veya inhibitör fenotipi ve referans gerinim CFUs azaltılmış olmamalıdır abrogate gerekir. Etkileşim hücre hücresi temas bağlı değilse ve diffusible bir mekanizmadır, suşları ayırarak referans gerinim öldürme rakip gerinim engellemelisiniz.
    1. Referans gerilimin 5 mL değerini bir filtrenin ortasına yerleştirin ve rakip gerilimin 5 mL 'yi farklı bir filtrenin ortasına yerleştirin. Referans gerinimi içeren filtreyi LBS agar plakasının yüzeyine yerleştirin. Rakip gerilimi içeren filtreyi, referans gerinim ile doğrudan filtrenin üstüne yerleştirin.
      Not: Her gerinim daha kolay doğrudan birbirlerine üzerine yerleştirilebilir böylece suşları doğrudan agar plaka üzerine tespit alt gerinim yerine filtreler üzerine tespit edilir.
    2. Suşların doğrudan birbiri üstüne yığılmış olmadığından endişe varsa, filtre üzerine tespit edilen referans gerinim inokulumunu hacmini azaltın. Bu, referans gerinim noktasının alanının rakip gerilimin üzerinde veya altında tam olarak daha küçük olmasını sağlayacaktır. Agar ortamından besinlerin difüzyon farklılıkları hesaba üst ve altta hangi gerinim alternatif.
    3. Filtre küçük moleküllerin difüzyon için izin sağlamak için, referans gerinim bir filtre üzerine tespit edilir ve (chloramphenicol) duyarlı bir antibiyotik diğer üzerine tespit edilir bir kontrol tedavisi içerir. Bir LBS agar plaka üzerinde doğrudan birbirlerine ve yer üzerine filtreleri yığını. Antibiyotik filtre aracılığıyla diffün muktedir ve referans gerinim öldürmek gerekir.
  3. 5 saat boyunca 24 °C ' de filtreler ile tabakaları inküt. Filtreleri hareket ettirmemek için kulyatan agar plakasını ters çevir etmeyin.
  4. 2,4 adıma göre başlangıç inokulumunu için seri dilüsyonlar gerçekleştirin.
  5. T final ölçümlerini alma
    1. Steril Cımbız kullanarak, bir 50 mL Falcon tüp 5 mL LBS suyu içeren her filtre kümesini aktarın. Her bir gerinim türünün tam Resuspension için izin vermek için filtreler fiziksel olarak tüp içinde ayrılmış olduğundan emin olun.
    2. Filtreleri tüm hücrelerden temizleninceye kadar yukarı ve aşağı pipetleme tarafından filtrelerden suşları resuspend. Her iki taraftan filtreleri ve temiz hücre malzemesi döndürmek için cımbız kullanın. Numune arasında etanol ile cımbız sterilize.
    3. Adım 2,5 göre T final için seri seyreltme gerçekleştirin. T final için toplam CFUs hesaplanırken, 1 mL 'den 5 mL 'ye "seyreltilmiş numunenin toplam hacmi" ayarını yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bakteriyel nüfus arasında rekabetçi etkileşimleri değerlendirmek için, bir kokulerasyon tahlil Protokolü geliştirilmiştir ve V. fischeriiçin optimize edilmiştir. Bu yöntem, antibiyotik direnci genler ve floresan proteinleri kodlayan istikrarlı plazmids kullanır, diferansiyel seçimi ve her gerinin görsel ayrımcılık için izin. Coinkübasyon testinden toplanan verileri analiz ederek, bir etkileşimin rekabetçi sonucu ve etkileşimin mekanizması tespit edilebilir. Örneğin, aşağıdaki deneyler V. fischeri ısolates kullanılarak yapılmıştır. Kokuleli suşlar iki kararlı plazmdan birini harbored: pVSV102 kanamyisin direnci ve Gfp + veya pVSV208 ifade kloramfenikol direnci ve DSRed +. Numune verilerinde, suşlar 1:1 oranında karışık ve LBS agar plakaları üzerinde 5 h için inkübe edildi. Bir kontrol tedavisi olarak, referans gerinimin farklılaşmış etiketlenen versiyonları birbirleri ile kokuluzlanmış. Deneysel tedaviler referans gerinim (pVSV102) ve rakip Strain 1 veya rakip Strain 2 (pVSV208) ile yapılmıştır. Her bir gerinim kültürleri hazırlanmış ve yukarıda açıklandığı gibi ve Şekil 1 ve Şekil 2' de gösterildiği gibi kokuluzlu.

Şekil 3' te, rakip gerilme 1 veya 2 ' nin referans gerinim iki şekilde sunulup gösterilmediğini belirlemek için veri analiz edilmiştir. Şekil 3A'da, deneme sırasında her zaman noktası için her gerinim türünün oranı 4.2.1 adıma göre hesaplanmıştır. Deneysel tedavilere göre, örnek veriler, referans gerinim ve rakip gerinim 1 ' in başında (0 saat) 0,5 bir oranda mevcut olup, deney, kontrol tedavisinde gözlenen ile tutarlı olan son (5 saat). Bu veriler, 5 h kokulinasyon sonra değişmemiştir suşların oranını göstermek ve bu nedenle hiçbir rekabet gözlenen. Buna karşılık, referans gerinim rakip gerilme 2 ile inkübe edildiğinde, referans gerinim başında 0,5 bir oranı (0 h) ve bir oranı < 0.01 sonunda (5 h) deneme, hangi kontrol daha önemli ölçüde daha düşük oldu tedavi (öğrencinin t-testi: P < 0,001). Bu veriler, referans gerinim oranının rakip gerinim 2 ' nin varlığını azaltmadığını ve bu nedenle rakip gerinim 2 ile referans gerinim arasında rekabet önerdiğini gösterir. Bu tür analizler, bir topluluğun içindeki suşların oranının zaman içinde nasıl değiştiğini ancak rekabetçi etkileşimin mekanizmasını belirlemek için kullanılmadığını belirlerken ve bu nedenle ek analiz ile birleştirilmeli şekilde uygulanmalıdır. Örneğin, rakip gerinim 2 ' nin varlığını azaltan referans gerinim oranı, çeşitli etkileşimlere atfedilebilir: (i) gerinim 2 referans Gerinmeden daha hızlı büyüdü, (ii) gerinim 2 referansın büyümesini engellenir veya (iii) gerinim 2, başvuru gerilmesini öldürme yoluyla ortadan kaldırmıştır.

Şekil 3B'de, günlük göreli rekabetçi Endeksi (RCI) her tedavi için adım 4.2.2 göre hesaplanır. Referans gerinim rakip gerilme 1 ile inkük edildiğinde, günlük RCI değerleri sıfır veya kontrol tedavisinden istatistiksel olarak farklı değildi (P > 0,05), suşlar arasındaki rekabeti gözlemlenmemiştir. Referans gerinim rakip gerinme 2 ile birlikte geldiğinde, günlük RCI değerleri sıfırdan önemli ölçüde büyüktür ve kontrol tedavisi (öğrencinin t-testi: P < 0,001). Bu veriler, Strain 2 ' nin referans gerinimi aşmasını önerir. Günlük RCI değerlerini analiz etmek, inkübasyon döneminde bir gerilimin diğeri tarafından aşılmış olup olmadığını belirlemek için basit bir yöntem sağlar. Bu analiz sonunda suşların oranını (5 saat) ve denemenin başlangıcını (0 h) içerir çünkü başlangıç oranı sonucu önemli ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, başlangıç oranı incelenmelidir ve günlük RCI verilerinden sonuçlar türetmek zaman kabul. Ayrıca, bu analiz rekabetçi mekanizma hakkında bilgi sağlamaz ve sadece inkübasyon sırasında suşların oranı nasıl değişecektir raporlar.

Şekil 4 , belirli bir etkileşim için rekabet mekanizmasını belirlemek üzere iki veri analizi yöntemini görüntüler. Şekil 4A'da, denemenin her zaman noktasında her gerinim Için toplam CFUs görüntülenir. Referans gerinim rakip gerinme 1 ile birlikte geldiğinde, her iki suşın CFUs 5 saat boyunca artmasına ve referans gerinim için CFUs 'a 5 saat (P > 0,05) gerilme 1 ' den veya kontrolden önemli ölçüde farklı değildi. Bu veriler, referans gerilimin 1. gerilme varlığı içinde büyüdüğünü ve hiçbir rekabetin oluşmadığını göstermektedir. Ancak, referans gerinim rakip gerinim 2 ile inkübe edildiğinde, 5 saat sonra gerilme 2 CFUs arttı ancak referans gerinim için CFUs azaldı. Referans gerinim CFUs 2 CFUs ve kontrol 5 h (öğrenci t-test: P < 0,002) gerilimden önemli ölçüde düşüktür. Bu veriler, başvuru gerinim CFUs gerilme 2 varlığında azalma olduğunu gösterir ve Strain 2 referans gerinim hücrelerini öldürür önerir. Referans gerinim CFUs bir azalma göstermiyor, ancak yerine hiçbir değişiklik (0 h ve 5 h referans gerinim CFUs arasında istatistiksel fark), bu veriler Strain 2 önermek olacaktır referans gerinim büyümesini inhibe ederek referans gerinim outcompeted. Dönüştürülmemiş toplam CFU verileri analiz özellikle bilgilendirici, her iki suşları için CFUs her zaman noktasında bağımsız olarak görüntülenir ve rekabet mekanizması tanımlamak için kullanılabilir.

Şekil 4b , bir rakip gerinin varlığının başvuru gerinmesini nasıl etkilediğini belirlemek için referans gerinimin yüzde kurtarılmasını gösterir. Referans gerinim rakip gerilme 1 ile inkübe edildiğinde, bir ~ 3.200 yüzde kurtarma gözlenen, hangi istatistiksel kontrol farklı değildi ve gerginlik 1 referans gerinim yüzde kurtarma etkilemez gösterir. Referans gerinim rakip gerilme 2 ile inkübe edildiğinde, kontrolden önemli ölçüde daha düşük olan ~ 4 yüzde iyileşme gözlendi (öğrencinin t-testi: P < 0,002). Yüzde kurtarma da önemli ölçüde daha az 100 (öğrenci t-testi: P < 0,002), gerginlik 2 referans gerinim hücrelerini öldürme tarafından referans gerinim outcompeted gösteren. Yüzde kurtarma istatistiksel olarak 100 farklı değilse, bu veriler gerinim 2 başvuru gerinim büyümesini engellenir önerir. Yüzde kurtarma verileri, referans gerinim popülasyonunun rakip gerinim varlığına nasıl yanıt verdiğini inceleyerek rekabet mekanizmasını karakterize etmek için basitleştirilmiş bir yol sağlar. Bununla birlikte, verileri bu şekilde görüntülemek, başlangıç oranının yanı sıra rakip gerinlik zenginliğini kuluçş boyunca nasıl değiştirdiği hakkında bilgi içermez.

Figure 1
Şekil 1: kokuluçik tahlil gösteren akış şeması. (A) ya PVSV102 (Ref. strain veya ICF) veya pVSV208 (referans gerinim, comp. strain veya CS) tarafından gösterilen (rakip gerginliği) ya da referans GERILME (lbs kan) için ortam seçici olarak yetiştirilen veya Gerilim (LBS cam). Suşlar daha sonra LBS suyunda resuspended ve bir OD = 1,0 normalleştirilmiş. (B) referans gerinim ve rakip gerilme hacmi 1:1 bir oranda karıştırılır. Bir seri seyreltme, her iki suşlar için CFUs belirlemek için bu karışımı ile gerçekleştirilir 0 h. (C) gerinim karışımı daha sonra lbs agar içeren 24-kuyu plakaları üzerine tespit edilir. Her çoğaltma kendi kuyunda tespit edilir. Spotlar kuru ve sonra 24 °C 5 h için inkübe izin verilir. 5 saat sonra, her bir gerginlik için CFUs ölçmek için bir seri seyreltme gerçekleştirilir. (D) panel B 'den gelen gerinim KARıŞıMı Ayrıca lbs agar Petri plakalarının kuru ve 24 °c ' de 24 saat boyunca inküt edilmesine izin verildi. 24 saat içinde, kokulat spot yeşil (referans gerinim) ve kırmızı (rakip gerilme) floresans algılamak için uyarlanmış bir floresan diseksiyon mikroskop kullanılarak görüntülenmiş. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 2
Şekil 2: seri seyreltme için gerekli plakaların temsili görüntüleri. (A) 96-kuyu plakası seri seyreltme gerçekleştirmek için kullanılır. Plaka, 12 satır ve 8 sütun olduğu gibi döndürülür. Her bir tedavinin tanımlayıcıları, kullanılan suşları ve limandaki plazmids (örn., pVSV102 ile referans gerinim ve pVSV208 ile rakip gerilme) ve her satır için çoğalan sayı (R1, R2, R3 veya R4) içerir. İlk sütun seyreltilmiş örnek ve sağdaki her sütun, önceki sütundaki 10 kat seyreltme (yukarıda listelenen seyreltme faktörü) temsil eder. (B) lbs agar Plate, lbs kan plakaları (üst) ve rakıp gerilim lbs cam plakaları (alt) üzerinde referans strain Için CFUs belirlemek için kullanılan deneysel tedavi. Her satır bir tedavi (örneğin, R1) bir çoğaltır ve her noktanın seyreltme faktörü plakanın üst kısmında listelenir. Her çoğaltma için sayılan CFUs sayısı sağdaki listelenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: rakip suşlarının referans gerinim üzerinde rekabet olup olmadığını değerlendirmek Için örnek veriler. (A) pVSV102 (koyu gri) veya pVSV208 (açık gri) barındıran coinkulasyon suşlarının oranı. BT, referans gerilimi ve BT 'nin rakip gerginliği gösterir. Kesikli yatay çizgi 0,5 bir oranını gösterir. Asterisk, 5 h (öğrencinin t-test: P < 0,001) kontrol içinde rakip gerinim veya referans gerinim daha nüfus istatistiksel olarak daha küçük bir oranı yapılan referans gerinim gösterir; NS önemli olmadığını gösterir (P > 0,05). (B) kokulaşlama için göreli rekabetçi indeksi (RCI) günlüğe yazılır. Kesikli dikey çizgi günlük RCI = sıfır gösterir. Asterisk günlük RCI değeri sıfır ve denetim (öğrencinin t-testi: P < 0,001) istatistiksel olarak büyük olduğunu gösterir. Hata çubukları SEM 'i gösterir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 4
Şekil 4: rekabet mekanizmasını belirlemek Için örnek veriler. (A) PVSV102 veya pVSV208 ile farklılaşarak etiketlenen V. fischeri izolatlar ile gerçekleştirilen kokulerasyon için toplam CFU sayar. CFUs deney başında toplandı (0 h) ve sonra 5 h kuluçk. BT, referans gerilimi ve CS rakip gerilimi gösterir. Kesikli yatay çizgi ortalama 0 h CFUs her iki suşları için gösterir; yıldız işareti, referans gerinim gösterir CFUs, 5 saat içinde kontrol tedavisine göre deneysel tedavide istatistiksel olarak daha düşüktür (öğrenci t-testi: P < 0,002). (B) referans gerilimin yüzde kurtarma. Yatay kesikli çizgi% 100 kurtarma gösterir (CFUs 'ta artış veya azalma yoktur); yıldız işareti yüzde kurtarma istatistiksel olarak daha düşük olduğunu gösterir% 100 ve kontrol tedavisi (öğrenci t-testi: P < 0,002). Hata çubukları SEM 'i gösterir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 5
Şekil 5: inkübasyon süresi ve görüntüleme optimizasyonu Için örnek veriler. (A) coinkübasyon Için toplam CFUs, CFUs 'un denemenin başında (0 saat), 5, 12 ve 24 saat kuluçktan sonra toplanmasını sağlar. BT, referans gerilimi ve C. S. 2 ' nin rakip gerginliği 2 olduğunu gösterir. Kesikli yatay çizgi ortalama 0 h CFUs her iki suşları için gösterir; yıldız işaretleri referans gerilme gösterir CFUs, belirli bir zaman noktasında kontrol tedavisine göre deneysel tedavide istatistiksel olarak daha düşüktü (öğrencinin t-testi: P < 0,002). Hata çubukları SEM 'i gösterir. (B) PANELDEKI CFU verilerine karşılık gelen floresan mikroskopisi görüntüleri A. ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın .

Figure 6
Şekil 6. Kokuluçlama oranı optimizasyonu için örnek veriler. PVSV102 (yeşil, üst sıra) ve pVSV208 (kırmızı, alt satır) ile rakip gerilme (CS) ve Floresan Mikroskobu görüntüleri 24 h. (A) suşlarında alındı bir 1:1 oranı veya (B) pVSV102 içeren referans gerilimin pVSV208 içeren rakip gerilme tarafından sayılmış olduğu bir 1:5 oranı karıştırıldı. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıda açıklanan kokuluzasyon tahlil interbakteriyel rekabet keşfetmek için güçlü bir yöntem sağlar. Bu yaklaşım, V. fischeri izolatlar ve rekabetçi mekanizma19karakterizasyonu arasında intraspecific rekabetin tanımlanması için izin. Tanımlanan yöntem Marine bakteri V. fischeriiçin optimize edilmiştir rağmen, kolayca klinik ve çevresel izolatlar dahil olmak üzere diğer bakteriyel türler yerleştirmek için değiştirilebilir. Rekabetçi mekanizmaların genellikle şartlı olarak düzenlenmiş olduğunu dikkate almak önemlidir5,6,23,24,25,26,27 , 28, böylece büyüme koşullarında küçük farklılıklar (örneğin, ayakta kültür, sıcaklık, vb sallayarak) ve medya türü (örneğin, tuz içeriği) önemli ölçüde sonuçları etkileyebilir. Bu nedenle, kokuluçlama koşullarını optimize etmek, farklı bakteriyel türlerin yanı sıra farklı rekabetçi mekanizmalar için de gereklidir. İzolatlar doğal ortamını yakından yansıtan kültür koşullarını seçmek en iyisidir. Örneğin, V. fischeri suşları arasında, deniz ortamının tuzluluk ve sıcaklığını yansıtacak şekilde, 24 °c ' de lbs medyası ile yapılan kokulerasyon tespit edilmiştir. Ancak, bazı bakteriler doğal olarak çevreye yetkin olan27,28 ve bu nedenle antagonistik etkileşimler sırasında lysed hücreler tarafından yayımlanan genetik malzeme alabilir29. Bu tür DNA transferini önlemek için kokulinasyon sonuçlarını etkilemeden, doğal olarak veya DNA alımını makinelerinin inaktivasyonu yoluyla, yetkin olmayan yetkinlikleri veya suşları teşvik etmeyen koşulları kullanmak önemlidir. Dahası, hücre büyüme aşaması, kültür yoğunluğu, kuluçş süresi veya başlangıç gerinim oranı gibi deneysel parametreler de farklı bakteriyel türler veya rekabetçi mekanizmalar için optimizasyon gerektirebilir. Örneğin, ilk kültür yoğunluğu, bakterilerin rakiple temas bağımlı mekanizmaları dağıtmak için yeteneğini etkileyebilen suşları arasında hücre hücresi teması miktarını dikte edecektir.

Şekil 5A , V. fischeri izolatlar ile kokuluçlama prosesi optimizasyonu sürecini görüntüler. Burada, CFU toplama ve Floresan Mikroskobu görüntüleme için bir dizi inkübasyon süreleri, her metriğin toplanması için en uygun zamanı belirlemek üzere değerlendirildi. CFUs, referans gerinim ve rakip gerginliği 2 ' nin karışımı LBS agar plakaları (0 h) üzerine tespit edildikten sonra hemen toplandı ve CFU ölçümleri ve floresan mikroskopisi görüntüleri 5, 12 ve 24 saat sonra alındı. Bu örnek veriler, iki suşlar arasındaki etkileşimle ilgili herhangi bir sonuç çıkarmadan önce tam optimizasyon önemini vurgulamaktadır. Örneğin, etkileşimin mekanizmasıyla ilgili iki farklı sonuç CFUs 'un ne zaman toplanmasına bağlı olarak çıkarılabilir: 5 veya 12 h 'den gelen CFUs, başvuru gerilimini öldüren 2 ' den sonra CFUs 24 saat içinde toplanan gerilme 2 ' nin büyümesini inhibe eder başvuru gerinim.

Floresan Mikroskobu ile kokuluçum lekeleri görselleştirme için optimum zaman CFU toplama için optimum zamandan farklı olabilir. Şekil 5B , 0, 5, 12 ve 24 saat arasında kokuluçlu lekeler floresan mikroskopisi görüntülerini görüntüler. 0 ve 5 h 'de, kokuluçlama lekeleri floresan mikroskobu ile görünmez. 12 saat içinde çekilen görüntüler için, kontrol tedavisinde her iki suşları görülebilir, henüz RFP (referans gerinim pVSV208) özellikle dimmer. Deneysel tedavide 12 h, rakip gerinim 2 görünür (henüz loş) ve referans gerinim algılanabilir değildir. Bakteriyel izolatlar arasındaki gerilime özgü farklar floresan proteinleri ifade etkileyebilir, ve böylece karışık noktada hücrelerin parlaklığı. RFP kontrolde GFP 'den özellikle daha dimmer olduğu için, kokulayma lekeleri daha sonra tekrar görüntülenmiş ve inkübe edilmeye devam etmelidir. 24 saat içinde çekilen görüntülerde, her iki suşlar görünürde algılanabilir ve kontrol denemede benzer bir parlaklıkta. Deneysel tedavi gerinim 2 görünür iken referans gerinim kokuluzasyon spot içinde gözlenmemiştir. 15-24 h kuluçk süresi sırasıyla istikrarlı plazmids pVSV102 ve pVSV208 kullanarak GFP ve RFP için V. fischeri görselleştirmek için yeterlidir, ancak kuluçk süresi farklı plazmids veya bakteriyel türler için ayarlanması gerekebilir. CFU veri toplama ve coinkübasyon noktalar görselleştirme için en uygun süre farklı olsa da, görüntüleme 24 saat hızlı bir şekilde V. fischeriiçin etkileşimleri ekran için iyi bir yoldur, çünkü sonuç 24 saat (hedef görülebilir ya da değil) görüntüleme elde 5 veya 12 saat içinde CFD kaplama ile elde edilen daha zaman yoğun nicel verileri yansıtır.

Başlangıç oranı, özellikle iki inhibitör suşları inküt ve verimliliği veya büyüme hızını öldürme gerilme spesifik farklar için hesaba ayarlanması gerekebilir, sonuçları önemli ölçüde etkileyebilir. Örneğin, Figure 6a , referans gerinin kendisi (kontrol) ve 1:1 oranında başlayarak diğer üç V. fischeri izolat ile kokulerinde olduğu deneylerin floresan mikroskopisi görüntülerini görüntüler. Bu örnek verilerde, referans gerinim, kendisi, rakip gerinim 1 ve rakip gerinim 3 ile 24 saat sonra inküle edildiğinde gözle görülür bir şekilde algılanır. Ancak, başlangıç oranı 1:5 olarak ayarlandı (yani, 50 ml referans gerinim ile karışık 250 ml rakip gerinim) referans gerinim sadece gözle görülür olarak kendisi ve Strain 1 ile Co başvuru gerinim. Bu ayar, referans geriliminin daha hızlı büyüme hızını rakip suşları tarafından sergilenen herhangi bir girişim rekabet mekanizmasının etkisini engellemekten önler. Şekil 6asonuçları dayanarak, 1:5 bir oranı (referans gerinim: rakip gerinim) referans gerinim öldürmek için yeteneği ek V. fischeri suşları ekrana kullanılmalıdır.

Bu protokol, kanamisin ya da kloramfenikol direnci genler içeren plazmiler ile farklılaşarak etiketleme suşları tarafından kokulsal suşları arasında ayrımcılık. Ancak, farklı antibiyotikler veya diğer seçim yöntemleri daha iyi farklı bakteriyel türler için uygun olabilir. Diferansiyel seçim için diğer yöntemler içerebilir: 1) belirli büyüme faktörleri (örneğin, DAP veya thymidine), 2) koşullu büyüme gereksinimleri (örneğin, bir gerinim 37 °C ' de büyür), ya da 3) bir gerinim/türe özgü eotrofi sömürüyor "Kill" geni (örn. CCDB veya sacb) ifade etmek için uygun koşullarda yetiştirilen etiketli gerilimin büyümesini ortadan kaldıran veya inhibe eden counterselection işaretçileri.

Uygun referans gerinim seçilmesi, kokuluzasyon testinden tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek ve yorumlamak için önemlidir. Bir referans gerinim iyi incelenmelidir (yani, bilimsel literatür geniş bir gövdeye sahip), hiçbir belirgin öldürme veya inhibitör yeteneği var, ve ideal bir sıralı genom var. Örneğin, Escherichia coli 'nin bazı suşları birçok bakteriyel kokuluçu deneyi için ortak referans suşlarıdır30,31. Ancak, E. coli , belirli bir rekabetçi mekanizma veya rakip için ekolojik olarak uygun olmayabilir, bu da sonuçları etkileyebilir. Örneğin, bazı bakteriler aynı ekolojik niş için özellikle yakından ilgili türler veya rakipleri hedefleyen mekanizmalar gelişti olabilir ve onların rekabetçi mekanizması bir E. coli referans gerinim karşı etkili olmayacaktır.

Özetle, burada açıklanan yöntem, interbakteriyel etkileşimleri ve rekabeti değerlendirmek için kolayca değiştirilmiş ve sağlam bir yaklaşım sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, çevresel veya Klinik araştırmalarla ilgili bakteriyel yalıtmalara uygulanabilir ve daha önce bilinmeyen veya araştırılması zor olan mikrobiyal etkileşimin çeşitli mekanizmalarını keşfetmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz onların yararlı geribildirim için yorumcular teşekkür etmek istiyorum. A.N.S., Gordon ve Betty Moore Vakfı tarafından Grant GBMF 255,03 aracılığıyla Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı 'na destekleniyordu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8, (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2, (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8, (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6, (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4, (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198, (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12, (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7, (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198, (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25, (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427, (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24, (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25, (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71, (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72, (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287, (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9, (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4, (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80, (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12, (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347, (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82, (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics