형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

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Summary

경두개 광학 화상 진찰은 온전한 두개골을 통해 살아있는 마우스의 피질에 있는 뇌척수액 수송의 광시야 화상 진찰을 허용합니다.

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Sweeney, A. M., Plá, V., Du, T., Liu, G., Sun, Q., Peng, S., Plog, B. A., Kress, B. T., Wang, X., Mestre, H., Nedergaard, M. In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59774, doi:10.3791/59774 (2019).

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Abstract

설치류의 뇌척수액(CSF) 흐름은 주로 트레이서의 생체 내 정량화를 사용하여 연구되었습니다. 2 광자 현미경 검사법 및 자기 공명 화상 진찰과 같은 기술은 CSF 교류의 생체 내 정량화에서 가능하게 했습니다 그러나 감소된 화상 진찰 부피 및 낮은 공간 해상도에 의해 각각 제한됩니다. 최근 연구는 CSF가 설치류 피질의 pial 및 관통 동맥을 둘러싼 관통 공간의 네트워크를 통해 뇌 의 자렌치마를 입력 하는 것으로 나타났습니다. CSF의 이러한 관능적 진입은 림프계의 주요 동인이며, 독성 대사 용질(예를 들어, 아밀로이드 β)의 통관에 연루된 통로이다. 여기에서, 우리는 살아있는 마우스의 본래 두개골을 통해 형광 CSF 추적자의 실시간, mesoscopic 화상 진찰을 허용하는 새로운 거시적인 화상 진찰 기술을 설명합니다. 이 최소 침습 적 방법은 다양한 실험 설계를 용이하게하고 CSF 역학의 단일 또는 반복 테스트를 가능하게합니다. 대용량 자리는 높은 공간 및 시간 해상도를 가지고 있으며, 그들의 큰 갠트리 및 작업 거리는 행동 장치에서 작업을 수행하는 동안 이미징을 허용합니다. 이 화상 진찰 접근은 이 기술에서 얻은 2 광자 화상 진찰 및 형광 측정을 사용하여 전 생체 외 형광 및 무선 표지한 추적자의 정량화와 강하게 상관관계가 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 경두개 거시적인 화상 진찰이 살아있는 마우스에 있는 림프수송을 평가하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 기술합니다, 더 비싼 화상 진찰 양식에 접근가능한 대안을 제안하.

Introduction

뇌척수액 (CSF)은 뇌와 척수를 목욕시키고 항상성을 유지하고 영양분을 공급하며 두개내 압력을 조절하는 데 관여합니다1. 지주막 공간에서 CSF는 피질 피질 동맥을 둘러싼 관통 공간 (PVS)의 네트워크를 통해 뇌로 들어간 다음 관통 하는 동맥을 따라 아래로 흐른다2. 일단 자중에서, CSF는 간질 액체 (ISF)와 교환하고, 낮은 저항성 백색 물질 관 및 perivenous 공간을 통해 뇌에서 아밀로이드 β (Aβ)및 타우 단백질 응집체와 같은 유해한 대사 산물을 운반2,3 . 이 통로는 astroglial aquaporin-4 (AQP4) 채널에 의존하고 따라서 신경교 림프 (glymphatic)시스템 4라고 불려왔다. 신경필의 노폐물은 궁극적으로 CSF-ISF로부터 두개골 신경 근처의 림프관과 자궁 경부 림프절쪽으로 수막에서 5. 이 시스템의 실패는 알츠하이머병 6,7,외상성 뇌 손상 3, 허혈성및 출혈성 뇌졸중 8과 같은여러 신경질환에 연루되어 있다.

CSF 수송은 과거에 시스터나 마그나 (CM)9,10 및 림프관 연구에 트레이서를 주입하여 가시화 할 수 있으며, 주로 2 광자 현미경4,11,12, 13,자기 공명 영상 (MRI)14,15,16,17,및 생체 내 이미징3,6,11, 도 18을 통해 트레이서 역학을 평가한다. 2 광자 현미경 검사법은 그것의 높은 공간 해결책 때문에 PVS및 실치에 있는 CSF 추적자의 상세한 화상 진찰을 위한 적당한 방법입니다, 그러나, 보기의 좁은 필드를 가지고 있고 침략적인 두개골 창 또는 두개골의 숱이 필요합니다. Ex vivo 화상 진찰은, 면역 성 화학과 조합하여, 전체 두뇌19에단 하나 세포에서 구역 수색하는 다단계 분석을 가능하게 합니다. 그러나, 사후 모템 조직을 관찰하는 데 필요한 관류-고정 과정은 CSF 흐름 방향에 중대한 변화를 일으키고 PVS를 붕괴시키고, 트레이서(12)의 분포 및 위치를 현저하게 변화시다. 마지막으로 MRI는 전체 뮤린과 인간의 뇌에 걸쳐 CSF 흐름을 추적 할 수 있지만, 그것은 공간 및 시간 적 흐름의 부족.

새로운 기술, 경두개 거시적 이미징은 살아있는 마우스의 전체 등지 피질에서 경막 CSF 수송의 광시야 이미징을 가능하게함으로써 이러한 제한 사항 중 일부를 해결합니다. 이러한 유형의 이미징은 멀티밴드 필터 큐브, 튜닝 가능한 LED 광원 및 고효율 CMOS 카메라10을사용하는 에피플루서성 대식경으로 수행된다. 이 설정은 두개골 표면 아래 1-2mm까지 PVS를 해결할 수 있으며 두개골을 완전히 그대로 유지하면서 피질 표면 아래 5-6mm까지 형광을 감지 할 수 있습니다10. 여기 파장을 빠르게 조정할 수 있는 멀티밴드 필터와 LED를 사용하면 여러 형광단을 사용할 수 있으므로 CSF는 동일한 실험에서 다양한 분자량 및 화학적 특성의 트레이서로 라벨을 부착할 수 있습니다.

이 절차는 두개골을 노출하고 화상 진찰 세션 도중 머리를 안정시키기 위하여 가벼운 무게 헤드 격판을 두기 위하여 간단하고, 최소침습 수술이 필요합니다. 트레이서는 두개골에 드릴링하거나 피펫 또는 캐뉼러9,20으로피질 조직을 관통하지 않고 CM으로 전달 될 수 있습니다. CM 캐뉼라와 헤드 플레이트는 며칠에서 몇 주까지 안정적으로 유지되며 클래식 엔드포인트 시각화에 비해 보다 복잡한 실험 설계를 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 경두개 거시적 이미징이 마취/수면 또는 깨어있는 마우스의 CM에 형광 CSF 추적자의 급성 또는 만성 주입 다음 림프계 기능을 연구하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

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Protocol

모든 실험은 로체스터 대학에서 동물 자원 대학위원회 (UCAR, 프로토콜 번호 2011-023)에 의해 승인되고 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 가이드에 따라 수행되었습니다.

1. 시스터나 마그나 캐뉼라, 헤드 플레이트 및 헤드 홀더 준비

  1. 수술 전에 모든 수술 기구와 머리 판을 살균하십시오.
    참고: 형광 트레이서는 시스터나 마그나 캐너레이션을 통해 CSF로 직접 전달됩니다. 이 절차에 대한 자세한 지침은 Xavier 외9를 참조하십시오.
  2. 간단히, 바늘 드라이버를 사용하여, 30G x 12.7 mm (1/2 인치) 바늘의 끝을 휴식, 아래로 방법의 3/4, 폴리에틸렌10 (PE10) 튜브 (약 45cm 길이)의 한쪽 끝에 바늘의 무딘 끝을 배치합니다. 경사만 PE10 튜브의 테두리 밖으로 튀어나오는지 확인합니다.
  3. 다른 30G 바늘의 경사진 끝의 1/4을 끊고 나머지 바늘의 무딘 끝을 PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 놓고 플라스틱 루어 잠금 장치가 여전히 부착되어 있습니다.
  4. 멸균, 인공 CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO 4, 2 mM MgSO4,2 mM CaCl2,10 mM 포도당, 및 26 mM NaHCO 3)로 100 μL 유리 주사기를 채웁니다.
  5. 주사기를 선의 끝에 부착하고 경종 바늘의 끝에 도달 할 때까지 aCSF로 채웁니다. 공기 열이 가변 주입 볼륨에 더 취약하기 때문에 주사기가 공기가 아닌 aCSF로 채워지는 것이 중요합니다.
  6. 만성 실험의 경우 aCSF로 채워진 선을 두고 1.7단계를 건너뜁니다.
  7. 급성 실험의 경우 주사기를 주입 펌프에 놓고 약 5mm의 공기를 배출하여 혼합을 방지합니다. 그 후, 실험에 필요한 트레이서의 총 부피를 철회하십시오 (죽은 공간 손실로 인해 20 % 추가 권장).
    참고: PE10 튜브는 트레이서를 적재할 때 기포가 유리 주사기의 플라스틱 커프에 들어가지 않도록 충분히 길어야 합니다. 일반적인 실험의 경우, 프로토콜은 0.5%에서 aCSF에서 희석된 알렉사 플루어 647(BSA-647)에 컨쥬게이징된 소 혈청 알부민10 μL을 사용한다.
  8. 헤드 플레이트가 헤드 홀더에 맞는지, 사용 중인 마우스에 적합한 크기인지 확인합니다. 이를 보장하기 위한 해부학적 마커: 창의 상단 테두리가 안구 선과 정렬되고 후방 테두리가 후두문 문장에 rostral 떨어집니다.
    참고: 스테인리스 스틸 헤드 플레이트는 멸균 및 재사용할 수 있습니다. 대부분의 시아노아크릴레이트 혼합물은 아세톤 용액으로 제거할 수 있습니다.

2. 외과 적 수술

  1. 마우스의 무게와 마취(예: 케타민/자일라진; 케타민 100 mg/kg 케타민, 10 mg/kg 자일라진; i.p.).
  2. 마우스가 더 이상 발가락 핀치에 반응하지 않고, 목과 머리를 멸균수로 적시고 클리퍼를 사용하여 면도하십시오. 부위를 면도한 후 알코올 면봉으로 부위를 다시 닦아 잔여 모발을 제거합니다.
    참고 : 클리핑하기 전에 모피를 적시면 절개 후 이미징 창의 머리카락 양이 크게 줄어듭니다.
  3. 온도 조절 패드 위에 마우스를 입체 프레임에 놓고 건조하지 않도록 마우스의 눈에 석유 안과 연고를 적용합니다.
  4. 노출된 피부를 클로르헨시딘 면봉으로 닦아줍니다. 2 분 후 알코올 닦아 클로르헨시딘을 제거하십시오. 마지막으로, 건조에 남아있을 수있는 요오드 용액을 적용합니다.
  5. 두개골과 목의 상단에 피하 진통 (0.25 % 부피바카인 HCl)을 주입하십시오.
  6. 후두 문으로 덮여 목의 부분에서 시작, 오버리 피부에 중간 선을 잘라 하고 interorbital 라인을 향해 rostrally 계속. 측두근육이 두개골에 삽입되는 국경으로 측면으로 절개합니다. fusiform 절개의 모든 피부를 제거하여 전두엽 및 정수리 뼈를 모두 노출시하십시오.
    주의 : 레트로 비동은 눈과 후방 안면 정맥의 큰 가지에 꼬리를 거짓말피나에 rostral 거짓말. 이러한 구조를 절약하기 위해 절개를 할 때주의하십시오. 이 경우, 몇 분 동안 멸균 면봉으로 지혈을 유지하여 출혈을 중지하고 계속.
  7. 멸균 식염수로 두개골을 관개하고 면봉을 사용하여 표면을 청소하여 이물질과 머리카락이 없는 경우 이미지 품질을 방해합니다. 두개골 투명도는 골막과 지나치게 근막을 그대로 두면 가장 잘 보존됩니다.
    참고: 이러한 구조물이 실수로 제거되면 시간이 지남에 따라 두개골이 건조하고 불투명해질 수 있습니다. aCSF로 재적감 또는 파라핀 오일과 글리세롤의 혼합물을 사용하여 급성 실험21에서 두개골 반사를 감소시소.
  8. 이 절차의 외과 적 세부 사항에 대한, 자비에르 외 9를 참조하십시오 -시스터나 마그나 캐뉼라를 삽입 진행 .
  9. CM 캐뉼라를 삽입한 후, 치아 시멘트를 치아 시멘트와 치아 아크릴산염 접착제를 테두리 주위의 머리 판의 복부 쪽에 적용하고 머리 판의 앞쪽 테두리가 비강 뼈의 후방 끝과 정렬되도록 두개골에 놓습니다. 스테리오 테두리는 시상 봉합사(midline)가 창에 대해 중앙에 있고 직선인지 확인하면서 심상 골격의 전방 측면과 정렬됩니다(그림1B).
  10. 접착제 가속기 몇 방울을 사용하여 헤드 플레이트의 위치를 고정합니다. 남은 틈을 시멘트 혼합물로 채우고 가속기로 경화하십시오.
    주의: 시아노아크릴레이다가 마우스의 눈과 접촉하지 않거나 이미징 창을 막지 않도록 하십시오.
  11. CM 캐뉼라를 헤드 플레이트에 붙이면 운반 중에 또는 마우스가 깨어날 때 분리되지 않도록 하십시오.
  12. 급성 실험의 경우 2.16단계로 건너뜁니다.
  13. 만성 실험의 경우, 노출된 두개골에 투명 건조 시아노아크릴레이트 접착제의 얇은 층을 적용, 이러한 이미징을 방해하기 때문에 거품을 생성하지 않도록주의. 접착제는 두개골에 대한 보호를 제공하고 이미징을 방해하지 않습니다. 접착제가 절개 테두리의 피부에 노출 된 두개골을 덮는지 확인하십시오.
  14. CM에서 aCSF 채워진 PE10 튜브 를 2-3cm 잡고 고온 소작 팁으로 라인을 잘라 지혈 클램프를 사용합니다. 분리되면 녹은 PE10 튜브를 평평하게 하여 캐뉼라를 밀봉합니다.
    주의: 캐뉼라가 밀봉된 후까지 클램프를 놓지 말고 CSF 누공을 방지하기 위해 튜브에 누출이 없는지 확인하십시오.
  15. 카프로펜(3일 동안 24시간마다 5mg/kg씩, 즉 3일 동안) 마우스를 온도 제어식 단일 보관 케이지로 되돌리고 이미징 전에 최소 24시간 동안 회복할 수 있도록 하십시오. 마우스가 흉골 의힘을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 방치하지 마십시오. 그대로 두개골 창은 몇 주 동안 안정적으로 유지됩니다.
    참고: 만성 실험은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
    주의: 일부 수술 후 합병증은 다음과 같습니다 : 두족혈종 / 상하 혈종, CSF 누공 및 감염.
  16. 급성 실험의 경우, 두개골이 고정된 위치에 있도록 헤드 플레이트를 사용하여 마우스를 헤드 홀더에 넣습니다. 마취 수준을 확인하고 마우스 아래에 가열 패드를 놓으십시오. 이제 마우스를 대식어로 이동합니다.
    주의: 수레에 주입 펌프와 함께 마우스를 조심스럽게 운반하십시오. CM 캐니언이 빠지면 두개내 압력이 떨어지고 CSF 누출이 실험 결과를 변경합니다.

3. 이미징을 위한 마우스 준비

참고: 이 프로토콜은 이미징 실험이 마취(단계 3.1에서 시작) 또는 깨어있는 마우스(단계 3.2에서 시작)에서 수행될지 여부에 따라 달라집니다.

  1. 마취 된 마우스
    1. 대용량 경의 무대에 헤드 홀더를 놓고 주사기 펌프에서 CM 캐뉼러에 이르는 라인에 꼬임이 없는지 확인하고 이것이 트레이서 주입에 영향을 줄 수 있기 때문에 팽팽하지 않습니다.
    2. 좋은 산소를 나타내는 점막의 호흡 속도와 분홍색 착색을 관찰하십시오. 필요한 경우 수분 수준을 확보하기 위해 피하적으로 식염수 주입. 동물이 충분히 마취되었는지 확인하고 필요한 경우 다시 복용하십시오.
    3. 대용량 카메라와 LED를 켜고 라이브 모드를 시작합니다.
    4. 시상 봉합사를 평행하게 하고 이미지의 중앙에 중심을 두는 양두 봉합사와 하단의 양두봉합사가 명확하게 시각화될 수 있도록 이미징 필드의 배율을 확인합니다(그림1C). 제자리에 들어가면 테이프로 헤드 홀더를 대용량 경사 단계에 고정하십시오.
    5. 노출된 두개골에 대식어를 집중시다. 상대적으로 큰 피사계 심도를 갖는 대식경에도 불구하고 마우스의 두개골의 곡률은 특정 영역의 초점만 허용합니다. 초점 평면이 관상 봉합사에 정수리 뼈 후방의 측면에 위치 할 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.
      참고: 이것은 대부분의 CSF 유입이 발생하는 중간 대뇌 동맥(MCA)의 위치입니다(그림1D,E)10.
  2. 깨어 있는 생쥐
    1. 화상 진찰 세션 에 앞서, 동물은 머리 판 수술에서 적어도 24 시간 동안 회복시키십시오. 더 긴 회복 기간 (5-7 일)도 권장됩니다. 이 시간 동안, 마우스를 훈련하여 회수 기간 동안 하루에 0.5-1 시간 동안 구속 튜브의 무대에 고정될 수 있도록 훈련시.
      참고 : 습관은 마우스가 마취없이 헤드 홀더에 부착 할 수 있으며 실제 실험 중에 스트레스와 불안을 줄일 수 있습니다. 이것이 가능하지 않고 마취가 실험을 방해하지 않는 경우, 흡입 마취제의 유도 용량 (예를 들어, 1-2 L / min O2 유량에서 isoflurane 2 %)을 사용하여 마우스를 헤드 스테이지에 신속하게 부착 할 수 있습니다.
    2. 마우스가 헤드 홀더와 구속 튜브에 고정되면 3.1.1-3.1.5 단계를 따릅니다.

4. 형광 CSF 추적기 주입

  1. 급성 CM 통조림
    1. 트레이서가 이미 캐뉼라에 적재된 후 1.6단계에서 시스터나 마그나에 배치되기 전에 주입 펌프를 원하는 속도 및 부피로 설정합니다. 일상적으로 사용되는 주입 패러다임은 1-2 μL/min에서 5-10 μL이지만, 이러한 매개 변수는 특정 실험 또는 동물의 크기 및 나이에 따라 조정할 수 있습니다.
  2. 만성 CM 통조림
    1. 이미징 세션을 시작하기 전에 급성 실험에 대한 단계 1.2-1.7을 따라 주입 라인을 준비하여 추적자를 전달합니다.
    2. 라인이 준비되면, 지혈클램프를 사용하여 만성 CM 캐뉼라의 밀봉된 단부절단을 절단하였다. 4.2.1 단계에서 준비된 라인에서 바늘을 꺼내 캐뉼라에 부드럽게 삽입하십시오. 클램프를 해제하고 주사기 펌프를 사용하여 CSF 트레이서를 CM에 이식된 바늘에 도달할 때까지 실험을 위해 원하는 주입 속도(예: 2 μL/min)로 진행합니다.
      주의 : 바늘이 라인을 연결할 때 튜브를 관통하는 경우 바늘을 제거하고 피어싱 된 세그먼트를 잘라이 단계를 반복하십시오. PE10 튜브의 찢어짐은 누출을 일으키고 실험 결과에 영향을 미칩니다.

5. 이미징 세션 설정

  1. 주입되는 형광 추적자에 기초하여, 각 채널에 대한 여기 파장 및 노출 시간을 결정한다. 타임랩스 이미징의 시간적 해상도를 최대화하기 위해 추적자를 시각화하는 데 필요한 최단 노출 시간을 선택합니다. 이러한 노출 시간은 상이한 동물들 사이의 CSF 수송을 비교하는 것을 목표로 하는 모든 후속 실험에 사용될 것이다.
    참고: 한 가지 팁은 CM 라인의 추적자를 사용하여 노출 시간을 조정하는 것입니다. 이 방법은 유용한 첫 번째 방법이지만 시간이 지남에 따라 최적화되어야 합니다.
  2. 실험 기간과 이미지를 획득할 간격을 선택합니다. 실험은 일반적으로 glymphatic 수송의 어떤 단계에 따라 30-60 분 사이에서 지속됩니다 관심의. 프레임 속도는 1프레임/분이며 대부분의 실험에 충분합니다.
  3. 파일 이름과 저장 디렉토리를 설정합니다.
  4. 이미징이 다른 변수(예: 심전도, 동맥 혈압, 전기생리학)의 동시 수집 이외에 수집될 경우, 대식검 및 펌프는 데이터 수집 소프트웨어로 트리거될 수 있도록 프로그래밍될 수 있다. 다음 단계로 이동하기 전에 매크로범위의 트리거링 기능이 올바른지 확인합니다.

6. 경두개 광학 이미징 실험

  1. 트레이서 주입과 이미징을 동시에 시작합니다.
  2. CM 캐뉼라와 PE10 튜브에 누출 흔적이 있는지 정기적으로 확인하십시오. CM에서 트레이서 누출이 있는 경우 이 실험의 결과를 제외해야 합니다.
    참고 : 추적자가 소뇌에 축적되기 시작하고 MCA의 림프 경로를 여행하지 않는 경우, CM 캐뉼라가 소뇌에 주입 되었을 가능성이 높습니다. 이 데이터는 포함되지 않아야 합니다.
  3. 급성 실험의 경우, 실험이 완료 된 후 현미경에서 마우스를 제거하고 여전히 적절하게 마취되어 있는지 확인하십시오. 신속하게 마우스를 참수하고 뇌 조직을 수확. 침지-4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)로 뇌를 고정시다.
    1. 만성 실험의 경우, 이미징이 완료되면 캐뉼라에서 CM 라인을 제거하고 멸균 aCSF로 세척하고 CM 캐뉼라를 고온 소작 팁으로 다시 밀봉하십시오. 헤드 스탠드에서 마우스를 제거하고 케이지로 되돌아갑니다. 추가 이미징이 필요하지 않을 때까지 이 과정을 반복한 다음 6.3단계를 따릅니다.

7. 데이터 분석

참고: CSF 프런트 트래킹과 같은 Matlab 기반 분석은 이러한 이미징 데이터 세트10,22의트레이서 전선에서 대량의 정량적 데이터를 추출할 수 있습니다. 그러나 이러한 파일 형식은 Fiji23과같은 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어에서 쉽게 가져오고 분석 할 수 있습니다.

  1. Bio-Formats 가져오기 도구를 사용하여 이미지 스택을 피지로 가져옵니다. 이 함수는 시간 및 픽셀 해상도를 포함하는 파일 메타데이터를 유지합니다. 이미지 스택을 .tiff 파일로 저장합니다.
  2. 다각형 선택 도구를 사용하여 두개골 주위또는 관심 영역(ROI)을 수동으로 그립니다. 예를 들어, 그림 1G에서 ROI는 외상성 뇌 손상 후 의 측문및 반대반구에 대해 별도로 그려졌다. ROI 관리자(분석및 도구>ROI관리자)에 ROI를 추가하고 저장해야 합니다.
    참고: CSF 수송은 두 가지 주요 방법으로 정량화될 수 있습니다: 1) 시간 동안의 평균 형광 강도 또는2) 유입 영역은 임계값을 적용한 후 ROI 또는 총 영역(mm2)의 백분율로 표현된다. 후자의 방법(도1H)은다음 단계에서 설명한다.
  3. 최대 형광으로 프레임의 임계값을설정합니다(이미지>adjust>임계값 선택...). Otsu와 같은 자동화된 임계값 방법은 일반적으로 CSF 추적자를 감지하는 데 적합합니다. 임계값을 적용합니다.
  4. 앞으로 진행하기 전에 분석>세트 측정에서 옵션 면적면적 분율이 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 ROI 관리자에서 More>다중 측정을선택합니다.
  5. 출력에서 ROI의 영역 값을 사용하여 %영역 값을 mm2로 변환합니다. %영역 값은 CSF 추적자를 통해 등대 피질 표면의 백분율을 반영합니다.
  6. 시간 함수로 MM2로 CSF 트레이서 유입을 플로팅합니다.

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Representative Results

CSF 유입은 뮤린 피질에 있는 CSF 추적자 수송의 mesoscopic 화상 진찰을 허용하는 epifluorescent 대식경 (그림1A)에심상합니다. 전체 두개골 머리 플레이트는 중앙에 있는 전두엽 및 정수리 뼈 둘 다, 및 interparietal 뼈의 rostral 부분 의 가시화를 허용합니다 (그림1B). 이미징 동안, 비전두, 시상, 관상 및 양두봉합사를 쉽게 식별할 수 있다(도1C). CM에 CSF 트레이서의 주입이 시작되면 (그림1D),트레이서 형광은 기저 시스터, olfactofrontal cistern, 및 송과석 오목 근처의 사분위수CSF의 큰 풀에서 처음 보입니다 (그림1E) ,왼쪽)을 참조하십시오. CSF 추적자는 중간 대뇌 동맥의 피질 피질 가지의 주간판 공간을 따라 뇌를 입력 (MCA) (그림1E,오른쪽).

경두개 광학 화상 진찰은 외상성 뇌 손상 후에 림프 기능을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다 (TBI)3. 마우스는 적당한 TBI를 수신하고 직후형광 CSF 트레이서(BSA-647)를 CM24에주입하였다. CSF 전송은 TBI(그림1F)후 60분 동안 이미지화되었다. 거시적 이미징은 트레이서가 타막전도 시스터에서 처음 보이지만 피질 PVS를 따라 림프유입이 TBI의 측면에서 완전히 폐지되었음을 보여줍니다 (그림1G,Supp. Movie1). 글리파틱 기능에 대한 TBI의 억제 효과는 여러 가지 다른 트레이서 정량화 방법을 사용하여 나타났으며 부상 후 본 Aβ와 타우의 축적 사이의 관계를 뒷받침할 수 있었다3. 생체 내 이미지의 정량적 분석은 동측 유입 영역이 반대반구에 비해 거의 3분의 1 감소한다는 것을 보여준다(도1H).

Figure 1
그림 1. 경두개 거시적 이미징. (A) 거시 적 이미징 설정의 회로도. (B) 두개골에 머리 판의 위치의 등도보기. 비강, 정면 및 정수리 뼈가 모두 볼 수 있습니다. (C) CSF 트레이서가 나타나기 전에 이미징 중에 노출된 마우스 두개골이 나타나서 손상되지 않은 두개골의 모든 두개골 봉합사를 명확하게 표시합니다. 스케일 바: 1mm (D) CSF 트레이서의 측면 도면이 시스터나 마그나(CM)로 진입하고 림프통로를 따라 기저 통에서 이동한다. (E, 왼쪽패널) 케타민 자일라진 마취 야생형 마우스에서 림프관 유입의 거시적 이미징은 CM 주사 후 20분(BSA-647; 2 μL/min에서 10 μL). CSF 트레이서가 비선봉골 아래의 로스트랄 라인 정맥 주위의 올팩트포프탈 시스테르에서, 시상 봉합사 아래의 우수한 시상 부비동 일부를 따라, 그리고 람도이드 아래의 횡부비동을 둘러싼 송과상 오목에서 볼 수 있습니다. 봉합 사. (E, 오른쪽패널) 왼쪽에 있는 이미지의 디지털 배율은 이러한 현미경으로 얻은 높은 공간 분해능을 나타낸다. CSF 트레이서는 중간 대뇌 동맥(MCA)10의시반 공간 내에서 이동합니다. 배율 표시줄: 0.5 mm (F) 실험 타임라인. 마취된 야생형 마우스는 적당한 외상성 뇌 손상(TBI)24를 받았고 CM 주사 직후(BSA-647; 10 μL 에서 2 μL/min), 60분의 거시적 이미징을 받았다. (G) TBI (파선) 후 CSF 트레이서 전송의 시간 경과 이미지. 스케일 막대: 1mm (H) 유입 영역(mm2)은 60분 실험 동안 각 반구에 걸쳐, (G), TBI(입시측)를 수신한 반구 및 하지 않은 반구(contralateral)에서 정량화하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 1. 사용자 정의 헤드 플레이트의 청사진. (A,B) 경두개 거시 적 이미징 프로토콜에 사용되는 사용자 정의 헤드 플레이트의 정확한 측정 (mm). 속이 빈 헤드 플레이트 (C)와전체 헤드 플레이트 (D)의 3D 회로도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 영화 1. 왼쪽 정수리 뼈에 적당한 외상성 뇌 손상 후 CSF 수송의 시간 경과 영상. 지속 시간 : 60 분. 규모 표시 줄 : 1mm이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 상업적으로 이용 가능한 형광 대식검 및 추적자를 사용하여 살아있는 마우스에 있는 경두개 CSF 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위한 상세한 프로토콜을 기술했습니다. 이 기술은 간단하고 최소 침습적이지만 정량적입니다. 생체 내 이미징은 CM 전달 후 3H-dextran 및 14C-inulin을 포함한 무선 표지 추적자의 액체 섬광 계수 계수와 전 생체 코로나 섹션 정량화10과같은 민감한 방법과 잘 연관되어있습니다. 18. 2 광자 현미경 검사법을 가진 검증은 대식경의 밑에 피질 혈관을 따라 보인 CSF 추적자가 MCA와 그 가지10의perivascular 공간 안에 주로 위치한다는 것을 보여줍니다. 이러한 CSF 유입 경로는 림프계(19)의 중요한구성요소이다. 이 프로토콜에서 다루지 않더라도, 이들 셋업은 또한 수막 및 자궁 경부 림프증25,26과같은 CSF 클리어런스 경로를 이미지화하는데 사용될 수 있다.

헤드 플레이트 설계의 개선으로 시간이 지남에 따라 동일한 마우스의 만성, 안정적이고 넓은 필드 이미징이 가능합니다. 헤드 플레이트 모양, 크기 및 무게는 각 특정 용도에 맞게 조정할 수 있습니다. 레이저 절단 및 3D 프린팅의 발전으로 사양에 대한 몇 가지 제한사항이 있습니다. 머리 도금은 또한 마취 또는 깨어있는 동물의 세로 이미징을 허용하고 그대로 두개골을 통해 이미지 할 수있는 능력은 두개골 또는 얇은 두개골 창(27)의 배치와 관련된 신경 염증 및 부종을 피할 수 있습니다. 28세 , 29. 이것은 두개골 버 구멍을 사용하여 피질을 통해 형광 추적자를 줄임피즘 또는 측면 심실로 입체적으로 전달하기 때문에 중요한 이점이며 림프 기능(20,26)을크게 감소시다. 대부분의 상용 대용량식의 큰 갠트리 및 작동 거리는 마우스가 바퀴를 달리거나 떠다니는 미로를 포함하여 다양한 구성으로 스테이지에 고정될 수 있도록 합니다. 마우스는 깨어있는 화상 진찰을 용이하게 하기 위하여 5-7 일 복구 기간 도중 현미경 단계에 고정되는 헤드가 되는 훈련되고 습관화될 수 있습니다30.

이 방법의 주요 한계 중 하나는 2 광자 현미경 검사법10에비해 대식경의 낮은 침투 깊이입니다. 이 장치는 손상되지 않은 두개골 아래 의 피질 표면의 몇 밀리미터만 해결할 수 있습니다. 그러나, 이것은 조직에서 더 깊게 일어나는 프로세스의 화상 진찰을 제한하는 동안, 입력의 주요 경로가 주로 등쪽 피질 표면의 주요 동맥 의 주위에 있기 때문에 일반적으로 림프 분석에 대한 문제가 되지 않습니다. 더 깊은 구조를 해결할 수 없음에도 불구하고 고효율 과학 CMOS 카메라가 있는 대용량 탐지기는 형광 감지 기능이 뛰어나습니다. 추적자가 뇌 표면에 위치하지 않음에도 불구하고, 총 형광 강도는 CM 주사10의시작 후 매 시점에서 뇌에서 발견되는 트레이서의 양과 상관관계가 있다. 이러한 파라미터는 더 긴 파장에서 이미징을 통해 조직 자동 형광과 빛의 산란을 감소시키고 낮은 방출보다 우수한 신호 대 잡음 비를 가지기 때문에 원적외선, 근적외선 또는 적외선 추적기를 사용하여 개선됩니다. 파장 형광화. 표준 대식범위는 동일한 실험에서 하나 이상의 추적자를 이미징할 수 있게 합니다. 대용량의 구성에 따라 필터 포탑은 획득 간에 회전해야 하므로 얻을 수 있는 시간해상도가 크게 줄어듭니다. 이는 조정 가능한 LED와 다중 대역 필터 큐브를 사용하여 개선할 수 있습니다. 이러한 개선에도 불구하고, 다채널 이미징은 LED가 여기 파장 사이를 전환하는 동안 획득이 지연되기 때문에 실제로 동시적이지 는 않습니다. 대부분의 거시적 설정과 호환되는 이미지 분할 광학을 사용하여 동시 듀얼 채널 이미징을 구현할 수 있습니다. 그러나 CMOS 카메라의 전체 해상도(2048 x 2048 픽셀)를 해상도의 절반(1024 x 1024 픽셀)으로 두 개의 시야로 나누어 공간 해상도를 희생합니다. CMOS 카메라는 이러한 활용도에 매우 적합하지만 CCD 카메라의 사용은 이 응용 프로그램에도 적용될 수 있습니다. 시간적 분해능을 감소시키는 추가 요인은 일반적으로 50 - 1000 ms 사이의 범위인 선택된 형광단의 적절한 여기를 위해 필요한 노출 시간입니다. 노출 시간을 늘리고 공간 해상도를 희생하여 프레임 속도를 증가시킵니다. 이러한 한계에도 불구하고 경두개 거시적 멀티채널 이미징은 높은 공간 해상도로 10~20Hz 사이의 프레임 속도를 달성할 수 있습니다.

경두개 거시적 이미징의 최근 예는 AQP4의 중요성을 입증하기 위해 마우스10,20 및 혈소판 유래 성장 인자 B(PDGF-B) 유지 모티프 녹아웃 마우스(22)를 녹아웃마우스(22)를 녹아웃으로 밀어내는 아쿠아포린-4(AQP4)를 사용하였다. 및 림프계에서 PDGF-B. 연구 는 녹아웃 마우스 라인과 비교하기 위해 C57Bl6 야생형 마우스를 사용했다. 그(것)들은 형광 추적자를 사용하여 30 분의 기간 동안 마우스를 형질전환으로 심상하고 결과는 녹아웃 선이 야생형에 비해 CSF 유입을 극적으로 감소했다는 결론을 내렸습니다.

이러한 특성으로 인해 경두개 광학 이미징은 CSF 수송을 연구하는 이상적인 기술, 특히 2개 이상의 동물 집단 사이에서 연구합니다. 그것은 미크로네알 규모의 해상도에서 살아있는 마우스에서 내질 추적기 역학의 측정을 허용, 생체 내 이미징 양식의 다른 비용의 분수. 이 기술은 생리적, 비침습적 방법으로 림프계의 연구를 허용하고, 건강과 질병10,20,25에서 그 기능을 조절하는 요인의 일부를 해명하는 데 유용하고있다 . 그러나 가장 흥미로운 특성은 CSF 유체 역학에 대한 미래의 질문에 대답 할 수있는 잠재력입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소와 노화에 국립 연구소에 의해 투자 되었다 (건강의 미국 국립 연구소; R01NS100366 및 RF1AG057575- MN, 우수 프로그램의 Fondation Leducq 대서양 횡단 네트워크, 그리고 EU 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 (부여 번호 666881; SVDs@대상). 또한 그래픽 일러스트레이션에 대한 전문적인 도움을 주신 Dan Xue에게 도왔습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Bupivacaine HCl University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81020
A-M Systems Dental Cement Powder Fisher Scientific NC9991371
Carprofen University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine Prevantics B10800
CMOS Camera Hammamatsu ORCA Flash 4.0
Head Plate University of Rochester No catalog # Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery Bovie Medical Corporation AA01
Insta-set Accelerator Bob Smith Industries BSI-151
Isoflurane - Fluriso Vet One 502017 University of Rochester Vivarium
Ketamine Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue Elmer's Products, Inc No catalog #, see link in comments https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape Fisher Scientific 19-027-761
Paraformaldehyde Sigma-aldrich P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous Braintree Scientific PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe Harvard Apparatus 70-4501
PURALUBE VET OINTMENT Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks Fisher Scientific 22-029-553
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice) Narishige International USA Inc MAG-1
Single-use Needles, BD Medical VWR BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 22-363-750
Tunable LED PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine University of Rochester Vivarium

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References

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