Электрофизиологические записи одноклеточных ионных токов под четко определенным сдвигами

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы описать модифицированную камеру потока параллельных пластин для использования в исследовании активации в реальном времени механочувствительных ионных каналов сдвигами.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fancher, I. S., Levitan, I. Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress. J. Vis. Exp. (150), e59776, doi:10.3791/59776 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Стресс сдвига жидкости, как известно, играют важную роль в эндотелиальной функции. В большинстве сосудистых кроватей повышенный сдвига стресс от острого увеличения кровотока вызывает сигнальный каскад, приводящий к вазодилатации, тем самым облегчая механическую нагрузку на сосудистую стенку. Структура сдвига стресс также хорошо известно, является критическим фактором в развитии атеросклероза с ламинар сдвига стресс время атеропротектор и нарушенных сдвига стресс про-атерогенных. Хотя у нас есть детальное понимание различных промежуточных клеточных сигнальных путей, рецепторы, которые сначала переводят механический стимул в химических посредников, полностью не поняты. Механочувствительные ионные каналы имеют решающее значение для реагирования на сдвига и регулируют сигнализирующую ячейку, вызывающую таким образом производство вазоактивных посредников. Эти каналы являются одними из самых ранних активированных сигнальных компонентов для сдвига и были связаны с сдвига индуцированной вазодилатации путем поощрения производства оксида азота (например, внутренне выправляя Kи Кира и переходный потенциал рецепторов »TRP» каналы) и эндотелия гиперполяризующий фактор (например, Кир и кальций активированный K »KCa» каналов) и сдвига индуцированного сосудосуживаемого через неопределенный механизм, который включает в себя пьезо каналов. Понимание биофизического механизма, с помощью которого эти каналы активируются силами сдвига (т.е. непосредственно или через первичный механо-рецептор) может обеспечить потенциальные новые цели для решения патофизиологии, связанной с эндотелиальной дисфункцией и атерогенез. По-прежнему существует серьезная проблема для записи потокиндуированной активации ионных каналов в режиме реального времени с помощью электрофизиологии. Стандартные методы, позволяющие подвергнуть клетки четко определенному стрессу сдвига, таким как конус и реометр пластин и замкнутая камера потока параллельной пластины, не позволяют в режиме реального времени изучать активацию ионного канала. Целью этого протокола является описание модифицированной параллельной камеры потока пластины, которая позволяет в режиме реального времени электрофизиологической записи механочувствительных ионных каналов под четко определенным напряжением сдвига.

Introduction

Гемодинамические силы, генерируемые кровотоком, хорошо известны, играют важную роль в эндотелиальной и сосудистой функции1,2. Также хорошо известно, что несколько типов ионных каналовостро реагируют на изменения в стрессе сдвига 3,4,5, что приводит к гипотезе, что ионные каналы могут быть первичными датчиками стресса сдвига. Совсем недавно мы и другие показали, что механочувствительные ионные каналы играют важную роль в нескольких сдвига стресса чувствительных сосудистых функций, в том числе вазоактивной реакции на сдвига стресс6,7,8 , и развития ангиогенез9. Механизмы чувствительности сдвига-стресса ионных каналов, однако, почти полностью неизвестны. Этот пробел в знаниях, вероятно, объясняется технической сложностью выполнения электрофизиологических записей при четко определенном стрессе сдвига. В этой статье, таким образом, мы предоставляем шаг за шагом подробныйпротокол обычно выполняется в нашей лаборатории для достижения этой цели 6,7,10,11.

Общая цель этого метода заключается в том, чтобы в режиме реального времени исследование ионного канала механоактивации под четко определенным напряжением сдвига в физиологическом диапазоне. Это достигается путем изменения стандартной параллельной камеры потока пластины, чтобы электрофизиологические пипетки, которые будут опущены в камеру и доступа клеток, выращенных на нижней пластине в режиме реального времени воздействия потока, обеспечивая уникальный подход для достижения этой цели цель6,7,11. В отличие от стандартных параллельных камер потока пластин, описанных в предыдущих публикациях может быть использован для анализа изображений в режиме реального времени клеток, подверженных сдвига сил12 или других неинвазивных подходов13,14, но не для Электрофизиологии. Аналогичным образом, конус и пластины аппарата, другой мощный подход подвергать клетки сдвига стресс15,16 также не подходит для электрофизиологических записей. Таким образом, эти устройства потока не позволяют исследуемую чувствительность напряжения сдвига ионных каналов. Трудность в выполнении электрофизиологических записей под потоком является основной причиной скудности информации о механизмах, ответственных за эти решающие эффекты.

С точки зрения альтернативных подходов к достижению той же цели, нет ни одного, кто был бы столь точным или контролируемым. Некоторые более предыдущие изучения попытались зафиксировать деятельность канала иона под потоком путем подвергать действию клетки к потоку жидкости приходя от другого pipette принесенных к vicinity клетки от выше17,18. Это очень нефизиологическое, так как механические силы, генерируемые в этих условиях, имеют мало общего с физиологическими профилями сдвига стресса в кровеносных сосудах. Аналогичные опасения относятся к попыткам имитировать физиологический стресс сдвига путем перфузии открытых камер. Как подробно описано в нашем предыдущем исследовании10, открытый жидко-воздушный интерфейс создает многочисленные нарушения и рециркуляции, которые являются нефизиологическими. Для решения всех этих проблем, мы разработали модифицированную параллельную пластину (MPP) системы подачи, также именуемую "минимально инвазивным устройством потока" в наших предыдущих исследованиях6,7,10,11, от акрила и широко используется в нашей лаборатории. Однако, несмотря на то, что оригинальное описание дизайна было опубликовано почти 20 лет назад и является единственным устройством потока, которое позволяет выполнять электрофизиологические записи под четко определенным напряжением сдвига, эта методология не была принятые другими лабораториями и Есть только очень мало исследований, которые пытаются зафиксировать токи под потоком. Поэтому мы считаем, что предоставление подробного описания для использования камеры потока MPP будет большим подспорьем для исследований, которые заинтересованы в механочувствительных ионных каналов и сосудистой биологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование животных в наших исследованиях одобрено Университетом Иллинойса в Чикагском комитете по уходу за животными (#16-183).

1. Сборка модифицированной параллельной плитной камеры потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 и рисунку 1 для Идентиадирований частей части потока MPP. Пожалуйста, обратитесь к рисунку 1 для схемы, подробно описывающей ориентацию камерных частей для сборки.

  1. Чтобы придерживаться прямоугольного стекла крышки, кусок D, в нижней части кусок C, сначала сделать силиконовый эластомер решение, тщательно смешивая 500 л силиконового elastomer лечащий агент в 5 мл силиконовой эластомер базы.
  2. Нанесите тонкий слой раствора силиконового эластомера по краям прямоугольного пространства части С и аккуратно поместите прямоугольную крышку стеклянной части D непосредственно на раствор эластомера, так что кусок D полностью покрывает открытое прямоугольное пространство части С. Аккуратно стереть излишки силиконового эластомера.
  3. Повторите шаг 1.2 для придерживания прямоугольного стекла крышки, кусок F, на дно кусок E и позволяют раствор улавливания кремниевых вылечить в течение ночи при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После вылеченного, прямоугольное стекло крышки будет оставаться придерживаться в течение шести месяцев, прежде чем необходимо заменить.
  4. Начиная с нижней части камеры, кусок E, собрать MPP потока камеры последовательно размещения каждого куска на вершине предыдущего в следующем порядке: кусок E (внизу), кусок C, кусок B, кусок B, кусок A (вверху).
  5. Выровнять винтовые отверстия каждой части на углах и плотно винт куски вместе, чтобы предотвратить утечки от происходящих во время администрирования потока в камеру потока MPP.

2. Подготовка клеток и посев в mPP Поток камеры

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.1'2.7 для культивированных эндотелиальных ячеек. Следуйте методу, подробно описанному в шагах 2.8–2.14 для изоляции эндотелиальных клеток от кремнеемой артериальной аркады мыши и подготовки свежеизолированных эндотелиальных клеток.

  1. В 6-колодец пластины, место от четырех до пяти 12 мм покрытия стеклянных кругов / хорошо и семенных клеток между 10% и 30% выпуклость, таким образом, что одиночные клетки могут быть доступны для электрофизиологических записей.
  2. Инкубировать клетки в стандартных условиях культуры (5% CO2, 37 КК) для не менее 2 ч, чтобы позволить клеткам придерживаться и не более 24 ч, как эндотелиальные клетки в опыте авторов становятся очень плоскими и трудно патч, когда семенами в суб-выпуклости для более чем 24 H.
  3. Удалить крышку стекла, содержащего присоединенные клетки из колодца 6-хорошо пластины, быстро промыть в фосфат-буферных солен (PBS), и передать 35 мм Петри блюдо, содержащее 2 мл электрофизиологического раствора ванны (Таблица 2) до передачи в поток MPP Камеры.
  4. Передача крышки стеклянного круга в прямоугольную крышку стекла, кусок D, который придерживается кусок C камеры потока MPP будучи уверенным, что адекватное решение остается на крышке стекла, так что клетки, чтобы не стать подвержены воздействию воздуха. Добавьте желаемый раствор ванны (250 евро) в клетки, чтобы крышка стеклянного круга и клетки были полностью погружены в раствор.
  5. Позиция крышка стеклянного круга так, что она лежит в половине ближе к стороне вакуумного резервуара так, что клетки будут в соответствии с разрезом отверстия кусок B. Убедитесь, что стеклянный круг крышки придерживается кусок D через раствор стекла сцепление так, что применение поток в камеру не нарушает положение крышки стеклянного круга.
  6. Соберите камеру потока MPP, завинчивая части вместе в соответствующем порядке, как описано в шагах 1.4 и 1.5 и как показано на рисунке 1. Перенесите камеру на стадию микроскопа и немедленно надоете в камеру раствором ванны, чтобы раствор достиг вакуумного резервуара для аспирации (10 мл).
  7. Определите здоровую клетку для эксперимента, идентифицируя клетку с темной границей и очевидным ядром. Избегайте клеток, которые, как представляется, blebbing или клетки, которые находятся в контакте с другими клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В лаборатории авторов используются эндотелиальные клетки аорты человека и первичные мезентерические эндотелиальные клетки мыши в культуре. Тем не менее, любой другой тип адепта клетки, которая представляет интерес для конкретных потребностей исследования могут быть использованы таким же образом.
  8. Вымойте изолированную артериальную аркаду в диссоциационном растворе(Таблица 2). Перенесите аркаду в центрифугу 2 мл, содержащую 2 мл предварительно разогретого (37 градусов по Цельсию) диссоциационизмового раствора (рецепт диссоциационизмного раствора, показанного в таблице2), содержащей нейтральную протезу (0,5 мг/мл) и эластазу (0,5 мг/мл). Инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия с нежной тряской каждые 10 минут.
  9. Удалить 1 мл нейтрального раствора диссоциации протеазы/эластаза и добавьте 1 мг/мл коллагеназы типа 1. Верните раствор коллагеназа в раствор, содержащий артерии, для конечной концентрации коллагеназа типа 1 0,5 мг/мл. Инкубировать в течение 2-3 мин при 37 градусах Цельсия.
  10. Используя 5-классные щипцкие пущи, быстро переместите аркаду на блюдо диаметром 35 мм Петри, содержащее каплю свежего, охлаждевшегося диссоциации в 750 л. Дальнейшее диссоциировать ткани с помощью двух 20 G шприц иглы механически освободить эндотелиальных клеток от ферментативно усваивается артерий.
  11. Используя 9-процентный стеклянный трубку Pasteur, стримируйте клеточный раствор в 10 раз перед переносом клеток в новую центрифугу мощностью 1,5 мл с помощью стеклянной трубки.
  12. Вымойте чашку Петри с другой 750 л раствора диссоциации и перенесите в ту же трубку. Используя стеклянный пипетка, дальнейшее механически разогнать клетки, труба по крайней мере 10x для создания одной подвески ячейки быть осторожным, чтобы не ввести пузырьки, которые могут повредить эндотелиальной целостности клеток.
  13. Добавьте 750 л эндотелиальной клеточной подвески (500–1000 ячеек) непосредственно к части D камеры потока MPP на половине, близкой к вакуумной стороне резервуара. Разрешить эндотелиальных клеток придерживаться между 45 мин и 1 ч при комнатной температуре.
  14. Соберите камеру потока MPP, завинчивая части вместе в соответствующем порядке, как описано в шагах 1.4 и 1.5 и как показано на рисунке 1. Перенесите камеру на стадию микроскопа и немедленно надоете в камеру раствором ванны, чтобы раствор достиг вакуумного аспирации (10 мл). Определите доступные эндотелиальные клетки по их грубым и круглым фенотипом19,20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разнообразие методов пищеварения и ферментных коктейлей были использованы для изоляции эндотелиальных клеток из различных артериальных кроватей. См Таблица 3 для подробного описания протоколов, которые были использованы различными следователями для изоляции эндотелиальных клеток для патч зажима электрофизиологии механочувствительных ионных каналов. Эти методы, вероятно, подходят для использования в сочетании с камерой потока MPP.

3. Управление сдвига стресс MPP поток камеры для электрофизиологических записей сдвига активированных механочувствительных ионных каналов

  1. Настройка гравитационной системы перфузии путем подключения 30 мл градуированный цилиндр шприца к 3-сторонним замком luer оснащена микроборами труб (внутренний диаметр: 0,05 дюйма, внешний диаметр: 0,09 дюйма), подходит для вставки в 3 мм диаметр впускного отверстия кусок A MPP Камеры.
  2. Прикрепите цилиндр к внешнему лицу клетки Фарадея, окружающей электрофизиологию установки(рисунок 2) с помощью двусторонней ленты. Перед вставкой трубки в камеру MPP предварительно заполните шприц и трубки раствором для ванны (см. Таблицу 2 для раствора для ванны, используемого для исследования внутренне выправляющих каналов Kи в эндотелиальных клетках). Вставьте трубку в входе камеры MPP отверстие входе части А.
  3. Предварительно заполните камеру потока MPP раствором, чтобы раствор удаляться в вакуумном резервуаре. Остановить поток в камеру и пополнить градуированный цилиндр на верхней отметке. Рассчитайте скорость потока вручную, позволяя раствору протекать через камеру и используя стоп-часы для расчета мЛ/с на заданной высоте цилиндра шприца.
  4. Поднимите или опустите шприц, чтобы изменить поток, и, таким образом, сдвига в камере, и продолжать этот процесс, пока желаемый уровень сдвига стресс найден.
  5. Рассчитайте стресс сдвига в параллельной камере, используя следующее уравнение21:
    6 х/ч2w
    где - вязкость жидкости (г/см), скорость потока (мл/с) и параллельная ширина плитообразной камеры (w - 2,2 см) и высота (ч - 0,1 см).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В текущей системе перфузии тяжести, на высоте цилиндра шприца (измеренной из верхней части цилиндра) на 57 см над стадией микроскопа, скорость потока составляет 0,3 мл/с. Сдвига рассчитывается в камере при этом шприц цилиндр высоты и скорости потока 0,7 dyn/cm2. Следует также отметить, что другие перфузийные системы, такие как перистальтический насос, могут быть использованы для управления потоком в камеру потока MPP. Тем не менее, эти устройства могут добавить нежелательной турбулентности и влиять на стабильность измерения электрофизиологии под потоком, поэтому, используя гравитационную перфузионную систему, описанную здесь, рекомендуется.
  6. Перенесите собранную камеру, содержащую присоединенные клетки, на стадию микроскопа электрофизиологии и вставьте трубку, предварительно заполненную раствором ванны, в отверстие куска А. Одновременно заполните камеру и промойте клетки 10 мл раствора для ванны поворота 3-путь Luer блокировки таким образом, что решение течет в камеру.
  7. После того, как желаемая конфигурация патча успешно получена позволяют токи канала стабилизироваться в статической ванне при комнатной температуре. После того, как токи стабилизировались, применять сдвига в шаг-мудрый моды позволяет увеличивается в ток, чтобы стабилизироваться до следующего шага увеличение сдвига стресса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наибольший успех авторы отмечают с перфорированной конфигурацией патча при изучении механоактивированных ионных каналов в эндотелиальных клетках. Для выполнения перфорированных цельноклеточных патч конфигураций, добавить 5 л 60 мг/мл бульона амфотерицин B в диметил сульфоксид (DMSO) до 1 мл 0,2 мкм стерильный фильтрованный раствор пипетки. После создания гига-омового уплотнения в конфигурации, прикрепленной к ячейке, перфорированные цельноклеточные пластыри образуются в течение 2–5 минут.
  8. Удалите воздействие сдвига на клетки, остановив поток в камеру, позволяя механочувствительным тонам канала вернуться к исходным тонам, наблюдаемым в статической ванне.
  9. Изолировать механочувствительные ионные каналы, представляющие интерес, изменяя валентность раствора (например, 60 мМ К, в растворе для ванны с 0 Ca2 в pipette растворе для изучения внутренне исправимых каналов КЗ. В таблице 2 показаны примерные рецепты решений) и/или фармакологическое ингибирование потенциально загрязняющих текущих источников.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Несколько фотографий, показывающих различные виды камеры потока MPP на стадии микроскопа (верхняя панель) и схематическое представление камеры потока MPP (нижняя панель) показаны на рисунке 1. Схема тикатизирует размеры всего устройства и камеры потока. На рисунке 2 показана фотография гравитационной перфузионной системы в камеру потока MPP в нашей лаборатории (верхняя панель). Также показано схематическое представление системы потока (нижняя панель), предназначенное для выделения шагов, которые изолируют клетки в камере потока от прилива раствора от перфузионной системы и от силы вакуумного удаления раствора.

Отличительной чертой механочувствительных ионных каналов является резкоевозвращение к базовым уровням при прекращении механического стимула 3,6,7. Рисунок 3 показывает в качестве примера, что удаление стимула сдвига стресса во время электрофизиологических записей Киртона из свежеизолированной эндотелиальной клетки приводит к возвращению к исходным тотам, первоначально записанным в статической ванне. Возвращение к базовым текущим уровням после остановки потока в камеру MPP произошло в течение десяти секунд после прекращения потока.

Электрофизиологические записи цельноклеточных (WC), особенно взятые из свежеизолированных клеток, часто имеют очевидные фоновые токи утечки, которые могут маскировать активность канала. Некоторые ионные каналы, такие как каналы внутреннего интоксикации k q, обладают биофизическими свойствами, которые позволяют вычесть фоновый ток утечки для более точного анализа. Рисунок 4 показывает в качестве примера процесс от необработанных данных(рисунок 4A) к рассчитанной и построенной линейной внешней утечки (рисунок4B) к окончательному, утечка вычитается представительный след(рисунок 4C). Смотрите подробное объяснение для расчета и вычитания утечки из сырья перфорированных записи патча WC в сопроводительной легенде на рисунке 4.

Figure 1
Рисунок 1: Камера потока MPP и детальная схема. Фотографии собранной камеры потока MPP (верхняя панель) показывают камеру на стадии микроскопа от трех различных взглядов: сторона, как рассматривается во время экспериментов (слева), от перфузионного впуска (средний), и от вакуумной розетки (справа), которая находится вне поля зрения в фотография. Направление потока обозначено в каждом из них. Обратите внимание, что грунтовая проволока может легко вписаться в одну из 2 мм прорезей при наклоне под углом 90 градусов. Подробная схема (внизу) показывает точные размеры для репликации аппарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Гравитационная перфузионная система. В верхней панели показана сметная фотография системы перфузии гравитации в нашей лаборатории. Двухступенчатая камера потока MPP и гравитационная перфузионная система подробно описаны в нижней панели. Выделение камеры потока, содержащей клетки и двух верхних и нижних резервуаров, выделено. Шаг 1 позволяет раствору течь из верхнего резервуара части B, чтобы кусок D камеры, где клетки посеяны. Шаг 2 позволяет решение течь от части D до нижнего резервуара, часть F. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные следы активации тока Кира и возврата к базовым текущим уровням при удалении потока. Хорошим положительным контролем для механоактивации ионных каналов является возвращение к базовым текущим уровням, первоначально наблюдаемым в статической ванне при прекращении механического стимулирования. Внутренне исправляющиеся токи канала K (Kir) активируются в течение нескольких секунд сдвига, когда гравитационное решение может течь в камеру потока MPP. После прекращения потока в камеру, Кир токи быстро вернуться к базовым статическим уровням наблюдается до потока. На пластырь более 400 мм был нанесен пандус номиналом от -140 мВ до 40 мв. Раствор для ванны содержал 60 мМ К, а потенциал разворота составлял 20 мВ. Репрезентативные следы были получены из эндотелиальной клетки, недавно изолированной от метантерных артерий мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Пример вычитания утечки для точного анализа механоактивированного Кирского тока. (A) Представитель сырой записи Кир ток из первичной мыши мезентерической эндотелиальной ячейки с заметнымлинейным внешним током утечки (яутечки). На пластырь более 400 мм был нанесен пандус номиналом от -140 мВ до 40 мв. Раствор для ванны содержал 60 мМ К, а потенциал разворота составлял 20 мВ. (B) Яутечка предотвращает анализ реальной активности канала Кир. Чтобы вычесть яутечки, сначала вычислить линейный наклонпроводимости яутечки (Gсклона (Я-Яb) /(V a -Vb)). Умножьтеg наклона на соответствующие напряжения всего сырья след к графику яутечки на необработанных данных. Линия должна накладывать внешнюю линейную утечку точно. (C) Вычесть построен яутечки из всего следа, так что линейный внешний ток является 0 pA / PF и реальный ток Кир может быть проанализирована. Обратите внимание в панели C, что внутреннее ток Kir примерно в два раза меньше исходного следа исходных данных в панели A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Высота (мм) Ширина (мм) Длина (мм) Дополнительная информация
Кусочек А 8 80 98 лет Содержит отверстие диаметром 3 мм для впускных перфузионных труб (см. Таблицаматериалов) и прямоугольное пространство 53 мм x 60 мм для доступа к средним частям и клеткам
Кусочек B 1 80 98 лет Содержит пространство (диагональ 20 мм) под перфузийным отверстием части А и три прорези 2 мм x 17 мм для доступа к клеткам
Кусочек C 1 80 98 лет Содержит 22 мм х 50 мм пространство, где кусок D придерживается с помощью раствора силиконового эластомера (см. Таблица материалов)
Кусочек D 0,16 24 40 г. Прямоугольный стеклянный слайд нижней части камеры потока
Кусочек E 5 80 120 г. Содержит пространство 45 мм x 50 мм, позволяющее визуализировать ячейки на части D. 20 мм х 45 мм пространство присутствует для резервуара вакуумной розетки, Piece F, чтобы быть прилипать
Кусочек F 0,16 24 50 лет Прямоугольное стеклянное скольжение дно резервуара вакуумной розетки
Собранный MPP 15 лет 80 120 г. Камера потока отделена от впускной перфузии и вакуума розетки двумя шагами, чтобы избежать нарушения четко определенного ламинара сдвига
Комната потока собранной MPP 1 22 Г. 42 г. Кусок D является стеклянный слайд нижней части камеры потока

Таблица 1: Размеры MPP (собраны и разобраны) и дополнительная информация, специфичная для каждой части устройства.

Решение Рецепт (в мМ) Ph
Диссоциация 55 NaCl, 80 Na-глутаматы, 6 KCl, 2 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 глюкоза, 10 HEPES 7.3
(Изоляция ячеек)
Ванна (Электрофизиология) 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 глюкоза, 10 HEPES 7.4
Пипетка (Электрофизиология) 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 глюкоза, 10 HEPES 7.2

Таблица 2: Примеры решений с рецептами, используемыми в экспериментах.

Протокол изоляции эндотелиальных клеток Ссылки
Коктейль нейтральной протеазы и эластаза (0,5 мг/мл каждый; 1 ч при 37 градусах Цельсия) сопровождается коллагеназой типа I (0,5 мг/мл; 2,5 мин) 6,7
Нежное механическое выскабливание 5-сантиметровойобласти 2, расположенной на внутренней стене нисходящей грудной аорты 11 Год
Na 17 Лет
Na 3
Коллагенеза типа IA (1 мг/мл) в течение 14 мин при 37 градусах Цельсия 8

Таблица 3: Методология изучения механочувствительных ионных каналов с использованием электрофизиологических методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сосудистая система постоянно подвергается воздействию активных гемодинамических сил, которые активируют механочувствительные ионные каналы3,22, но физиологические роли этих каналов в сдвига стресс-индуцированной механотрансдукции только начинают появляться4,6,8. Механизмы, ответственные за механочувствительность сдвига стресс-активированных каналов остаются неизвестными. В подробном описании протокола описывается метод прямого исследования механочувствительных ионных каналов, подверженных стрессу ламинаров в режиме реального времени.

Критическим и важным шагом этого протокола является использование модифицированной параллельной камеры потока пластин, которая имеет узкие отверстия, чтобы электрофизиологические пипетки должны быть опущены в камеру и клетки доступа под потоком. Общий принцип этого устройства заключается в том, что если отверстия достаточно узкие,то физиологический стресс сдвига (до 15 dyn/cm 2) может быть достигнут без переполнения раствора из-за сил поверхностного натяжения10. Для успешного проведения этих экспериментов крайне важно: (i) к семенным клеткам в области нижней пластины, наймеся непосредственно под отверстиями; ii) установить гига-ому печать до начала потока или во время очень медленного (0,01 dyn/cm2)фонового потока; iii) поддерживать стабильную печать при наращивании потока. Размеры четырех частей акрилового аппарата, используемого в нашей лаборатории, предоставляются вместе с подробными схемами(рисунок1) таким образом, что камера потока MPP и система потока (рисунок2) могут быть воспроизведены для использования в любом лабораторном исследовании механочувствительные ионные каналы. Эти размеры также могут быть изменены, чтобы увеличить площадь, посеянную клетками, и изменить высоту канала потока, что изменило бы связь между скоростью потока и напряжением сдвига. Уменьшение высоты камеры потока приведет к более высокому стрессу сдвига для той же скорости потока, что может быть полезно для достижения более высоких напряжений сдвига. Камера также может быть изменена, чтобы включить барьер разделения потока, который вызывает местную область рециркуляции нарушенного потока23.

Основные преимущества использования камеры потока MPP включают (1) исследование в режиме реального времени сдвига активированных ионных каналов из эндотелиальных клеток в культуре и клетки, свежеизолированные из сосудистой ткани, (2) воздействие клеток и ответ механочувствительного иона каналы физиологически значимых уровней стресса сдвига, и (3) легко сборки и разборки с перфузии вариантов для экспериментов. Что касается других существующих методов, единственный другой метод, который позволяет выполнять электрофизиологические записи под четко определенным напряжением сдвига является посев клеток внутри капиллярного конца и вставки пипетки записи в капиллярное отверстие, как было сделано в ранних исследованиях3,22. Есть, однако, несколько недостатков по сравнению с методом, описанным здесь, такие как трудность посева клеток в капилляры, доступ к очень небольшому числу клеток, которые находятся достаточно близко к капиллярной конца для пипетки, чтобы иметь возможность достичь их, и помехи потока в конце канала потока (капилляр в данном случае). Каждый из этих недостатков затрудняет выполнение электрофизиологии под потоком в клетках, культивированных в капиллярном открытии и практически невозможно залатать или даже семенные клетки, свежеизолированные от сосуды. Также невозможно ввести шаг для создания области нарушенного потока. Все другие существующие методы, которые либо используют открытые камеры24,25 или пыхтя решения непосредственно на клетке17,18 не имитируют гемодинамической среды в кровеносных сосудах.

Основным ограничением этого метода, однако, является ограничение для достижения сдвига стресс на более высоких уровнях физиологического диапазона. В частности, физиологические уровни стресса сдвига, по оценкам, достигают до 70 dyn/cm2 в здоровых артериях26. В отличие от этого, самый высокий уровень стресса сдвига, что мы могли бы достичь в текущей конфигурации камеры было 15 dyn/cm2, после чего силы поверхностного натяжения становятся недостаточными, чтобы предотвратить решение, чтобы выплеснуться из отверстий10. Вполне возможно, что уменьшение высоты канала потока может позволить достичь более высоких уровней стресса сдвига. Поддержание стабильного гига-ом уплотнения под высоким стрессом сдвига является еще одной проблемой, но уровень успеха является разумным с практикой. Мы обнаружили, что использование перфорированной метод патч (в том числе антибиотик амфотерицина B в растворе пипетки, как описано выше) дает более стабильные записи, чем стандартная конфигурация всей клетки. Кроме того, камера потока MPP и решения, используемые точно не реплицировать сдвига кровотока в артериях. Кровь является вязкой, неньютоновской жидкости, что мы не реплицировали в наших экспериментах в пробирке. Кроме того, камера, используемая здесь, представляет собой параллельную камеру, в то время как стресс сдвига в артериях лучше всего вычисляется с помощью формулы сдвига в цилиндре.

Существуют важные соображения и ограничения для выполнения одноканальных записей под потоком. Этот метод подходит для конфигурации, прикрепленной к клетке (пипетка, прикрепленная к мембране неповрежденной клетки), которая дает стабильные уплотнения. Важно, хотя, чтобы знать, что отдельные каналы, чья активность записывается непосредственно не подвергаются стресс сдвига, потому что они защищены записи пипетки, особенно в наизнанку конфигурации27. Мы считаем, что вырезанные конфигурации патча не являются наиболее надежными при проверке чувствительности ионных каналов для потока, потому что вырезанная мембрана, как правило, втягивается в пипетку записи и, таким образом, не подвергается четкоопределенному потоку.

С точки зрения типа клеток, которые могут быть использованы в этих экспериментах, сосудистые эндотелиальные клетки представляют собой наиболее применимый тип клеток для изучения сдвига стресс и механочувствительных каналов. Более ранние исследования сосредоточены в первую очередь на культурных эндотелиальных клеток3,28, которые легко доступны. Мы протестировали и расширили использование этого метода для эндотелиальных клеток, свежеизолированных от артерий сопротивления мышей6,7. Другие типы клеток, безусловно, должны быть рассмотрены. Сосудистые гладкие мышечные клетки, например, может стать подвержены стресс сдвига во время болезни государств, где эндотелий был поврежден и удален29,30. Это представляет собой интригующую область исследования которой mechanosensitive каналов, которые находятся в гладкой мышцы, которые в противном случае не влияет на сдвига стресс, теперь будет способствовать потенциально патофизиологических механизмов болезни. Кроме того, трансфекция автомобильных клеточных линий, таких как HEK или CHO с геном, кодируя канал интереса, является отличной платформой для биофизического анализа каналов в сочетании с использованием камеры потока MPP.

Важно также отметить, что в то время как первоначальное намерение для камеры потока MPP было для реального времени исследование ионного канала mechanoactivation, применение устройства может выйти за рамки этой цели. В частности, тот же подход может быть использован для исследований, которые используют датчики электродов, такие как оксид азота (NO) датчик для определения выпуска НЕТ в ответ на стресс сдвига. Таким образом, мы предоставляем обобщенные методологии для тех, кто заинтересован в расследовании механически регулируемых биологических процессов в режиме реального времени и содействовать дальнейшему изменению камеры MPP для удовлетворения конкретных потребностей исследований для тех, кто изучает механочувствительные процессы в различных областях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Национальным институтом сердца, легких и крови (R01 HL073965, IL) и (T32 HL007829-24, ISF). Авторы также хотели бы отметить, Научная машина магазин в Университете Иллинойса в Чикаго для генерации наших последних MPP потока камер.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile syringe filters VWR 28145-501 Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution
5 grade forceps Fine Scientific Tools 1252-30 Used for transferring digested arteries to fresh solution
9" Pasteur Pipet Fisher Scientifc 13-678-20D Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells 
12 mm diameter Cover glass circles Fisher Scientifc 12-545-80 For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses
24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass Sigma-Aldrich CLS2975224 Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)
24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass Sigma-Aldrich CLS2975245 Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)
20 G syringe needles Becton Dickinson and Co 305175 For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries
35 mm Petri dish Genesee Scientific 32-103 For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528-50MG Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.
Collagenase, type I Worthington Biochemical 100 mg - LS004194 Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientifc 67-68-5 Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp
Elastase, lyophilized Worthington Biochemical 25 mg - LS002290  Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid  Corning 353046 For use with studies involving cultured cells and multiple treatments
Neutral protease/dispase Worthington Biochemical 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation
SylGard  World Precision Instruments SYLG184 Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)
Tygon ND 10-80 tubing Microbore Tubing AAQ04133 ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97, (2), 495-528 (2017).
  2. Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
  3. Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331, (6152), 168-170 (1988).
  4. Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27, (5), 671-678 (2006).
  5. Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596, (6), 979-984 (2018).
  6. Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595, (7), 2339-2364 (2017).
  7. Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7, (5), (2018).
  8. Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8, (1), 350 (2017).
  9. Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515, (7526), 279-282 (2014).
  10. Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28, (10), 1184-1193 (2000).
  11. Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98, (8), 1064-1071 (2006).
  12. Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
  13. Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
  14. White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
  15. Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68, (5), 1885-1896 (2016).
  16. Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103, (3), 177-185 (1981).
  17. Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (11), 7780-7785 (2002).
  18. Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32, (8), 1589-1593 (2000).
  19. Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40, (2), 159-168 (2003).
  20. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31, (5), 1175-1186 (2011).
  21. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
  22. Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286, (6), C1367-C1375 (2004).
  23. Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38, (1), 64-75 (2018).
  24. Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
  25. Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
  26. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282, (21), 2035-2042 (1999).
  27. Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431, (1), 129-131 (1995).
  28. Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85, (9), 820-828 (1999).
  29. Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216, (2), 389-395 (2008).
  30. Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, (8), 1512-1516 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics