מודל טרום קליני של תרומת הלב לאחר מוות הדם

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מציג גישה פשוטה וגמישה להערכת סוכני מיזוג או אסטרטגיות חדשות כדי להגביר את הכדאיות של תרומת הלב לאחר מוות הדם.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Aceros, H., Joulali, L., Borie, M., Ribeiro, R. V., Badiwala, M. V., Der Sarkissian, S., Noiseux, N. Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death. J. Vis. Exp. (150), e59789, doi:10.3791/59789 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הביקוש להשתלה הלב הוא בעלייה; עם זאת, זמינות האיברים מוגבלת בשל העני של תורמים מתאימים. תרומת איברים לאחר מוות הדם (DCD) הוא פתרון כדי לטפל בזמינות זו מוגבלת, אבל בשל תקופה של איסכמיה חמים ממושכת ואת הסיכון של פציעה ברקמה, השימוש השגרתי שלה השתלת לב לעתים רחוקות נראה. בכתב יד זה אנו מספקים פרוטוקול מפורט היטב מחקה את השיטות הקליניות הנוכחיות בהקשר של DCD עם ניטור רציף של תפקוד הלב, המאפשר הערכה של אסטרטגיות הרומן הספר והתערבויות לירידה פציעת איסכמיה-reperfusion.

במודל זה, הפרוטוקול DCD מתחיל בחולדות לואיס מאוחסות על ידי עצירת אוורור כדי לגרום למוות במחזור הדם. כאשר לחץ דם סיסטולי יורד מתחת 30 מ מ, זמן האיסכמי חם הוא יזם. לאחר שנקבע מראש תקופת איסכמי חם, הלבבות הם לרוקן עם הפתרון cardioplegic מיקרופון, הושגו, ורכוב על לאנגדורף לשעבר vivo מערכת הזרקת לב. לאחר 10 דקות של reperfusion הראשונית ייצוב, מיזוג לב מוערך ברציפות עבור 60 מינימום באמצעות ניטור לחץ מחדש. פגיעת לב מוערך על ידי מדידת טרופונין T ו סיכונים גודל הוא כימות על ידי כתמים היסטולוגית. זמן איסכמי חם יכול להיות מאופנן ומותאם לפתח את הכמות הרצויה של נזק מבנית ופונקציונלי. פרוטוקול זה פשוט מאפשר הערכה של אסטרטגיות שונות מיזוג קרדיוקטיבי הציג ברגע של הקרדיו, reperfusion הראשונית ו/או במהלך vivo perfusion לשעבר. ממצאים שהתקבלו פרוטוקול זה ניתן לשכפל במודלים גדולים, הקלה על תרגום קליני.

Introduction

השתלת איברים מוצק בהשתלה כללית ובלב, בפרט, הם על עליית ברחבי העולם1,2. השיטה הסטנדרטית לרכישת איברים היא תרומה לאחר מוות מוחי (DBD). בהינתן קריטריוני הכללה קפדנית של DBD, פחות מ 40% של הלבבות המוצעים מתקבלים3, ובכך להגביל את ההצעה מול הביקוש הגוברת והרחבת רשימת ההמתנה לאיברים. כדי לטפל בבעיה זו, השימוש באיברים שנתרמו לאחר מוות הדם (DCD) נחשב לפתרון פוטנציאלי4.

ב-dcd תורמים, עם זאת, שלב נשימות אגונאליות לאחר נסיגה של טיפול ותקופה של איסכמיה חמה לא מוגנת לפני החייאה הם בלתי נמנע5. פגיעת איברים פוטנציאליים לאחר מוות הדם יכול להוביל לתפקוד איברים, להסביר את חוסר הרצון לאמץ באופן שגרתי DCD השתלות לב. הוא דיווח כי רק 4 מרכזים להשתמש dcd לבבות קלינית, עם קריטריונים מחמירים הכוללת מאוד קצר איסכמיה מאוד חם ותורמים צעירים ללא פתוגיות כרוניות6,7. מסיבות אתיות ומשפטיות, ניתן ליישם התערבויות מוגבלות או ללא התערבות קרדיוקרדיסטית בתורמים לפני מוות הדם5,8,9. כך, כל הקלה כדי להקל על הפגיעה איסכמיה-reperfusion (IR) מוגבל לטיפולים קרדיולפתאריים שיזמו במהלך הreperfusion המוקדמות עם פתרונות קרדיולצימית, ואינם מאפשרים הערכה תפקודית נאותה. לשעבר vivo לב זלוף (evhp) ו-התניה של הלב dcd באמצעות פלטפורמות ייעודי הוצע כפתרון אלטרנטיבי ולמד על ידי חוקרים שונים10,11,12,13 . EVHP מציעה הזדמנות ייחודית לספק סוכני שלאחר המיזוג ללבבות DCD כדי לשפר את ההחלמה הפונקציונלית. עם זאת, עבור תרגום קליני יעיל, בעיות טכניות ומעשיות רבות נותרו להיות ממוען, וזה מורכב עוד יותר על ידי חוסר הסכמה על מגוון של קריטריונים הפרזיה ופונקציונלי כדי לקבוע את היכולת הזריעה6, שמונה.

כאן אנו מדווחים על התפתחות של פרוטוקול DCD לפני המחקר הקליני בשילוב עם מערכת הvivo לשעבר הפרה של הלב שניתן להשתמש בו כדי לחקור לאחר מיזוג איברים יזם בזמן הרכישה, במהלך reperfusion הראשונית, ו /או ברחבי EVHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל טיפול בעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים תאמו את המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים מעבדה ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש בוועדה של מרכז אשפוז דה לאוניברסיטת מונטריאול המרכז למחקר.

1. ההכנות הראשוניות

  1. הפעל את אמבטיית המים כדי לחמם את מערכת המסירה (איור 1a) ואת מערכת לאנגדורף לשעבר vivo זלוף (איור 1a). הגדר את טמפרטורת המים עד 38.5 ° c לטמפרטורת פתרון של 37 ° c. ניתן לראות את תצלומי ההתקנה באיור המשלים 1A, B.
  2. הכינו 1 ליטר של התמיסה הקרדיוקרדילית. הוסף 1 mL של 2% לידוקאין הידרוכלוריד ו 10 מ מ 2 מ"מ KCl (הריכוז הסופי 20 מ"מ) עד 1 L של פלזמה-Lyte A (140 mM Na, 5 מ"מ K, 1.5 mM מ ג, 98 mM Cl, 27 מילימטר אצטט, 23 מ"מ gluconate). PH נכון 7.4 שימוש 6 N HCl.
    זהירות: מודל זה הוא רגיש מאוד ל-pH. תיקון pH שגוי (מחוץ לטווח הפיזיולוגי של 7.3-7.4) או פתרונות בלתי יציבים של pH עלולים לפגוע בניסוי או לספק נתונים לא מהימנים.
  3. הכינו 4 L של הפתרון Krebs (113 mM היאl, 4.5 mM KCl, 1.6 mM נה2PO4, 1.25 mm cacl2, 1 מ"מmgcl 2 ∙ 6H2O, 5.5 מ"מ D-גלוקוז, 25 mM נחקו3). המוני מצע 1 L של הפתרון צריך להיות כדלקמן: 6.1 g של הנרוג, 0.3355 g של KCl, 0.2035 g של MgCl2∙ 6h2O, 0.192 g של נה2PO4, 0.1387 g של cacl2, 0.99 g של D-גלוקוז, 2.1 g של נחקו3 , הנפח הסופי של 1 L במים מפולים במיוחד. הוסיף את ה מיכל שלוש אחרון שימנע משקעים. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ואחסן לילה. תקן את ה-pH כדי 7.4 כאשר הפתרון הוא ב 37 ° צ' ובועה עם 5% CO2/95% O2.
  4. ממלאים את מעגל לאנגדורף עם פתרון קרבס ולהפעיל את משאבת המערכת. לוודא כי בועות לא נותרו בתוך אבובים. כוונן את מהירות המשאבה הפריסטטית ל-80 סל"ד (שווה ערך ל-1 L/min). באמצעות שני הדרך הפסקת התרנגול, להתאים את הזרימה כדי לשמור על טפטוף איטי דרך צינורית אבי העורקים עד שהלב מוצמד (איור 1B). שמור דגימה של הפתרון krebs (15 mL) בשפופרת חרוטי 50 mL על הקרח לצורך הובלת לב.
  5. תמלא את מערכת האספקה. עם התמיסה הקרדיוליסטית לאחר הבועות יוסרו, להחליף את המעגל מלוחים באמצעות התרנגול 3 דרך לעצור (איור 1A). . כוונן את קצב הטפטוף מלוחים חייב להיות באיטיות נוטף מהקצה של הקטטר כדי להבטיח כי הפתרון לא מוזרק לב לפני מותו של בעל החיים.

2. הכנה לבעלי חיים

  1. באמצעות תא אינהלציה, לגרום להרדמה. ברגע שהחיה אינה מגיבה, בצע הזרקה של קטמין (75 מ"ג/ק"ג) ו-xylazine (5 מ"ג/ק"ג) או הרדמה מתאימה באופן דומה, בעקבות התקנות המקומיות, כדי לשמור על ההרדמה לשאר הפרוצדורה. להבטיח את עומק ההרדמה על ידי שום תגובה צביטה הבוהן ו palpebral רפלקס.
  2. החיה משתמשת בצנתר. בעובי של 14 גר' הפעל אוורור ב 50 נשימות לדקה, עם לחץ דרכי הנשימה מוגבל 20 cmH2O.
  3. מניחים את החיה על כרית חימום שנקבעה "בינונית" ומכסה עם משטח סופג כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. הכנס לווין בטמפרטורה רקטלית וחבר חיישן אוקסימטר של הפולס לאחת הרגליים. לשמור על טמפרטורה רקטלית ב 37 ° c במהלך ההליך.
  4. גישה לכלי דם
    1. לעשות 3 כדי 4 ס מ העור חתך באמצע הצוואר באמצעות מספריים. שימוש במספריים מעוקלים, מנתחים בוטה את הרקמה התת עורית וחושפים את שריר הלשון הימני. באמצעות מלקחיים לא טראומטיים, הזז את השריר מעבר לשני עד לעורק העורק הימני (פועם), וריד העורק (לא פועם) והעצב התועה (לבן) מזוהים באופן חזותי (איור משלים 2 א). בזהירות להפריד את העצב תועה מתוך העורק הראשי באמצעות תשר קהה מספריים מעוקל.
    2. הכנס הפארין (2,000 IU/ק"ג) דרך עורק הצוואר הימני. החל לחץ על אתר ההזרקה לאחר נסיגה המחט כדי למנוע דליפת דם.
    3. באמצעות מלקחיים מעוקלים, לעבור 2 5-0 התפרים משי סביב העורק הראשי. לסגר את עורק הראש. בהיבט העליון של העורק החשוף . שמור על התפר הטוב ביותר משיכת התפר הקרוב ביותר ישמשו לשליטה בדימום בשלב הבא (איור משלים 2 ב). המרחק בין התפרים צריך להיות בקירוב 2 ס מ.
    4. באמצעות stereomicroscope לצורך הדמיה טובה יותר, בזהירות לעשות חתך 1 מ"מ עם מספריים מיקרו ניתוח על הקיר הקדמי של עורק הראש. להכניס 22 גרם, 1-סנטימטר העירוי הסגור לכיוון קשת אבי העורקים. הצנתר מחובר 2 התרנגול להפסיק לעצור, המאפשר חיבור ללחץ מתמר לניטור קבוע, עם האפשרות של הזרקת תמיסת מלח או קרדיולוגית דרך מערכת המסירה (איור 1A).

3. ייזום של תרומת הלב לאחר מוות הדם (DCD) פרוטוקול

הערה: ניתן לראות את ציר הזמן המלא של הפרוטוקול באיור 2.

  1. הישבנים מחדש את עומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטה הבוהן והערכת palpebral רפלקס. אם התגובה היא נצפתה, לבצע הזרקה תוך הצפק של קטמין (37.5 mg/Kg) ו xylazine (2.5 mg/ק"ג). הערכה מחדש לאחר 5 דקות. אם לא נצפתה תשובה המשך בהליך. יש לבצע את מהדק הקנה רק בחיות מיויתות כראוי.
  2. כבו את המאוורר. והוציאו את החיה , שימוש במלחציים נגד יתושים. מהדק את קנה הנשימה הרגע הזה נחשב לתחילתו של השלב האגלי. התחל לספור את הזמן הפונקציונלי החמים התפקודי (שנינות) כאשר לחץ הדם הסיסטולי השיא טיפות מתחת 30 mmHg, או אם מופיע פרפור פרוזדורי או חדרית, מה שבא הראשון (איור 3).
    הערה: מידת הנזק צריכה להיות פרופורציונלית לשנינות. ניסויים נחוצים כדי למטב את הזמן על פי הרדמה בשימוש, בעלי חיים זן, מין ומשקל נבחר. בבעלי חיים בשליטה, מיד לאחר הגישה לכלי הדם בעורק הראש מאובטח, מוזרק הקרדיו, והלב מקבל כמתואר בשלב הבא (איור 2). ההתחלה של הפרזיה עם הקרדיוסטית נחשבת לסופה של התבונה.
  3. בסוף התבונה, בצע. כריתת אונה המדיאלי השאר את החזה פתוח. באמצעות מפסק אלם שימוש במספריים, לפתוח את הבור הבור הנחות ושניהם האטריה כדי למנוע שריר הלב או הקרדיודקחיסון (איור משלים 3). . תהדק את העורקים מעל הסרעפת דרך העורק הקודם של העורק הראשי, להחדיר את הפתרון cardioplegic בלחץ מתמיד של 60 mmHg עבור 5 דקות באמצעות מערכת העברת שילוח. לחץ אינפוזיה ניתן לשנות על ידי שינוי גובה של עמודת המים.
  4. בסוף האינפוזיה, מנתחים את העורק הראשי הנמצא מתחת לעורקי הריאות באמצעות מלקחיים מעוקלים (4A). . לעורק התחתי השמאלי להבטיח אורך אבי העורקים של לפחות 0.5 ס"מ על הצינורית של מנגנון לאנגדורף.
  5. להחזיק את הלב מאבי העורקים, להשלים את הניתוח באמצעות הפרדת הלב מעורקי הריאות וממבני החזה האחרים (איור משלים 4B). במהירות, לטבול את הלב לתוך הקרח קר קרבס פתרון לתחבורה מהירה למערכת vivo ex. שמור את זמני הניתוח וההעברה בקצרה ככל האפשר (5 דקות).

4. לשעבר Vivo מערכת הלב Perfusion (EVHP) והערכה פונקציונלית לב

  1. פתח את לומן אבי העורקים. באמצעות מלקחיים Deair העורקים על ידי מילוי לומן עם הפתרון Krebs טפטוף כדי למנוע בועות לכפות על כלי הדם כלילית. הורידו את הצינורית לתוך אבי העורקים, מטפלים לא להעביר את שורש אבי העורקים או לפגוע בעלונים של שסתומי אבי העורקים. תקן את הכיוונון באמצעות מהדק קטן.
  2. באמצעות העצירות 2 הדרך, להגדיל את הזרימה כדי לחפש דליפות אפשריות העורקים. אם אף אחד לא מזוהה, היטב לתקן את העורקים לצינורית באמצעות תפר משי 2-0. . פתח לגמרי את הזרימה לצינורית לשמור על לחץ האבי העורקים בלחץ פיזיולוגי של 60-70 mmHg (מותאם על ידי שינוי הגובה של המערכת). ברגע זה מתחילה הreperfusion וזמן הייצוב הראשוניים. ניתן לשנות את לחץ אבי העורקים בהתאם לתוכנית הניסיונית של החוקר.
  3. סובב את הלב כך שבסיס הלב (atria) יעמוד בפני חיישן הלחץ. . מנתח את הורידים הריאתי הכנס את בלון לייטקס מחובר חיישן הלחץ. ודא כי הבלון ממוקם במלואו בתוך החדר על ידי בדיקה חזותית. באיטיות למלא את הבלון עם תמיסת מלח עד הלחץ דיאסטולי הקצה (EDP) מוגדר ל 15 מ מ. להתאים לפי הצורך כדי לשמור על קבוע edp (הקבועים מראש edp פיזיולוגי). ניתן לכוונן את ה-EDP בהתאם ליעדי הניסוי של כל חוקר.
  4. הכנס את האלקטרודה הצועדת לפנים הקדמי של הלב (מערכת העיכול הימנית). הימנע מלשאת את כלי הדם הכליליים. לאחר הכאה ספונטנית הוא נצפתה, ליזום התנועה על 300 פעימות לדקה. המתח הנדרש עשוי להשתנות בין ניסויים וזנים חולדות.
  5. לאחר 10 דקות של ייצוב, ליזום הקלטה רציפה בלחץ מתמשך ההקלטה מדידה. רגע זה נחשב לתחילתו של שלב ההתניה וההערכה (זמן 0) שיימשך 1 h (איור 2). התניה עשויה להיות ממושכת, אך ירידה תלויה בזמן בהתבלפות צפויה בכל לבבות.
  6. בתחילת מחדש, לאסוף הקולחים הלב לרדת מתוך ורידים הלב עבור 5 דקות עבור הערכה בסיסית תזרים כלילית וניתוחים ביוכימיים. עבור טרופונין T לחזור על כל 15 דקות (כפול 0, 15, 30, 45 ו 60 דקות). עבור ניתוחים אחרים האינדיבידואליזציה של זמני איסוף נדרשת (איור 2).

5. סוף הניסיון

  1. . תסיר את הלב ממנגנון לנגדורף
  2. באמצעות להב פלדה ישר פחמן גבוהה (להב מיקרוטומה או דומה), להסיר את בסיס הלב (כולל עורק העורקים והריאות).
  3. עם חדר החדר הימני פונה למטה, לחתוך שקופיות המוח רוחבי של 1-2 מ"מ עובי. בחלק מייצג אחד (בדרך כלל השלישי) בלו את החדר הימני ואת ההקפאה להקפיא את החדר השמאלי. ניתן להשתמש בדוגמה זו לניתוחים ביוכימיים.
  4. להטביע את הסעיפים הנותרים כדי טרי מוכנים 5% 2, 3, 5-triphenyl-טטרזויום כלוריד במאגר פוספט מסחרי מלוחים pH 7.4 עבור 10 דקות ב 37 ° c. רקמות בר קיימא הם צבע אדום לבנים.
  5. לשטוף פעמיים עם מאגר פוספט מלוחים pH 7.4 ולתקן עם 10% פורמלין ב 4 ° c בלילה. לשטוף פעמיים עם פוספט מלוחים באגירה pH 7.4 ולשמור כל פרוסה שקוע.
  6. משיכת עודפי נוזלים ומשקל כל שקופית. לצלם תמונות צבע דיגיטליות משני הצדדים. השתמש ניתוח planimetric כדי לחשב אחוז סיכונים size ונכון עבור פרוסה משקל המוח הכולל. צבע מתפוגג עם הזמן. יש לקחת תמונות בהקדם האפשרי.

6. ניתוח נתונים

  1. שמור את כל נתוני הלחץ בקובץ חדש לכל חיה.
  2. לניתוחי לחץ, בחרו לפחות 200 מחזורי לחץ לנקודות זמן. ניתוח יכול להתבצע לא מקוון (לאחר סיום הניסוי) באמצעות תוכנה ייעודית (לדוגמה, LabChart). פרמטרי לב וכלי דם נפוצים זמינים כוללים: לחץ מקסימלי שנוצר, לחץ דיאסטולי הקצה, + dP/dt (מדרון תלול במהלך העומס של עקומת הלחץ, מחוון של היכולת החדרית),-dP/dt (מדרון תלול במהלך ה למטה של עקומת הלחץ, מחוון של קיבולת הרפיה חדרית) בין היתר.
    הערה: לניתוח טרופונין, גידול ב טרופונין שחרור ב reperfusion הוא צפוי. אחרי 1 h של reperfusion ב-evhp מערכת, רמות טרופונין עלול לרדת לבסיס, הדגיש את הצורך בעיתוי זהיר באוסף וטיפול של דגימות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר ההטברות, לחץ הדם צונח במהירות בתבנית צפויה (איור 3). הזמן הצפוי למוות הוא פחות מ -5 דקות.

איור 4 מראה עקומת ממוצע לחץ/זמן בתחילת התניה לאחר 0, 10 ו 15 דקות של שנינות. תפקוד הקונאקטולה ישתפר לאורך זמן. השימוש בתקופות קצרות של שנינות תאפשר לחזור לשגרה, ונזק מורפולוגיים לא יהיה ניתן לזיהוי (איור 5 ואיור 6).

הוכחת המושג שימוש של סוכן מיזוג הוסיף עם הקרדיוגרמה ובשלב הייצוב מראים כי הנזק שנוצר על ידי 15 דקות של שנינות במודל זה הם מאוד קלה אפנון על ידי סוכני קרדיוסטטים (איור 4, איור 5 ו איור 6).

Figure 1
איור 1: סכימות הציוד הנדרשות. דרישות מינימליות עבור מערכת מסירה (a) לvivo לשעבר (ב) לנגדורף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ציר זמן של פרוטוקול. ציר הזמן מרגע העיבור עד לסוף הפרוטוקול. בבעלי חיים שליטה, הלגיון הוא יזם ללא DCD או זמן איסכמי חם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: לחץ דם תאיים/העלילה הזמן. האבולוציה אופייני של לחץ דם תאיים לאחר היווצרות. כוכבי הזמן החמים איסכמיה כאשר לחץ הדם הסיסטולי השיא יורד מתחת לגיל 30 mmhg, או אם מופיע דום לב או פרפור פרוזדורים, מה שבא ראשון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: Ex vivo הממוצע להכות לנצח הזמן לחץ המוח עקומת. תמונה שנגזר ניתוחים של נתונים שצולמו לאחר 10 דקות ייצוב ו זלוף (זמן 0 בדמות 2) עם או בלי השימוש של סוכן תרופתי ניסיוני התניה. זמן האיסכמי מתייחס לזמני איסכמי חם (שנינות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: לשעבר vivo התאוששות וניתוחים פונקציונליים. (A) מתמשך בלחץ הזמן ללחוץ עקומת לאחר 10 דקות ייצוב ו זלוף עם או בלי שימוש של סוכן תרופתי ניסיוני התניה. חיצים להראות ממצאים עקב שינוי ידני של EDP. (ב) מקסימום (+ dp/dt) ו מינימום (-dP/dt) שיעור של שינוי הלחץ ב LV לעומת העלילה זמן נגזר (א) מראה שיפור תלוי זמן באופן הפעולה ללא טיפול (הקו הירוק). לבבות בעלי שנינות קצרה (שורה אדומה) או מטופלים (צהובים) מציגים תבנית דומה לקבוצת הבקרה (קו כחול). נקודות נתונים הן משמעות של לפחות 200 פעימות בודדות. סרגלים מציגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע של כל נקודת נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6:2, 3, 5-טריפניאיל-טטרזויום-כלוריד בסוף הניסויים. אזור סיכונים נצפתה בעקבות מגוון זמני האיסכמי חם (שנינות) והשימוש בסוכן התניה תרופתי. אדום לבנים: רקמות קיימא. צהוב בהיר: רקמה לא קיימא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: צילום ההתקנה. (א) צילום המציג את הכיוונון של מערכת השילוח. ציוד ממוספר מתאים: הגורם המכיל (1), מלכודת בועה (2), חיישן הלחץ וקטטר (3), משאבה פריסטלטית (4), פוליגרף המחובר לחיישן הלחץ (5) ומאוורר בעלי חיים קטנים (6). (ב) צילום המציג את הכיוונון של מערכת הvivo לשעבר של הלב לנגדורף. ציוד ממוספר מקביל ל: מיכל מבשם (1), מכולה של סוכן מיזוג (2) וחדר לב (3). אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 2: ניתוח צוואר. (א) צילום המציג את עורק הצוואר החשוף (חץ) לפני הזרקת הפארין. (ב) מציג את עורק הראש הגזור (חץ) עם התפרים שמוקמו בקרת דימום. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 3: פתיחת האתריה למניעת החיסון. (א) צילום המציג את הפתח של הגפה השמאלית (1). על רקע העורקים (2) מהודק מעל הסרעפת (3). (ב) מראה את פתיחת הנספח הימני (1). אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 4: רכש לב. (א) צילום המציג את השימוש של מלקחיים מעוקלים כדי להפריד את העורקים (החץ) ואת עורק הריאתי. (ב) צילום המציג ניתוח לב ומכרזים. הלב הוא להחזיק את העורקים באמצעות מלקחיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מציג מודל פשוט, נוח תכליתי של DCD לב, המציע את ההזדמנות להעריך התאוששות תפקודית הלב, הנזק לרקמות ואת השימוש לאחר מיזוג סוכנים לאחר המיזוג כדי לשפר את ההחלמה של תורם לבבות שנמחקו לאחר ההשתלה. מערכות vivo לשעבר של לב זלוף (evhp) מערכות כבר אופטימיזציה כדי לספק פלטפורמה להערכת תפקוד הלב ולהציע הזדמנות ייחודית לספק ולבדוק פתרונות ששונו בתוספת עם שלאחר מיזוג סוכנים תרופתי כדי ל לשמר ולתקן את לבבות dcd בקטן15 ובעלי חיים גדולים16,17 מודלים של dcd לב. עם זאת, הפרוטוקולים הם לעתים קרובות מפורט מספיק ולא תמיד רלוונטי קלינית, הפיכת תרגום קליני קשה.

בתחום של מודלים DCD, מודלים DCD לשעבר vivo, כמו זה שמתואר על ידי צאנז18, חוסר שלב האגונאליות. על ידי גרימת דום לב על ידי עצירת אוורור מכני, מערכת העצבים הסימפתטית הוא מופעל מוגזם, המוביל "סערה קטכולאמין"19. גידול זה בcatecholamines משנה את המאפיינים של איברי התורם, והוא נקשר מעמד פונקציונלי מופחת של איברים DCD ניסיוני19. בנוסף, את הירידה הפרוגרסיבית בפונקציה לפני דום לב מוביל לימין המוח ופציעה הסוגר. בפרוטוקול שלנו, הצלחנו לגרום למוות במחזור הדם באמצעות מודל חנק הרלוונטי קלינית, אשר שומר על תגובות אלה.

שני הראשי בדגמי DCD vivo לב מתוארים בספרות: חזה פתוח15 והחזה סגור20 דגמים. הפיזיולוגיה של הלב משתנה על ידי גישת החזה הפתוח על ידי הפחתת המגע מכני ריאות/לב מטעינת. יתר על כן, בהליכים בחזה פתוח, אובדן חום הגוף מואץ, המשפיעים עוד יותר על תוצאות פונקציונליות21. לכן עדיף לשמור על גישה סגורה למניעת אובדן חום. עידון נוסף הוא למזער את השונות של הזמן למוות במחזור הדם. Kearns ואח ' דיווחו כי הזמן למוות (הזמן ל-non-לפרוס או לחץ דם מתכוון פחות מ 30 mmHg) היה בין 3 עד 11 דקות. ב 10 ו 20 דקות שנינות, 40% ו 60% של לבבות לא שחזור הפונקציה, בהתאמה, על vivo ex מכשיר לב עובד, מה שהופך פרשנות נתונים קשה יותר15. חלופה להפחתת הזמן למוות במחזור הדם היא להשתמש בסוכנים משותק20; אף על פי כן, כמה עדויות מצביעות על השפעות לב ישיר של vecuronium, בשל השפעותיו על האינבציה הסימפתטית והפאראסימפתטית22. כדי להגדיל את האפשרות, אנו בחרו לסדר את הקנה הנשימה, בשילוב עם לחץ עורקים מדויק מחודש, ומאפשר זמן הומוגנית יותר (< 5 דקות). ידוע כי הנזק איברים מתחיל לפני רגע של מוות הדם; עם כמה מחברים בהתחשב בלחץ הדם הסיסטולי לחתוך מתחת 50 mmHg כתחילת שנינות תפקודית6, המסבירה את הסירוב לאיברים השתלת לאחר הטופס תקופה ארוכה נסיגה של החיים לקיים צעדים עד reperfusion. בפרוטוקול זה, הגדרת השנינות המשמשת לאחר התקן הניסיוני הנוכחי15, עם זאת, מחקרים נוספים נחוצים כדי להבהיר את הקבוצה המדויקת של פרמטרים הומודינמיים המסמנים את האינדוקציה של נזק איברים כדי לשפר את השנינות חישוב, ובכך מציע מידע טוב יותר עבור פרקטיקה קלינית.

העירוי של הפתרון הקרדיולוגי בלחץ פיזיולוגי קבוע וטמפרטורה מציעה הזדמנות ייחודית ליזום מיזוג לב ורקמות הגנה עם כל סוכן תרופתי או באמצעים אחרים. ליטושים טכניים כוללים לולאה של העורקים החזי, הגבלת הפרזיה ללב ובכך להקטין את כמות הפתרון הדרוש עבור כל מאמר. לאחר הלב הוא על מערכת EVHP, הערכה תפקודית סטנדרטית היא הכרחית. זה הוכח כי השימוש במערכת evhp יש פוטנציאל לשפר את החייאה של לבבות שנחשבו בעבר לא שתילת שולחן23,24. מעניין, מערכת evhp הזמינה קלינית מעריכה את הכדאיות הקרדיולוגית רק באמצעות מדידות לקטט טוריות8,23. מדידות לקטט אינן קשורות ביצועים קרדיולוגית של לבבות dcd24,25, ולכן מדידות נוספות להערכת הערכת הזריעה הכרחית. התקנה ניסיונית זו מאפשרת הערכה תפקודית מלאה, כולל לחצים שנוצרו מדידות שריר הלב כולל + dP/dT ו-dP/dT, המאפשר הערכה יסודית יותר של תפקוד הלב לפני ההשתלה הסופית . ההחלטה נעשתה בנוסף, מדידות של הטרופונין לב, סמן של נזק שריר הלב בקורלציה ישירה כדי סיכונים בגודל26, ו קינטיקה שחרור קשורים במידה של איסכמיה לב באיסכמיה לנגדורף/reperfusion מערכת. בפרט, עם זמני איסכמי ארוך (60 min), רמות טרופונין נשמרות אחרי 1 h reperfusion, בעוד ldh ו קריאטינין קינאז ירידה משמעותית, ולהיות לא קשור במידה של נזק לב27,28, ולכן השימוש באמצעים סדרתיים מבטיחים הערכה מלאה של הכדאיות באיברים לפני ההשתלה. משתנה מרכזי בהערכה בתפקוד הלב הוא קצב הלב. קצב הלב ספונטנית קשורה באופן הפוך לאורך של איסכמיה29, ואת קצב הלב ישירות עם + dP/dt ב לבבות עכברוש מבודדים30 ו בעלי חיים מודלים31. מעניין, בעבודה שפורסמה לאחרונה על מודלים מכרסמים של לבבות dcd ו evhp מיזוג, התנועה לא היה שימוש ושיעורי הלב היו משתנים ונרשמו בפרוטוקולים שלהם15,18,20. כדי לשמור על קצב הלב הפיסיולוגי, התנועה היתה בשימוש לאחר שהלב התאושש הציר הקצבי. שנבחרו 300 bpm תדירות דומה לאלה של בריא, לא הדגיש חולדות32.

מגבלות פרוטוקול זה כוללות את השימוש של הרדמה נדיפים עבור אינדוקציה. סוכנים אלה הוכחו להיוועץ איסכמי התניה33. אף על פי כן, הזמן הקצר של השימוש בהרדמה לא היה השפעה הנצפה בפרוטוקול זה ותפקוד שריר הלב מתקדמת עדיין ציין עם הגדלת שנינות. ניתן לראות גם כמגבלה של השימוש באנמיקרופון קרדיוסמטי. מאפשר תרגום אופטימלי מתוך מצבים של מבחנה בשימוש לפיתוח סוכני מיזוג פרמקולוגיים, מאחר שתאים מתוחזקים בדרך כלל ב-37 ° c. עם זאת, בתהליך זה ניתן לווסת בקלות את הטמפרטורה בהתאם לדרישות החוקר. מצד שני, השימוש בתכשיר לאנגדורף לעומת הכנה להכנת לב הפועל לצורך מיזוג מחדש עשוי להיראות גם כמגבלה. הכנת לב העבודה מאפשרת הקלטה רציפה של לולאה לחץ/נפח12,15, עם מבוקרת pre ו-afterload, המאפשר הערכה תפקודית מלאה. היתרון העיקרי של הכנה לאנגדורף הוא שהיא שומרת על מעשה בלתי פוסק של אבי העורקים ועל הלחץ, במיוחד במהלך הreperfusion הראשונית, כאשר הלחץ שנוצר הוא מינימלי. בנוסף, כיוונון ההערכה הינו פשוט יותר לליבו של לאנגדורף בהשוואה להכנת לב פועל. עם זאת, התקנה זו יכולה להיות מומרת להכנת לב העבודה אם לבדוק את הצורך. לחילופין, הנפשת לב ניתן לבצע באתרו באמצעות הפרזיה האזורית norמיקרופון, עם ביצועי הלב נמדד ישירות על ידי שימוש של קטטר מילאר34, המאפשר הומודינמיקה מקיפה ושריר הלב פונקציונלי הערכה לפני רכישת איברים. בבני אדם, הן באתרו הvivo לשעבר אסטרטגיות מיזוג מחדש תוארו6, ולכן הפיתוח של שני הדגמים מאפשר השוואות ניסיוני שעשויים לתרגם לאופטימיזציה של פרקטיקה קלינית. לבסוף, הגודל הקטן וקצב הלב הגבוה של המודל החי הזה עשוי להיחשב כמגבלה בשל הקשיים הטכניים הפוטנציאליים שנצפו בעת ביצוע ניסויים אלה, וההבדלים הפיזיולוגיים הבלתי נמנעים בין החולדה ללבבות האדם. אם ההערכה EVHP כבר סטנדרטית, חוקר יכול להיות מכיר את הטכניקה הזאת על ידי ביצוע מעט כמו 3 ניסויים. מצד שני, השימוש בדגם בעלי חיים קטן זה מאפשר הקרנה נוחה בעלות סבירה, הזמנת דגמי בעלי חיים גדולים ויקרים יותר, כגון מודל הפורצין, לטיפולים בעלי פוטנציאל מעבר אנושי גבוה.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן לוקח בחשבון את השיטות הטובות ביותר הנובע ממספר קבוצות מחקר לבבות DCD. פרוטוקול זה מעניק שליטה מלאה של התבונה, ומאפשר הערכה מבנית ופונקציונלית מקיפה של הטיפול בשיטות מיזוג קרדיוקטיבי בחולדות. פרוטוקול זה ניתן להגדיל והועבר למודלים בעלי חיים גדולים, המאפשר לתרגם ממצאי מחקר למציאות קלינית ובסופו של דבר מאפשר פיתוח של טיפולים חדשניים הגדלת האיכות והזמינות של האיברים להצלת החיים הדרושים ביותר על ידי חולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מדווחים על עניין קנייני או מסחרי בכל מוצר שהוזכר או מושג שנדון במאמר זה.

Acknowledgments

חלקים מיצירה זו תמכו בתרומה נדיבה של מרסל ורונדה גוסליס ופונבה מר סטפני פואמי. ניקולא נואסטריקס הוא המלומד של FRQ-S.

המחברים רוצים להודות לג Zhuo Le Huang, גבריאל גאקון, סופיה גאסי, וקתרין סקלריני לתמיכה שלהם באיסוף מידע.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag Baxter Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter Jelco 4098 To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Milipore-Sigma T8877 Vital coloration
22 G 1" I.V catheter BD 383532 I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr Skalar 50-3147 Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" Skalar 22-9027 Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp ADinstruments FE221 Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride Milipore-Sigma C1016 CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose Milipore-Sigma G8270 D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer ADinstruments MLAC06 Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock) ADinstruments MLT0670 Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS Gibco 14190-144 Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" Skalar 66-2740 Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10% Milipore-Sigma HT501128 Fixative solution
Heating Pad Sunbean 756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL Sandoz For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% Fisher scientific A144-500 Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine Bimeda Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart ADinstruments Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon Radnoti 170404 In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution AstraZeneca Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS ACP Chemicals M-0460 MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor Radnoti 159905 Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker Biotronik Reliaty Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter Fisher scientific AE150
Physiological monitor Kent Scientific Physiosuite For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A Baxter Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride Milipore-Sigma P4504 KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml Hospira Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph ADinstruments Electronic polygraph
Silk 2-0 Ethicon A305H Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0 Ethicon A302H Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation Hallowell EMC 000A2770 Small animal ventilator
Sodium bicarbonate Milipore-Sigma S5761 NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride Milipore-Sigma S7653 NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets ACP chemicals S3700 Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic Milipore-Sigma S0751 NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" Skalar 22-1240 Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades Thomas scientific 6727C18 Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" CardinalHealth 8881511235 For heparin injection
Veterinary General Surgery Set Skalar 98-1275 Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set Skalar 98-1311 Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system Radnoti 120101BEZ Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine Bayer Sedative. 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gass, A. L., et al. Cardiac Transplantation in the New Era. Cardiology in Review. 23, (4), 182-188 (2015).
  2. von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31, (2), 141-152 (2017).
  3. Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53, (8), 831-837 (2006).
  4. Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23, (1), 136-141 (2018).
  5. Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175, (8), S1 (2006).
  6. Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7, (1), 75-81 (2018).
  7. Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7, (1), 67-74 (2018).
  8. Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22, (3), 189-197 (2017).
  9. McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31, (11), 631-634 (2005).
  10. Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16, (6), 667-673 (1997).
  11. Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24, (10), 1665-1672 (2005).
  12. Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42, (2), 25 (2017).
  13. Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28, (6), 634-642 (2015).
  14. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Academic Press. 77-108 (2016).
  15. Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101, (8), e231-e239 (2017).
  16. Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105, (6), 1763-1770 (2018).
  17. Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14, (8), 1744-1752 (2014).
  18. Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. (2018).
  19. Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36, (5), 919-926 (2009).
  20. Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64, (2), 225-231 (2018).
  21. Priebe, H. J. The acute open-chest model. British Journal Of Anaesthesia. 60, (8 Suppl 1), 38-41 (1988).
  22. Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19, (6), 1000-1008 (1992).
  23. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385, (9987), 2585-2591 (2015).
  24. Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (12), 1443-1452 (2016).
  25. White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, (10), 893-901 (2015).
  26. Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33, (4), 847-854 (2011).
  27. Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27, (2), 793-803 (1995).
  28. Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21, (3), 286-295 (2016).
  29. Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7, (8), e43642 (2012).
  30. Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228, (2), 360-364 (1975).
  31. Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66, (2), 98-105 (2012).
  32. Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (2), 175-184 (2011).
  33. Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T. Anesthetic cardioprotection: the role of adenosine. Current Pharmaceutical Design. 20, (36), 5690-5695 (2014).
  34. Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics