Modelo pré-clínico de doação cardíaca após a morte circulatória

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Summary

Este protocolo apresenta uma abordagem simples e flexível para a avaliação de novos agentes condicionantes ou estratégias para aumentar a viabilidade da doação cardíaca após a morte circulatória.

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Aceros, H., Joulali, L., Borie, M., Ribeiro, R. V., Badiwala, M. V., Der Sarkissian, S., Noiseux, N. Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death. J. Vis. Exp. (150), e59789, doi:10.3791/59789 (2019).

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Abstract

A demanda de transplante cardíaco está em ascensão; no entanto, a disponibilidade de órgãos é limitada devido a uma escassez de doadores adequados. A doação de órgãos após a morte circulatória (DCD) é uma solução para abordar essa disponibilidade limitada, mas devido a um período de isquemia morna prolongada e ao risco de lesão tecidual, seu uso rotineiro no transplante cardíaco raramente é observado. Neste manuscrito nós fornecemos um protocolo detalhado que imita pròxima práticas clínicas atuais no contexto de DCD com monitoração contínua da função de coração, permitindo a avaliação de estratégias e de intervenções cardioprotetores novas para diminuir lesão de isquemia-reperfusão.

Neste modelo, o protocolo de DCD é iniciado em ratos de Lewis anestesiados parando a ventilação para induzir a morte circulatória. Quando a pressão arterial sistólica cai abaixo de 30 mmHg, o tempo de isquemia quente é iniciado. Após um período isquêmico morno pré-ajustado, os corações são liberados com uma solução cardioplégica normotérmica, adquiridos, e montados em um sistema ex vivo da perfusão do coração de Langendorff. Após 10 min de reperfusão inicial e estabilização, o condicionamento cardíaco é continuamente avaliado por 60 min usando a monitorização da pressão intraventricular. Um ferimento de coração é avaliado medindo o troponina cardíaco T e o tamanho do enfarte é quantificado pela mancha histológica. O tempo de isquemia quente pode ser modulado e adaptado para desenvolver a quantidade desejada de danos estruturais e funcionais. Este protocolo simples permite a avaliação de diferentes estratégias de condicionamento cardioprotetor introduzidas no momento da cardioplegia, reperfusão inicial e/ou durante a perfusão ex vivo. Os achados obtidos nesse protocolo podem ser reproduzidos em grandes modelos, facilitando a tradução clínica.

Introduction

A transplantação contínua do órgão no transplante geral e cardíaco, em particular, está na ascensão Worldwide1,2. O método padrão de suprimento de órgãos é a doação após a morte encefálica (DBD). Dado os critérios estritos da inclusão de DBD, menos de 40% dos corações oferecidos são aceitados3, limitando desse modo a oferta frente à demanda crescente e estendendo a lista de espera do órgão. Para abordar esse problema, o uso de órgãos doados após a morte circulatória (DCD) é considerado uma solução potencial4.

No entanto, em doadores de DCD, uma fase agonal após a retirada do cuidado e um período de isquemia morna desprotegida antes da ressuscitação são inevitáveis5. A lesão potencial do órgão após a morte circulatória pode conduzir à deficiência orgânica do órgão, explicando a relutância para adotar rotineiramente transplantações do coração de DCD. É relatado que apenas 4 centros utilizam o DCD Hearts clinicamente, com critérios rigorosos que incluem tempos de isquemia quente muito curtos e jovens doadores sem patologias crônicas6,7. Por razões éticas e jurídicas, intervenções cardioprotetoras limitadas ou não podem ser aplicadas em doadores antes da morte circulatória5,8,9. Assim, qualquer mitigação para aliviar a lesão de isquemia-reperfusão (IR) é limitada a terapias cardioprotetoras iniciadas durante a reperfusão precoce com soluções cardioplémicas, e não permitem uma avaliação funcional adequada. A perfusão cardíaca ex vivo (evhp) e o recondicionamento do coração de DCD utilizando plataformas dedicadas têm sido propostos como uma solução alternativa eestudados por vários estudiosos10,11,12,13 . A EVHP oferece uma oportunidade única de entregar agentes de pós-condicionamento aos corações DCD para melhorar a recuperação funcional. No entanto, para uma tradução clínica eficiente, muitas questões técnicas e práticas continuam a ser abordadas, e isso é agravado pela falta de consenso sobre uma gama de perfusão e critérios funcionais para determinar a transplantabilidade6, a 8.

Nisto nós relatamos o desenvolvimento de um protocolo pequeno animal pré-clínico reprodutível de DCD combinado com um sistema ex vivo da perfusão do coração que possa ser usado para investigar o borne-condicionamento do órgão iniciado na altura da colheita, durante o reperfusion inicial, e /ou em todo o EVHP.

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Protocol

Todos os cuidados com os animais e protocolos experimentais conformados com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais do centro de pesquisa centro hospitalier de l' Université de Montréal.

1. preparações preliminares

  1. Ligar o banho de água para aquecer o sistema de parto cardioplegia (Figura 1a) e o sistema de perfusão de Langendorff ex vivo (Figura 1b). Ajuste a temperatura da água a 38,5 ° c para uma temperatura da solução de 37 ° c. As fotografias da instalação podem ser vistas na Figura 1a suplementar, B.
  2. Prepare 1 L de solução cardioplégico. Adicionar 1 mL de cloridrato de lidocaína a 2% e 10 mL de KCl de 2 mM (concentração final 20 mM) a 1 L de plasma-Lyte A (140 mM na, 5 mM K, 1,5 mM mg, 98 mM CL, 27 mM acetato, 23 mM gluconato). PH correto a 7,4 usando HCl 6 N.
    Atenção: Este modelo é altamente sensível ao pH. Uma correção de pH errada (fora do intervalo fisiológico 7.3-7.4) ou soluções de pH instável pode comprometer o experimento ou fornecer dados não confiáveis.
  3. Prepare 4 litros de solução de Krebs (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2po4, 1,25 mm CAcl2, 1 mm MgCl2∙ 6h2O, 5,5 mm D-glucose, 25 mm NaHCO3). As massas de substrato por 1 L de solução devem ser as seguintes: 6,1 g de NaCl, 0,3355 g de KCl, 0,2035 g de MgCl2∙ 6h2O, 0,192 g de NaH2po4, 0,1387 g de CAcl2, 0,99 g de D-glucose, 2,1 g de NaHCO3 , volume final de 1 L em água desionizada ultrapura. Adicione o NaHCO 3. º último a evitar a precipitação. Filtre a solução usando um filtro de 0,22 μm e armazene durante a noite. Corrija o pH para 7,4 quando a solução está em 37 ° c e bolha com 5% CO2/95% o2.
  4. Encha o circuito de Langendorff com a solução de Krebs e comece a bomba do sistema. Certifique-se de que nenhuma bolha é deixada dentro da tubulação. Ajuste a velocidade da bomba peristáltica para 80 rpm (equivalente a 1 L/min). Usando a torneira de batente em dois sentidos, ajuste o fluxo para manter um gotejamento lento através da cânula aórtica até que o coração esteja Unido (Figura 1b). Mantenha uma amostra de solução de Krebs (15 mL) em um tubo cónico de 50 mL no gelo para o transporte do coração.
  5. Encha o sistema de parto cardioplegia com a solução cardioplégica. Uma vez que as bolhas são removidas, mude o circuito para soro fisiológico usando uma torneira de batente de 3 vias (Figura 1a). Ajuste a taxa de gotejamento. O soro fisiológico deve ser lentamente pingando da ponta do cateter para garantir que nenhuma solução cardioplégico seja injetada antes da morte do animal.

2. preparação animal

  1. Utilizando uma câmara de inalação, induzir anestesia com isoflurano 3%. Uma vez que o animal não responde, realize uma injeção intraperitoneal de cetamina (75 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) ou anestésico similarmente adequado, seguindo os regulamentos locais, para manter a anestesia para o resto do procedimento. Assegure a profundidade da anestesia por nenhuma reação à pitada do dedo do pé e ao reflexo palpebral.
  2. Intubate o animal utilizando um cateter intravenoso de 14 G e 2 polegadas. Comece a ventilação em 50 respirs por o minuto, com pressão da via aérea limitada a 20 cmH2O.
  3. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento definido como "médio" e cubra com uma almofada absorvente para manter a temperatura do corpo. Inserir uma sonda de temperatura retal e anexar um sensor de oxímetro de pulso transdérmico a um dos pés. Manter a temperatura retal a 37 ° c durante todo o procedimento.
  4. Acesso vascular
    1. Faça uma incisão na pele de 3 a 4 cm no pescoço usando uma tesoura. Usando a ponta sem corte curvada scissors, Blunt dissecar o tecido subcutaneous e expor o músculo esterno direito. Usando pinça não traumática, mova o músculo lateralmente até que a artéria carótida direita (pulsante), veia jugular (não pulsante) e o nervo vago (branco) sejam identificados visualmente (Figura 2a suplementar). Separe com cuidado o nervo vago da artéria carotídea usando a ponta sem corte curvada tesouras.
    2. Injete heparina (2.000 UI/kg) através da veia jugular direita. Aplique pressão no local da injecção após a retração da agulha para evitar fugas de sangue.
    3. Usando fórceps curvo, passe duas 5-0 suturas de seda ao redor da artéria carótida. Prenda firmemente uma sutura longe do ponto de origem para obstruir a artéria carotídea no aspecto superior da artéria exposta. Mantenha a sutura proximal desamarrada. A tração da sutura proximal será utilizada para o controle do sangramento na próxima etapa (Figura 2b suplementar). A distância entre as suturas deve ser de aproximadamente 2 cm.
    4. Usando um estereomicroscópio para melhor visualização, faça com cuidado uma incisão de 1 mm com tesouras de microcirurgia sobre a parede anterior da artéria carótida. Insira um cateter intravenoso fechado de 22 G, 1 polegada em direção ao arco aórtico. O cateter é conectado a uma torneira de parada de 2 vias, permitindo a conexão a um transdutor de pressão para monitoramento constante, com a possibilidade de injetar soro fisiológico ou cardioplegia através do sistema de parto cardioplegia (Figura 1a).

3. iniciação do protocolo de doação cardíaca após morte circulatória (DCD)

Nota: Uma linha do tempo completa do protocolo pode ser vista na Figura 2.

  1. Re-Asses a profundidade anestésica realizando uma pitada do dedo do pé e avaliando o reflexo palpebral. Se for observada reação, realize uma injeção intraperitoneal de cetamina (37,5 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg). Reavaliar após 5 minutos. Se nenhuma resposta for observada, continue o procedimento. A braçadeira traqueal só deve ser realizada em animais adequadamente anestesiados.
  2. Desligue o ventilador e extubato o animal. Usando o fórceps do mosquito, prenda a traquéia. Este momento é considerado como o início da fase agonal. Comece a contar o tempo de isquemia funcional quente (WIT) quando a pressão arterial sistólica máxima cair abaixo de 30 mmHg, ou se aparecer assistolia ou fibrilação ventricular, o que vier primeiro (Figura 3).
    Nota: A extensão de dano deve ser proporcional ao WIT. Experimentos são necessários para otimizar o tempo de WIT de acordo com o anestésico usado, estirpe animal, sexo e peso escolhidos. Nos animais controle, imediatamente após o acesso vascular carotídeo é fixado, a cardioplegia é injetada e o coração é suprido conforme descrito na próxima etapa (Figura 2). O início da perfusão com cardioplegia é considerado como o fim da sagacidade.
  3. No final da WIT, realize uma esternotomia medial. Mantenha o tórax aberto usando um retractor de ALM. Usando tesouras, abra a veia cava inferior e ambos os átrios para evitar distensão miocárdica ou recirculação cardioplegia (figura complementar 3). Aperte a aorta acima do diafragma. Através da artéria carotídea previamente cateterizada, inutilizar a solução cardioplégica a uma pressão constante de 60 mmHg por 5 min usando o sistema de parto cardioplegia. A pressão da infusão pode ser modificada alterando a altura da coluna de água.
  4. Ao término da infusão cardioplégico, dissecar a aorta proximal ascendente da artéria pulmonar utilizando fórceps curvo (figura 4a suplementar). Corte a aorta distal à artéria subclávia esquerda. Assegure um comprimento aórtico de pelo menos 0,5 cm para o canulação para o instrumento de Langendorff.
  5. Segurando o coração da aorta, complete a cardiectomia, separando o coração das veias pulmonares e outras estruturas torácicas (Figura 4B suplementar). Ràpida, mergulhe o coração dentro à solução Ice-Cold de Krebs para o transporte rápido ao sistema ex vivo. Mantenha a dissecção e os tempos de transporte o mais curtos possível (5 min).

4. sistema de perfusão cardíaca ex vivo (EVHP) e avaliação funcional cardíaca

  1. Abra o lúmen aórtico usando fórceps. Deair a aorta enchendo o lúmen com a solução pingando de Krebs para evitar forçar bolhas dentro aos vasos coronarianos. Abaixe a cânula na aorta, tomando cuidado para não passar a raiz aórtica ou danificar os folhetos da valva aórtica. Fixe a configuração com um grampo pequeno.
  2. Usando o stopcock de 2 vias, aumente o fluxo para procurar possíveis vazamentos na aorta. Se nenhum for detectado, Fixe firmemente a aorta à cânula usando uma sutura de seda 2-0. Abra totalmente o fluxo para a cânula. Manter a pressão aórtica a uma pressão fisiológica de 60-70 mmHg (ajustada alterando a altura do sistema). Neste momento inicia-se o tempo inicial de reperfusão e estabilização. A pressão aórtica pode ser modificada de acordo com o plano experimental do investigador.
  3. Gire o coração para que a base do coração (átrios) esteja voltada para o sensor de pressão. Amplie a abertura atrial ventricular esquerda dissecando as veias pulmonaas. Insira o balão de látex conectado a um sensor de pressão. Certifique-se de que o balão está totalmente posicionado dentro do ventrículo por inspeção visual. Encha lentamente o balão com soro fisiológico até que a pressão diastólica final (EDP) esteja definida para 15 mmHg. Ajuste conforme necessário para manter a EDP constante (EDP fisiológico pré-determinado). O EDP pode ser ajustado de acordo com os objetivos experimentais de cada investigador.
  4. Insira o eletrodo de estimulação na face anterior do coração (trato de saída do ventrículo direito). Evite perfurar os vasos coronarianos. Uma vez que o espancamento espontâneo é observado, iniciar a estimulação em 300 batimentos por min. a tensão requerida pode variar entre experimentos e cepas de ratos.
  5. Após 10 min de estabilização, iniciar a gravação de medição de pressão intraventricular contínua. Este momento é considerado o início da fase de recondicionamento e avaliação (tempo 0) que durará por 1 h (Figura 2). O recondicionamento pode ser prolongado, mas uma diminuição dependente do tempo na contratilidade é esperada em todos os corações.
  6. No início do recondicionamento, coletar efluente cardíaco caindo das veias cardíacas por 5 min para avaliação de fluxo coronariano basal e análises bioquímicas. Para troponina T repetir a cada 15 min (vezes 0, 15, 30, 45 e 60 min). Para outras análises, é necessária a individualização dos tempos de coleta (Figura 2).

5. fim da experiência

  1. Retire o coração do aparelho de Langendorff.
  2. Usando uma lâmina de aço carbono de alta reta (lâmina de micrótomo ou similar), retire a base do coração (incluindo aorta e artéria pulmonar).
  3. Com o ventrículo direito virado para baixo, corte as lâminas ventriculares transversais de 1-2 mm de espessura. Em uma seção representativa (normalmente a terceira), o ventrículo direito e a pressão congelam o ventrículo esquerdo. Esta amostra pode ser usada para análises bioquímicas.
  4. Submerge as seções restantes dentro ao cloreto recentemente preparado de 5% 2, 3, 5-triphenyl-Tetrazolium no pH fisiológico 7,4 do tampão de fosfato comercial para 10 minutos em 37 ° c. Os tecidos viáveis são tijolos vermelhos coloridos.
  5. Lave duas vezes com tampão fosfato soro fisiológico pH 7,4 e fixar com formalina 10% a 4 ° c durante a noite. Lave duas vezes com pH salina tamponado fosfato 7,4 e mantenha cada fatia submersa.
  6. Retire o excesso de líquido e peso cada slide. Tirar imagens de cor digital de ambos os lados. Use análises planimetric para calcular o tamanho do infarto dos por cento e corrija para a fatia e o peso ventricular total. A coloração desvanece-se com o tempo. As fotos devem ser tiradas o mais rápido possível.

6. análise de dados

  1. Salve todos os dados de pressão em um novo arquivo por animal.
  2. Para análises de pressão, selecione pelo menos 200 ciclos de pressão por pontos de tempo. As análises podem ser executadas off-line (após a conclusão do experimento) usando software dedicado (ou seja, LabChart). Os parâmetros cardiovasculares comuns disponíveis incluem: pressão máxima gerada, pressão diastólica final, + DP/DT (inclinação mais íngreme durante o movimento ascendente da curva de pressão, um indicador da habilidade contrátil ventricular),-DP/DT (inclinação mais íngreme durante a diminuição da curva de pressão, um indicador de capacidade de relaxamento ventricular) entre outros.
    Nota: para análises de troponina, espera-se um aumento na liberação de troponina na reperfusão. Após 1 h de reperfusão no sistema EVHP, os níveis de troponina podem diminuir para a linha de base, salientando a necessidade de um tempo cuidadoso na coleta e manuseio dessas amostras.

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Representative Results

Após a extubação, a pressão arterial cai rapidamente em um padrão previsível (Figura 3). O tempo esperado até a morte é inferior a 5 min.

A Figura 4 mostra uma curva média de pressão/tempo no início do recondicionamento após 0, 10 e 15 min de Wit. Contractile função irá melhorar ao longo do tempo. O uso de curtos períodos de sagacidade permitirá a contratilidade voltar ao normal, e os danos morfológicos não serão detectáveis (Figura 5 e Figura 6).

O uso de prova de conceito de um agente de condicionamento adicionado com a cardioplegia e na fase de estabilização mostra que o dano gerado por 15 min de WIT neste modelo é capaz de ser modulado por agentes cardioprotetores (Figura 4, Figura 5 e Figura 6).

Figure 1
Figura 1: esquemas de equipamentos necessários. Exigências mínimas para um (a) sistema de entrega do cardioplegia e um (B) sistema ex vivo da perfusão do coração de Langendorff. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: cronograma do protocolo. Cronograma desde o momento da extubação até o final do protocolo. Nos animais de controle, a cardioplegia é iniciada sem DCD ou tempo de isquemia quente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: pressão arterial Intracarotídeo/plotagem temporal. Evolução típica da pressão sanguínea testo após extubação. O tempo de isquemia quente é estrelado quando a pressão arterial sistólica máxima cai abaixo de 30 mmHg, ou se a assistolia ou fibrilação ventricular aparecer, o que vier primeiro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: curva de tempo de pressão ventricular média ex vivo da batida-à-batida. Imagem derivada de análises de dados obtidos após 10 min de estabilização e perfusão (tempo 0 na Figura 2) com ou sem o uso de um agente experimental de condicionamento cardioprotetor farmacológico. O tempo isquêmico refere-se aos tempos isquêmicos quentes (WIT). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: recuperação ex vivo e análises funcionais. (A) curva de pressão-tempo ventricular contínua após 10 min de estabilização e perfusão com ou sem o uso de um agente de condicionamento cardioprotetor farmacológico experimental. As setas mostram artefatos devido à modificação manual da EDP. (B) taxa máxima (+ DP/DT) e mínima (-DP/DT) de alteração de pressão na parcela de LV versus tempo derivada de (a) mostrando uma melhora dependente do tempo na contratilidade sem tratamento (linha verde). SAGACIDADE curta (linha vermelha) ou corações tratados (amarelos) mostram um padrão semelhante ao grupo controle (linha azul). Os pontos de dados são a média de pelo menos 200 batidas individuais. As barras mostram o erro padrão da média de cada ponto de dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: coloração do cloreto de 2, 3, 5-trifenilo-tetrazólio no final dos experimentos. Área do enfarte observada após épocas isquêmicas mornas diferentes (Wit) e o uso de um agente de condicionamento cardioprotetores farmacológico. Tijolo vermelho: tecido viável. Amarelo claro: tecido não viável. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura complementar 1: fotografia de configuração. (A) fotografia mostrando a configuração para o sistema de entrega de cardioplegia. O equipamento numerado corresponde a: recipiente de cardioplegia (1), armadilha de bolha (2), sensor de pressão e cateter (3), bomba peristáltica (4), polígrafo conectado ao sensor de pressão (5) e ventilador animal pequeno (6). (B) fotografia que mostra a configuração do sistema de perfusão do coração de Langendorff ex vivo. O equipamento numerado corresponde a: recipiente do Perfusate (1), recipiente do agente de condicionamento (2) e câmara do coração (3). Por favor clique aqui para baixar esta figura.

Figura complementar 2: dissecção do pescoço. (A) fotografia que mostra a veia jugular exposta (seta) antes da injeção de heparina. (B) mostra a artéria carotídea dissecada (seta) com as suturas colocadas para o controle do sangramento. Por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 3: abertura dos átrios para evitar a recirculação. (A) fotografia que mostra a abertura do Apêndice Atrial esquerdo (1). No fundo, a aorta (2) é apertada acima do diafragma (3). (B) mostra a abertura do Apêndice Atrial direito (1). Por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 4: suprimento cardíaco. (A) fotografia mostrando o uso de fórceps curvo para separar a aorta (seta) e a artéria pulmonar. (B) fotografia que mostra dissecção e suprimento cardíaco. O coração é pressionado pela aorta usando fórceps. Por favor clique aqui para baixar esta figura.

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Discussion

O protocolo apresentado aqui apresenta um modelo simples, conveniente e versátil de DCD cardíaco, oferecendo a oportunidade de avaliar a recuperação funcional cardíaca, dano tecidual e o uso de agentes cardioprotetores pós-condicionamento para melhorar a recuperação do doador os corações rejeitados de outra forma para transplante. Sistemas de perfusão cardíaca ex vivo (EVHP) foram otimizados para fornecer uma plataforma para avaliar a função cardíaca e oferecer uma oportunidade única de entregar e testar soluções modificadas suplementadas com agentes farmacológicos pós-condicionamento para preservar e reparar corações DCD em pequenos15 e grandes animais16,17 modelos de DCD cardíaco. No entanto, os protocolos são muitas vezes insuficientemente detalhados e nem sempre clinicamente relevantes, tornando difícil a tradução clínica.

No Reino dos modelos DCD, ex vivo modelos DCD, como o descrito por Sanz18, falta uma fase agonal. Induzindo a parada cardíaca parando a ventilação mecânica, o sistema nervoso simpático é overactivated, conduzindo a uma "tempestade da catecolamina"19. Esse aumento nas catecolaminas modifica as características dos órgãos doadores e tem sido associado a um status funcional reduzido de órgãos experimentais de DCD19. Adicionalmente, o declínio progressivo na função antes da assistolia conduz à distensão ventricular direita e à lesão conseqüente. Em nosso protocolo, nós induzimos a morte circulatória usando um modelo clinicamente relevante da asfixia, que mantenha estas respostas.

Dois modelos cardíacos principais de DCD in vivo são descritos na literatura: caixa aberta15 e caixa fechada20 modelos. A fisiologia cardíaca é alterada pela abordagem do tórax aberto, reduzindo a interação mecânica pulmão/coração e pré-carga. Além disso, em procedimentos de tórax aberto, a perda de calor corporal é acelerada, afetando ainda mais os desfechos funcionais21. Conseqüentemente é preferível manter uma aproximação fechada da caixa que impede a perda de calor. Outro refinamento é minimizar a variabilidade do tempo para a morte circulatória. Kearns et al. relataram que o tempo até a morte (tempo até a pressão arterial não pulsátil ou média inferior a 30 mmHg) foi entre 3 e 11 min. Nos 10 e 20 min de sagacidade, 40% e 60% dos corações não recuperam a função, respectivamente, em um aparelho de coração de trabalho ex vivo, tornando a interpretação dos dados mais difícil15. Uma alternativa para reduzir o tempo para a morte circulatória é usar agentes paralítico20; no entanto, algumas evidências apontam para efeitos cardíacos diretos do vecurônio, devido aos seus efeitos na inervação simpática e parassimpática22. Para aumentar a reprodutibilidade, optou-se pelo pinçamento traqueal, aliado a uma monitorização precisa da pressão arterial, possibilitando um tempo agonal mais homogêneo (< 5 min). Sabe-se que o dano de órgão começa antes do momento da morte circulatória; com alguns autores considerando uma pressão arterial sistólica de corte abaixo de 50 mmHg como o início da sagacidade funcional6, explicando a relutância dos órgãos de transplante após um longo período de retirada das medidas de sustentação da vida até a reperfusão. Neste protocolo, a definição de WIT utilizada segue o padrão experimental atual15, no entanto, novos estudos são necessários para esclarecer o conjunto exato de parâmetros hemodinâmicos que marcam a indução de dano de órgão, a fim de melhorar a sagacidade o cálculo, oferecendo assim a melhor informação para a prática clínica.

A infusão de solução cardioplégico em constante pressão fisiológica e temperatura oferece uma oportunidade única para iniciar o condicionamento cardíaco e proteção tecidual com qualquer agente farmacológico ou por outros meios. Os refinamentos técnicos incluem o aperto da aorta torácica, limitando a perfusão ao coração e reduzindo assim a quantidade de solução necessária para cada ensaio. Uma vez que o coração está no sistema de EVHP, a avaliação funcional estandardizada é necessária. Demonstrou-se que o uso de um sistema evhp tem o potencial de melhorar a ressuscitação de corações previamente considerados não transplantáveis23,24. Curiosamente, o sistema evhp clinicamente disponível avalia a viabilidade cardíaca apenas por meio de medições seriadasdelactato8,23. As medidas de lactato não estão relacionadas ao desempenho cardíaco dos corações de DCD24,25, portanto, medidas adicionais para avaliar a transplantabilidade são necessárias. Esta configuração experimental permite uma avaliação funcional completa, incluindo pressões geradas e medidas de contratilidade miocárdica, incluindo + dP/dT e – dP/dT, permitindo uma avaliação mais completa da função cardíaca antes do transplante final decisão é tomada. Adicionalmente, as medidas de troponina cardíaca, um marcador de lesão miocárdica diretamente correlacionada ao tamanho do infarto isquêmico26, e a cinética de liberação estão relacionadas à extensão da isquemia cardíaca em um sistema de isquemia/reperfusão de Langendorff. Em particular, com tempos isquêmicos longos (60 min), os níveis de troponina são mantidos após 1 h de reperfusão, enquanto a LDH e a creatinina quinase diminuem significativamente e não estão relacionadas à extensão dos danos cardíacos27,28, assim o uso de medidas de troponina serial assegura uma avaliação completa da viabilidade do órgão antes do transplante. Uma grande variável de confusão na avaliação funcional cardíaca é a frequência cardíaca. A frequência cardíaca espontânea está inversamente relacionada ao comprimento da isquemia29, e a frequência cardíaca se correlaciona diretamente com + DP/DT em corações isolados de ratos30 e em modelos animais31. Curiosamente, no trabalho publicado recentemente em modelos de roedores de DCD Hearts e evhp condicionamento, o estimulação não foi utilizado e as taxas cardíacas foram variáveis e registradas em seus protocolos15,18,20. Para manter a freqüência cardíaca fisiológica, o ritmo foi usado uma vez que o coração tinha recuperado a contração rítmica. A frequência de 300 BPM escolhida é semelhante à dos ratos saudáveis e não estressados32.

As limitações deste protocolo incluem o uso do anestésico volátil para a indução. Estes agentes foram mostrados para conferir o pré-condicionamento isquêmico33. No entanto, o curto período de uso do anestésico inalatório não teve efeito observável neste protocolo e a disfunção miocárdica progressiva ainda foi observada com o aumento da sagacidade. O uso de cardioplegia normotérmica também pode ser visto como uma limitação. O uso de cardioplegia normotérmica permite a tradução ideal das condições in vitro utilizadas para o desenvolvimento de agentes condicionantes farmacológicos, uma vez que as células são geralmente mantidas a 37 ° c. No entanto, nesta configuração a temperatura cardioplegia pode ser facilmente regulada de acordo com as exigências do investigador. Por outro lado, o uso de uma preparação de Langendorff versus uma preparação do coração de trabalho para o recondicionamento também pode ser visto como uma limitação. A preparação do coração de trabalho permite a gravação contínua de um laço da pressão/volume12,15, com pre e AfterLoad controlados, permitindo a avaliação funcional completa. A principal vantagem de uma preparação de Langendorff é que mantém uma constante pressão aórtica e perfusão, especialmente durante a reperfusão inicial, quando a pressão gerada é mínima. Além, a instalação da avaliação é mais simples para o coração de Langendorff comparado a uma preparação de trabalho do coração. No entanto, esta configuração pode ser convertida em um trabalho de preparação do coração, se julgar necessário. Alternativamente, a reanimação cardíaca pode ser realizada in situ utilizando perfusão regional normotérmica, sendo o desempenho cardíaco medido diretamente pelo uso de um cateter Millar34, permitindo a realização de hemodinâmica e funcional miocárdicos abrangentes avaliação antes da contratação de órgãos. Em humanos, as estratégias de recondicionamento in situ e ex vivo foram descritas6, assim, o desenvolvimento de ambos os modelos permite comparações experimentais que podem traduzir para a otimização da prática clínica. Finalmente, o tamanho pequeno e a alta frequência cardíaca deste modelo animal podem ser considerados como uma limitação devido às potenciais dificuldades técnicas observadas durante a realização desses experimentos, e as inevitáveis diferenças fisiológicas entre o rato e o coração humano. Se a avaliação do EVHP já estiver padronizada, um pesquisador pode ser familiarizado com essa técnica realizando tão pouco quanto 3 experimentos. Por outro lado, o uso deste pequeno modelo animal permite a triagem conveniente a um custo razoável, reservando modelos animais maiores e mais onerosos, como o modelo suíno, a terapias com alto potencial translacional humano.

Concluindo, o protocolo aqui descrito leva em consideração as melhores práticas emanando de vários grupos que pesquisam corações de DCD. Este protocolo concede controle total da WIT, permitindo uma avaliação estrutural e funcional abrangente das estratégias de tratamento de condicionamento cardioprotetor em ratos. Este protocolo pode ser escalado e transferido para grandes modelos animais, permitindo traduzir os resultados da pesquisa para a realidade clínica e, finalmente, permitindo o desenvolvimento de novas terapias aumentando a qualidade e disponibilidade de órgãos salva-vidas muito necessário por Pacientes.

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Disclosures

Os autores relatam nenhum interesse proprietário ou comercial em nenhum produto mencionado ou conceito discutido neste artigo.

Acknowledgments

Partes deste trabalho foram apoiadas por uma generosa contribuição da Fondation Marcel et Rolande Gosselin e Fondation Sr. stefane Foumy. Nicolas Noiseux é estudioso do FRQ-S.

Os autores desejam agradecer a Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi, e Catherine Scalabrini por seu apoio na coleta de dados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag Baxter Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter Jelco 4098 To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Milipore-Sigma T8877 Vital coloration
22 G 1" I.V catheter BD 383532 I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr Skalar 50-3147 Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" Skalar 22-9027 Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp ADinstruments FE221 Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride Milipore-Sigma C1016 CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose Milipore-Sigma G8270 D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer ADinstruments MLAC06 Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock) ADinstruments MLT0670 Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS Gibco 14190-144 Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" Skalar 66-2740 Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10% Milipore-Sigma HT501128 Fixative solution
Heating Pad Sunbean 756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL Sandoz For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% Fisher scientific A144-500 Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine Bimeda Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart ADinstruments Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon Radnoti 170404 In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution AstraZeneca Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS ACP Chemicals M-0460 MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor Radnoti 159905 Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker Biotronik Reliaty Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter Fisher scientific AE150
Physiological monitor Kent Scientific Physiosuite For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A Baxter Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride Milipore-Sigma P4504 KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml Hospira Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph ADinstruments Electronic polygraph
Silk 2-0 Ethicon A305H Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0 Ethicon A302H Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation Hallowell EMC 000A2770 Small animal ventilator
Sodium bicarbonate Milipore-Sigma S5761 NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride Milipore-Sigma S7653 NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets ACP chemicals S3700 Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic Milipore-Sigma S0751 NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" Skalar 22-1240 Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades Thomas scientific 6727C18 Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" CardinalHealth 8881511235 For heparin injection
Veterinary General Surgery Set Skalar 98-1275 Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set Skalar 98-1311 Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system Radnoti 120101BEZ Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine Bayer Sedative. 20 mg/mL

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