肿瘤进展和血管生成的双生物发光成像

Medicine

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Summary

该协议描述了通过双生物发光成像实时监测肿瘤进展和血管生成情况的肿瘤携带小鼠模型。

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Zhang, K., Wang, C., Wang, R., Chen, S., Li, Z. Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (150), e59763, doi:10.3791/59763 (2019).

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Abstract

血管生成作为肿瘤进展的关键环节,已成为抗肿瘤治疗的研究热点和目标。然而,没有可靠的模型来同时以视觉和敏感的方式追踪肿瘤进展和血管生成。生物发光成像具有灵敏度高、特异性强、测量准确等优点,在活成像中具有独特的优势。这里介绍的一个协议,通过注射一个雷尼拉荧光酶标记的鼠乳腺癌细胞系4T1到转基因小鼠与血管生成诱导萤火酶酶表达建立肿瘤小鼠模型。该小鼠模型提供了一个有价值的工具,通过单只小鼠的双生物发光成像,实时监测肿瘤进展和血管生成。该模型可广泛应用于抗肿瘤药物筛选和肿瘤研究。

Introduction

血管生成是癌症从小,局部肿瘤到更大的,潜在的转移肿瘤1,2进展的一个基本过程。肿瘤生长与血管生成的相关性成为肿瘤学研究领域的重点之一。然而,传统的测量形态变化的方法未能同时监测活体动物的肿瘤进展和血管生成。"

肿瘤细胞的生物发光成像(BLI)是监测肿瘤生长的一种特别合适的实验方法,因为它的非侵入性、敏感性和特异性3、4、5、6.BLI技术基于荧光素酶在排放生物发光时可以催化特定基质氧化的原理。植入的肿瘤细胞中表达的荧光素酶与注射的基质发生反应,这种基质可以通过活的成像系统检测,信号间接反映细胞数或细胞定位在体内6、7的变化。

除了肿瘤生长,肿瘤血管生成(癌症进展的关键步骤)也可以通过BLI技术使用Vegfr2-Fluc-KI转基因小鼠8,9,10可视化。血管内皮生长因子(Vegf)受体2(Vegfr2),一种类型的Vegf受体,主要表达在成年小鼠血管内皮细胞11。在Vegfr2-Fluc-KI转基因小鼠中,萤火虫荧光素酶(Fluc)的DNA序列被敲入内源性Vegfr2序列的第一个外子。因此,Fluc以与小鼠血管生成水平相同的方式表示(显示为 BLI 信号)。为了生长超过几毫米的大小,肿瘤从现有的血管中招募新的血管,这高度表达由肿瘤细胞1的生长因子触发的Vegfr2。这为使用Vegfr2-Fluc-KI转基因小鼠通过BLI非侵入性监测肿瘤血管生成开辟了可能性。

在此协议中,建立了一个带肿瘤的小鼠模型,分别通过萤火虫荧光素酶(Fluc)和雷尼拉荧光酶(Rluc)成像来监测单个小鼠的肿瘤进展和血管生成(图1)。创建 4T1 细胞系 (4T1-RR),通过 Rluc 成像可稳定增长 Rluc 和红色荧光蛋白 (RFP) 来跟踪细胞生长。为了进一步调查血管生成在肿瘤的进展和回归的动态变化,另一个4T1细胞系(4T1-RRT)被创建,表达自杀基因单纯疱疹病毒截断胸腺激酶(HSV-ttk),Rluc和RFP。通过对甘西洛韦(GCV)的分管,HSV-ttk表达细胞被选择性地消融。基于这些细胞系,建立了Vegfr2-Fluc-KI小鼠的肿瘤承载模型,作为连接肿瘤进展和体内肿瘤血管生成的实验模型。

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Protocol

实验必须符合关于将动物用于研究的国家和体制条例。必须获得进行实验的权限。动物的处理和研究的实验程序遵循南开大学动物护理和使用委员会准则,该指南符合国家卫生研究院(NIH)批准的《动物护理指南》。

1. 吕吕路-RFP (RR) 和 LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) 慢病毒包装和生产

注:pLV-RR在启动子EF1+下携带雷尼拉荧光酶(Rluc)和红色荧光蛋白(RFP)的基因序列,而pLV-RRT携带编码Rluc、RFP和单纯疱疹病毒截断胸腺素激酶(HSV-ttk)的基因序列(图 2.

  1. 种子 1 x 106的 293T 细胞每孔进入 6 孔板,并在 37°C 的加湿培养箱中培养 5% CO 2,Dulbeco 的改性鹰培养基 (DMEM) 含有 10% 的胎儿牛血清 (FBS)。
  2. 准备脂体悬浮液:在室温(RT)孵育5分钟后,将7.5 μL的脂体和0.25 mL的最小必需介质(MEM)混合到1.5 mL管中,以均匀地分散脂体。
  3. 准备DNA溶液(DNA-RR):分别,将pLV-RR载体和帮助剂质粒添加到1.5 mL管中的MEM0.25 mL,如表1所述。
  4. 获得脂质体/DNA-RR化合物:轻轻地将DNA-RR溶液加入制备的脂质体悬浮液中,滴滴,在RT孵育20分钟,使DNA粘结到脂质膜上。
  5. 将293T细胞的培养基替换为含有10%FBS的1mL DMEM,并将脂体/DNA-RR化合物轻轻加入293T细胞的培养基。
  6. 在加湿培养箱中孵育5%CO2,在37°C下孵育12~16小时后,用含有10%FBS和100 U/mL青霉素的1mL DMEM将含有293T细胞培养基的脂质体/DNA-RR化合物取代。
  7. 转染后,在加湿培养箱中继续培养293T细胞48小时。然后,收集293T细胞的上清液,在300 x g下将培养基离心5分钟,以颗粒293T细胞。将含有慢病毒-RR(LV-RR)的上清液转移到1.5 mL无菌聚丙烯储存管中,并储存在-80°C。
    注:为了处理重组性扁豆病毒,需要一个生物安全2级(BSL-2)设施。
  8. 重复步骤1.1~1.7,在步骤1.3中使用pLV-RRT载体代替pLV-RR载体,以获得慢病毒-RRT(LV-RRT)。将 LV-RRT 储存在 -80 °C。
    注:在某些情况下,非纯化慢病毒库存可能抑制细胞生长。伦蒂病毒库存可能需要纯化。含有LV-RR或LV-RRT颗粒的慢病毒储存物应分为1.5 mL管(每管1 mL),以避免多个自由解冻周期。

2. 4T1细胞基因表达的LV-RR和LV-RRT慢病毒转导

  1. 种子4T1细胞进入6孔板(5 x 105细胞/孔)和培养与罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)1640培养含有10%FBS在加湿培养箱与5%CO2在37°C过夜。
  2. 从培养板上取出培养基,并将其更换为 1 mL 新鲜 RPMI 1640 介质以及 1 mL 的慢病毒库存(LV-RR 或 LV-RRT)到每个孔。加入8μg/mL多宝仁,通过上下移液,轻轻混合含有慢病毒颗粒的介质。
    注:请注意,该介质含有慢病毒颗粒,可转导人体细胞。
  3. 在1000 μg的离心机中旋转转导溶液,在RT下旋转60分钟,帮助提高转导效率。离心后,培养4T1细胞4~12小时,并在37°C下用5%CO2的加湿培养箱中维持。
    注:对于某些细胞系,聚二苯乙烯可能对长期培养有毒。因此,不同细胞的培养时间可能是可更改的。多次检查细胞状态,以找到适当的孵育时间。
  4. 用 2 mL 的 RPMI 1640 培养基刷新含有 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素链霉素的转导 4T1 细胞的培养基,以去除慢病毒颗粒和聚宝烯。

3. LV-RR和LV-RRT转导4T1细胞的药物筛选和鉴定

  1. 根据LV-RR或LV-RRT携带的BSD抗基因选择含有高爆杀菌(BSD)的转导细胞,如描述以下步骤。
    注:或者,根据LV-RR或LV-RRT携带的RFP基因,通过流动细胞测定选择RFP阳性的转导细胞。
  2. 转导后48小时,通过4T1细胞在1:3至1:4的比例与选择介质(RPMI 1640介质包含10%FBS,100 U/mL青霉素链霉素,和5μg/mL BSD)。每 2 或 3 天更换一次介质。
    注: 最佳BSD浓度可能因细胞系而异。因此,在初步实验前,应进行杀灭曲线的试验,以确定BSD的最佳浓度。
  3. 药物后7天筛查,在荧光倒相对比显微镜下观察LV-RR转导4T1细胞(4T1-RR)和LV-RRT转导4T1细胞(4T1-RRT)。分别计算三个视场中RFP+ 4T1细胞和所有4T1细胞的数量,以分别估计RFP阳性比(图2)。
    注:或者,转导4T1细胞的RFP阳性比可以通过流式细胞测定来识别。
  4. 使用活成像系统检测细胞数和肾信号之间的线性关系,测量4T1-RR细胞和4T1-RRT细胞的肾信号(图3)。
  5. 以1:3至1:4的分割比率,扩大BSD筛选的4T1-RR和4T1-RRT细胞,并将细胞系储存在液氮中。

4. Vegfr2-Fluc-KI小鼠和肿瘤携带小鼠模型

注:转基因Vegfr2-Fluc-KI小鼠,6-8周大,雌性,用于本实验,以非侵入性监测血管生成在体内由BLI。

  1. 在60毫米培养皿中培养4T1-RR细胞和4T1-RRT细胞,分别在37°C下,在5%CO2的加湿培养箱中培养。当细胞在80%汇合时,取出培养基,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。
  2. 取出PBS,并分别添加额外的2 mL 0.25%胰蛋白酶-0.53 mM EDTA溶液。将培养皿保持在RT(或37°C),直到细胞分离。
  3. 加入含有10%FBS的5~10mL新鲜培养基,然后吸出并分配细胞,将4T1-RR和4T1-RRT细胞分别重新悬浮到15 mL离心管中。使用计数室计数两种类型的 4T1 细胞,并在 RPMI 1640 介质中以每 100 μL 的浓度 1 x 106制备细胞悬浮液。
  4. 麻醉在麻醉诱导室中用1%-3%的等氟在100%氧气中麻醉Vegfr2-Fluc-KI小鼠,流速为1 L/min。然后,在小鼠眼睛上涂上眼膏,以防止脱水。
  5. 将鼠标从造型室中取出,并在 nosecone 中的位置。使用电动护油和脱毛霜完全去除小鼠肩部的头发,这可以提供手术现场的良好视图,避免在后续实验中阻塞 BLI 信号。
  6. 皮下注入4T1-RR细胞(1 x 106细胞在100μL总体积)和4T1-RRT细胞(1 x 106细胞在100μL的总体积)分别在每只鼠标的左肩和右肩(记录为第0天)。将小鼠置于热支持中的恢复区域,直到完全恢复。
  7. 植入4T1-RR和4T1-RRT细胞后,触摸肿瘤质量,检查小鼠每天有肿瘤(图S1)。在植入后的第7天,在腹内注射50毫克/千克甘西洛韦(GCV)给肿瘤小鼠每天两次,直到实验结束。
    注:在本实验之前,应检测4T1-RRT细胞的GCV细胞毒性。GCV的杀灭效率可以通过不同浓度的GCV细胞计数测定来评估(图S2)。
  8. 在4T1植入后的第0、3、7、14和21天,监测肿瘤小鼠的肿瘤生长和血管生成,并通过Rluc和Fluc成像进行评估(图4)。

5. 肿瘤(Rluc)和血管生成(氟)的双生物发光成像

  1. 打开活成像系统,初始化活成像软件,然后初始化系统。
    注:系统初始化需要几分钟时间才能将电荷耦合器件(CCD)摄像机冷却至-90°C,然后才能开始成像。当 CCD 相机冷却时,温度将变为绿色。
  2. 使用以下摄像机设置:
    检查发光和照片。
    检查叠加。
    发光设置:
    在正常条件下,曝光时间设置 AUTO。
    装箱设置到 8。
    F/停止设置为 1。
    排放过滤器设置打开。
    照片设置:
    装订到中等。
    F/停止设置为 8。
    IVIS 系统设置:
    视场:C=1 鼠标视图,D=5 鼠标视图。
    主题高度设置 1.5 厘米。
  3. 称重和记录小鼠,并计算所需的锥肠素(CTZ;2.5毫克/千克)和D-荧光素(150毫克/千克)的体积。
  4. 在麻醉诱导室中,在100%氧气中用1%的氧对携带肿瘤小鼠进行1%~3%的分型麻醉,流速为1 L/min。 监测小鼠脚趾捏合反应,确认麻醉状态。然后,在两只眼睛上滴一滴润滑眼药膏,以避免角膜损伤。
  5. 使用胰岛素注射器针头将每公斤体重2.5毫克CTZ(3.33毫克/毫克/升)注射到小鼠的逆栏中(例如,对于20克小鼠,注射15μL以输送50微克CTZ)。
  6. 将携带肿瘤的小鼠轻轻移入相机室,其鼻子在麻醉锥中轻轻移动,并立即获取小鼠背道的几张照片,以获得来自 4T1 细胞的 Rluc 信号,直到 BLI 信号消失。
    注:CTZ的半寿命非常短,Rluc的信号急剧下降±30s。为确保任何残余 Rluc 信号已消散,Rluc 和 Fluc 成像之间的间隔应超过 10 分钟。
  7. 使用胰岛素注射器针注射150mg/kg D-荧光素(30mg/mL)的内渗透剂(例如,对于20克小鼠,注射100μL以提供3毫克D-荧光素)。在荧光成像之前,将鼠标保持在 RT 处 10 分钟。
  8. 再次将鼠标移入相机室,使其鼻子在麻醉锥中,并获取几张小鼠背的拍照,以获得血管生成中的荧光信号。
    注: 应为每个鼠标执行氟动能监测仪,直到信号达到最大值,然后淡出。
  9. 对每只鼠标重复步骤 5.4_5.8。
  10. 成像后,保持小鼠在温暖的环境,直到动物醒来。
  11. 在所需的时间点(第3天、第7天、第14天和第21天),重复上述步骤(步骤5.3~5.10),以检测肿瘤进展和肿瘤血管生成。
  12. 分析Rluc和Fluc信号数据,研究肿瘤生长与肿瘤进展血管生成之间的关系。
    注: 覆盖 BLI 信号站点的感兴趣区域 (ROI) 用于分析数据。测量每个时间点的光子/秒/厘米2/斯罗迪安 (p/s/cm2/sr) 单位中 ROI 的总辐射(光子)。
  13. 使用图形软件分析 ROI 的 Rluc 和 Fluc 信号 (图 4)。

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Representative Results

在本实验中,利用4T1细胞建立了乳腺癌小鼠模型,以研究肿瘤生长与肿瘤血管生成的关系(图1)。首先,包装了两个慢病毒,其基因序列分别表达Rluc/RFP(LV-RR)和Rluc/RFP/HSV-ttk(LV-RRT),如先前报告7。然后,分别通过转导LV-RR和LV-RRT创建两个不同的4T1细胞系,分别命名为4T1-RR和4T1-RRT。经过3天的药物筛选,在荧光显微镜下观察4T1-RR和4T1-RRT,以检测转导效率。如荧光成像所示,4T1-RR或4T1-RRT细胞中99%以上为RFP阳性,这表明4T1-RR和4T1-RRT细胞系由LV-RR和LV-RRT转导(图2A,B)建立。同时,在培养期间,野生型4T1和4T1-RR或4T1-RRT在细胞形态和生长方面没有差异。总之,我们成功地构建了4T1-RR和4T1-RRT细胞系,而不影响细胞状态。随后,捕获了4T1-RR和4T1-RRT细胞的生物发光成像(BLI),以检测Rluc信号。BLI图像显示,4T1-RR和4T1-RRT细胞都发出强度相同的强生物发光信号(图3A)。此外,Rluc信号和细胞数之间的线性关系在4T1-RR(R2 = 0.9974)和4T1-RRT细胞(R2 = 0.9989)中观察到,这表明Rluc信号可用于反映体内肿瘤生长(图3B).

在此基础上,利用转基因Vegfr2-Fluc-KI小鼠,建立了一个带肿瘤的小鼠模型,以研究乳腺癌生长的血管生成。由于将氟克序列敲入鼠体内Vegfr2序列的第一个外子,在肿瘤进展期间以与小鼠血管生成相同的方式表示氟(显示为生物发光信号)。在皮下注射4T1-RR和4T1-RRT细胞后,在CTZ存在时,Rluc信号监测细胞生长(图4A)。同时,在同一小鼠中,用氟信号对肿瘤生长引起的血管生成进行了评估。在植入4T1-RR和4T1-RRT后的第7天,对肿瘤小鼠施用GCV,导致4T1-RRT细胞死亡。BLI图像显示,4T1-RR和4T1-RRT细胞的Rluc信号在GCV治疗前以相同的速率增加;然而,4T1-RRT细胞的Rluc信号在GCV治疗后急剧下降。而 4T1-RR 的 Rluc 信号仍然温和增加。显然,Rluc信号和肿瘤大小之间存在显著的相对性(图S1)。

同时,根据Fluc图像,氟信号随着Rluc的上升而增加,在Rluc下降后减小(图4B)。这些结果表明,肿瘤血管生成与肿瘤生长有直接关系。药物GCV诱导的肿瘤细胞死亡可能导致肿瘤血管生成抑制(图4C)。为了证明Fluc信号确实在检测肿瘤内的血管生成,动物在第21天完成成像后被牺牲,以获得血管组织学证据。根据抗VEGFR2免疫染色的图像,4T1-RR肿瘤组织中的微血管结构明显比4T1-RRT肿瘤组织明显,与荧光信号一致(图5)。总之,这种双生物发光成像策略可用于监测肿瘤进展和血管生成,以及评估不同药物对肿瘤生长和肿瘤微环境血管生成的影响。

Figure 1
图1:肿瘤生长和血管生成双生物发光成像图谱。LV-RR和LV-RRT转导的4T1细胞被植入Vegfr2-Fluc-KI转基因小鼠体内。在肿瘤生长过程中,Rluc和Fluc的BLI同时在单个小鼠中执行,分别反映肿瘤生长和血管生成状态。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:4T1-RR和4T1-RRT细胞的转导效率,通过荧光成像识别。(A) pLV-RR 的图解显示,Rluc 和 RFP 序列在启动器 EF1+ 下表示。一个视场的明亮和荧光图像显示4T1-RR细胞为RFP阳性。(B) pLV-RRT图图显示,单启动子EF1+激活了Rluc、RFP和HSV-ttk基因。一个视场的明亮和荧光图像显示4T1-RRT细胞为RFP阳性。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:转导4T1-RR和4T1-RRT细胞的生物发光成像。 (A)在CTZ存在的情况下,对4T1-RR和4T1-RRT细胞的生物发光成像。(B) 4T1-RR和4T1-RRT细胞的测量Rluc信号与细胞数保持线性关系。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:活动物肿瘤生长和血管生成动态过程的可视化。 (A)实验的流图和Rluc和Fluc的双BLI检测。(B)转基因小鼠肿瘤发育过程中肿瘤进展的代表性Rluc图像和血管生成波动图像。(C) Rluc信号的测量表明,植入的肿瘤细胞生长迅速,而4T1-RRT细胞在GCV分量后显著退位。(D)荧光信号的定量表明,血管生成发生在肿瘤细胞植入后,与GCV引起的肿瘤生长和死亡呈平行趋势。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:VEGFR2免疫染色4T1-RR和4T1-RRT组织在第21天。第21天,为VEGFR2(绿色)染色的肿瘤组织部分的代表性图像。核与DAPI(蓝色)反染。刻度条 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图S1:体内肿瘤进展期间肿瘤大小的曲线。植入后4T1-RR和4T1-RRT细胞的肿瘤大小增加,但4T1-RRT细胞的肿瘤大小开始减少GCV治疗后。请点击此处下载此文件。

图S2:GCV对4T1-RRT细胞的细胞毒性作用。4T1-RRT细胞随着GCV浓度升高而死亡。请点击此处下载此文件。

图S3:肺中4T1-RR细胞的BLI图像。4T1-RR细胞尾静脉注射后,BLI检测到细胞的Rluc信号。请点击此处下载此文件。

LV-RR 和 LV-RRT 封装条件
组件 MEM 介质 3-质粒系统 4质粒系统
pLV-RR/pLV-RRT 矢量A 0.25 mL 1.5 μg 1.5 μg
Gag-Pol = Rev 表达式向量B  1.0 μg
Gag-Pol 表达式向量C 0.75 μg
修订表达式向量D 0.3 μg
VSV-G 表达式向量E 0.5 μg 0.45 μg
脂 质 体 0.25 mL 7.5 μL 7.5 μL

表1:在293T细胞中生产LV-RR和LV-RRT病毒的慢病毒包装系统的转染条件。(A) pLV-cDNA载体分别为pLV-RR和pLV-RRT。(B) Gag-Pol + Rev 表达式向量可以是 pCMV-deltaR8.91 (TRC) 或 psPAX2(添加基因)。(C) Gag-Pol 表达载体可以选择 pMDLg/pRRE(添加基因)、pLP1(体素)和 pPACKH1-GAG (SBI)的任一。(D)修订表达载体应为pRSV-REV(添加基因)、pLP2(体基)或pPACKH1-REV(SBI)。(E) VSV-G 表达载体可以选择 pMD.G (TRC)、pMD2.G(增生)、pCMV-VSV-G(增生)、pVSV-G (SBI) 或 pLP/VSVG(Invitrogen)。该协议使用了三质粒系统,包括psPAX2、pMD2.G和pLV-RR或pLV-RRT。

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Discussion

在本协议中,描述了一种非侵入性双BLI方法,用于监测肿瘤发育和血管生成。BLI报告器系统是首次开发,包含HSV-ttk/GCV自杀基因,用于跟踪肿瘤进展和通过Rluc成像在体内的回归。同时,通过氟成像利用Vegfr2-Fluc-KI小鼠评估肿瘤血管生成。这种带肿瘤小鼠模型能够提供一个实用的平台,通过双BLI在单一小鼠具有高相关性、可重复性和可翻译性,为连续和非侵入性跟踪肿瘤发育和肿瘤血管生成提供实用平台。

血管生成涉及长期肿瘤进展,因此具有很高的重要性1。研究肿瘤进展与血管生成的关系是十分必要的。越来越多的抗血管生成策略被调查用于癌症治疗,它们依靠可视化的监测方法准确评估治疗结果。此外,传统放疗和化疗后肿瘤组织的新血管化是肿瘤学研究的另一个热门领域。这些研究需要一个动物模型,允许实时监测肿瘤生长和血管生成。传统动物模型中肿瘤组织的病理变化通常依赖于组织病理学检查,这需要动物的牺牲。这些双 BLI 鼠标模型有助于解决错误范围较大和动物牺牲造成的成本较高的问题。

在这个双BLI小鼠模型中,最关键的步骤是同时使用两种类型的荧光素酶,包括氟克和Rluc,分别跟踪细胞和血管生成。这两种荧光素酶的基质特异性使得在单个主机中执行两种类型的 BLI 成为可能。此外,Coelenterazine(Rluc的基质)的半衰程非常短,这导致Rluc信号迅速消失,而不会影响下一个氟克信号检测15。因此,在操作过程中,由于D-荧光素(氟的基板)的半寿命较长,在氟成像之前应实施Rluc成像。此外,确定基板的孵育时间是获得完美BLI图像的关键。基质的代谢可以改变体内基质的浓度,导致BLI信号强度的变化。

随着技术的进步,某些细胞和亚细胞事件在体内跟踪的其他成像模式已应用于临床前和临床研究,如荧光成像、磁共振成像(MRI)和正电子排放断层扫描 (PET)16,17.与这些成像策略相比,生物发光成像具有高灵敏度、强特异性、精确测量性,在活成像研究领域显示出其独特的优越性。使用的 Rluc 成像允许 HSV-ttk/GCV 药物系统的肿瘤生长和抗肿瘤效果在活的动物中动态可视化。除了监测皮下组织外,Rluc还被用于其他研究中的BLI技术来追踪肺部的细胞。在将4T1-RR的尾静脉注入鼠标后,我们将鼠标移入活成像系统,以检测CTZ给给后Rluc信号。Rluc信号的图像显示,注射细胞主要位于肺部(图S3)。如上所述,Rluc报告基因可以追踪不同位置的各种癌细胞,从而鼓励在癌症生物学研究中充分利用这种小鼠模型。

除了这些优势之外,BLI 技术还可用于检测特定分子的表达水平。此前,在相关前体下表达的荧光量报告基因已用于测量皮下肿瘤的血管发育。在肿瘤进展过程中,血管结构和分子可以通过小鼠手术植入的窗口室观察到。然而,该方法仍有局限性,包括不可避免的入侵、荧光淬火和强烈的背景噪声。在Vegfr2-Fluc-KI小鼠中建立的带肿瘤小鼠模型对Vegfr2的表达水平进行了非侵入性观察,这是肿瘤血管生成中最重要的分子。同时,BLI图像表现出无噪声的特异性。双BLI小鼠模型在研究肿瘤进展和回归的潜在分子机制方面可能具有更广泛的应用。

BLI 技术基于 Rluc(排放 480 nm)和氟(排放 562 nm)的表达,已被许多体内疾病模型采用。由于在检测深层组织时,600 nm以下波长的生物发光灵敏度较低,因此BLI技术在体内的广泛应用受到限制。这是由光的吸收和散射引起的,这种光将可探测的信号降低到每厘米组织的十倍。为了解决这个问题,一些研究人员将研究重点放在荧光的红色发射变型上,这些变子发出的光在600nm18以上。由于使用Fluc18、19的这些变体可以显著减少光的吸收和散射,因此荧光酶变体的应用将扩大这一协议,以扩大肿瘤学研究领域。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

本研究得到国家重点研发项目(2017YFA0103200)、国家自然科学基金(81671734)和天津市科技支撑项目重点项目(18YFZCSY00010)的支持。中央大学 (63191155)。我们感谢格洛丽亚·南斯的修订,这些修订对于提高我们手稿的质量很有价值。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA Gibco 25200072
1.5 mL Tubes Axygen Scientific MCT-105-C-S
15 mL Tubes Corning Glass Works 601052-50
293T ATCC CRL-3216
4T1 ATCC CRL-2539
60 mm Dish Corning Glass Works 430166
6-well Plate Corning Glass Works 3516
Biosafety Cabinet Shanghai Lishen Scientific Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) Sigma-Aldrich 15205
Cell Counting Kit-8 MedChem Express HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator Thermo Fisher Scientific 4111
Coelenterazine (CTZ) NanoLight Technology 479474
D-luciferin Potassium Salt Caliper Life Sciences 119222
DMEM Medium Gibco C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS) BIOIND 04-001-1A
Fluorescence Microscope Nikon Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV) Sigma-Aldrich Y0001129
Graphics Software GraphPad Software Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles Becton Dickinson 328421
Isoflurane Baxter 691477H
Lentiviral Packaging System Biosettia cDNA-pLV03
Liposome Invitrogen 11668019
Living Imaging Software Caliper Life Sciences Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Lumina II
MEM Medium Invitrogen 31985-070
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning Glass Works R21031399
Polybrene Sigma-Aldrich H9268-1G
RPMI1640 Medium Gibco C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge Thermo Fisher Scientific Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator Haier DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System XENOGEN Corporation 7293

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References

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