Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.

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Zhang, K., Wang, C., Wang, R., Chen, S., Li, Z. Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (150), e59763, doi:10.3791/59763 (2019).

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Abstract

Die Angiogenese als entscheidender Prozess der Tumorprogression ist zu einem Forschungs-Hotspot und Ziel der Anti-Tumor-Therapie geworden. Es gibt jedoch kein zuverlässiges Modell, um Tumorprogression und Angiogenese gleichzeitig visuell und sensibel zu verfolgen. Die Biolumineszenz-Bildgebung zeigt ihre einzigartige Überlegenheit in der lebendigen Bildgebung aufgrund ihrer Vorteile hoher Empfindlichkeit, starker Spezifität und genauer Messung. Präsentiert hier ist ein Protokoll, um ein tumortragendes Mausmodell zu etablieren, indem eine Renilla-Luziferase-markierte murine Brustkrebs-Zelllinie 4T1 in die transgene Maus mit Angiogenese-induzierter Firefly-Luzifferase-Expression injiziert wird. Dieses Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung in einer einzigen Maus zu überwachen. Dieses Modell kann weit verbreitet in Anti-Tumor-Arzneimittel-Screening und Onkologie-Forschung angewendet werden.

Introduction

Angiogenese ist ein wesentlicher Prozess bei der Progression von Krebs von kleinen, lokalisierten Neoplasmen zu größeren, potenziell metastasierenden Tumoren1,2. Die Korrelation zwischen Tumorwachstum und Angiogenese wird zu einem der Schwerpunkte im Bereich der onkologischen Forschung. Herkömmliche Methoden zur Messung morphologischer Veränderungen können jedoch die Tumorprogression und Angiogenese bei lebenden Tieren nicht gleichzeitig mit einem visualisierten Ansatz überwachen.

Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von Tumorzellen ist eine besonders geeignete experimentelle Methode zur Überwachung des Tumorwachstums aufgrund seiner Nicht-Invasivität, Empfindlichkeit und Spezifität3,4,5,6 . Die BLI-Technologie basiert auf dem Prinzip, dass die Luziferase die Oxidation eines bestimmten Substrats katalysieren kann, während sie Diebiomineszenz aussendet. Die in implantierten Tumorzellen exprimierte Luziferase reagiert mit dem injizierten Substrat, das durch ein lebendiges Bildgebungssystem nachgewiesen werden kann, und Signale spiegeln indirekt die Veränderungen der Zellzahl oder Zelllokalisierung in vivo6,7wider.

Abgesehen vom Tumorwachstum kann die Tumorangiogenese (der kritische Schritt in der Krebsprogression) auch durch BLI-Technologie mit Vegfr2-Fluc-KI transgenen Mäusen8,9,10visualisiert werden. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (Vegf) Rezeptor 2 (Vegfr2), eine Art Von Vegf-Rezeptor, wird meist in den vaskulären Endothelzellen von erwachsenen Mäusen11exprimiert. Bei transgenen Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen wird die DNA-Sequenz der Firefly-Luziferase (Fluc) in das erste Exon der endogenen Vegfr2-Sequenz geschlagen. Als Ergebnis wird der Fluc (der als BLI-Signale erscheint) in einer Weise ausgedrückt, die mit dem Niveau der Angiogenese bei Mäusen identisch ist. Um über ein paar Millimeter zu wachsen, rekrutiert der Tumor neue Gefäße aus bestehenden Blutgefäßen, die die durch Wachstumsfaktoren aus den Tumorzellen1ausgelöste Vegfr2 stark ausdrücken. Dies eröffnet die Möglichkeit, vegfr2-Fluc-KI transgene Mäuse zu verwenden, um die Tumorangiogenese durch BLI nicht-invasiv zu überwachen.

In diesem Protokoll wird ein tumortragendes Mausmodell zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in einer einzigen Maus durch Firefly luciferase (Fluc) bzw. Renilla luciferase (Rluc) Bildgebung eingerichtet (Abbildung 1). Es entsteht eine 4T1-Zelllinie (4T1-RR), die Rluc und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) stabil ausdrückt, um das Zellwachstum durch Rluc-Bildgebung zu verfolgen. Um die dynamischen Veränderungen der Angiogenese in der Progression und Regression des Tumors weiter zu untersuchen, wird eine weitere 4T1-Zelllinie (4T1-RRT) erstellt, die Selbstmord-Genherpes simplex-Virus abgeschnittene Thymidinkinase (HSV-ttk), Rluc und RFP ausdrückt. Durch die Verabreichung von Ganciclovir (GCV) werden die HSV-ttk-Exemitzellen selektiv ablated. Basierend auf diesen Zelllinien wird ein tumortragendes Modell in Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen entwickelt, das als experimentelles Modell dient, das die Tumorprogression und Tumorangiogenese in vivo überbrückt.

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Protocol

Die Versuche müssen den nationalen und institutionellen Vorschriften über die Verwendung von Tieren zu Forschungszwecken entsprechen. Genehmigungen für die Durchführung von Experimenten müssen eingeholt werden. Die Behandlung von Tieren und die experimentellen Verfahren der Studie entsprechen den Richtlinien des Nankai University Animal Care and Use Committee, die den richtlinien für Tierpflege entsprechen, die von den National Institutes of Health (NIH) genehmigt wurden.

1. LV-Rluc-RFP (RR) und LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) lentivirale Verpackung und Produktion

ANMERKUNG: Der pLV-RR trägt die Gensequenzen von Renilla luciferase (Rluc) und rotem fluoreszierendem Protein (RFP) unter dem Promotor EF1, während der pLV-RRT die Gensequenzen trägt, die Rluc, RFP und Herpes simplex virus abgeschnittene Thymidinkinase (HSV-ttk) ( Abbildung 2).

  1. Samen 1 x 106 von 293T Zellen pro Brunnen in eine 6 Wellplatte und Kultur über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C mit Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).
  2. Bereiten Sie die Liposomensuspension vor: Mischen Sie 7,5 l Liposom und 0,25 ml minimales wesentliches Medium (MEM) in ein 1,5 ml Rohr nach inkubationszeit für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um Liposomen gleichmäßig zu dispergieren.
  3. Die DNAs-Lösung (DNAs-RR) vorbereiten: Fügen Sie den pLV-RR-Vektor und die Hilfsplasmide in einem 1,5 ml-Rohr, wie in Tabelle 1beschrieben, 0,25 ml MEM hinzu.
  4. Erhalten Sie die Liposomen-/DNAs-RR-Verbindung: Fügen Sie die DNAs-RR-Lösung vorsichtig in vorbereitete Liposomensuspension Tropfen für Tropfen und inkubieren Sie für 20 min bei RT, so dass die DNA-Bindungen an die Lipidmembran.
  5. Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 1 ml DMEM, das 10% FBS enthält, und fügen Sie die Liposomen-/DNAs-RR-Verbindung vorsichtig zum Medium der 293T-Zellen hinzu.
  6. Nach der Inkubation in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2 bei 37 °C für 12–16 h, ersetzen Sie die Liposomen/DNAs-RR-Verbindung, die ein Medium der 293T-Zellen enthält, durch 1 ml DMEM mit 10% FBS und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin.
  7. Die 293T-Zellen im befeuchteten Inkubator nach der Transfektion 48 h weiter kultivieren. Dann sammeln Sie den Überstand der 293T-Zellen und zentrifugieren Sie das Medium bei 300 x g für 5 min, um die 293T-Zellen zu pellet. Den lentivirus-RR (LV-RR)-haltigen Überstand in 1,5 ml sterile Polypropylen-Lagerröhrchen geben und bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Für die Arbeit mit dem rekombinanten Lentivirus ist eine Anlage der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) erforderlich.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 1.1–1.7 und verwenden Sie pLV-RRT-Vektor anstelle des pLV-RR-Vektors in Schritt 1.3, um das Lentivirus-RRT (LV-RRT) zu erhalten. LV-RRT bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Der nicht gereinigte lentivirale Bestand kann in einigen Fällen das Zellwachstum hemmen. Lentivirale Bestände müssen möglicherweise gereinigt werden. Die lentiviralen Bestände, die LV-RR- oder LV-RRT-Partikel enthalten, sollten zur Lagerung in 1,5 ml-Rohre (1 ml pro Röhre) unterteilt werden, um mehrere Freitauzyklen zu vermeiden.

2. LV-RR und LV-RRT lentivirale Transduktion zur Genexpression in 4T1-Zellen

  1. Samen 4T1-Zellen in eine 6-Well-Platte (5 x 105 Zellen/well) und Kultur mit Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10% FBS über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C.
  2. Entfernen Sie das Medium von der Kulturplatte und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches RPMI 1640 Medium sowie 1 ml Lentivirale Vorräte (LV-RR oder LV-RRT) an jedem Brunnen. Fügen Sie 8 g/ml Polybren hinzu und mischen Sie das Medium, das lentivirale Partikel enthält, sanft, indem Sie nach oben und unten pfeifen.
    HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass das Medium lentivirale Partikel enthält, die menschliche Zellen transducieren könnten.
  3. Spintransduktionslösung in einer Zentrifuge bei 1.000 g für 60 min bei RT zur Steigerung der Transduktionseffizienz. Nach der Zentrifugation 4T1-Zellen für 4–12 h kulturieren und in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C aufbewahren.
    HINWEIS: Für einige Zelllinien kann Polybren für die Langzeitkultur giftig sein. Daher kann die Inkubationszeit für die Transducing verschiedener Zellen änderbar sein. Überprüfen Sie den Zellenstatus mehrmals, um die geeignete Inkubationszeit zu finden.
  4. Erfrischen Sie das Medium der transduzierten 4T1-Zellen mit 2 ml RPMI 1640 Medium, das 10% FBS und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin enthält, um lentivirale Partikel und Polybren zu entfernen.

3. Arzneimittelscreening und Identifizierung von LV-RR- und LV-RRT-transduzierten 4T1-Zellen

  1. Wählen Sie transduzierte Zellen mit Medium, das Blasticidin (BSD) enthält, gemäß dem BSD-Resistenzgen, das von LV-RR oder LV-RRT getragen wird, wie die folgenden Schritte beschrieben.
    HINWEIS: Alternativ könnten die transduzierten Zellen, die RFP-positiv sind, durch Durchflusszytometrie gemäß dem RFP-Gen ausgewählt werden, das von LV-RR oder LV-RRT getragen wird.
  2. 48 h nach Transduktion Durchgang 4T1-Zellen im Verhältnis 1:3 zu 1:4 mit Selektionsmedium (RPMI 1640 medium mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 5 g/ml BSD). Wechseln Sie das Medium alle 2 oder 3 Tage.
    HINWEIS: Die optimale BSD-Konzentration kann von Zelllinie zu Zelllinie variieren. Daher sollte ein Pilotversuch der Kill-Kurve durchgeführt werden, um die optimale Konzentration von BSD vor dem ersten Experiment zu bestimmen.
  3. 7 Tage nach dem Arzneimittelscreening die LV-RR-transduzierten 4T1-Zellen (4T1-RR) und LV-RRT-transduzierte 4T1-Zellen (4T1-RRT) unter dem fluoreszenzinvertierten Phasenkontrastmikroskop. Zählen Sie die Anzahl der RFP+ 4T1-Zellen und aller 4T1-Zellen in drei Sichtfeldern, um das RFP-positive Verhältnis zu schätzen (Abbildung 2).
    HINWEIS: Alternativ könnte das RFP-positive Verhältnis der transducierten 4T1-Zellen durch Durchflusszytometrie identifiziert werden.
  4. Messen Sie die Renilla-Signale von 4T1-RR-Zellen und 4T1-RRT-Zellen mit hilfe eines lebenden Bildgebungssystems, um die lineare Beziehung zwischen Zellzahlen und Renillasignalen zu erkennen (Abbildung 3).
  5. Erweitern Sie BSD-geprüfte 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen mit Selektionsmedium bei Split-Verhältnissen zwischen 1:3 und 1:4 und speichern Sie die Zelllinienbestände in flüssigem Stickstoff.

4. Vegfr2-Fluc-KI Mäuse und tumortragendes Mausmodell

HINWEIS: Die transgenen Vegfr2-Fluc-KI-Mäuse, 6-8 Wochen alt und weiblich, werden in diesem Experiment verwendet, um die Angiogenese in vivo von BLI nicht-invasiv zu überwachen.

  1. Kultur 4T1-RR-Zellen und 4T1-RRT-Zellen in 60 mm Petrischalen in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C. Wenn die Zellen bei 80% Zusammenfluss sind, entfernen Sie das Medium und spülen Sie es mit Phosphatgepufferter Saline (PBS).
  2. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie eine zusätzliche 2 ml von 0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA-Lösung bzw. hinzu. Halten Sie die Schale bei RT (oder bei 37 °C) auf, bis sich die Zellen lösen.
  3. Fügen Sie 5–10 ml frisches Medium mit 10% FBS hinzu, dann aspirieren und abgeben Zellen, um 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen in 15 ml Zentrifugenröhren zu suspendieren. Zählen Sie zwei Arten von 4T1-Zellen mit einer Zählkammer und bereiten Sie die Zellsuspensionen mit einer Konzentration von 1 x 106 pro 100 l in RPMI 1640 medium vor.
  4. Anästhetisieren Sie die Vegfr2-Fluc-KI-Mäuse mit 1%–3% Isofluran in 100% Sauerstoff in der Anästhesie-Induktionskammer mit einer Durchflussrate von 1 L/min. Überwachen Sie die Zehenpinch-Reaktion der Maus, um den Status der Anästhesie zu bestätigen. Dann wenden Sie ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus, um Austrocknung zu verhindern.
  5. Entfernen Sie die Maus aus der Kammer und positionieren Sie sie in nosecone. Entfernen Sie das Haar der Schulter der Maus vollständig mit Elektrorasierer und Haarentfernungscreme, die eine gute Sicht auf das chirurgische Feld bieten könnte und vermeiden, die BLI-Signale in Folgeexperimenten zu blockieren.
  6. Subkutan injizieren 4T1-RR-Zellen (1 x 106 Zellen bei einem Gesamtvolumen von 100 L) und 4T1-RRT-Zellen (1 x 106 Zellen bei einem Gesamtvolumen von 100 L) in die linke bzw. rechte Schulter jeder Maus (Aufnahme als Tag 0). Platzieren Sie Mäuse im Erholungsgebiet mit thermischer Unterstützung, bis sie vollständig geborgen sind.
  7. Berühren Sie nach der Implantation von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen die Tumormassen, um zu überprüfen, ob die Mäuse jeden Tag tumortragend sind (Abbildung S1). Am Tag 7 nach der Implantation injiziert intraperitoneal 50 mg/kg Ganciclovir (GCV) zweimal täglich bis zum Ende des Experiments in die tumortragende Maus.
    HINWEIS: Vor diesem Experiment sollte das Zytotoxisch von GCV an 4T1-RRT-Zellen nachgewiesen werden. Die Tötungseffizienz von GCV konnte durch Zellzähltest mit unterschiedlicher GCV-Konzentration bewertet werden (Abbildung S2).
  8. Am Tag 0, 3, 7, 14 und 21 nach der 4T1-Implantation überwachen Sie das Tumorwachstum und die Angiogenese tumortragender Mäuse und bewerten sie sowohl durch Rluc als auch durch Fluc-Bildgebung (Abbildung4).

5. Duale Biolumineszenz-Bildgebung von Tumor (Rluc) und Angiogenese (Fluc)

  1. Öffnen Sie das lebende Bildgebungssystem, initialisieren Sie die lebende Bildgebungssoftware, und initialisieren Sie dann das System.
    HINWEIS: Die Systeminitialisierung dauert einige Minuten, um die aufgeladene Gerätekamera (CCD) auf -90 °C abzukühlen, bevor die Bildgebung beginnen kann. Die Temperatur wird grün, wenn die CCD-Kamera gekühlt wird.
  2. Verwenden Sie die folgenden Kameraeinstellungen:
    Überprüfen Sie die Lumineszenz und Fotografie.
    Überprüfen Sie Überlagerung.
    Lumineszenzeinstellungen:
    Belichtungszeit setzt AUTO unter normalen Bedingungen.
    Binning setzt auf 8.
    F/Stop setzt auf 1.
    Emissionsfilter setzt Open.
    Fotoeinstellungen:
    Binning setzt auf Medium.
    F/Stop setzt auf 8.
    IVIS-Systemeinstellungen:
    Sichtfeld: C=1 Mausansicht, D=5-Mäuseansicht.
    Die Motivhöhe setzt 1,5 cm.
  3. Wiegen und erfassen Sie die Mäuse und berechnen Sie das benötigte Volumen von Coelenterazin (CTZ; 2,5 mg/kg) und D-Luziferin (150 mg/kg).
  4. Anästhetisieren Sie tumortragende Maus um 1%–3% Isofluran in 100% Sauerstoff in der Anästhesie-Induktionskammer mit einer Durchflussrate von 1 L/min. Überwachen Sie die Zehenpinch-Reaktion der Maus, um den Status der Anästhesie zu bestätigen. Geben Sie dann einen Tropfen Schmieraugensalbe auf beide Augen, um Hornhautschäden zu vermeiden.
  5. Injizieren Sie 2,5 mg CTZ (3,33 mg/ml) pro Kilogramm Körpergewicht in die Retrobulbar der Maus (z. B. für eine 20 g Maus, injizieren Sie 15 l, um 50 g CTZ zu liefern) mit einer InsulinspritzeNadel.
  6. Bewegen Sie die tumortragende Maus mit der Nase im Anästhesiekegel sanft in die Kamerakammer und erfassen Sie sofort mehrere Bilder des Maus-Dorsal, um die Rluc-Signale von 4T1-Zellen zu erhalten, bis die BLI-Signale verblassen.
    ANMERKUNG: Die Halbwertszeit von CTZ ist sehr kurz und die Signale von Rluc fallen süberschmisch um 30 s. Um sicherzustellen, dass sich jedes verbleibende Rluc-Signal aufgelöst hat und das Intervall zwischen Rluc und Fluc-Bildgebung mehr als 10 min betragen sollte.
  7. Intraperitoneal injizieren 150 mg/kg D-Luciferin (30 mg/ml) mit einer Insulinspritze Nadel (z.B. für eine 20 g Maus, injizieren 100 l, um 3 mg D-Luciferin zu liefern). Halten Sie die Maus bei RT für 10 min vor Fluc-Bildgebung.
  8. Bewegen Sie diese Maus wieder in die Kamerakammer mit ihrer Nase im Anästhesiekegel und erfassen Sie mehrere Bilder der Maus dorsal, um die Fluc-Signale von der Angiogenese zu erhalten.
    HINWEIS: Der kinetische Fluc-Monitor sollte für jede Maus durchgeführt werden, bis die Signale das Maximum erreichen und dann verblassen.
  9. Wiederholen Sie die Prozedurschritte 5.4–5.8 für jede Maus.
  10. Nach der Bildgebung die Mäuse in einer warmen Umgebung warten, bis die Tiere aufwachen.
  11. Zum gewünschten Zeitpunkt (Tag 3, 7, 14 und 21) wiederholen Sie oben stehende Verfahren (Schritt 5.3–5.10), um die Tumorprogression und Tumorangiogenese im Laufe der Zeit zu erkennen.
  12. Analysieren Sie die Rluc- und Fluc-Signale, um den Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Angiogenese bei der Tumorprogression zu untersuchen.
    HINWEIS: Die Regionen von Interesse (ROI), die die BLI-Signalstelle abdecken, werden zur Analyse der Daten verwendet. Messen Sie die Gesamtstrahlung (Photonen) des ROI in der Einheit photonen/sekunden/cm2/steradian (p/s/cm2/sr) für jeden Zeitpunkt.
  13. Analysieren Sie die Rluc- und Fluc-Signale des ROI mithilfe von Grafiksoftware (Abbildung 4).

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Representative Results

In diesem Experiment wurde ein Brustkrebs-Mausmodell mit 4T1-Zellen erstellt, um den Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Tumorangiogenese zu untersuchen (Abbildung 1). Zunächst wurden zwei Lentiviren verpackt, die Gensequenzen trugen, die Rluc/RFP (LV-RR) und Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT) exättierten, wie bereits berichtet7. Anschließend wurden zwei verschiedene 4T1-Zelllinien mit den Namen 4T1-RR und 4T1-RRT durch die Transducing LV-RR bzw. LV-RRT erstellt. Nach einem Drogenscreening für 3 Tage wurden die 4T1-RR und 4T1-RRT unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um die Transduktionseffizienz zu erkennen. Wie in der Fluoreszenz-Bildgebung gezeigt, waren mehr als 99% der 4T1-RR- oder 4T1-RRT-Zellen RFP-positiv, was darauf hindeutet, dass die Zelllinien 4T1-RR und 4T1-RRT durch LV-RR- und LV-RRT-Transduktion nachgewiesen wurden (Abbildung 2A,B). In der Zwischenzeit gab es keine Unterschiede in der Zellmorphologie und wachstum zwischen Wildtyp 4T1 und 4T1-RR oder 4T1-RRT während der Kulturzeit gefunden. Zusammenfassend haben wir erfolgreich 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zelllinien gebaut, ohne die Zellzustände zu beeinflussen. Anschließend wurde die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen erfasst, um die Rluc-Signale zu erkennen. Die BLI-Bilder zeigten, dass sowohl 4T1-RR- als auch 4T1-RRT-Zellen starke biolumineszierende Signale gleicher Stärke ausstießen (Abbildung 3A). Außerdem wurden die linearen Beziehungen zwischen Rluc-Signalen und Zellzahlen sowohl in 4T1-RR (R2 = 0,9974) als auch in 4T1-RRT-Zellen (R2 = 0,9989) beobachtet, was darauf hindeutete, dass die Rluc-Signale verwendet werden könnten, um das Tumorwachstum in vivo zu spiegeln (Abbildung 3B ).

Auf dieser Grundlage wurde mit den transgenen Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen ein tumortragendes Mausmodell entwickelt, um die Angiogenese zu untersuchen, während der Brustkrebs wächst. Als Ergebnis des Klopfens der Fluc-Sequenz in das erste Exon der Vegfr2-Sequenz in Murine wurde der Fluc (der als biolumineszierende Signale erscheint) in einer Weise exprimiert, die mit der Angiogenese bei Mäusen während der Tumorprogression identisch ist. Nach subkutaner Injektion von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen wurde das Zellwachstum durch Rluc-Signale in Gegenwart von CTZ an den Tagen 0, 3, 7, 14 und 21 überwacht (Abbildung 4A). Zur gleichen Zeit, Angiogenese durch Tumorwachstum induziert wurde durch Fluc-Signale in Gegenwart von D-Luciferin in der gleichen Maus bewertet. Am Tag 7 nach der Implantation von 4T1-RR und 4T1-RRT wurde GCV den tumortragenden Mäusen verabreicht, was dazu führte, dass die 4T1-RRT-Zellen abstarben. Die BLI-Bilder zeigten, dass die Rluc-Signale von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen vor der GCV-Behandlung mit der gleichen Rate zunahmen; Rluc-Signale von 4T1-RRT-Zellen verringerten sich jedoch stark nach der GCV-Behandlung. während die Rluc-Signale von 4T1-RR noch sanft zunahmen. Offensichtlich bestand eine signifikante Relativitätstheorie zwischen Rluc-Signalen und der Tumorgröße (Abbildung S1).

In der Zwischenzeit, nach den Fluc-Bildern, stiegen die Fluc-Signale in Übereinstimmung mit dem Rluc Anstieg und sanken nach dem Rluc-Rückgang (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es eine direkte Korrelation zwischen Tumorangiogenese und Tumorwachstum gab. Der Tod von Tumorzellen, die durch das Medikament GCV induziert werden, kann zu einer Hemmung der Tumorangiogenese führen (Abbildung 4C). Um zu zeigen, dass das Fluc-Signal tatsächlich die Angiogenese innerhalb der Tumore entdeckte, wurden die Tiere geopfert, nachdem sie die Bildgebung am 21. Tag beendet hatten, um histologische Beweise für Vaskulatur zu erhalten. Nach den Bildern der Anti-VEGFR2-Immunfärbung waren die mikrovaskulären Strukturen im 4T1-RR-Tumorgewebe deutlich deutlicher als bei 4T1-RRT-Tumorgewebe, die mit den Fluc-Signalen übereinstimmten (Abbildung 5). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Dual-Biolumineszenz-Bildgebungsstrategie verwendet werden kann, um Tumorprogression und Angiogenese zu überwachen sowie Anti-Tumor-Effekte verschiedener Medikamente auf das Tumorwachstum und die Angiogenese in der Tumormikroumgebung zu bewerten.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Karte der dualen Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorwachstum und Angiogenese. Die 4T1-Zellen, die von LV-RR und LV-RRT transgenen Mäusen transgenen Mäusen implantiert wurden. Während des Tumorwachstums wurden BLI von Rluc und Fluc gleichzeitig in einer einzigen Maus durchgeführt, um das Tumorwachstum bzw. den Angiogenesestatus widerzuspiegeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Transduktionseffizienz von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen, die durch Fluoreszenz-Bildgebung identifiziert werden. (A) Die schematische Zeichnung von pLV-RR zeigte, dass Rluc- und RFP-Sequenzen unter dem Projektträger EF1 ausgedrückt wurden. Die hellen und fluoreszierenden Bilder eines Sichtfeldes zeigten, dass 4T1-RR-Zellen RFP-positiv waren. (B) Die Diagrammzeichnung von pLV-RRT zeigte, dass der Einzelpromotor EF1-Rluc-, RFP- und HSV-ttk-Gene aktivierte. Die hellen und fluoreszierenden Bilder eines Sichtfeldes zeigten, dass 4T1-RRT-Zellen RFP-positiv waren. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Biolumineszenz-Bildgebung von transduzierten 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen. (A) Biolumineszenz-Bildgebung von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen in Gegenwart von CTZ. (B) Die gemessenen Rluc-Signale von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen hielten eine lineare Beziehung zu den Zellzahlen aufrecht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Visualisierung der dynamischen Prozesse des Tumorwachstums und der Angiogenese bei einem lebenden Tier. (A) Flussdiagramm des Experiments und duale BLI-Erkennung von Rluc und Fluc. (B) Repräsentative Rluc-Bilder der Tumorprogression und Fluc-Bilder der Angiogenese während der Tumorentwicklung bei einer transgenen Maus. (C) Die Messung von Rluc-Signalen zeigte, dass die implantierten Tumorzellen schnell wuchsen, während 4T1-RRT-Zellen nach der Verabreichung von GCV signifikant zurückgingen. (D) Die Quantifizierung von Fluc-Signalen zeigte, dass die Angiogenese nach der Tumorzellimplantation auftrat, nach einem parallelen Trend mit Tumorwachstum und Tod, der durch GCV induziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: VEGFR2-Immunostainierung von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Geweben am 21. Tag. Repräsentative Bilder von Tumorgewebeabschnitten, die für VEGFR2 (grün) am 21. Tag gefärbt wurden. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) konterkariert. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung S1: Kurve der Tumorgröße während der Tumorprogression in vivo. Die Tumorgröße von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen nahm nach der Implantation zu, aber die Tumorgröße von 4T1-RRT-Zellen begann nach der Behandlung nach dem GCV zu verringern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S2: Zytotoxische Wirkung von GCV auf 4T1-RRT-Zellen. Die 4T1-RRT-Zellen starben mit der erhöhten Konzentration von GCV. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S3: BLI-Bild von 4T1-RR-Zellen in der Lunge. Nach der Schwanzveneninjektion von 4T1-RR-Zellen wurde das Rluc-Signal der Zellen von BLI detektiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

LV-RR und LV-RRT Verpackungsbedingungen
Komponenten MEM mittel 3-Plasmid-System 4-Plasmid-System
pLV-RR/pLV-RRT VektorA 0,25 ml 1,5 g 1,5 g
Gag-Pol + Rev-AusdrucksvektorB  1,0 g
Gag-Pol-ExpressionsvektorC 0,75 g
Rev-AusdrucksvektorD 0,3 g
VSV-G-ExpressionsvektorE 0,5 g 0,45 g
Liposomen 0,25 ml 7,5 l 7,5 l

Tabelle 1: Transfektionsbedingungen des lentiviralen Verpackungssystems zur Herstellung von LV-RR- und LV-RRT-Virusbeständen in 293T-Zellen. (A) Der pLV-cDNA-Vektor war pLV-RR bzw. pLV-RRT. (B) Der Gag-Pol + Rev-Expressionsvektor kann entweder pCMV-deltaR8.91 (TRC) oder psPAX2 (Addgene) sein. (C) Der Gag-Pol-Expressionsvektor kann einen beliebigen pMDLg/pRRE (Addgene), pLP1 (Invitrogen) und pPACKH1-GAG (SBI) auswählen. (D) Rev-Expressionsvektor sollte pRSV-REV (Addgene), pLP2 (Invitrogen) oder pPACKH1-REV (SBI) sein. (E) Der VSV-G-Expressionsvektor kann pMD.G (TRC), pMD2.G (Addgene), pCMV-VSV-G (Addgene), pVSV-G (SBI) oder pLP/VSVG (Invitrogen) auswählen. In diesem Protokoll wurde das Drei-Plasmid-System verwendet, einschließlich psPAX2, pMD2.G und pLV-RR oder pLV-RRT.

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Discussion

In diesem Protokoll wird ein nicht-invasiver dualer BLI-Ansatz zur Überwachung der Tumorentwicklung und Angiogenese beschrieben. Das BLI-Reportersystem wurde entwickelt und enthält das HSV-ttk/GCV-Selbstmordgen zur Verfolgung der Tumorprogression und Regression in vivo durch Rluc-Bildgebung. In der Zwischenzeit wird die Tumorangiogenese mit Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen mittels Fluc-Bildgebung untersucht. Dieses tumortragende Mausmodell ist in der Lage, eine praktische Plattform für die kontinuierliche und nicht-invasive Tracking-Tumorentwicklung und Tumorangiogenese durch duales BLI in einer einzigen Maus mit hoher Relevanz, Reproduzierbarkeit und Umsetzbarkeit zu bieten.

Die Angiogenese betrifft die langfristige Tumorprogression und ist damit von hoher Bedeutung1. Es ist notwendig, den Zusammenhang zwischen Tumorprogression und Angiogenese zu untersuchen. Immer mehr Anti-Angiogenese-Strategien wurden für die Krebsbehandlung untersucht, die sich auf visualisierte Monitoransätze stützen, um die Behandlungsergebnisse genau zu bewerten. Darüber hinaus ist die Neovaskularisation von Tumorgewebe nach traditioneller Strahlentherapie und Chemotherapie ein weiterer beliebter Bereich der onkologischen Forschung12,13,14. Diese Studien erfordern ein Tiermodell, das die Überwachung des Tumorwachstums und der Angiogenese in Echtzeit ermöglicht. Die pathologischen Veränderungen von Tumorgeweben in traditionellen Tiermodellen sind in der Regel von histopathologischen Untersuchungen abhängig, die Tieropfer erfordern. Diese dualen BLI-Mausmodelle helfen, die Probleme größerer Fehlerbereiche und höherer Kosten durch das Opfern von Tieren anzugehen.

In diesem dualen BLI-Mausmodell ist der wichtigste Schritt die Verwendung von zwei Arten von Luziferasen, einschließlich Fluc und Rluc, um Zellen und Angiogenese gleichzeitig zu verfolgen. Die Substratspezifität dieser beiden Luziferasen ermöglicht es, zwei Arten von BLI in einem einzigen Host durchzuführen. Außerdem ist die Halbwertszeit von Coelenterazin (dem Substrat von Rluc) sehr kurz, was dazu führt, dass die Rluc-Signale schnell verpuffen, ohne die nächste Fluc-Signalerkennung15zu beeinflussen. Daher sollte im Operationsprozess die Rluc-Bildgebung vor der Fluc-Bildgebung aufgrund der längeren Halbwertszeit von D-Luzifferin (dem Substrat von Fluc) implementiert werden. Darüber hinaus ist die Ermittlung der Inkubationszeit der Substrate der Schlüssel zum Erfassen perfekter BLI-Bilder. Der Stoffwechsel von Substraten kann die Konzentration von Substraten in vivo verändern, was zu Einer Variation der BLI-Signalintensität führt.

Im Besitz von technologischen Fortschritten wurden andere bildgebende Modalitäten für die In-vivo-Tracking bestimmter zellulärer und subzellulärer Ereignisse in präklinischen und klinischen Forschungen wie Fluoreszenz-Bildgebung, Magnetresonanztomographie (MRT) und Positron angewendet. Emissionstomographie (PET)16,17. Im Vergleich zu diesen bildgebenden Strategien hat die Biolumineszenz-Bildgebung eine hohe Empfindlichkeit, starke Spezifität und genaue Messung, was ihre einzigartige Überlegenheit auf dem Gebiet der lebenden bildgebenden Studien zeigt15. Die eingesetzte Rluc-Bildgebung ermöglicht es, Tumorwachstum und Anti-Tumor-Effekte des HSV-ttk/GCV-Propharmasystems dynamisch bei einem lebenden Tier zu visualisieren. Abgesehen von der Überwachung subkutaner Gewebe wurde Rluc verwendet, um Zellen in der Lunge durch BLI-Technologie in anderen Forschungen zu verfolgen. Nach der Schwanzveneninjektion von 4T1-RR in eine Maus haben wir diese Maus in das lebende Bildgebungssystem verschoben, um die Rluc-Signale nach Verabreichung von CTZ zu erkennen. Das Bild des Rluc-Signals zeigte, dass sich die injizierten Zellen hauptsächlich in der Lunge befanden (Abbildung S3). Wie bereits erwähnt, kann das Rluc-Berichtsgen verschiedene Krebszellen an verschiedenen Orten nachverfolgen, was die volle Nutzung dieses Mausmodells in der Krebsbiologieforschung fördert.

Zusätzlich zu diesen Vorteilen kann die BLI-Technologie verwendet werden, um die Expressionsniveaus bestimmter Moleküle zu erkennen. Bisher wurden Fluorophor-Reportergene, die unter entsprechenden Promotoren exprimiert werden, verwendet, um die Gefäßentwicklung bei subkutanen Tumoren zu messen. Während der Tumorprogression können die Gefäßstruktur und Moleküle durch die chirurgisch implantierten Fensterkammern bei Mäusen beobachtet werden. Diese Methode hat jedoch immer noch Einschränkungen, einschließlich unvermeidlicher Invasion, Fluorophor-Abschreckung und starkem Hintergrundrauschen. Das in der Vegfr2-Fluc-KI-Maus etablierte tumortragende Mausmodell erzeugt eine nicht-invasive Beobachtung des Expressionsniveaus von Vegfr2, dem wichtigsten Molekül in der Tumorangiogenese. Inzwischen zeigen die BLI-Bilder eine große Spezifität ohne Rauschen. Das duale BLI-Mausmodell kann breitere Anwendungen bei der Untersuchung der potenziellen molekularen Mechanismen bei der Tumorprogression und -regression haben.

Die BLI-Technologie, die auf der Expression von Rluc (Emission 480 nm) und Fluc (Emission 562 nm) basiert, wurde in einer Reihe von In-vivo-Krankheitsmodellen übernommen. Der weit verbreitete Einsatz der BLI-Technologie in vivo wurde aufgrund der geringen Empfindlichkeit der Biolumineszenz bei Wellenlängen unter 600 nm beim Nachweis von tiefem Gewebe eingeschränkt. Dies wird durch die Absorption und Streuung von Licht verursacht, wodurch das nachweisbare Signal um das Zehnfache des Zentimeters Gewebe verringert wird. Um diese Frage zu beantworten, haben einige Forscher Studien auf die Rotstrahler-Varianten von Fluc konzentriert, die Licht über 600 nm18emittieren. Da die Absorption und Streuung von Licht durch die Verwendung dieser Varianten von Fluc18,19bemerkenswert reduziert werden kann, werden die Anwendungen von Luziferase-Varianten dieses Protokoll auf ein größeres Feld der onkologischen Forschung ausdehnen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde unterstützt durch das National Key R&D Program of China (2017YFA0103200), die National Natural Science Foundation of China (81671734) und Key Projects of Tianjin Science and Technology Support Program (18YFZCSY00010), Fundamental Research Funds for den Zentraluniversitäten (63191155). Wir erkennen die Revisionen der Gloria Nance an, die für die Verbesserung der Qualität unseres Manuskripts wertvoll waren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA Gibco 25200072
1.5 mL Tubes Axygen Scientific MCT-105-C-S
15 mL Tubes Corning Glass Works 601052-50
293T ATCC CRL-3216
4T1 ATCC CRL-2539
60 mm Dish Corning Glass Works 430166
6-well Plate Corning Glass Works 3516
Biosafety Cabinet Shanghai Lishen Scientific Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) Sigma-Aldrich 15205
Cell Counting Kit-8 MedChem Express HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator Thermo Fisher Scientific 4111
Coelenterazine (CTZ) NanoLight Technology 479474
D-luciferin Potassium Salt Caliper Life Sciences 119222
DMEM Medium Gibco C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS) BIOIND 04-001-1A
Fluorescence Microscope Nikon Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV) Sigma-Aldrich Y0001129
Graphics Software GraphPad Software Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles Becton Dickinson 328421
Isoflurane Baxter 691477H
Lentiviral Packaging System Biosettia cDNA-pLV03
Liposome Invitrogen 11668019
Living Imaging Software Caliper Life Sciences Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Lumina II
MEM Medium Invitrogen 31985-070
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning Glass Works R21031399
Polybrene Sigma-Aldrich H9268-1G
RPMI1640 Medium Gibco C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge Thermo Fisher Scientific Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator Haier DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System XENOGEN Corporation 7293

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References

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