Enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini

Immunology and Infection

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Summary

Le but de ce protocole est de décrire une chambre parallèle modifiée d'écoulement de plaque pour l'usage en étudiant l'activation en temps réel des canaux d'ion mechanosensitive par le stress de cisaillement.

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Fancher, I. S., Levitan, I. Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress. J. Vis. Exp. (150), e59776, doi:10.3791/59776 (2019).

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Abstract

Le stress de cisaillement de fluide est bien connu pour jouer un rôle important dans la fonction endothéliale. Dans la plupart des lits vasculaires, le stress élevé de cisaillement des augmentations aigues du flux sanguin déclenche une cascade de signalisation ayant pour résultat la vasodilatation atténcitant ainsi le stress mécanique sur la paroi vasculaire. Le modèle de l'effort de cisaillement est également bien connu pour être un facteur critique dans le développement de l'athérosclérose avec l'effort laminaire de cisaillement étant atheroprotective et le stress perturbé de cisaillement étant pro-atherogenic. Bien que nous ayons une compréhension détaillée des différentes voies intermédiaires de signalisation cellulaire, les récepteurs qui traduisent d'abord le stimulus mécanique en médiateurs chimiques ne sont pas complètement compris. Les canaux ioniques mécanosensibles sont essentiels à la réponse au cisaillement et régulent la signalisation cellulaire induite par le cisaillement contrôlant ainsi la production de médiateurs vasoactifs. Ces canaux sont parmi les premiers composants de signalisation activés à cisaillement et ont été liés à la vasodilatation induite par le cisaillement par la promotion de la production d'oxyde nitrique (p. ex., rectification intérieure de Ket potentiel récepteur transitoire [TRP] canaux) et facteur d'hyperpolarisation de l'endothélium (p. ex., canaux K et K activés par le calcium) et vasoconstriction induite par le cisaillement par un mécanisme indéterminé qui implique des canaux piézoïdes. Comprendre le mécanisme biophysique par lequel ces canaux sont activés par des forces de cisaillement (c.-à-d. directement ou par un récepteur mécano-récepteur primaire) pourrait fournir de nouvelles cibles potentielles pour résoudre la pathophysiologie associée au dysfonctionnement endothélial et l'athérogenèse. Il est encore un défi majeur d'enregistrer l'activation induite par le flux des canaux ioniques en temps réel en utilisant l'électrophysiologie. Les méthodes standard pour exposer les cellules à un stress bien défini, comme le rhéomètre de cône et de plaque et la chambre d'écoulement parallèle fermée de plaque ne permettent pas l'étude en temps réel de l'activation de canal d'ion. Le but de ce protocole est de décrire une chambre de flux de plaque parallèle modifiée qui permet l'enregistrement électrophysiologique en temps réel des canaux ioniques mécanosensibles sous le stress bien défini de cisaillement.

Introduction

Les forces hémodynamiques générées par le flux sanguin sont bien connues pour jouer des rôles majeurs dans la fonction endothéliale et vasculaire1,2. Il est également bien connu que plusieurs types de canaux ioniques répondent vivement aux changements dans le stress de cisaillement3,4,5 conduisant à l'hypothèse que les canaux ioniques peuvent être des capteurs de stress de cisaillement primaire. Plus récemment, nous et d'autres avons montré que les canaux ioniques mécanosensibles jouent des rôles critiques dans plusieurs fonctions vasculaires sensibles au stress de cisaillement, y compris la réponse vasoactive au stress de cisaillement6,7,8 , et l'angiogenèse développementale9. Les mécanismes de la sensibilité de cisaillement-stress des canaux d'ion, cependant, sont presque totalement inconnus. Cette lacune de connaissances est probablement due à la difficulté technique d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini. Dans cet article, par conséquent, nous fournissons un protocole détaillé étape par étape régulièrement effectué dans notre laboratoire pour atteindre cet objectif6,7,10,11.

L'objectif global de cette méthode est de permettre l'investigation en temps réel de la mécanactivation du canal ionique sous un stress bien défini dans la gamme physiologique. Ceci est réalisé en modifiant une chambre parallèle standard d'écoulement de plaque pour permettre à une pipette électrophysiologique d'être abaissée dans la chambre et aux cellules d'accès cultivées sur la plaque inférieure pendant l'exposition en temps réel au flux, fournissant une approche unique pour réaliser ceci but6,7,11. En revanche, les chambres parallèles standard d'écoulement de plaque, décrites dans les publications précédentes peuvent être employées pour l'analyse en temps réel d'imagerie des cellules exposées aux forces de cisaillement12 ou à d'autres approches non-invasives13,14 mais pas pour Électrophysiologie. De même, l'appareil de cône et de plaque, une autre approche puissante pour exposer des cellules au stress de cisaillement15,16 n'est pas non plus approprié pour des enregistrements électrophysiologiques. Ainsi, ces dispositifs de débit ne permettent pas l'enquête sur la sensibilité au stress de cisaillement des canaux ioniques. La difficulté d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous le flux est la principale raison du manque d'informations sur les mécanismes responsables de ces effets cruciaux.

Pour ce qui est des approches alternatives pour atteindre le même objectif, il n'y en a aucune qui soit aussi précise ou contrôlée. Certaines études antérieures ont tenté d'enregistrer l'activité des canaux ioniques sous le flux en exposant les cellules à un flux de liquide provenant d'une autre pipette apportée à proximité d'une cellule de plus de17,18. C'est très non physiologique, car les forces mécaniques générées dans ces conditions ont peu en commun avec les profils physiologiques du stress de cisaillement dans les vaisseaux sanguins. Des préoccupations similaires s'appliquent aux tentatives de simuler le stress physiologique du cisaillement par perfusion de chambres ouvertes. Comme nous l'avons vu en détail dans notre étude précédente10, une interface à ciel liquide ouvert crée de multiples perturbations et recirculation, qui ne sont pas physiologiques. Pour répondre à toutes ces préoccupations, nous avons conçu une chambre de débit de plaque parallèle modifiée (MPP), également appelée « dispositif d'écoulement mini-invasif » dans nos études antérieures6,7,10,11, faite de l'acrylique et largement utilisé dans notre laboratoire. Cependant, en dépit du fait que la description originale de la conception a été publiée il y a près de 20 ans et qu'elle est le seul dispositif d'écoulement qui permet d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini, cette méthodologie n'a pas été adopté par d'autres laboratoires et il n'y a que très peu d'études qui tentent d'enregistrer les courants en cours d'écoulement. Nous croyons, par conséquent, que fournir une description détaillée de l'utilisation de la chambre de débit MPP sera d'une grande aide pour les chercheurs qui s'intéressent aux canaux ioniques mécanosensibles et la biologie vasculaire.

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Protocol

L'utilisation d'animaux dans nos études est approuvée par l'Université de l'Illinois au Chicago Animal Care Committee (#16-183).

1. Assemblage de la chambre de flux de plaques parallèles modifiées

REMARQUE: Veuillez consulter le tableau 1 et la figure 1 pour les pièces d'information de la chambre de circulation des députés. Veuillez consulter la figure 1 pour un schéma détaillant l'orientation des pièces de chambre pour l'assemblage.

  1. Pour adhérer au verre rectangulaire de couverture, pièce D, au fond de la pièce C, faites d'abord la solution d'élastomère de silicone en mélangeant soigneusement l'agent de durcissement d'élastomère de silicone de 500 l dans 5 ml de base d'élastomère de silicone.
  2. Appliquer une fine couche de la solution d'élastomère de silicone autour des bords de l'espace rectangulaire de la pièce C et placez délicatement la pièce rectangulaire en verre D directement sur la solution d'élastomère de telle sorte que la pièce D couvre complètement l'espace rectangulaire ouvert de la pièce C. Essuyez soigneusement l'excès de solution d'élastomère de silicone.
  3. Répétez l'étape 1.2 pour adhérer au verre de couverture rectangulaire, pièce F, au fond de la pièce E et permettre à la solution d'élastomère de silicone de guérir pendant la nuit à température ambiante.
    REMARQUE: Une fois durci, le verre rectangulaire restera respecté jusqu'à six mois avant d'avoir besoin d'être remplacé.
  4. Commençant par la pièce de chambre inférieure, pièce E, assembler la chambre d'écoulement MPP en plaçant séquentiellement chaque pièce sur le dessus de la précédente dans l'ordre suivant : pièce E (en bas), pièce C, pièce B, pièce A (en haut).
  5. Alignez les trous de vis de chaque pièce dans les coins et vissez fermement les morceaux ensemble pour éviter que des fuites ne se produisent pendant l'administration de l'écoulement vers la chambre d'écoulement du MPP.

2. Préparation cellulaire et ensemencement dans la Chambre de flux du MPP

REMARQUE: Suivez les étapes 2.1-2.7 pour les cellules endothéliales cultivées. Suivez la méthode détaillée dans les étapes 2.8-2.14 pour isoler les cellules endothéliales de l'arcade artérielle mésentérique de souris et la préparation des cellules endothéliales fraîchement isolées.

  1. Dans une plaque de 6 puits, placez quatre à cinq cercles de verre de 12 mm et des cellules de semences entre 10 % et 30 % de confluence de sorte que les cellules simples peuvent être consultées pour les enregistrements électrophysiologiques.
  2. Incuber les cellules dans des conditions de culture standard (5% CO2, 37 oC) pendant pas moins de 2 h pour permettre aux cellules d'adhérer et pas plus de 24 h que les cellules endothéliales dans l'expérience des auteurs deviennent très plat et difficile à patcher lorsqu'il est ensedu à la sous-confluence pour plus de 24 h.
  3. Retirer un verre de couverture contenant des cellules adhérentes d'un puits de la plaque de 6 puits, rincer rapidement à la saline tamponnée par le phosphate (PBS) et transférer dans un plat Petri de 35 mm contenant une solution de bain électrophysiologique de 2 ml (tableau 2) avant le transfert au débit MPP chambre.
  4. Transférer le cercle de verre de couverture sur le verre de couverture rectangulaire, pièce D, qui est adhéré à la pièce C de la chambre d'écoulement MPP étant sûr que la solution adéquate reste sur le verre de couverture de sorte que les cellules ne soient pas exposées à l'air. Ajouter la solution de bain désirée (250 l) aux cellules afin que le cercle de verre de couverture et les cellules soient complètement immergés dans la solution.
  5. Placez le cercle de verre de couverture de telle sorte qu'il repose dans la moitié la plus proche du côté du réservoir de vide de sorte que les cellules seront en ligne avec les ouvertures de fendu de la pièce B. Assurez-vous que le cercle de couverture en verre adhère à la pièce D par l'adhérence de verre de solution de sorte que l'application de l'écoulement vers la chambre ne perturbe pas la position du cercle de verre de couverture.
  6. Assembler la chambre d'écoulement du MPP en sitoyant les pièces dans l'ordre approprié, tel que décrit dans les étapes 1.4 et 1.5 et comme indiqué à la figure 1. Transférer la chambre au stade du microscope et perfuser immédiatement la chambre avec une solution de bain de sorte que la solution atteigne le réservoir de vide pour l'aspiration (10 ml).
  7. Identifiez une cellule saine pour l'expérience en identifiant une cellule avec une bordure foncée et un noyau évident. Évitez les cellules qui semblent être des taches ou des cellules qui sont en contact avec d'autres cellules.
    REMARQUE: Dans le laboratoire des auteurs, les cellules endothéliales aortiques humaines et les cellules endothéliales mésentériques primaires de souris dans la culture sont employées. Cependant, tout autre type de cellule adhérente qui est d'intérêt pour les besoins de recherche spécifiques peuvent être utilisés de la même manière.
  8. Laver l'arcade artérielle isolée dans la solution de dissociation (tableau 2). Transférer l'arcade dans un tube centrifugeur de 2 ml contenant 2 ml de solution de dissociation préréchauffée (37 oC) (recette de solution de dissociation indiquée dans le tableau 2) contenant de la protéase neutre (0,5 mg/ml) et de l'élastase (0,5 mg/mL). Incuber pendant 1 h à 37 oC en secouant doucement toutes les 10 min.
  9. Retirez 1 mL de la solution de dissociation neutre de protéase/élastase et ajoutez 1 mg/mL de collagène de type 1. Remettre la solution de collagène à la solution contenant les artères pour une concentration finale de collagène de type 1 de 0,5 mg/mL. Incuber pendant 2 h 3 min à 37 oC.
  10. À l'aide de forceps de 5 grades, déplacez rapidement l'arcade sur un plat Petri de 35 mm de diamètre contenant une goutte de 750 ll de solution de dissociation fraîche et réfrigérée. Dissocier davantage le tissu en utilisant deux aiguilles de seringue séparices de 20 G pour libérer mécaniquement les cellules endothéliales des artères enzymatiquement digérées.
  11. À l'aide d'une tuyauterie en verre Pasteur jetable de 9 po, triturate la solution cellulaire 10x avant de transférer les cellules dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 ml à l'aide de la tuyauterie en verre.
  12. Laver le plat Petri avec une autre solution de dissociation de 750 l et transférer dans le même tube. À l'aide de la pipette en verre, disperser mécaniquement les cellules en pipetting au moins 10x pour créer une suspension de cellule unique en prenant soin de ne pas introduire des bulles qui peuvent endommager l'intégrité des cellules endothéliales.
  13. Ajouter directement 750 l de la suspension des cellules endothéliales (500 à 1 000 cellules) directement à la pièce D de la chambre d'écoulement du MPP sur la moitié la plus proche du côté du vide du réservoir. Laisser les cellules endothéliales adhérer entre 45 min et 1 h à température ambiante.
  14. Assembler la chambre d'écoulement du MPP en sitoyant les pièces dans l'ordre approprié, tel que décrit dans les étapes 1.4 et 1.5 et comme le montre la figure 1. Transférer la chambre au stade du microscope et perfuser immédiatement la chambre avec une solution de bain de sorte que la solution atteint l'aspiration du vide (10 ml). Identifier les cellules endothéliales accessibles par leur phénotype rugueux et rond19,20.
    REMARQUE: Une variété de méthodes de digestion et de cocktails enzymatiques ont été utilisés pour isoler les cellules endothéliales de différents lits artériels. Voir le tableau 3 pour les descriptions détaillées des protocoles qui ont été utilisés par une variété de chercheurs pour isoler les cellules endothéliales pour l'électrophysiologie de pince patch des canaux ioniques mécanosensibles. Ces méthodes sont probablement appropriées pour une utilisation en combinaison avec la chambre de débit MPP.

3. Contrôler le stress de cisaillement à la chambre de flux de MPP pour des enregistrements électrophysiologiques des canaux mécanosensibles activés par cisaillement

  1. Mettre en place un système de perfusion gravitationnelle en connectant un cylindre de seringue gradué de 30 ml à une serrure luer à 3 voies équipée d'un tube microbore (diamètre interne : 0,05 pouce, diamètre externe : 0,09 pouce) adapté à l'insertion dans le trou d'entrée de 3 mm de diamètre de la pièce A du MPP chambre.
  2. Attachez le cylindre gradué à la face extérieure de la cage de Faraday entourant la plate-forme d'électrophysiologie (Figure 2) à l'aide de ruban à double face. Avant d'insérer le tube dans la chambre du MPP, remplissez la seringue et le tube avec une solution de bain (voir le tableau 2 pour la solution de bain utilisée pour étudier les canaux de rectification intérieure de K dans les cellules endothéliales). Insérer le tube dans le trou d'entrée de la chambre d'écoulement MPP de la pièce A.
  3. Préremplir la chambre d'écoulement MPP avec une solution telle que la solution est enlevée dans le réservoir sous vide. Arrêter le flux vers la chambre et remplir le cylindre gradué à la marque supérieure. Calculez les débits manuellement en permettant à la solution de circuler dans la chambre et en utilisant un chronomètre pour calculer les mL/s à une hauteur de cylindre de seringue donnée.
  4. Soulevez ou abaissez la seringue pour modifier le débit, et ainsi cisaillez dans la chambre, et continuez ce processus jusqu'à ce qu'un niveau désiré de stress de cisaillement soit trouvé.
  5. Calculez le stress de cisaillement dans une chambre parallèle en utilisant l'équation suivante21:
    6 Q/h2w
    où la viscosité fluide (g/cm), le débit Q et la largeur de la chambre de plaque parallèle (w - 2,2 cm) et la hauteur (h à 0,1 cm) sont des taux d'écoulement.
    REMARQUE: Dans le système actuel de perfusion gravitationnelle, à hauteur de cylindre de seringue (mesurée du haut du cylindre) de 57 cm au-dessus du stade du microscope, le débit est de 0,3 ml/s. Le cisaillement calculé dans la chambre à cette hauteur et débit de cylindre de seringue est 0.7 dyn/cm2. Il convient également de noter que d'autres systèmes de perfusion, comme une pompe péristétique, peuvent être utilisés pour contrôler le débit vers la chambre d'écoulement du MPP. Cependant, ces dispositifs peuvent ajouter la turbulence non désirée et influencer la stabilité des mesures d'électrophysiologie sous l'écoulement, ainsi, utilisant le système de perfusion de gravité décrit ici est recommandé.
  6. Transférer une chambre assemblée contenant des cellules adhérentes au stade du microscope de la plate-forme d'électrophysiologie et insérer le tube prérempli avec une solution de bain dans le trou de la pièce A. Remplir simultanément la chambre et laver les cellules avec 10 ml de solution de bain par tournant le verrou luer à trois voies de telle sorte que la solution s'écoule vers la chambre.
  7. Une fois que la configuration de patch désirée est obtenue avec succès permettent aux courants de canal de se stabiliser dans un bain statique à température ambiante. Une fois que les courants se sont stabilisés, appliquez le cisaillement d'une manière progressive permettant aux augmentations de courant de se stabiliser avant l'augmentation suivante du stress de cisaillement.
    REMARQUE: Les auteurs trouvent le plus grand succès avec la configuration perforée de correction en étudiant les canaux d'ion mécanisés dans les cellules endothéliales. Pour effectuer des configurations perforées de patchs à cellules entières, ajoutez 5 l d'un stock de 60 mg/mL d'amphotericinbb dans du sulfure de diméthyle (DMSO) à 1 ml de solution de pipette filtrée stérile de 0,2 m. Après avoir généré un joint giga-ohm dans la configuration cellulaire, des plaques de cellules entières perforées se forment dans un délai de 2 à 5 minutes.
  8. Supprimer l'exposition au cisaillement des cellules en arrêtant le flux vers la chambre, ce qui permet aux courants de canaux mécanosensibles de revenir aux courants de base observés dans le bain statique.
  9. Isoler les courants d'intérêt des canaux ioniques mécanosensibles en modifiant la valence des solutions (p. ex., 60 mM Kdans la solution de bain avec 0 Ca2 dans la solution pipette pour étudier les canaux de K ' vers l'intérieur. Le tableau 2 montre des exemples de recettes de solutions) et/ou d'inhibition pharmacologique des sources actuelles potentiellement contaminantes.

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Representative Results

Plusieurs photographies montrant des vues différentes de la chambre d'écoulement du MPP à l'étape du microscope (panneau supérieur) et une représentation schématique de la chambre d'écoulement du MPP (panneau inférieur) sont présentées à la figure 1. Le schéma détaille les dimensions de l'ensemble de l'appareil et de la chambre d'écoulement. La figure 2 montre une photographie du système de perfusion gravitationnelle vers la chambre d'écoulement du MPP dans notre laboratoire (panneau supérieur). On montre également une représentation schématique du système d'écoulement (panneau inférieur) destiné à mettre en évidence les étapes qui isolent les cellules de la chambre d'écoulement de la ruée vers la solution du système de perfusion et de la force de l'élimination du vide de la solution.

Une caractéristique des canaux ioniques mécanosensibles est un retour brutal aux niveaux de base à la cessation du stimulus mécanique3,6,7. La figure 3 montre à titre d'exemple que l'élimination du stimulus de stress de cisaillement pendant les enregistrements électrophysiologiques du courant de Kir à partir d'une cellule endothéliale fraîchement isolée entraîne un retour aux courants de base initialement enregistrés dans un bain statique. Le retour aux niveaux de courant de référence après l'arrêt du débit vers la chambre du MPP s'est produit dans les dix secondes suivant l'arrêt du débit.

Les enregistrements électrophysiologiques à cellules entières (WC), en particulier ceux prélevés dans des cellules fraîchement isolées, ont souvent des courants de fond évidents qui peuvent masquer l'activité du canal. Certains canaux ioniques, tels que ceux de la famille de canaux de Ket de rectification intérieure, ont des propriétés biophysiques qui permettent de soustraire le courant de fond de fuite pour une analyse plus précise. La figure 4 montre à titre d'exemple le processus des données brutes (figure 4A) à la fuite linéaire calculée et tracée vers l'extérieur (figure 4B) jusqu'à la trace représentative finale soustraite de fuite (figure 4C). Voir une explication détaillée pour le calcul et la soustraction de la fuite de l'enregistrement brut perforé WC patch dans la légende d'accompagnement à la figure 4.

Figure 1
Figure 1 : Chambre d'écoulement des députés et schéma détaillé. Les photographies de la chambre d'écoulement assemblée mPP (panneau supérieur) montrent la chambre sur la scène du microscope à partir de trois points de vue différents: le côté vu lors d'expériences (à gauche), de l'entrée de perfusion (au milieu), et de la sortie de vide (à droite) qui est hors de vue dans la photographie. La direction du débit est étiquetée dans chacund. Notez que le fil de terre peut facilement s'insérer dans l'une des fentes de 2 mm lorsqu'il est plié à un angle de 90 degrés. Un schéma détaillé (en bas) montre les dimensions exactes pour la réplication de l'appareil. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Le système de perfusion gravitationnelle. Une photographie étiquetée du système de perfusion gravitationnelle de notre laboratoire est montrée dans le panneau supérieur. La chambre d'écoulement mPP en deux étapes et le système de perfusion gravitationnelle sont détaillés dans le panneau inférieur. La séparation de la chambre d'écoulement contenant des cellules et des deux réservoirs supérieurs et inférieurs est mise en évidence. L'étape 1 permet à la solution de s'écouler du réservoir supérieur de la pièce B à la pièce D de la chambre où les cellules sont enseissées. Étape 2 permet solution de s'écouler de la pièce D vers le bas vers le réservoir inférieur, pièce F. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Traces représentatives de l'activation actuelle induite par le cisaillement des canaux Kir et retour aux niveaux de courant de base lors de l'élimination du débit. Un bon contrôle positif pour la méchanoactivation des canaux ioniques est le retour aux niveaux de courant de ligne de base initialement observés dans un bain statique à la cessation du stimulus mécanique. Les courants de canal de K (Kir) rectifiants vers l'intérieur sont activés en quelques secondes par le stress de cisaillement lorsque la solution de gravité est autorisée à s'écouler vers la chambre d'écoulement du MPP. À la cessation du débit vers la chambre, les courants Kir reviennent rapidement aux niveaux statiques de base observés avant le débit. Une rampe de -140 mV à 40 mV a été appliquée sur le patch sur 400 ms. La solution de bain contenait 60 mM Ket le potentiel d'inversion était de 20 mV. Les traces représentatives ont été générées à partir d'une cellule endothéliale fraîchement isolée des artères mésentériques de souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Exemple de soustraction de fuite pour l'analyse précise du courant de Kir mécanisé. (A) Enregistrement brut représentatif du courant kir à partir d'une cellule endothéliale mésentérique de souris primaire avec le courant extérieur linéaire notable de fuite (jefuis). Une rampe de -140 mV à 40 mV a été appliquée sur le patch sur 400 ms. La solution de bain contenait 60 mM Ket le potentiel d'inversion était de 20 mV. (B) Jefuis empêche l'analyse de l'activité réelle du canal Kir. Pour soustraire ileak, d'abord calculer la conductance de pente linéaire de ifuite (gpente ' (Ia-Ib)/(Va-Vb)). Multipliezla pente G par des tensions correspondantes de la trace brute entière pour tracer ifuite sur les données brutes. La ligne doit recenser exactement la fuite linéaire extérieure. (C) Soustrayez lafuite tracée I de la trace entière de sorte que le courant extérieur linéaire est de 0 pA/pF et le courant réel de Kir peut être analysé. Notez dans le panneau C que le courant Kir intérieur est environ la moitié de celui de la trace de données brutes d'origine dans le panneau A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Hauteur (mm) Largeur (mm) Longueur (mm) Informations supplémentaires
Pièce A 8 Annonces 80 Ans, états-unis ( 98 Annonces Contient un trou de 3 mm de diamètre pour les tubes de perfusion d'inlet (voir Tableau des matériaux) et un espace rectangulaire de 53 mm x 60 mm pour l'accès aux pièces et aux cellules du milieu
Pièce B 1 Fois 80 Ans, états-unis ( 98 Annonces Contient un espace (20 mm de diagonale) sous le trou de perfusion de la pièce A et trois fentes de 2 mm x 17 mm pour accéder aux cellules
Pièce C 1 Fois 80 Ans, états-unis ( 98 Annonces Contient un espace de 22 mm x 50 mm où la pièce D est adhérée à l'aide de la solution d'élastomère en silicone (voir Tableau des matériaux)
Pièce D 0,16 24 Ans, états-unis 40 ans, états-unis ( Le fond rectangulaire de glissière de verre de la chambre d'écoulement
Pièce E 5 Annonces 80 Ans, états-unis ( 120 Ans et plus Contient un espace de 45 mm x 50 mm pour permettre la visualisation des cellules de la pièce D. Un espace de 20 mm x 45 mm est présent pour que la sortie de vide du réservoir, pièce F, soit respectée
Pièce F 0,16 24 Ans, états-unis 50 Annonces Fond de glissière de verre rectangulaire du réservoir de sortie de vide
Député assemblé 15 Annonces 80 Ans, états-unis ( 120 Ans et plus La chambre de débit est séparée de la perfusion d'entrée et du vide de sortie par deux étapes pour éviter la perturbation du cisaillement laminaire bien défini
Chambre de flux du député assemblé 1 Fois 22 Ans 42 Ans, états-unis ( La pièce D est le fond de glissière en verre de la chambre d'écoulement

Tableau 1 : Dimensions du MPP (assemblés et démontés) et informations supplémentaires spécifiques à chaque partie de l'appareil.

solution Recette (en mM) Ph
dissociation 55 NaCl, 80 Na-glutamate, 6 KCl, 2 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 glucose, 10 HEPES 7,3 Annonces
(Isolement cellulaire)
Bath (Electrophysiologie) 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 glucose, 10 HEPES 7,4 Annonces
Pipette (Électrophysiologie) 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 glucose, 10 HEPES 7,2 Annonces

Tableau 2 : Exemples de solutions avec des recettes utilisées dans les expériences.

Protocole d'isolement cellulaire endothélial Références
Cocktail de protéase neutre et d'élastase (0,5 mg/ml chacun; 1 h à 37 oC) suivi de collagène de type I (0,5 mg/ml; 2,5 min) 6,7
Raclage mécanique doux d'une région de 5 cm2 située à la paroi intérieure de l'aorte thoracique descendante 11 Ans, états-unis (
Na 17 Annonces
Na 3 (en)
Collagène De collagène IA (1 mg/ml) pendant 14 min à 37 oC 8 Annonces

Tableau 3 : Méthodologie pour étudier les canaux ioniques mécanosensibles à l'aide de techniques électrophysiologiques.

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Discussion

Le système vasculaire est constamment exposé aux forces hémodynamiques actives, qui activent les canaux ioniques mécanosensibles3,22 mais les rôles physiologiques de ces canaux dans la mécanotransduction induite par le stress de cisaillement est seulement commence à émerger4,6,8. Les mécanismes responsables de la méchanosensibilité des canaux activés par le stress de cisaillement restent inconnus. Le protocole détaillé décrit ici la méthode d'investigation directe des canaux ioniques mécanosensibles exposés au stress de cisaillement laminaire en temps réel.

L'étape critique et essentielle de ce protocole est l'utilisation d'une chambre de flux de plaques parallèles modifiée s'est assortie d'ouvertures étroites pour permettre à une pipette électrophysiologique d'être abaissée dans la chambre et d'accéder aux cellules sous courant. Le principe général de ce dispositif est que si les ouvertures sont assez étroites,le stress physiologique de cisaillement (jusqu'à 15 dyn/cm 2) peut être réalisé sans débordement de solution dû aux forces de tension de surface10. Afin d'effectuer ces expériences avec succès, il est essentiel: (i) pour les cellules de semence dans la zone de la plaque inférieure qui est directement sous les ouvertures; (ii) établir un joint giga-ohm avant le déclenchement du débit ou pendant un flux defond très lent (lt;0,01 dyn/cm 2) ; (iii) maintenir un joint stable tout en accélérant le débit. Les dimensions de l'appareil acrylique quatre pièces utilisé dans notre laboratoire sont fournies avec des schémas détaillés (figure 1) de sorte que la chambre d'écoulement et le système d'écoulement du MPP (figure 2) peuvent être reproduits pour une utilisation dans n'importe quel laboratoire d'investigation canaux ioniques mécanosensibles. Ces dimensions peuvent également être modifiées pour augmenter la zone ensemencée par les cellules et pour modifier la hauteur du canal d'écoulement, ce qui changerait la relation entre le débit et le stress de cisaillement. Une diminution de la hauteur de la chambre d'écoulement entraînerait un stress de cisaillement plus élevé pour le même débit, ce qui pourrait être bénéfique pour atteindre des contraintes de cisaillement plus élevées. La chambre peut également être modifiée pour inclure une barrière de séparation du débit qui induit une région locale de recirculation du débit perturbé23.

Les principaux avantages de l'utilisation de la chambre d'écoulement MPP comprennent (1) l'étude en temps réel des canaux ioniques activés par cisaillement à partir de cellules endothéliales dans la culture et les cellules fraîchement isolées des tissus vasculaires, (2) l'exposition des cellules et la réponse de l'ion mécanosensible canaux vers des niveaux physiologiquement pertinents de stress de cisaillement, et (3) l'assemblage et le démontage faciles avec des options de perfusion pour l'expérimentation. En ce qui concerne d'autres méthodes existantes, la seule autre méthode qui permet d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous le stress bien défini de cisaillement est d'ensemencer les cellules à l'intérieur d'une extrémité capillaire et d'insérer la pipette d'enregistrement dans l'ouverture capillaire, comme a été fait dans les premières études3,22. Il y a cependant de multiples inconvénients par rapport à la méthode décrite ici, comme la difficulté d'ensemencement des cellules dans les capillaires, l'accès à un très petit nombre de cellules qui sont assez proches de l'extrémité capillaire pour que la pipette puisse les atteindre, et perturbations du débit à l'extrémité du canal d'écoulement (capillaire dans ce cas). Chacun de ces inconvénients rend difficile d'effectuer l'électrophysiologie sous le flux dans les cellules cultivées dans l'ouverture capillaire et pratiquement impossible de patcher ou même les cellules de semences fraîchement isolées de la vascularisation. Il est également impossible d'introduire une étape pour générer une zone de débit perturbé. Toutes les autres méthodes existantes qui emploient des chambres ouvertes24,25 ou soufflant des solutions directement sur une cellule17,18 n'imitent pas l'environnement hémodynamique dans le vaisseau sanguin.

La principale limitation de cette méthode, cependant, est une contrainte pour atteindre le stress de cisaillement à des niveaux plus élevés de la gamme physiologique. Plus précisément, on estime que les niveaux physiologiques de stress de cisaillement atteignent jusqu'à 70 dyn/cm2 dans les artères saines26. En revanche, le niveau de stress de cisaillement le plus élevé que nous pourrions atteindre dans la configuration actuelle de la chambre était de 15 dyn/cm2, après quoi les forces de tension de surface ne deviennent pas suffisantes pour empêcher la solution de déborder des ouvertures10. Il est possible que la diminution de la hauteur du canal d'écoulement puisse permettre d'atteindre des niveaux de stress de cisaillement plus élevés. Maintenir un sceau giga-ohm stable sous stress de cisaillement élevé est un autre défi, mais le taux de réussite est raisonnable avec la pratique. Nous avons constaté que l'utilisation de la technique de correction perforée (y compris l'amphotericinB antibiotique dans la solution de pipette comme décrit ci-dessus) donne des enregistrements plus stables que la configuration standard de cellules entières. De plus, la chambre d'écoulement MPP et les solutions utilisées ne reproduisent pas exactement le cisaillement du flux sanguin dans les artères. Le sang est un liquide visqueux et non newtonien que nous n'avons pas reproduit dans nos expériences in vitro. En outre, la chambre utilisée ici est une chambre parallèle tandis que le stress de cisaillement dans les artères est mieux calculé en utilisant la formule pour le cisaillement dans un cylindre.

Il y a des considérations et des limites importantes pour effectuer des enregistrements à un seul canal sous le flux. Cette méthode est appropriée pour une configuration cellulaire (pipette attachée à la membrane d'une cellule intacte), qui donne des joints stables. Il est cependant essentiel de savoir que les canaux uniques dont l'activité est enregistrée ne sont pas directement exposés au stress de cisaillement parce qu'ils sont protégés par la pipette d'enregistrement, en particulier dans la configuration intérieure27. Nous croyons que les configurations de patch excisées ne sont pas les plus fiables lorsqu'elles sont utilisées pour tester la sensibilité des canaux ioniques à s'écouler parce que la membrane excisée est généralement tirée dans la pipette d'enregistrement et n'est donc pas exposée à un débit bien défini.

En ce qui concerne le type de cellules qui peuvent être utilisées dans ces expériences, les cellules endothéliales vasculaires représentent le type de cellule le plus applicable à l'étude du stress de cisaillement et des canaux mécanosensibles. Les études antérieures se sont concentrées principalement sur les cellules endothéliales cultivées3,28 qui sont facilement disponibles. Nous avons testé et étendu l'utilisation de cette méthode aux cellules endothéliales fraîchement isolées des artères de résistance de souris6,7. D'autres types de cellules devraient certainement être considérés. Les cellules musculaires lisses vasculaires, par exemple, peuvent être exposées au stress de cisaillement pendant les états de la maladie où l'endothélium a été endommagé et enlevé29,30. Cela représente un domaine d'étude intrigant par lequel les canaux mécanosensibles qui résident dans le muscle lisse, qui autrement ne seraient pas influencés par le stress de cisaillement, contribuerait maintenant aux mécanismes potentiellement pathophysiologiques de la maladie. En outre, la transfection de lignées cellulaires de véhicules comme HEK ou CHO avec le gène codant le canal d'intérêt est une excellente plate-forme pour les analyses biophysiques des canaux en combinaison avec l'utilisation de la chambre d'écoulement MPP.

Il est également important de noter que, bien que l'intention initiale de la chambre de débit du MPP était pour l'enquête en temps réel de la mécanactivation du canal ionique, l'application de l'appareil peut s'étendre au-delà de cet objectif. Plus précisément, la même approche peut être utilisée pour les études qui utilisent des capteurs d'électrodes, comme un capteur d'oxyde nitrique (NO) pour déterminer la libération de NON en réponse au stress de cisaillement. Par conséquent, nous fournissons une méthodologie généralisée pour ceux qui ont intérêt à étudier les processus biologiques réglementés mécaniquement en temps réel et nous favorisons d'autres modifications de la chambre des députés pour répondre à des besoins de recherche spécifiques pour ceux qui étudient processus mécanosensibles dans une variété de domaines.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) et (T32 HL007829-24, ISF). Les auteurs aimeraient également remercier le Scientific Machine Shop de l'Université de l'Illinois à Chicago pour avoir généré nos dernières chambres de flux mPP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile syringe filters VWR 28145-501 Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution
5 grade forceps Fine Scientific Tools 1252-30 Used for transferring digested arteries to fresh solution
9" Pasteur Pipet Fisher Scientifc 13-678-20D Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells 
12 mm diameter Cover glass circles Fisher Scientifc 12-545-80 For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses
24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass Sigma-Aldrich CLS2975224 Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)
24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass Sigma-Aldrich CLS2975245 Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)
20 G syringe needles Becton Dickinson and Co 305175 For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries
35 mm Petri dish Genesee Scientific 32-103 For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528-50MG Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.
Collagenase, type I Worthington Biochemical 100 mg - LS004194 Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientifc 67-68-5 Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp
Elastase, lyophilized Worthington Biochemical 25 mg - LS002290  Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid  Corning 353046 For use with studies involving cultured cells and multiple treatments
Neutral protease/dispase Worthington Biochemical 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation
SylGard  World Precision Instruments SYLG184 Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)
Tygon ND 10-80 tubing Microbore Tubing AAQ04133 ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber

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References

  1. Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97, (2), 495-528 (2017).
  2. Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
  3. Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331, (6152), 168-170 (1988).
  4. Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27, (5), 671-678 (2006).
  5. Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596, (6), 979-984 (2018).
  6. Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595, (7), 2339-2364 (2017).
  7. Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7, (5), (2018).
  8. Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8, (1), 350 (2017).
  9. Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515, (7526), 279-282 (2014).
  10. Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28, (10), 1184-1193 (2000).
  11. Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98, (8), 1064-1071 (2006).
  12. Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
  13. Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
  14. White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
  15. Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68, (5), 1885-1896 (2016).
  16. Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103, (3), 177-185 (1981).
  17. Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (11), 7780-7785 (2002).
  18. Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32, (8), 1589-1593 (2000).
  19. Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40, (2), 159-168 (2003).
  20. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31, (5), 1175-1186 (2011).
  21. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
  22. Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286, (6), C1367-C1375 (2004).
  23. Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38, (1), 64-75 (2018).
  24. Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
  25. Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
  26. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282, (21), 2035-2042 (1999).
  27. Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431, (1), 129-131 (1995).
  28. Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85, (9), 820-828 (1999).
  29. Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216, (2), 389-395 (2008).
  30. Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, (8), 1512-1516 (1997).

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